專利名稱：一種作為藥物載體的金納米顆粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于鉑類藥物載體技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及負(fù)載有鉑類藥物的金納米顆粒藥物載體及其制備方法。

背景技術(shù)：
根據(jù)《生物醫(yī)學(xué)工程雜志》(2004年二十一卷第三期，第495-497頁(yè))的文章所述，藥物載體是指能夠負(fù)載藥物并能改變藥物進(jìn)入體內(nèi)的方式和在體內(nèi)的分布、控制藥物的釋放速率并將藥物輸送到靶向器官的體系，它能夠有效降低藥物對(duì)正常組織的毒副作用，提高藥物的生物利用度。
2007年中華醫(yī)學(xué)會(huì)公布的數(shù)據(jù)顯示，惡性腫瘤已成為危害我國(guó)居民生命的各類疾病中的第一殺手，每年中國(guó)有200萬(wàn)人死于腫瘤。順鉑(Cisplatin，CDDP)是一個(gè)含鉑的抗腫瘤藥物，應(yīng)用范圍比較廣泛，但它的副作用很多，包括腎臟毒性、惡心、嘔吐，神經(jīng)毒性、耳毒性、禿頭癥以及電解質(zhì)紊亂，且使用時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)大部分病人都會(huì)對(duì)順鉑產(chǎn)生抗藥性，《自然綜述·癌癥》(2005年第5期第161頁(yè)到171頁(yè))的文章(Nature ReviewsCancer，2005，5161-171)認(rèn)為這些癥狀主要是由于藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用沒(méi)有選擇性，因此需要尋找新的辦法以改進(jìn)順鉑的治療。
美國(guó)化學(xué)會(huì)的雜志《化學(xué)材料》(Chemistry Material，2003，151957)介紹了一種用十六烷基三甲基溴化氨(CTAB)穩(wěn)定的金納米顆粒的方法，用CTAB作為軟性模板劑，采用種子生長(zhǎng)法制備的金納米顆粒，所得到的金納米顆粒是棒狀的，并且顆粒的尺寸是可控的，但尚未見(jiàn)到將它作為鉑類藥物載體應(yīng)用的報(bào)道?！痘瘜W(xué)與生物學(xué)》雜志(Chemistry&Biology，11557)報(bào)道了鉑類藥物的前體藥物為順鉑的前體藥物順式，順式，反式-二氨二氯二丁二酸合鉑的結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)用途，但至今尚未見(jiàn)到將它們負(fù)載到金納米顆粒上用于藥物運(yùn)輸應(yīng)用的報(bào)道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種作為鉑類藥物載體的金納米顆粒及其制備方法。
本發(fā)明的作為鉑類藥物載體的金納米顆粒，特征在于其中的透膜肽通過(guò)巰基以共價(jià)鍵結(jié)合在金納米顆粒的表面，且該透膜肽還通過(guò)氨基以酰氨鍵結(jié)合在鉑類藥物的前體藥物的羧基上； 所述透膜肽是序列中包含1個(gè)半胱氨酸和5到19個(gè)精氨酸的一段包含8個(gè)到20個(gè)氨基酸的肽； 所述鉑類藥物的前體藥物為順鉑的前體藥物或者為卡鉑的前體藥物或者為奧沙利鉑的前體藥物； 所述順鉑的前體藥物選自如下所列的化合物1或化合物2或化合物3；所述卡鉑的前體藥物選自化合物4或化合物5或化合物6；所述奧沙利鉑的前體藥物選自化合物7或化合物8或化合物9； 所述化合物1到化合物9的結(jié)構(gòu)式為
其中1≤n≤5。
本發(fā)明的作為鉑類藥物載體的金納米顆粒的制備方法，其特征在于采用如下步驟將金納米顆粒通過(guò)金與透膜肽的巰基以共價(jià)鍵結(jié)合上透膜肽，再通過(guò)透膜肽的氨基與鉑類藥物的前體藥物的羧基以共價(jià)鍵將鉑類藥物的前體藥物結(jié)合到透膜肽上，包括 第一步，透膜肽結(jié)合的金納米顆粒的制備 金納米種子溶液的制備將0.25～1mL的0.005～0.01M氯金酸加入到5～10mL的0.1～0.2M CTAB溶液中混合均勻，至溶液為棕黃色；加入0.5～1mL的0.01～0.02M的NaBH4溶液，快速攪拌2～20min，至溶液呈棕色；于30～50℃水浴中靜置2～20小時(shí)，備用； CTAB穩(wěn)定的金納米顆粒的制備先將5～10mL的0.1～0.2M CTAB和5～10mL的0.01～0.02M氯金酸在30～50℃水浴下用磁力攪拌器混合均勻；然后加入0.18～0.5mL的0.01～0.02M硝酸銀和0.2～0.4mL 0.1～0.2M的抗壞血酸，用漩渦振蕩器混合均勻，得到無(wú)色透明的生長(zhǎng)溶液；最后加入0.01～0.03mL上述制備的金納米種子溶液，用漩渦振蕩器混合10～50秒鐘后靜置于30～50℃水浴中2～24小時(shí)，得到金納米顆粒溶液； 透膜肽結(jié)合的金納米顆粒的制備向制備得到的金納米顆粒溶液(700nm處紫外吸收值為1～100)中加入透膜肽1mg～1g/mL；反應(yīng)8小時(shí)～3天后，將反應(yīng)液在4000～20000轉(zhuǎn)/分鐘下離心3～60min，去除上清液中未反應(yīng)的透膜肽；將被沉淀在離心管底部的與透膜肽結(jié)合的金納米顆粒超聲分散于超純水中，即得到透膜肽結(jié)合的金納米顆粒的水溶液； 第二步，制備負(fù)載鉑類藥物的透膜肽結(jié)合的金納米顆粒 鉑類藥物的前體藥物化合物1-化合物9的制備為 