專利名稱：一種人骨肉瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人骨肉瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
早在5000年前的古埃及木乃伊上，醫(yī)學(xué)研究人員就發(fā)現(xiàn)了骨肉瘤的存在 (Marina N，etal. Biology and therapeutic advances for pediatric osteosarcoma. 0ncologist2004;9(4) :422-41)。直至現(xiàn)在，骨肉瘤是兒童及青少年中最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤。尤其在20歲以前，骨肉瘤患者占到所有惡性骨腫瘤患者的近60% (Saeter G, Kloke 0, JelicS, et al. ESMO Minimum Clinical Recommendations for diagnosis, treatment and follow-up ofosteosarcoma. Ann Oncol. 2005 ； 16Suppl l:i71_2),任何年齡均可發(fā)病，但是75%的骨肉瘤患者年齡在10 25歲。男性略多于女性，比例約為 1.5 I0通常，80%至90%的骨肉瘤發(fā)生在生長迅速骨骼的干骺段，包括股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端和肱骨近端。自1970年以來，尤其是隨著術(shù)前術(shù)后輔助化療的廣泛應(yīng)用，骨肉瘤的診療取得了很大進(jìn)展，但目前臨床上骨肉瘤的診療現(xiàn)狀仍不能令人滿意，這一原因首先在于骨肉瘤極易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，之前相關(guān)文獻(xiàn)報道，如果在僅行手術(shù)切除治療，骨肉瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率可達(dá)80%，大多發(fā)生在術(shù)后3-6個月之內(nèi)(Saeter G，Kloke 0，Jelic S，et al. ESMO Minimum ClinicalRecommendations for diagnosis, treatment and follow-up of osteosarcoma. Ann Oncol. 2005 ； 16 Suppl 1 :i71_2)；其次在于骨肉瘤對化療的耐藥性，近年來骨肉瘤的化療總體有效率仍然徘徊在60%左右，而制約骨肉瘤化療療效的一個主要原因就是骨肉瘤細(xì)胞對化療的耐藥性。而在臨床上，化療已成為骨肉瘤綜合治療中不可缺少的一種手段。骨肉瘤對化療藥物的耐藥性分為內(nèi)在耐藥和獲得性耐藥兩類。前者是腫瘤細(xì)胞在治療的初始階段即對多種抗腫瘤藥物無明顯反應(yīng)；后者在化療初期效果較好， 但經(jīng)過若干療程后，腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物產(chǎn)生了耐藥性。與其他腫瘤不同，骨肉瘤對化 ？T 1^^ ￠{41 (Marina N, et al. Biology and therapeutic advances for pediatric osteosarcoma. Oncologist 2004 ；9 (4) :422-41)，這無疑進(jìn)一步加大了臨床上治療的難度。以上問題的解決都需要研究人員對骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制做出更加深入的探索，從而闡明相關(guān)分子機(jī)制，為骨肉瘤的治療提供有效的靶點，進(jìn)而最終改善骨肉瘤患者的預(yù)后。為了進(jìn)一步探討骨肉瘤發(fā)病學(xué)所涉及的機(jī)制，近年來在骨肉瘤研究領(lǐng)域，建立相應(yīng)的腫瘤動物模型，探索在動物體內(nèi)腫瘤發(fā)生和發(fā)展規(guī)律，進(jìn)而尋求切實有效的預(yù)防和治療措施，成為諸多研究者的選擇，建立動物腫瘤模型有動物自發(fā)腫瘤、物理化學(xué)手段誘發(fā)腫瘤以及移植性腫瘤三種方法。前二者對于實驗動物的品系、實驗環(huán)境和參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化要求嚴(yán)格且周期較長，普遍開展有一定困難，且難以做到和人的腫瘤在組織學(xué)、放射學(xué)和生物學(xué)特性上的完全一致性。而移植性動物腫瘤模型具有生物學(xué)特性穩(wěn)定、生長一致性、實驗周期短、可操作性可重復(fù)性好等優(yōu)點，是目前較為常用的造模方法(Goorin AM, Schwartzentruber DJ, Devidas Μ. et al. Presurgical chemotherapy compared withimmediatesurgery and adjuvant chemotherapy for nonmetastatic osteosarcoma Pediatric OncologyGroup Study POG-8651.J Clin Oncol. 2003Apr 15 ；21 (8) 1574-80)。尤其是免疫抑制動物如裸鼠的應(yīng)用，使得研究者得以廣泛開展異體移植，即將瘤塊或細(xì)胞接種于裸鼠皮下，使腫瘤生長能模擬人惡性腫瘤成瘤后的過程，成瘤率高，成瘤時間均一，瘤體大小和重量容易測量，容易進(jìn)行基礎(chǔ)和臨床研究，是目前研究最廣泛的動物模型。而建立移植性動物腫瘤模型自然離不開骨肉瘤細(xì)胞株的幫助，現(xiàn)在已經(jīng)有部分商品化的骨肉瘤細(xì)胞株如MG-63、Saos-2、U2-0S、UOS等在市場上供應(yīng)，為研究人員提供了良好的支持平臺。