專(zhuān)利名稱(chēng)：豬細(xì)小病毒l株及在制備豬細(xì)小病毒病滅活疫苗中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株新分離的病毒毒株，尤其涉及一株豬細(xì)小病毒毒L株，本發(fā)明還 涉及病毒L株在制備豬細(xì)小病毒病滅活疫苗中的用途，屬于豬細(xì)小病毒病的防治領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬細(xì)小病毒(PPV)可引起豬的繁殖障礙，主要表現(xiàn)為胎兒和胚胎的感染和死亡， 而母體通常并不表現(xiàn)臨床癥狀。血清學(xué)陰性母豬主要在妊娠的前半期經(jīng)口鼻感染病毒，結(jié) 果免疫機(jī)能不全的胎兒經(jīng)胎盤(pán)受到感染，從而導(dǎo)致發(fā)病。經(jīng)檢查得知在世界各地的豬群中， 該病毒是普遍存在的，在大多數(shù)豬場(chǎng)呈地方性流行。此病流行很廣，在歐、美、亞及大洋洲很 多國(guó)家均有報(bào)道。我國(guó)的各省市相繼分離到豬細(xì)小病毒，血清陽(yáng)性率很高。本病對(duì)養(yǎng)豬業(yè) 的危害極大。由于PPV目前尚無(wú)有效的藥物治療方法，因此，該病的預(yù)防免疫就顯得更為重 要。近年來(lái)，公認(rèn)使用疫苗是預(yù)防PPV、提高母豬繁殖率的唯一方法。到目前為止，世界 上已有美國(guó)、澳大利亞、日本、丹麥、西班牙、捷克、德國(guó)、原蘇聯(lián)和中國(guó)等10多個(gè)國(guó)家報(bào)告 研制了 PPV疫苗，其中除美國(guó)和日本有3個(gè)弱毒疫苗外，其余均為滅活疫苗，并都已成為商 品化生產(chǎn)苗，常用的滅活劑有AEI、BEI、甲醛溶液和丙內(nèi)酯。美國(guó)的Mengeling(1979) 還報(bào)告生產(chǎn)應(yīng)用了一種PPV和豬偽狂犬(PrV) 二聯(lián)苗，效果較好。中國(guó)均普遍使用PPV滅活疫苗，使用的主要滅活劑有福爾馬林、B2丙內(nèi)酯 (B2PL)、N-乙酰乙烯亞胺(AEI)、二乙烯亞胺(BEI)等。有試驗(yàn)結(jié)果表明，PPV用福爾馬林滅 活后做成的疫苗的保護(hù)效果不如用二乙烯亞胺滅活后做成的疫苗的保護(hù)效果好；用B-丙 內(nèi)酯滅活的疫苗的保護(hù)力較好(潘雪珠等，1992)。免疫佐劑也是影響PPV滅活疫苗免疫效 果的重要因素。有試驗(yàn)結(jié)果表明，50%的氫氧化鋁、順丁烯乙酰(EMA)、油水乳劑、DDA分別 作為佐劑的疫苗，均誘導(dǎo)豬產(chǎn)生高滴度的抗體。但幾種佐劑的混合物，如油佐劑、SDS、氫氧 化鋁和油乳劑的混合物以及SDS、氫氧化鋁的混合物作佐劑的疫苗產(chǎn)生的抗體滴度均較低 (Mo lito r等，1985)。目前國(guó)內(nèi)有兩種豬細(xì)小病毒滅活疫苗供預(yù)防本病。一種是豬細(xì)小病 毒滅活氫氧化鋁疫苗，另一種是豬細(xì)小病毒滅活油佐劑苗。對(duì)于豬細(xì)小病毒應(yīng)用二乙烯亞 胺滅活，并加入油佐劑配制而成雙向油乳劑滅活苗，還未報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供一株新分離的豬細(xì)小病毒毒株；本發(fā)明的目的之二是將上述豬細(xì)小病毒毒株用于制備豬細(xì)小病毒病雙向油乳劑 滅活疫苗；本發(fā)明目的之三是提供一種制備上述豬細(xì)小病毒病雙向油乳劑滅活疫苗的方 法；本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的一株新分離的豬細(xì)小病毒(PPV) L株，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No. 3352 ；分類(lèi)命名是豬細(xì)小病毒；保藏時(shí)間是2009年10月23日；保藏單位是中國(guó)微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微 生物研究所。本發(fā)明豬細(xì)小病毒(PPV)L株的分離方法，包括無(wú)菌采集取母豬死胎的肝、腸系膜淋巴結(jié)、腎、腦等組織。