化合物1的制備將0.6mmol～6mmol順鉑和5～50mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到6～60mL水中，加熱到40～80℃，攪拌反應(yīng)1～10小時(shí)，黃色固體慢慢溶解，溶液呈淡黃色；濃縮反應(yīng)液至0.5～5mL并降溫至0～8℃，有米黃色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到亮黃色固體產(chǎn)物化合物10；將1～30mmol丁二酸酐和0.3～3mmol化合物10于1～5mLDMF中加熱到60～90℃反應(yīng)1～5小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈黃色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向該溶液中加入30～50mL乙醚有淡黃色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到淡黃色的目的產(chǎn)物化合物1； 化合物2的制備將0.6mmol～6mmol順鉑和5～25mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到6～60mL水中，加熱到40～80℃，攪拌反應(yīng)1～10小時(shí)，黃色固體慢慢溶解，溶液呈淡黃色；濃縮反應(yīng)液至0.5～5mL并降溫至0～8℃，有米黃色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到亮黃色固體產(chǎn)物化合物11；將1～30mmol丁二酸酐和0.3～3mmol化合物11于1～5mL DMF中加熱到60～90℃反應(yīng)1～5小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈黃色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向該溶液中加入30～50mL乙醚有淡黃色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到淡黃色的目的產(chǎn)物化合物2； 化合物3的制備將0.6mmol～6mmol順鉑和5～25mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到6～60mL乙醇中，加熱到40～80℃，攪拌反應(yīng)1～10小時(shí)，黃色固體慢慢溶解，溶液呈淡黃色；濃縮反應(yīng)液至0.5～5mL并降溫至0～8℃，有米黃色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到亮黃色固體產(chǎn)物化合物12；將1～30mmol丁二酸酐和0.3～3mmol化合物12于1～5mLDMF中加熱到60～90℃反應(yīng)1～5小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈黃色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向該溶液中加入30～50mL乙醚有淡黃色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到淡黃色的目的產(chǎn)物化合物3； 化合物4的制備將0.6mmol～6mmol奧沙利鉑和5～50mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到6～60mL水中，加熱到40～80℃，攪拌反應(yīng)1～10小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至0.5～5mL并降溫至0～8℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物13；將1～30mmol丁二酸酐和0.3～3mmol化合物13于1～5mL DMF中加熱到60～90℃反應(yīng)1～5小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向該溶液中加入30～50mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物4； 化合物5的制備將0.6mmol～6mmol奧沙利鉑和5～25mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到6～60mL水中，加熱到40～80℃，攪拌反應(yīng)1～10小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至0.5～5mL并降溫至0～8℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物14；將1～30mmol丁二酸酐和0.3～3mmol化合物14于1～5mLDMF中加熱到60～90℃反應(yīng)1～5小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向該溶液中加入30～50mL乙醚有淡白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物5； 化合物6的制備將0.6mmol～6mmol奧沙利鉑和5～25mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到6～60mL乙醇中，加熱到40～80℃，攪拌反應(yīng)1～10小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至0.5～5mL并降溫至0～8℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物15；將1～30mmol丁二酸酐和0.3～3mmol化合物15于1～5mL DMF中加熱到60～90℃反應(yīng)1～5小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向該溶液中加入30～50mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物6； 