但與其他腫瘤相比，目前骨肉瘤細(xì)胞株的生物性狀多樣性仍顯不足，這大大限制了骨肉瘤發(fā)病學(xué)分子機(jī)制的研究(Bacci G,Longhi A5Fagioli F. et al. Adjuvantand neoadjuvant chemotherapy for osteosarcoma of the extremities :27year experience atRizzoli Institute, Italy. Eur J Cancer. 2005 Dec ；41 (18) :2836-45. Epub 2005Nov 17 ；Bacci G,Ferrari S,Mercuri M,et al. Neoadjuvant chemotherapy for osteosarcoma of the extremities inpatients aged 41_60years :outcome in 34cases treated with adriamycin,cisplatinum andifosfamide between 1984and 1999. Acta Orthop. 2007Jun ； 78(3) :377-84),此外，這些骨肉瘤細(xì)胞株的生物學(xué)特性與臨床上骨肉瘤的生物學(xué)性狀相比存在一定差異，尤其是在原發(fā)耐藥和高轉(zhuǎn)移潛能這兩個方面，目前鮮有同時具備以上兩種生物學(xué)特性骨肉瘤細(xì)胞株建系的報道，而原發(fā)耐藥和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移恰恰是目前骨肉瘤治療中兩個個無法回避的瓶頸問題。正因為如此，不少研究者致力于以手術(shù)方式從骨肉瘤患者身上取下新鮮瘤體組織標(biāo)本進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，并完成原代細(xì)胞株建株，對骨肉瘤的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期在骨肉瘤的研究上取得突破(Bacci G, Longhi A, Fagioli F. et al. Adjuvant and neoadjuvantchemotherapy for osteosarcoma of the extremities 27 year experience at Rizzoli Institute, Italy. Eur J Cancer. 2005 Dec ；41 (18) 2836-45.Epub 2005 Nov 17 ；Bacci G, Ferrari S, Mercuri M, etal. Neoadjuvant chemotherapy for osteosarcoma of the extremities in patients aged 41—60 years outcome in 34 cases treated with adriamycin,cisplatinum and ifosfamide between 1984 andl999. Acta Orthop. 2007 Jun ；78 (3) :377-84 ；Bacci G, Ferrari S, Longhi A, Picci P, et al. Highdose ifosfamide in combination with high dose methotrexate, adriamycin and cisplatin in theneoadjuvant treatment of extremity osteosarcoma preliminary results of an Italian SarcomaGroup/Scandinavian Sarcoma Group pilot study. J Chemother,2002 Apri ； 14 (2) :198-206)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對現(xiàn)有的人骨肉瘤細(xì)胞株存在的生物多樣性低，與臨床上骨肉瘤的生物學(xué)性狀相差較大的不足，提供一種新的人骨肉瘤細(xì)胞株及其用途。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是一種人骨肉瘤細(xì)胞，其保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC-C201002。本發(fā)明還提供如上所述的人骨肉瘤細(xì)胞的子代細(xì)胞。
本發(fā)明還提供如上所述的人骨肉瘤細(xì)胞的用途，用于在哺乳動物中產(chǎn)生骨肉瘤。 所述的哺乳動物優(yōu)選裸鼠。所述的裸鼠優(yōu)選BALB/c-nu/nu裸鼠。所述的骨肉瘤較佳的是軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤。本發(fā)明還提供一種篩選治療骨肉瘤的候選藥物的方法，包括以下步驟將測試化合物施用于動物模型，施用后導(dǎo)致骨肉瘤癥狀改善或治愈的測試化合物就是治療骨肉瘤的候選化合物，其中所述的動物模型具有如上所述的人骨肉瘤細(xì)胞所導(dǎo)致的骨肉瘤。所述的動物模型優(yōu)選裸鼠。所述的裸鼠優(yōu)選BALB/c-nu/nu裸鼠。在施用步驟中，將測試化合物的施用方式優(yōu)選局部施用于骨肉瘤病灶處、或口服給藥。本發(fā)明中，上述優(yōu)選條件在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實例。本發(fā)明除特別說明之外，所用的百分比都是質(zhì)量百分比。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下(1)本發(fā)明的人骨肉瘤細(xì)胞株性狀穩(wěn)定，可穩(wěn)定多次傳代。