以1 10加入滅菌生 理鹽水，研磨，制備組織懸液，經(jīng)反復(fù)3次凍融后，2000r/min離心15min，收集上清液，再經(jīng) 0. 2ul濾膜濾器過(guò)濾，將濾出液置-30°C冰箱凍結(jié)保存。取分離的毒株接種ST傳代細(xì)胞上， 在C02 3 7°C條件下培養(yǎng)，每天對(duì)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)進(jìn)行觀察。形態(tài)結(jié)果顯示細(xì)胞固縮， 突立聚集，顆粒增多，有的細(xì)胞融合，細(xì)胞脫落，出現(xiàn)空斑。本發(fā)明豬細(xì)小病毒L株電鏡負(fù)染觀察結(jié)果可觀察到外觀呈六角形或圓形，無(wú)囊 膜的病毒粒子，直徑約為20nm。本發(fā)明豬細(xì)小病毒L株免疫熒光法檢查結(jié)果標(biāo)本感染ST傳代細(xì)胞，細(xì)胞有病變， 在細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)中，可見(jiàn)呈蘋(píng)果綠色的特異性熒光，陰性對(duì)照無(wú)特異性熒光出現(xiàn)。病毒血凝活性檢測(cè)收獲含毒細(xì)胞培養(yǎng)液能凝集豚鼠紅細(xì)胞，具有較高的血凝活 性，而且隨著傳代培養(yǎng)次數(shù)的增加，病毒對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)性增強(qiáng)，病毒血凝價(jià)有提高。本發(fā)明豬細(xì)小病毒L株的測(cè)序結(jié)果對(duì)PPV VP2進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)附圖4，利 用DNA MAN軟件對(duì)L株VP2基因片段進(jìn)行序列分析，L株和其它幾株P(guān)PV VP2的進(jìn)化樹(shù)分 析，見(jiàn)附表1及附圖5。表明L株與NADL-2株和China株的遺傳距離最近。將上述豬細(xì)小病毒毒株滅活，加入佐劑，就可得到豬細(xì)小病毒病滅活疫苗；優(yōu)選的，一種利用本發(fā)明細(xì)小病毒毒株制備豬細(xì)小病毒病雙向油乳劑滅活疫苗的 方法，包括培養(yǎng)所述的豬細(xì)小病毒L株，得到豬細(xì)小病毒抗原液；將豬細(xì)小病毒抗原液滅 活；濃縮；分別配制油相和水相，將水相和油相混合在一起后乳化，即得。二乙烯亞胺的濃度及作用時(shí)間對(duì)滅活苗的效果有非常顯著的影響，鑒次，本發(fā)明 選用二乙烯亞胺作為滅活劑，對(duì)滅活劑的使用劑量、作用時(shí)間、滅活效果等進(jìn)行一系列試 驗(yàn)，以?xún)?yōu)化二乙烯亞胺滅活豬細(xì)小病毒程序。最終發(fā)現(xiàn)以終末濃度0. 02%二乙烯亞胺溶液 滅活豬細(xì)小病毒效果為好；當(dāng)以終末濃度0. 02%二乙烯亞胺溶液在30°C，lOOr/min，氣浴 振蕩的條件下，72h滅活豬細(xì)小病毒的效果為最佳。其中，所述油相可參考下述方法制備得到注射用白油94份、司本-806份和硬脂 酸鋁1. 5份混合在一起，配制得到油相；所述水相可參考下述方法制備得到96ml滅活后的豬細(xì)小病毒抗原液中加入4ml 吐溫-80，加入硫柳汞至終濃度為0. 01wt% ；配制得到水相；優(yōu)選的，將所述水相和油相按照4 1. 5比例混合在一起進(jìn)行乳化。本發(fā)明滅活疫苗免疫劑量為豬肌肉注射2ml/頭，一次接種滅活疫苗，現(xiàn)地免疫期 可達(dá)6個(gè)月以上。超劑量接種10ml/頭，單劑量3次重復(fù)接種后，均未發(fā)現(xiàn)任何異常反應(yīng)， 說(shuō)明本發(fā)明所制備的滅活疫苗具有良好的免疫原性及安全性。


圖1細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)結(jié)果。圖2病毒的電鏡檢查結(jié)果。