化合物7的制備將0.6mmol～6mmol卡鉑和5～50mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到6～60mL水中，加熱到40～80℃，攪拌反應(yīng)1～10小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至0.5～5mL并降溫至0～8℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物16；將1～30mmol丁二酸酐和0.3～3mmol化合物16于1～5mLDMF中加熱到60～90℃反應(yīng)1～5小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向該溶液中加入30～50mL乙醚有淡白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物7； 化合物8的制備將0.6mmol～6mmol卡鉑和5～25mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到6～60mL水中，加熱到40～80℃，攪拌反應(yīng)1～10小時(shí)，白黃色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至0.5～5mL并降溫至0～8℃，有米白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物17；將1～30mmol丁二酸酐和0.3～3mmol化合物17于1～5mLDMF中加熱到60～90℃反應(yīng)1～5小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向該溶液中加入30～50mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物8； 化合物9的制備將0.6mmol～6mmol卡鉑和5～25mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到6～60mL水中，加熱到40～80℃，攪拌反應(yīng)1～10小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至0.5～5mL并降溫至0～8℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物18；將1～30mmol丁二酸酐和0.3～3mmol化合物18于1～5mLDMF中加熱到60～90℃反應(yīng)1～5小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向該溶液中加入30～50mL乙醚有淡白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物9； 負(fù)載鉑類藥物的透膜肽結(jié)合的金納米顆粒的制備向700nm處紫外吸收為1～20的透膜肽結(jié)合的金納米顆粒溶液中加入1～30mmol/mL化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7或化合物8或化合物9，及1～40mmol/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)和1～40mmol/mL N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，在30～70℃反應(yīng)8～48小時(shí)，將反應(yīng)液在4000～20000轉(zhuǎn)/分鐘離心3～60min，去除上清液，將被沉淀在離心管底部的結(jié)合透膜肽的金納米顆粒超聲分散于超純水中，即得到負(fù)載鉑類藥物的透膜肽結(jié)合的金納米顆粒的水溶液； 第三步，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種在96孔板內(nèi)，培養(yǎng)2～24小時(shí)后更換新鮮的培養(yǎng)基，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度梯度的藥物，對(duì)照組不加入藥物，空白組沒(méi)有接種細(xì)胞且不加藥物；繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后采用噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定細(xì)胞活性，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率，從而得到藥物的細(xì)胞毒性。
本發(fā)明的作為鉑類藥物的金納米顆粒是利用配體交換和不同分子之間的氨基羧基縮合形成酰氨鍵進(jìn)行組裝的原理制備而得。采用本發(fā)明方法制備的作為鉑類藥物載體的金納米顆粒，提高了金納米顆粒的生物利用度并有效地提高了鉑類藥物對(duì)腫瘤的細(xì)胞毒性，負(fù)載了鉑類藥物的金納米顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用與單獨(dú)使用鉑類藥物作用相比提高了大約10倍，這為金納米顆粒在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用開(kāi)辟了一條新途徑，同時(shí)本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉，可以工業(yè)化生產(chǎn)。



圖1為結(jié)合了透膜肽的金納米顆粒的電鏡圖。
圖2是經(jīng)過(guò)修飾后的金納米顆粒的紫外-可見(jiàn)光譜圖。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1 一、CTAB穩(wěn)定的金納顆粒的制備 透膜肽結(jié)合的金納米顆粒的制備(可參考《化學(xué)材料》(Chemistry Material，2003，151957)的方法) 金納米種子溶液的制備將0.25mL的0.005M氯金酸加入到5mL的0.1M CTAB溶液中混合均勻，溶液為棕黃色；加入0.5mL的0.01M的NaBH4溶液，快速攪拌2min，此時(shí)溶液呈淡棕色；于30℃水浴中靜置2小時(shí)，備用； CTAB穩(wěn)定的金納米顆粒的制備先將5mL 0.1M CTAB和5mL的0.01M氯金酸在30℃水浴下用磁力攪拌器混合均勻；然后加入0.18mL的0.01M硝酸銀和0.2mL 0.1M的抗壞血酸，用漩渦振蕩器混合均勻，得到無(wú)色透明的生長(zhǎng)溶液；最后加入0.01mL上述金納米種子溶液，用漩渦振蕩器混合10秒鐘后靜置于30℃水浴中2小時(shí)。