(2)本發(fā)明的骨肉瘤細(xì)胞株具有臨床上骨肉瘤的生物學(xué)性狀，尤其是同時具備原發(fā)耐藥和高轉(zhuǎn)移潛能的特性。對于解決原發(fā)耐藥和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移這兩個目前骨肉瘤治療中無法回避的瓶頸問題，具有重要意義，是人骨肉瘤基礎(chǔ)研究和臨床前期應(yīng)用的理想細(xì)胞株。本發(fā)明的人骨肉瘤細(xì)胞株，于2010年2月2日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)(武漢，中國)，保藏藏號為CCTCC-C201002，培養(yǎng)物名稱為人骨肉瘤細(xì)胞株SF-86。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1 光鏡下原代細(xì)胞培養(yǎng)至第5代時細(xì)胞圖，黑色箭頭所指部分即為成纖維細(xì)胞中的散在異形細(xì)胞集落。圖2 光鏡下原代細(xì)胞培養(yǎng)至第30代時細(xì)胞圖。圖3 光鏡下原代細(xì)胞培養(yǎng)至第90代時細(xì)胞圖。圖4 光鏡下細(xì)胞株培養(yǎng)至90代以后行細(xì)胞爬片HE染色圖，其間可見部分細(xì)胞呈集落生長(黑色箭頭)，并見多核巨細(xì)胞(藍(lán)色箭頭)。圖5 原代細(xì)胞株周期分布圖。圖6 =MTT法測定細(xì)胞生長曲線。圖7 細(xì)胞懸液法建立移植瘤體積生長曲線與時間關(guān)系。圖8 細(xì)胞懸液法成瘤后第4周裸鼠荷瘤情況。圖9 細(xì)胞懸液法成瘤后第5周裸鼠荷瘤情況，可見腫瘤表面血管極為豐富。圖10 荷瘤裸鼠肝臟表面的可疑病灶(黑色箭頭)，后經(jīng)病理檢查證實為骨肉瘤肝轉(zhuǎn)移灶。圖11 荷瘤裸鼠肺臟表現(xiàn)的可疑病灶(黑色箭頭)(后經(jīng)病理檢查證實為骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移灶)。圖12 移植瘤切除后巨體觀。圖13 移植瘤切除后剖面巨體觀。
圖14 移植瘤行石蠟包埋后HE染色切片光鏡下可見大量肉瘤樣異形細(xì)胞生長， 細(xì)胞間可見大量類骨質(zhì)及軟骨(黑色箭頭)形成。圖15 細(xì)胞懸液法建立移植瘤免疫組化，Bcl-2陽性。圖16 細(xì)胞懸液法建立移植瘤免疫組化，⑶99陽性。圖17 細(xì)胞懸液法建立移植瘤免疫組化，⑶117陰性。圖18 細(xì)胞懸液法建立移植瘤免疫組化，Des陰性。圖19 細(xì)胞懸液法建立移植瘤免疫組化，Κ 67陽性。圖20 細(xì)胞懸液法建立移植瘤免疫組化，MG陰性。圖21 細(xì)胞懸液法建立移植瘤免疫組化，P53陽性。圖22 細(xì)胞懸液法建立移植瘤免疫組化，SMA陽性圖23 細(xì)胞懸液法建立移植瘤免疫組化，Vim陽性。圖M 組織塊接種法后2周末，可見移植瘤(左側(cè)背部皮膚)右方出現(xiàn)了明顯的皮下轉(zhuǎn)移灶(黑色箭頭)，病理證實為皮下轉(zhuǎn)移瘤。圖25 組織塊接種法建立裸鼠移植瘤，處死裸鼠時見肝臟表面可疑病灶，經(jīng)病理學(xué)證實為骨肉瘤肝轉(zhuǎn)移灶(黑色箭頭)。圖沈組織塊接種法建立裸鼠移植瘤，處死裸鼠時見肺臟表面可疑病灶，經(jīng)病理學(xué)證實為骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移灶(黑色箭頭)。圖27 組織塊法移植瘤體積生長曲線與時間關(guān)系。圖28 移植瘤行石蠟包埋后HE染色切片光鏡下可見大量肉瘤樣異形細(xì)胞生長， 細(xì)胞間可見大量類骨質(zhì)及軟骨(黑色箭頭)形成，符合典型的骨肉瘤病理學(xué)特征。圖四組織塊接種法建立移植瘤免疫組化，Bcl-2陽性。圖30 組織塊接種法建立移植瘤免疫組化，⑶99陽性。圖31 組織塊接種法建立移植瘤免疫組化，⑶117陰性。圖32 組織塊接種法建立移植瘤免疫組化，Des陰性。圖33 組織塊接種法建立移植瘤免疫組化，Κ 67陽性。圖34 組織塊接種法建立移植瘤免疫組化，MG陰性。圖35 組織塊接種法建立移植瘤免疫組化，p53陽性。圖36 組織塊接種法建立移植瘤免疫組化，SMA陽性。圖37 組織塊接種法建立移植瘤免疫組化，Vim陽性。
具體實施例方式本發(fā)明采用原代組織塊培養(yǎng)法對新鮮骨肉瘤手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，待有細(xì)胞暈生長后通過選擇性消化以去除成纖維細(xì)胞，在體外傳代至少達(dá)80代以上以完成初步建系。對所建立的原代細(xì)胞株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞爬片HE染色、細(xì)胞周期檢查、生長曲線測定、分裂指數(shù)及貼壁率測定、MTT藥敏實驗測定、異種移植實驗，并將采用瘤塊/細(xì)胞接種法所產(chǎn)生的移植瘤進(jìn)行HE染色及免疫組化測定，與原發(fā)腫瘤標(biāo)本進(jìn)行對比以確定是否完整保留了原發(fā)腫瘤的特性。本發(fā)明經(jīng)90次體外傳代后，初步建立了高度原發(fā)耐藥的原代骨肉瘤細(xì)胞株，且經(jīng)荷瘤動物模型證實該細(xì)胞株具備高度轉(zhuǎn)移潛能，而且由于該細(xì)胞株的耐藥和轉(zhuǎn)移特性為原發(fā)具有，而不是通過誘導(dǎo)獲得，較采用誘導(dǎo)方式獲得的耐藥表型更加穩(wěn)定，而且也更符合臨床上骨肉瘤耐藥的特點。為今后進(jìn)一步探索骨肉瘤病因?qū)W、尤其是耐藥和轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制提供了理想的研究樣本。