圖3免疫熒光法檢查結(jié)果。圖4本發(fā)明豬細(xì)小病毒毒株滅活疫苗的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式 進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1豬細(xì)小病毒L 株的分離、培養(yǎng)、鑒定一、選育方法1.病料采集無(wú)菌采集取母豬死胎的肝、腸系膜淋巴結(jié)、腎、腦等組織。以1 10 加入滅菌生理鹽水，研磨，制備組織懸液，經(jīng)反復(fù)3次凍融后，2000r/min離心15min，收集上 清液，再經(jīng)0. 2ul濾膜濾器過(guò)濾，將濾出液置-30°C冰箱凍結(jié)保存。2.分離培養(yǎng)將上述病料按病毒培養(yǎng)液的10%含量接入尚未形成單層的細(xì)胞培 養(yǎng)物中，37°C感作lh，換加含2%讀牛血清的MEM培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)5日。第二代培養(yǎng)78h， 收獲含毒培養(yǎng)液，經(jīng)3次凍融后，收毒。連續(xù)傳代5代。3.基礎(chǔ)種子批建立取原始毒種，按病毒培養(yǎng)液量的0. 5%接入尚未形成單層的 ST細(xì)胞培養(yǎng)物中，置37°C培養(yǎng)，當(dāng)病變達(dá)到70%時(shí)，收獲含毒細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)3次凍融后，收 毒。連續(xù)傳代6代。4.生產(chǎn)種子批建立取基礎(chǔ)種子，按病毒培養(yǎng)液量的0. 5%接入尚未形成單層的 ST細(xì)胞培養(yǎng)物中，置37°C培養(yǎng)，當(dāng)病變達(dá)到70%時(shí)，收獲含毒細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)3次凍融后，收 毒。連續(xù)傳代11代。最終獲得一株具有希望特性的所需豬細(xì)小病毒毒株，并命名為并命名為豬細(xì)小病 毒L株；取分離的毒株接種ST傳代細(xì)胞上，在C02 3 7°C條件下培養(yǎng)，每天對(duì)細(xì)胞病變效應(yīng) (CPE)進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示細(xì)胞固縮，突立聚集，顆粒增多，有的細(xì)胞融合，細(xì)胞脫落，出現(xiàn) 空斑。病變見(jiàn)圖1。二、電鏡負(fù)染觀察經(jīng)培養(yǎng)5-7d后，病變細(xì)胞上清蔗糖梯度超速離心，分離病毒顆粒進(jìn)行電鏡負(fù)染觀察。結(jié)果顯示可觀察到外觀呈六角形或圓形，無(wú)囊膜的病毒粒子，直徑約為20nm。見(jiàn) 圖2三、免疫熒光法檢查取分離的毒株接種ST傳代細(xì)胞上，在C02 3 7°C條件下培養(yǎng)47h，當(dāng)CPE達(dá)70%時(shí)， 傳第二代，選用第二代培養(yǎng)物經(jīng)3次凍融后，做熒光抗體檢查。取已培養(yǎng)24h的ST細(xì)胞蓋 玻片培養(yǎng)物，接種病毒，再經(jīng)24h培養(yǎng)。取出蓋玻片，用PBS沖洗，經(jīng)丙酮固定，再用豬細(xì)小 病毒熒光抗體濕盒內(nèi)染色30min，沖洗，封固，鏡檢。結(jié)果顯示標(biāo)本感染ST傳代細(xì)胞，細(xì)胞有病變，在細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)中，可見(jiàn)呈蘋(píng)果綠 色的特異性熒光，陰性對(duì)照無(wú)特異性熒光出現(xiàn)。見(jiàn)圖3。
(4)病毒血凝活性檢測(cè)取96孔微量反應(yīng)板(U型)，用pH 7. 2的PBS將含毒細(xì)胞培養(yǎng)液做2倍連續(xù)稀釋?zhuān)?加入含4HAU豬細(xì)小病毒血凝素液，并設(shè)PBS和病毒對(duì)照，充分振蕩后，置4°C，18h，再加入 0.6%豚鼠紅細(xì)胞懸液，置室溫lh，當(dāng)對(duì)照孔中的紅細(xì)胞呈顯著鈕扣狀時(shí)判定結(jié)果。結(jié)果顯示收獲含毒細(xì)胞培養(yǎng)液能凝集豚鼠紅細(xì)胞，具有較高的血凝活性，而且隨 著傳代培養(yǎng)次數(shù)的增加，病毒對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)性增強(qiáng)，病毒血凝價(jià)有提高。