圖1為本實(shí)施例中所制備得到的結(jié)合了透膜肽的金納米顆粒的電鏡圖。從圖中可見(jiàn)金納米顆粒的粒徑在50nm，顆粒形狀為棒狀。
圖2是經(jīng)過(guò)修飾后的金納米顆粒的紫外-可見(jiàn)光譜圖，其中實(shí)線是CTAB穩(wěn)定的金納米顆粒的紫外-可見(jiàn)光譜圖；虛線為結(jié)合了透膜肽的金納米顆粒的紫外-可見(jiàn)光譜圖。從圖中可見(jiàn)，連接了透膜肽的金納米顆粒仍然保持了金納米顆粒原有的物理特性。
二、鉑類藥物的前體藥物化合物1或者化合物2或者化合物3或者化合物4或者化合物5或者化合物6或者化合物7或者化合物8或者化合物9的制備(可參考《化學(xué)與生物學(xué)》(Chemistry&Biology，11557)上介紹的方法) 化合物1的制備將0.6mmol順鉑和5mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到6mL水中，加熱到40℃，攪拌反應(yīng)1小時(shí)，黃色固體慢慢溶解，溶液呈淡黃色；濃縮反應(yīng)液至0.5mL并降溫至0℃，有米黃色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到亮黃色固體產(chǎn)物化合物10；將1mmol丁二酸酐和0.3mmol化合物10于1mL DMF中加熱到60℃反應(yīng)1小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈黃色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1mL丙酮后，向該溶液中加入30mL乙醚有淡黃色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到淡黃色的目的產(chǎn)物化合物1； 化合物2的制備將0.6mmol順鉑和5mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到6mL水中，加熱到40℃，攪拌反應(yīng)1小時(shí)，黃色固體慢慢溶解，溶液呈淡黃色；濃縮反應(yīng)液至0.5mL并降溫至0℃，有米黃色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到亮黃色固體產(chǎn)物化合物11；將1mmol丁二酸酐和0.3mmol化合物11于1mL DMF中加熱到60℃反應(yīng)1小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈黃色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1mL丙酮后，向該溶液中加入30mL乙醚有淡黃色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到淡黃色的目的產(chǎn)物化合物2； 化合物3的制備將0.6mmolmmol順鉑和5mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到6mL乙醇中，加熱到40℃，攪拌反應(yīng)1小時(shí)，黃色固體慢慢溶解，溶液呈淡黃色；濃縮反應(yīng)液至0.5mL并降溫至0℃，有米黃色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到亮黃色固體產(chǎn)物化合物12；將1mmol丁二酸酐和0.3mmol化合物12于1mL DMF中加熱到60℃反應(yīng)1小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈黃色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1mL丙酮后，向該溶液中加入30mL乙醚有淡黃色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到淡黃色的目的產(chǎn)物化合物3； 化合物4的制備將0.6mmol奧沙利鉑和5mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到6mL水中，加熱到40℃，攪拌反應(yīng)1小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)；濃縮反應(yīng)液至0.5mL并降溫至0℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物13；將1mmol丁二酸酐和0.3mmol化合物13于1mL DMF中加熱到60℃反應(yīng)1小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1mL丙酮后，向該溶液中加入30mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物4； 化合物5的制備將0.6mmol奧沙利鉑和5mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到6mL水中，加熱到40℃，攪拌反應(yīng)1小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至0.5mL并降溫至0℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物14；將1mmol丁二酸酐和0.3mmol化合物14于1mL