本發(fā)明中，篩選治療骨肉瘤的候選藥物的方法包括以下步驟(1)將所述的骨肉瘤細(xì)胞或其子代細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，接種于哺乳動物皮下，進(jìn)行飼養(yǎng)，獲得人骨肉瘤動物模型；或者，上述接種的哺乳動物飼養(yǎng)直至接種區(qū)皮下出現(xiàn)移植瘤，取下移植瘤，切碎，接種于另一哺乳動物皮下，飼養(yǎng)，獲得人骨肉瘤動物模型。(2)將測試化合物施用于動物模型，施用后導(dǎo)致骨肉瘤癥狀改善或治愈的測試化合物就是治療骨肉瘤的候選化合物。較佳的使用對照實驗。采用細(xì)胞懸液注射或瘤組織塊移植來建立動物模型。細(xì)胞懸液注射成瘤對瘤細(xì)胞濃度要求較高，在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，以IO5Ail濃度進(jìn)行皮下注射，5只裸鼠中僅1只成瘤，而采用5X 107/ml濃度后，10只裸鼠均形成了皮下移植瘤。本發(fā)明采用組織塊接種法成瘤率較細(xì)胞懸液法為高，且成瘤后瘤體生長速度也更快。下面用實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所述的“室溫”是指進(jìn)行試驗的操作間的溫度，一般為15°C。實施例1原代骨肉瘤細(xì)胞株SF-86的建立與生物學(xué)特性鑒定1.實驗材料1. 1原代細(xì)胞組織來源及細(xì)胞培養(yǎng)所需主要試劑組織來源男性17歲患者，2008年5月因左股骨上段骨肉瘤行左大腿高位截肢術(shù)，病理診斷成骨肉瘤(軟骨母細(xì)胞型)，術(shù)后按骨肉瘤術(shù)后輔助化療常規(guī)予術(shù)后輔助化療，08年6月發(fā)現(xiàn)右上臂，左臀部出現(xiàn)腫塊，于08年6月行右上臂，左臀部腫塊切除，術(shù)后病理轉(zhuǎn)移性骨肉瘤，免疫組化p53(+)、Vim(+)、Des (-)、SMA (-)、Ki67(+)、CDl 17(-)、 ⑶99(+)、Bcl-2 (+) ,MG (-),08年7月發(fā)現(xiàn)雙肺內(nèi)出現(xiàn)多發(fā)轉(zhuǎn)移灶，同時08年8月又發(fā)現(xiàn)右側(cè)頭皮下軟組織轉(zhuǎn)移灶。本實驗中原代細(xì)胞培養(yǎng)組織來源取材自08年6月行右上臂腫塊切除術(shù)中取下的軟組織轉(zhuǎn)移灶。培養(yǎng)液為含有青霉素(100IU/mL)及鏈霉素(100yg/mL) 雙抗的DMEM培養(yǎng)液，添加20%胎牛血清后-20°C保存。1. 2實驗中主要化學(xué)藥品與試劑Saos-2骨肉瘤細(xì)胞株及MG_63細(xì)胞株，由美國ATCC收錄，購自上海中科院細(xì)胞所； 人成骨肉瘤耐MTX細(xì)胞株(Saos-2/MTX 4. 4)，由上海市第六人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科實驗室于 2007年成功誘導(dǎo)培育建系(王建軍；姚陽；耐甲氨蝶呤人骨肉瘤細(xì)胞株建立及其生物學(xué)特性；腫瘤，2007年08期)；胎牛血清，購自杭州四季清生物工程材料有限公司；含有雙抗的 DMEM培養(yǎng)液及RPMI-1640培養(yǎng)液，購自美國GIBCO公司；胰蛋白酶，購自美國Amresco公司； 四甲基偶氮唑鹽(MTT)，購自美國SIGMA公司；二甲基亞砜(DMSO)，碘化丙啶(propidium iodide, PI), RNA裂解酶，購自美國SIGMA公司；MTT藥敏實驗中所用的化療藥物由上海市第六人民醫(yī)院腫瘤藥敏實驗室所提供。1. 3實驗中主要儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國Thermo電子器械公司；超凈工作臺，上海上凈凈化設(shè)備廠；
IX-70倒置相差顯微鏡及配備拍照系統(tǒng)，日本Olympus公司；電熱恒溫水槽DK-600，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；臺式離心機(jī)TGL-16B，上海安亭科學(xué)儀器廠；小型臺式高速離心機(jī)，德國Eppendorf ；流式細(xì)胞儀FACStarPLUS，美國B. D公司；電子天平，JA1003N,上海精密科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，DHG型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；超低溫冰箱MDF-293型，日本SANYO公司；器皿及耗材96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶Q5cm2及75cm2)、細(xì)胞計數(shù)板、蓋玻片、 Eppendorf移液器、離心管(15ml)、凍存管(2ml) 02.實驗方法2. 1SF-86細(xì)胞株的建立與培養(yǎng)腫瘤標(biāo)本用Hanks液沖洗數(shù)次。剪成直徑Imm左右的小塊后，再反復(fù)沖洗，貼壁接種于培養(yǎng)瓶底，底面朝上，同時加入含體積分?jǐn)?shù)為20%胎牛血清及含有青霉素(100IU/mL) 及鏈霉素(ΙΟΟμ g/mL)雙抗的DMEM培養(yǎng)液5ml，置37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，池后緩慢將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)。 4d后見有細(xì)胞暈生長，定期半量換液。1個月后，待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶時采用選擇性胰酶消化法傳第1代，此時細(xì)胞處于一個生長相對緩慢期，半個月后再用胰酶消化法傳第2代。