見(jiàn)表1 (5)病毒的測(cè)序檢測(cè)根據(jù)豬細(xì)小病毒NADL-2株的全基因序列自行設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用于擴(kuò)增VP2基因 片段(2808bp-4407bp)。上游引物為 Pl:5' CAATGAGTGAAAATGTGGAA 3'，下游引物為 P2: 5' TTTGCTGTGAATGTTAGTGT 3'。對(duì)PPV提取DNA，并對(duì)VP2基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序。結(jié)果顯示利用DNA MAN軟件對(duì)L株VP2基因片段進(jìn)行序列分析，測(cè)序結(jié)果得到了 與預(yù)期結(jié)果相符的1600bp的基因片段，其中包括PPV VP1基因的2個(gè)核苷酸和VP2基因的 1598個(gè)核苷酸。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)SEQ ID N0:1。PPV L株VP2基因片段與其它PPV毒株的同源性比較結(jié)果見(jiàn)表2。表2 PPV L株VP2基因片段與其它PPV毒株的同源性比較 本發(fā)明病毒L株和其它幾株P(guān)PV VP2的進(jìn)化樹(shù)分析，表明L株與NADL-2株和China 株的遺傳距離最近。實(shí)施例2豬細(xì)小病毒病滅活苗的制備1.制苗用病毒液的制備生產(chǎn)種子毒種按病毒培養(yǎng)液量的0. 5%接入尚未形成單層的ST細(xì)胞培養(yǎng)物中，置37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，當(dāng)病變達(dá)到70%時(shí)，收獲含毒細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)3次 凍融后，收毒。2.滅活按病毒液總量的0.02%向病毒液中加入二乙烯亞胺溶液，充分振蕩后， 于30°C、100r/min搖床上滅活72h，然后加入1 %硫代硫酸鈉溶液，終止滅活。并作無(wú)菌檢驗(yàn)。3.濃縮取滅活后的病毒液，經(jīng)13000r/min連續(xù)離心，然后以0. 2um濾膜濾器過(guò) 濾。微濾后的病毒液以50KD濾膜濾器超濾濃縮5倍。4.油佐劑滅活疫苗的配制按照注射用白油94份、司本-806份和硬脂酸鋁1. 5份 的比例配制油相；按照96ml抗原加入4ml吐溫-80及0. 01 %加入硫柳汞的比例配制水相； 水相和油相按照4 1. 5比例進(jìn)行乳化，制成油包水單相苗。試驗(yàn)例1本發(fā)明豬細(xì)小病毒毒株滅活疫苗的工藝優(yōu)化試驗(yàn)選用二乙烯亞胺作為滅活劑，對(duì)滅活劑的使用劑量、作用時(shí)間、滅活效果等進(jìn)行一 系列試驗(yàn)，以?xún)?yōu)化二乙烯亞胺滅活豬細(xì)小病毒程序。(1) 二乙烯亞胺使用劑量及濃度確定設(shè)定1%,0. 2%,0. 05%,0. 02%等濃度的二乙烯亞胺，在30°C，100r/min，氣浴振 蕩的條件下，滅活48h，滅活后做滅活病毒液細(xì)胞培養(yǎng)物感染性病毒檢查及小白鼠感染試 驗(yàn)。確定以終末濃度0. 02%二乙烯亞胺溶液滅活豬細(xì)小病毒效果最佳。(2) 二乙烯亞胺作用時(shí)間確定0.02%二乙烯亞胺，在301，10017/1^11，氣浴振蕩的條件下，分別做7、10、15、24、 48、60、72、80h等不同時(shí)間的滅活，滅活后做滅活病毒液細(xì)胞培養(yǎng)物感染性病毒檢查及小白 鼠感染試驗(yàn)。確定以終末濃度0. 02%二乙烯亞胺溶液在30°C，lOOr/min，氣浴振蕩的條件 下，做72h滅活豬細(xì)小病毒效果最佳。(3) 二乙烯亞胺毒性試驗(yàn)設(shè)定1%、0. 2%、0. 02%等濃度的二乙烯亞胺溶液，注射18_22g小白鼠，觀察10d， 記錄死亡數(shù)和存活數(shù)。確定0. 2% 二乙烯亞胺注射0. 2ml及0. 02% 二乙烯亞胺0. 4ml為安 全劑量。