DMF中加熱到60℃反應(yīng)1小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1mL丙酮后，向該溶液中加入30mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物5； 化合物6的制備將0.6mmol奧沙利鉑和5mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到6mL乙醇中，加熱到40℃，攪拌反應(yīng)1小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至0.5mL并降溫至0℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物15；將1mmol丁二酸酐和0.3mmol化合物15于1mL DMF中加熱到60℃反應(yīng)1小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1mL丙酮后，向該溶液中加入30mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物6； 化合物7的制備將0.6mmol卡鉑和5mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到6mL水中，加熱到40℃，攪拌反應(yīng)1小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至0.5mL并降溫至0℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物16；將1mmol丁二酸酐和0.3mmol化合物16于1mL DMF中加熱到60℃反應(yīng)1小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1mL丙酮后，向該溶液中加入30～50mL乙醚有淡白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物7； 化合物8的制備將0.6mmol卡鉑和5mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到6mL水中，加熱到40℃，攪拌反應(yīng)1小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至0.5mL并降溫至0℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物17；將1mmol丁二酸酐和0.3mmol化合物17于1mL DMF中加熱到60℃反應(yīng)1小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1mL丙酮后，向該溶液中加入30mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物8； 化合物9的制備將0.6mmol卡鉑和5mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到6mL水中，加熱到40℃，攪拌反應(yīng)1小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至0.5mL并降溫至0℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物18；將1mmol丁二酸酐和0.3mmol化合物18于1mL DMF中加熱到60℃反應(yīng)1小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1mL丙酮后，向該溶液中加入30mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物9。
三、透膜肽修飾的金納顆粒的制備 按1mg/mL向金納米顆粒溶液(700nm處紫外吸收值為1)中加入透膜肽，然后攪拌反應(yīng)3天，通過(guò)透膜肽與金納米顆粒的吸附作用結(jié)合到金納米顆粒表面；反應(yīng)結(jié)束后，沒(méi)有反應(yīng)的肽通過(guò)離心的方法分離，將反應(yīng)液于4000rpm下離心60min，金納米顆粒顆粒被沉淀在離心管底部，去除上清液中未反應(yīng)的透膜肽；然后在將納米顆粒超聲分散于超純水中，即得到透膜肽結(jié)合的金納米顆粒的水溶液。所得到的金納米顆粒的電鏡照片即前面所述的圖1，紫外-可見(jiàn)圖譜即前面所述的圖2。
四、負(fù)載鉑類藥物的透膜肽修飾的金納米顆粒的制備 向700nm處紫外吸收為1的透膜肽結(jié)合的金納米顆粒溶液中加入化合物1或者化合物2或者化合物3或者化合物4或者化合物5或者化合物6或者化合物7或者化合物8或者化合物9的量為1mmol/mL及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)1mmol/mL和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)1mmol/mL，在30℃反應(yīng)8小時(shí)，將反應(yīng)液在4000轉(zhuǎn)/分鐘離心60min，去除上清液，將被沉淀在離心管底部的結(jié)合透膜肽的金納米顆粒超聲分散于超純水中，即得到負(fù)載鉑類藥物的透膜肽結(jié)合的金納米顆粒的水溶液。負(fù)載到金納米顆粒表面的鉑濃度通過(guò)電感耦合等離子質(zhì)譜或原子吸收光譜來(lái)定量。
實(shí)施例2 一、CTAB穩(wěn)定的金納顆粒的制備種子溶液的制備將0.75mL的0.075M氯金酸加入到6mL的0.15M CTAB溶液中混合均勻，溶液為棕黃色；加入0.75mL的0.15M的NaBH4溶液，快速攪拌10min，此時(shí)溶液呈淡棕色；于40℃水浴中靜置10小時(shí)，備用； CTAB穩(wěn)定的金納米顆粒的制備先將6mL的0.15M CTAB和6mL的0.015M氯金酸在40℃水浴下用磁力攪拌器混合均勻；然后加入0.3mL的0.015M硝酸銀和0.3mL 0.15M的抗壞血酸，用漩渦振蕩器混合均勻，得到無(wú)色透明的生長(zhǎng)溶液；最后加入0.02mL上述金納米種子溶液， 金納米用漩渦振蕩器混合30秒鐘后靜置于40℃水浴中12小時(shí)。