至第 8代時，細(xì)胞生長速度逐漸加快，鏡下見異形細(xì)胞比例逐漸增多，漸迅速生長，以后均采用選擇性傳代法，每4 5天傳代1次，至08年10月傳至第20代時，細(xì)胞生長速度已較前明顯加快，鏡下見異形細(xì)胞已取得明顯生長優(yōu)勢，此時不再采用選擇性胰酶消化傳代，僅用常規(guī)胰酶消化，并逐步將培養(yǎng)液中的胎牛血清比例減低至10%，每2-3天傳代一次。該細(xì)胞株命名為人骨肉瘤細(xì)胞株SF-86。2. 2細(xì)胞培養(yǎng)凍存MG-63及SF-86 取對數(shù)期細(xì)胞，棄培養(yǎng)瓶中的舊液，加入0. 25%胰蛋白酶Iml消化后，加入培養(yǎng)液終止消化。反復(fù)吹打貼壁細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，用滴管將懸液移至離心管中，lOOOr/min離心5min，棄上清液，加入細(xì)胞凍存液(含10% DMSO的細(xì)胞培養(yǎng)液，兩者體積之比為1 9) 1.8ml，重懸細(xì)胞，使凍存液中細(xì)胞終濃度為5X IO6個/ml 5X IO7個/ ml。用吸管將其移入凍存管Oml)中。凍存管標(biāo)記后，4°C放置30分鐘，-20°C放置30分鐘，-40°C放置30分鐘，-80°C放置30分鐘，最后移入液氮中保存。Saos-2及Mos-2/MTX 4. 4 培養(yǎng)方法同上，僅培養(yǎng)液用含10 %胎牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液。2. 3細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)蘇從液氮中取出細(xì)胞凍存管，迅速置于37°C水浴箱內(nèi)，并快速晃動，直到細(xì)胞凍存液完全融解。用吸管將細(xì)胞懸液移入離心管，lOOOr/min離心5min，棄上清液。再此加入DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，離心，棄上清液。然后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液后重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移至培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37°C含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液。Saos-2及Mos-2/MTX 4. 4 培養(yǎng)復(fù)蘇方法同上，僅培養(yǎng)液用含10%胎牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液。2. 4光鏡下SF-86細(xì)胞形態(tài)觀察
在倒置相差顯微鏡下觀察SF-86原代細(xì)胞株建株過程中細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，并照像。 2. 5SF-86細(xì)胞爬片，染色(1)爬片用玻片的制備選用一般的蓋玻片，先浸入洗滌液中約半小時，洗凈后置于濃硫酸中浸泡并過夜， 第二天先用自來水沖洗20遍，再用三蒸水沖洗3遍，用綢布搽拭涼干。置于已消毒過的玻璃培養(yǎng)皿中烘干，進(jìn)行高壓消毒。(2)細(xì)胞爬片取對數(shù)期細(xì)胞，棄培養(yǎng)瓶中的舊液，加入0.25%胰蛋白酶Iml消化后，加入培養(yǎng)液終止消化。反復(fù)吹打貼壁細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞接種密度至lX104/ml。細(xì)胞爬片選用六孔培養(yǎng)板，將蓋玻片置于孔中，往蓋玻片上滴加1000個左右細(xì)胞(ΙΟΟμ 1，再加入約 500 μ 1培養(yǎng)液，混勻)而后在蓋玻片周圍滴入8滴PBS，保持培養(yǎng)環(huán)境濕潤。置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)48小時，待鏡下見細(xì)胞在蓋玻片上生長至80%左右時，取玻片進(jìn)行HE染色。固定細(xì)胞爬片后用4%的多聚甲醛固定20分鐘后，PBS洗2遍后進(jìn)行染色。染色用中性樹膠把無細(xì)胞面和載玻片固定以便于染色。先置于蘇木素中1 1. 5 分鐘；自來水洗數(shù)遍，洗去蘇木素和浮色，放入分化液片刻以溶解蘇木素，放入伊紅1 2分鐘；而后按80%酒精2 3分鐘；95%酒精12 3分鐘；95%酒精115分鐘；100%酒精15 分鐘；100%酒精I(xiàn)IlO分鐘；二甲苯IlO分鐘；二甲苯IIlO分鐘；將玻片細(xì)胞面和載玻片用中性樹膠封片。最后拍照。2. 6SF-86細(xì)胞株細(xì)胞分裂指數(shù)測定過程同細(xì)胞爬片培養(yǎng)，消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接至內(nèi)含蓋玻片的培養(yǎng)皿中。在(X)2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，使細(xì)胞長在蓋片上，取出蓋片，按下列順序操作PBS漂洗3分鐘一甲醇冰醋酸=3 1固定液中固定30分鐘一Giemsa液染色10分鐘一自來水沖洗。蓋片晾干后反扣在載玻片上，鏡檢。以公式分裂指數(shù)=分裂細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)X 100%進(jìn)行計算，取三片蓋玻片進(jìn)行計算，取平均值。2. 7SF-86細(xì)胞株細(xì)胞貼壁率測定取對數(shù)生長期細(xì)胞，以IX IO6個/ml進(jìn)行接種(接種于25cm2培養(yǎng)瓶中)，分別于接種4小時、8小時后消化已貼壁細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡下進(jìn)行計數(shù)，計算貼壁率，實驗重