試驗(yàn)例2本發(fā)明豬細(xì)小病毒病滅活苗的免疫效果試驗(yàn)按照實(shí)施例2的制備方法連續(xù)生產(chǎn)3批疫苗，對(duì)10276頭豬(多數(shù)為初產(chǎn)母豬) 進(jìn)行了疫苗接種實(shí)驗(yàn)。以免疫劑量為豬肌肉注射2ml/頭，一次接種滅活疫苗，現(xiàn)地免疫期 可達(dá)6個(gè)月以上，說(shuō)明該疫苗具有良好的免疫原性。以使用劑量接種2ml/頭，超劑量接種10ml/頭，未發(fā)現(xiàn)任何異常反應(yīng)。取試制的 疫苗接種后備母豬、妊娠豬未見(jiàn)免疫對(duì)生殖功能有任何影響，配種、妊娠、產(chǎn)仔均正常。證明 疫苗安全性良好。
權(quán)利要求
一株分離的豬細(xì)小病毒L株，其微生物保藏號(hào)是CGMCC No.3352。
2.權(quán)利要求1所述的豬細(xì)小病毒L株在制備預(yù)防或治療細(xì)小病毒病疫苗中的用途。
3.一種預(yù)防或治療細(xì)小病毒病滅活疫苗，含有有效量的權(quán)利要求1所述的豬細(xì)小病毒 L株的抗原液和佐劑。
4.一種制備權(quán)利要求1所述豬細(xì)小病滅活疫苗的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的 豬細(xì)小病毒L株，得到豬細(xì)小病毒抗原液；將豬細(xì)小病毒抗原液滅活；濃縮；分別配制油相 和水相，將水相和油相混合在一起后乳化，即得。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于用二乙烯亞胺滅活豬細(xì)小病毒抗原液。
6.按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于以終末濃度0.02wt%二乙烯亞胺溶液滅 活豬細(xì)小病毒抗原液。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于以終末濃度0.02wt%二乙烯亞胺溶液在 30°C，lOOr/min，氣浴振蕩的條件下，滅活豬細(xì)小病毒抗原液72h。
8.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述油相按照下述方法制備得到注射用 白油94份、司本-80 6份和硬脂酸鋁1.5份混合在一起，配制得到油相；所述水相按照下述 方法制備得到96ml滅活后的豬細(xì)小病毒抗原液中加入4ml吐溫_80，加入硫柳汞至終濃度 為0.01wt% ；配制得到水相。
9.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于將所述水相和油相按照4 1.5的體積 比例混合在一起后進(jìn)行乳化。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了豬細(xì)小病毒L株及在制備豬細(xì)小病毒病滅活疫苗中的用途。本發(fā)明所分離毒株的微生物保藏號(hào)是CGMCC No.3352。該毒株與NADL-2株及China株具有極高的同源性、保持高的繁殖力，病毒穩(wěn)定。應(yīng)用二乙烯亞胺滅活該病毒的抗原液，加入油佐劑制得雙向油乳劑滅活苗；用所制備的滅活疫苗對(duì)10276頭豬(多數(shù)為初產(chǎn)母豬)進(jìn)行了疫苗接種實(shí)驗(yàn)，免疫劑量為豬肌肉注射2ml/頭，一次接種滅活疫苗，現(xiàn)地免疫期可達(dá)6個(gè)月以上。超劑量接種10ml/頭，單劑量3次重復(fù)接種后，均未發(fā)現(xiàn)任何異常反應(yīng)，說(shuō)明本發(fā)明滅活疫苗具有良好的免疫原性及安全性。
文檔編號(hào)A61K39/23GK101851609SQ201010110218
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年2月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月2日
發(fā)明者任德強(qiáng), 吳金, 崔艷麗, 張智明, 張立恒, 戴秀莉, 楊萬(wàn)秋, 柴華, 潘興廣, 胡瑛瑛, 藏玉婷 申請(qǐng)人:哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司