二、鉑類藥物的前體藥物化合物1或者化合物2或者化合物3或者化合物4或者化合物5或者化合物6或者化合物7或者化合物8或者化合物9的制備 化合物1的制備將3mmol順鉑和10mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到20mL水中，加熱到60℃，攪拌反應(yīng)5小時(shí)，黃色固體慢慢溶解，溶液呈淡黃色；濃縮反應(yīng)液至2mL并降溫至4℃，有米黃色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到亮黃色固體產(chǎn)物化合物10；將10mmol丁二酸酐和1mmol化合物10于2mL DMF中加熱到70℃反應(yīng)2小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈黃色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.2mL丙酮后，向該溶液中加入40mL乙醚有淡黃色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到淡黃色的目的產(chǎn)物化合物1； 化合物2的制備將3mmol順鉑和15mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到10mL水中，加熱到60℃，攪拌反應(yīng)70小時(shí)，黃色固體慢慢溶解，溶液呈淡黃色；濃縮反應(yīng)液至2mL并降溫至4℃，有米黃色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到亮黃色固體產(chǎn)物化合物11；將20mmol丁二酸酐和1mmol化合物11于2mL DMF中加熱到80℃反應(yīng)2小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈黃色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.2mL丙酮后，向該溶液中加入40mL乙醚有淡黃色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到淡黃色的目的產(chǎn)物化合物2； 化合物3的制備將3mmol順鉑和10mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到30mL乙醇中，加熱到50℃，攪拌反應(yīng)60小時(shí)，黃色固體慢慢溶解，溶液呈淡黃色；濃縮反應(yīng)液至2mL并降溫至4℃，有米黃色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到亮黃色固體產(chǎn)物化合物12；將10mmol丁二酸酐和1mmol化合物12于2mL DMF中加熱到70℃反應(yīng)3小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈黃色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.2mL丙酮后，向該溶液中加入40mL乙醚有淡黃色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到淡黃色的目的產(chǎn)物化合物3； 化合物4的制備將3mmol奧沙利鉑和10mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到10mL水中，加熱到50℃，攪拌反應(yīng)5小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至02mL并降溫至4℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物13；將10mmol丁二酸酐和1mmol化合物13于2mL DMF中加熱到70℃反應(yīng)2小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.2mL丙酮后，向該溶液中加入40mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物4； 化合物5的制備將3mmol奧沙利鉑和15mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到10mL水中，加熱到50℃，攪拌反應(yīng)40小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至1mL并降溫至4℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物14；將10mmol丁二酸酐和1mmol化合物14于2mL DMF中加熱到70℃反應(yīng)2小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.3mL丙酮后，向該溶液中加入40mL乙醚有淡白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到淡黃色的目的產(chǎn)物化合物5； 化合物6的制備將2mmol奧沙利鉑和15mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到10mL乙醇中，加熱到60℃，攪拌反應(yīng)5小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈淡無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至4mL并降溫至4℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物15；將10mmol丁二酸酐和1mmol化合物15于2mL