復(fù)三次。2. 8SF-86細(xì)胞株細(xì)胞倍增時間測定采用Patterson公式計算細(xì)胞在對數(shù)生長期的倍增時間Td = Tlg2/lg(Nt/N0)， Td 倍增時間(h) ；T 細(xì)胞數(shù)由NO增至Nt所用時間；N 細(xì)胞數(shù)。實驗重復(fù)三次。2. 9SF-86細(xì)胞株細(xì)胞周期測定(1)流式細(xì)胞術(shù)PI染色測定細(xì)胞周期原理PI,即碘化丙錠，可以與細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA結(jié)合，采用RNA抑制劑將RNA消化后，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測到的與DNA結(jié)合的PI的熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。由于細(xì)胞周期各時相的DNA含量不同，通常正常細(xì)胞的G1/G0期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量 (2N)，而G2/M期具有四倍體細(xì)胞的DNA含量0N)，而S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。因此，通過流式細(xì)胞術(shù)PI染色法對細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測時，可以將細(xì)胞周期各時相區(qū)分為G1/G0期，S期和G2/M期，并可通過特殊軟件計算各時相的百分率。由于PI不能通過細(xì)胞膜完整的細(xì)胞(如活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞)，在標(biāo)本制備時，必須先用乙醇或其他破膜劑增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，才能使PI進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞內(nèi)的核酸結(jié)合。(2)流式細(xì)胞術(shù)PI染色測定細(xì)胞周期方法取對數(shù)生長期細(xì)胞，用胰酶消化法收集IX IO6個細(xì)胞，PBS洗兩遍(800轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘)，棄上清，振蕩，重懸，加入70%預(yù)冷乙醇中，吹打均勻，4°C固定過夜。離心(800 轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘)棄去上清，冰PBS液洗兩次并重懸，吹打時注意輕柔，防止出現(xiàn)過多細(xì)胞碎片干擾檢測。移入流式細(xì)胞儀離心管中，加入終濃度為100μ g/ml的RNase酶，37度水浴中處理30分鐘；加入終濃度為50 μ g/ml的PI液，避光4度孵育30分鐘，之后用300 目尼龍網(wǎng)過濾，用cloter XL型流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞株周期分布，實驗重復(fù)三次。2. 10MTT法測定SF-86細(xì)胞生長曲線及耐藥性(1)藥敏實驗中藥物的配制化療藥物儲存液的配制分別用無血清的DMEM培養(yǎng)液及RPMI-164培養(yǎng)液融解藥物MTX (甲氨蝶呤)、DDP (順鉬)、PTX (紫杉醇)、EPI (表阿霉素)、IFO (異環(huán)磷酰胺)、THP (吡柔比星)；配置成1000Χ血漿峰濃度(peak serum concentration, PSC)儲存液，_20°C保存。每月重新配制一次，使用前用對應(yīng)培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)濃度。各藥物的血漿峰濃度IPSC(μ g/ml)MTX 10 μ g/ml ；DDP 100 μ g/ml ；PTX 46 μ g/ml ；EPI 50 μ g/ml ； IFO 2220 μ g/ml ； THP8 μ g/ml (以上數(shù)據(jù)由上海市第六人民醫(yī)院腫瘤藥敏實驗室提供)。(2)MTT法藥敏及MTT法測定細(xì)胞生長曲線實驗原理四唑藍(lán)(microculture tetrazolium，商品名噻唑藍(lán)，簡稱MTT)是一種能接受氫原子的染料。該物質(zhì)能夠進(jìn)入活細(xì)胞內(nèi)，并在線粒體內(nèi)琥珀酸脫氫酶的作用下使外源性的 MTT還原為難溶性的紫色結(jié)晶物甲簪(Formazan)沉積在細(xì)胞中。因為死細(xì)胞的線粒體沒有這個功能，故不能形成紫色結(jié)晶?；瘜W(xué)試劑二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲簪，最后所產(chǎn)生的藍(lán)紫色液體用酶標(biāo)儀在一定波長下測出其吸光光度值，從而間接地反映出活細(xì)胞的數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量(以吸光光度值表示)與活細(xì)胞數(shù)呈正比。利用此原理可以測定抗腫瘤藥物處理后細(xì)胞的存活率，從而預(yù)測腫瘤細(xì)胞對某種藥物的敏感程度；此外亦可以利用此原理測定SF-86細(xì)胞的生長曲線。(3)實驗方法MTT法測定細(xì)胞周期接種細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔5 X IO3個細(xì)胞(已行預(yù)實驗測定)接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μ 1，每板接種8孔，共接種8塊96孔板。