DMF中加熱到80℃反應(yīng)4小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.2mL丙酮后，向該溶液中加入40mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物6； 化合物7的制備將3mmol卡鉑和10mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到40mL水中，加熱到60℃，攪拌反應(yīng)5小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至2mL并降溫至4℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物16；將10mmol丁二酸酐和1mmol化合物16于2mL DMF中加熱到70℃反應(yīng)2小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.1～0.5mL丙酮后，向該溶液中加入40mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物7； 化合物8的制備將3mmol卡鉑和15mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到10mL水中，加熱到50℃，攪拌反應(yīng)7小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至1mL并降溫至4℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物17；將10mmol丁二酸酐和2mmol化合物17于2mL DMF中加熱到70℃反應(yīng)2小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.3mL丙酮后，向該溶液中加入40mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物8； 化合物9的制備將3mmol卡鉑和15mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到50mL水中，加熱到70℃，攪拌反應(yīng)2小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至2mL并降溫至4℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物18；將10mmol丁二酸酐和1mmol化合物18于2mL DMF中加熱到70℃反應(yīng)2小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈白色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.3mL丙酮后，向該溶液中加入50mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物9； 三、透膜肽修飾的金納顆粒的制備為 按250mg/mL向金納米顆粒溶液中(向700nm處紫外吸收值為10)加入透膜肽，然后攪拌反應(yīng)24hrs；反應(yīng)結(jié)束后，沒(méi)有反應(yīng)的肽通過(guò)離心的方法分離，將反應(yīng)液于10000rpm下離心10min，金納米顆粒顆粒被沉淀在離心管底部，去除上清液中未反應(yīng)的透膜肽；然后在將納米顆粒超聲分散于超純水中，即得到透膜肽結(jié)合的金納米顆粒的水溶液。
四、負(fù)載鉑類藥物的透膜肽修飾的金納米顆粒的制備為 向700nm處紫外吸收為10的透膜肽結(jié)合的金納米顆粒溶液中加入化合物1或者化合物2或者化合物3或者化合物4或者化合物5或者化合物6或者化合物7或者化合物8或者化合物9的量為10mmol/mL及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)10mmol/mL和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)10mmol/mL，在50℃反應(yīng)28小時(shí)，將反應(yīng)液在10000轉(zhuǎn)/分鐘離心10min，去除上清液，將被沉淀在離心管底部的結(jié)合透膜肽的金納米顆粒超聲分散于超純水中，即得到負(fù)載鉑類藥物的透膜肽結(jié)合的金納米顆粒的水溶液。負(fù)載到金納米顆粒表面的鉑濃度通過(guò)電感耦合等離子質(zhì)譜或原子吸收光譜來(lái)定量。
實(shí)施例3 一、CTAB穩(wěn)定的金納顆粒的制備 金納米種子溶液的制備將1mL的0.01M氯金酸加入到10mL的0.2M CTAB溶液中混合均勻，溶液為棕黃色；加入1mL的0.02M的NaBH4溶液，快速攪拌20min，此時(shí)溶液呈淡棕色；于50℃水浴中靜置20小時(shí)，備用； CTAB穩(wěn)定的金納米顆粒的制備先將10mL的0.2M CTAB和10mL的0.02M氯金酸在50℃水浴下用磁力攪拌器混合均勻；然后加入0.5mL的0.02M硝酸銀和0.4mL的0.2M的抗壞血酸，用漩渦振蕩器混合均勻，得到無(wú)色透明的生長(zhǎng)溶液；最后加入0.03mL上述金納米種子溶液，用漩渦振蕩器混合50秒鐘后靜置于50℃水浴中24小時(shí)。