同時每板均設(shè)與試驗孔平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照。培養(yǎng)細(xì)胞將培養(yǎng)板放入CO2孵箱，在37°C、5% CO2及飽和濕度條件下，進(jìn)行培養(yǎng)。呈色自接種時算起，每隔M小時取出一塊96孔板，每孔加入MTT 20 μ L，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時，然后用移液器小心吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μ L，溶解結(jié)晶成淡藍(lán)紫色液體，輕搖96孔板lOmin，使結(jié)晶溶解充分。用flfellscan MK3型酶標(biāo)儀在570nm波長下測每孔吸光光度值。測定8孔后計算吸光光度值均值，實驗一共重復(fù)3次。
比色選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，紀(jì)錄結(jié)果，空白孔調(diào)零。以時間為橫軸，光吸收值(A)為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。MTT法藥敏實驗測定SF-86多藥耐藥表型設(shè)定0. 001XPPC、0. 01XPPC、0. 1XPPC、1XPPC、5XPPC、10XPPC、100XPPC 七個梯度濃度，用MTT法計算不同藥物在7種濃度下對SF-86、MG-63、Saos_2、Saos-2/MTX 4. 4四株細(xì)胞株藥物的腫瘤細(xì)胞體外抑制率(ID)，ID = (1-用藥孔OD值/無藥對照孔OD 值)X 100%，并據(jù)此計算各種藥物對三株細(xì)胞株的細(xì)胞50%抑制率藥物劑量(IC50)。具體方法SF-86及MG-63細(xì)胞株用0. 25%胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細(xì)胞，用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以1 X IO4個/mL的細(xì)胞懸液濃度將細(xì)胞懸液接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔體積100 μ L，置于37°C含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M小時。M小時后觀察，細(xì)胞形態(tài)佳、貼壁牢。根據(jù)實驗分組加入工作濃度藥物，每孔100 μ L。同時設(shè)置有細(xì)胞不加藥物的對照組和沒有細(xì)胞加藥的空白組。繼續(xù)培養(yǎng)M小時后，每孔加入MTT 20 μ L， 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時，然后用移液器小心吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μ L，溶解結(jié)晶成淡藍(lán)紫色液體，輕搖96孔板lOmin，使結(jié)晶溶解充分。用flfellscan MK3型酶標(biāo)儀在570nm 波長下測每孔吸光光度值。每個藥物濃度重復(fù)3孔，實驗一共重復(fù)3次。Saos-2及&ios-2/MTX 4. 4細(xì)胞株除使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，加入工作濃度藥物時稀釋液應(yīng)與培養(yǎng)液相同外，其余同上。2. 11支原體污染檢查采用熒光染色法進(jìn)行支原體污染檢查，熒光染色用能與DNA特異性結(jié)合的熒光染料Hoechst 33258，可使支原體內(nèi)含有的DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。SF-86細(xì)胞培養(yǎng)中，每培養(yǎng)20代，將細(xì)胞接種蓋玻片上，在細(xì)胞未長滿前取出玻片，用不合酚紅的Hanks液漂洗一下，用1 3醋酸甲酵固定10分鐘，然后用生理鹽水漂洗。 置于用生理鹽水配濃度為50pg/ml的Hoechst 33258中染色10分鐘。染色后用蒸溜水洗 1-2分鐘。向細(xì)胞面滴加PH5. 5磷酸緩沖液數(shù)滴，然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下如見到散在于細(xì)胞同圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點即判定為支原體污染。對SF-86細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定前均行支原體污染檢測，無支原體污染方可進(jìn)行。3.實驗結(jié)果3. 1.光鏡下SF-86細(xì)胞形態(tài)觀察原代細(xì)胞培養(yǎng)至第5代時，光鏡下可見大量成纖維細(xì)胞，胞體較大，扁平梭形為主，形成單層后呈現(xiàn)放射狀，交叉排列，胞核呈卵圓形。部分成纖維細(xì)胞間可見散在異形細(xì)胞集落，表現(xiàn)為光鏡下形態(tài)不規(guī)則，生長形態(tài)較紊亂，與周圍生長走向均一的成纖維細(xì)胞差異明顯(圖1，黑色箭頭所指部分)。隨著選擇性消化傳代的進(jìn)行，光鏡下異形細(xì)胞的比例逐漸增多，至第30代時，光鏡下可見大量貼壁生長，體積中等，大小均勻，呈梭形或三角形， 細(xì)胞核較大，核仁清晰，生長形態(tài)紊亂、走向不一的異形細(xì)胞，形態(tài)上與MG-63、Mos-2骨肉瘤細(xì)胞形態(tài)類似，部分呈集落生長，未見成纖維細(xì)胞生長(圖幻。至第90代時光鏡下觀察， 細(xì)胞形態(tài)始終保持穩(wěn)定，未見成纖維細(xì)胞生長(圖幻。培養(yǎng)過程中鏡下細(xì)胞形態(tài)保持穩(wěn)定， 未見細(xì)菌、真菌、原蟲污染及其他細(xì)胞株交叉污染表現(xiàn)，凍存復(fù)蘇后，臺盼藍(lán)拒染活細(xì)胞在 90%以上。
3. 1. 2SF-86細(xì)胞爬片制備后HE染色觀察HE染色后光鏡下觀察，可見大量異型性細(xì)胞呈貼壁生長，呈上皮樣細(xì)胞排列，部分形成集落，極性較差，細(xì)胞質(zhì)嗜堿，核大且深染，核漿比例倒置，核染色質(zhì)較粗，核仁大，部分可見核分裂相，并可見多核瘤巨細(xì)胞(圖4)。3. 1. 3SF-86細(xì)胞分裂指數(shù)測定以公式分裂指數(shù)=分裂細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)X100%進(jìn)行計算，取三片蓋玻片進(jìn)行計算取平均值，該細(xì)胞株分裂指數(shù)為20. 36%。3. 1. 4SF-86細(xì)胞貼壁率測定取對數(shù)生長期細(xì)胞，以1 X IO6個/ml進(jìn)行接種(接種于25cm2培養(yǎng)瓶中)，4小時后貼壁率為35%，8小時后貼壁率為58%。3. 1. 5SF-86細(xì)胞倍增時間測定采用Patterson公式計算細(xì)胞在對數(shù)生長期的倍增時間Td = Tlg2/lg(Nt/N0)， Td 倍增時間(h) ；T 細(xì)胞數(shù)由NO增至Nt所用時間；N 細(xì)胞數(shù)。該細(xì)胞株倍增時間為27. 8 小時。3. 1. 6流式細(xì)胞儀測定SF-86細(xì)胞株周期運用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期結(jié)果顯示，該細(xì)胞株Gl期所占比例為61. 3%，G2期細(xì)胞所占比例為22. 0%，S期細(xì)胞所占比例為16. 7% (圖5)。3. 1. 7MTT法測定SF-86細(xì)胞生長曲線(見圖6)。3. 1. 8MTT法測定SF-86的多藥耐藥表型統(tǒng)計出由酶標(biāo)儀所測得的每個試驗組的OD平均值，以空白孔OD值調(diào)零，用公式 細(xì)胞抑制率(％ ) = (1-加藥組平均OD值/對照組平均OD值)X 100%，計算出相應(yīng)的細(xì)胞活性抑制率。結(jié)果見表1，可見該細(xì)胞株表現(xiàn)出對目前臨床上骨肉瘤常用化療藥物明顯的耐藥性。表1.與 Saos-2、MG-63、Saos-2/MTX 4. 4 相比 SF-86 的耐藥表型測定
權(quán)利要求
1.一種人骨肉瘤細(xì)胞，其特征在于，其保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC-C201002。
2.如權(quán)利要求1所述的人骨肉瘤細(xì)胞的子代細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的人骨肉瘤細(xì)胞的用途，其特征在于，用于在哺乳動物中產(chǎn)生骨肉瘤。
4.如權(quán)利要求3所述的人骨肉瘤細(xì)胞的用途，其特征在于，所述的哺乳動物是裸鼠。
5.如權(quán)利要求4所述的人骨肉瘤細(xì)胞的用途，其特征在于，所述的裸鼠是BALB/c-nu/ nu裸鼠。
6.如權(quán)利要求3所述的人骨肉瘤細(xì)胞的用途，其特征在于，所述的骨肉瘤是軟骨母細(xì)胞型骨肉瘤。
7.一種篩選治療骨肉瘤的候選藥物的方法，其特征在于，包括以下步驟將測試化合物施用于動物模型，施用后導(dǎo)致骨肉瘤癥狀改善或治愈的測試化合物就是治療骨肉瘤的候選化合物，其中所述的動物模型具有權(quán)利要求1所述的人骨肉瘤細(xì)胞所導(dǎo)致的骨肉瘤。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的動物模型是裸鼠。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的裸鼠是BALB/c-nu/nu裸鼠。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，在施用步驟中，將測試化合物的施用方式選自局部施用于骨肉瘤病灶處、或口服給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人骨肉瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用。該人骨肉瘤細(xì)胞株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NOC201002。該人骨肉瘤細(xì)胞株可用于在哺乳動物中產(chǎn)生骨肉瘤，制備骨肉瘤動物模型，可進(jìn)一步用于篩選治療骨肉瘤的候選藥物。本發(fā)明的人骨肉瘤細(xì)胞株性狀穩(wěn)定，可穩(wěn)定多次傳代。體外傳代自第30代至第90代性狀保持穩(wěn)定。本發(fā)明的骨肉瘤細(xì)胞株具有臨床上骨肉瘤的生物學(xué)性狀，尤其是同時具備原發(fā)耐藥和高轉(zhuǎn)移潛能的特性。對于解決原發(fā)耐藥和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移這兩個目前骨肉瘤治療中無法回避的瓶頸問題，具有重要意義，是人骨肉瘤基礎(chǔ)研究和臨床前期應(yīng)用的理想細(xì)胞株。
文檔編號A61K49/00GK102154209SQ20101011074
公開日2011年8月17日 申請日期2010年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月12日
發(fā)明者余文熙, 姚陽, 沈贊 申請人:余文熙, 姚陽, 沈贊