二、鉑類藥物的前體藥物化合物1或者化合物2或者化合物3或者化合物4或者化合物5或者化合物6或者化合物7或者化合物8或者化合物9的制備 化合物1的制備將6mmol順鉑和50mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到60mL水中，加熱到80℃，攪拌反應(yīng)10小時(shí)，黃色固體慢慢溶解，溶液呈淡黃色；濃縮反應(yīng)液至5mL并降溫至8℃，有米黃色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到亮黃色固體產(chǎn)物化合物10；將30mmol丁二酸酐和3mmol化合物10于5mL DMF中加熱到90℃反應(yīng)5小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈黃色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.5mL丙酮后，向該溶液中加入50mL乙醚有淡黃色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到淡黃色的目的產(chǎn)物化合物1； 化合物2的制備將6mmol順鉑和25mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到60mL水中，加熱到80℃，攪拌反應(yīng)10小時(shí)，黃色固體慢慢溶解，溶液呈淡黃色；濃縮反應(yīng)液至5mL并降溫至8℃，有米黃色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到亮黃色固體產(chǎn)物化合物11；將30mmol丁二酸酐和3mmol化合物11于5mL DMF中加熱到90℃反應(yīng)5小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈黃色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.5mL丙酮后，向該溶液中加入50mL乙醚有淡黃色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到淡黃色的目的產(chǎn)物化合物2； 化合物3的制備將6mmol順鉑和25mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到60mL乙醇中，加熱到80℃，攪拌反應(yīng)10小時(shí)，黃色固體慢慢溶解，溶液呈淡黃色；濃縮反應(yīng)液至5mL并降溫至8℃，有米黃色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到亮黃色固體產(chǎn)物化合物12；將30mmol丁二酸酐和3mmol化合物12于5mL DMF中加熱到90℃反應(yīng)5小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈黃色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.5mL丙酮后，向該溶液中加入50mL乙醚有淡黃色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到淡黃色的目的產(chǎn)物化合物3； 化合物4的制備將6mmol奧沙利鉑和50mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到60mL水中，加熱到80℃，攪拌反應(yīng)10小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至5mL并降溫至8℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物13；將30mmol丁二酸酐和3mmol化合物13于5mL DMF中加熱到90℃反應(yīng)5小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.5mL丙酮后，向該溶液中加入50mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物4； 化合物5的制備將6mmol奧沙利鉑和25mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到60mL水中，加熱到80℃，攪拌反應(yīng)10小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至5mL并降溫至8℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物14；將30mmol丁二酸酐和3mmol化合物14于5mL DMF中加熱到90℃反應(yīng)5小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.5mL丙酮后，向該溶液中加入50mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物5； 化合物6的制備將6mmol奧沙利鉑和25mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到60mL乙醇中，加熱到80℃，攪拌反應(yīng)10小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至5mL并降溫至8℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物15；將30mmol丁二酸酐和3mmol化合物15于5mL DMF中加熱到90℃反應(yīng)5小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.5mL丙酮后，向該溶液中加入50mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物6； 化合物7的制備將6mmol卡鉑和5～50mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到60mL水中，加熱到80℃，攪拌反應(yīng)10小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至5mL并降溫至8℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物16；將30mmol丁二酸酐和3mmol化合物16于5mL DMF中加熱到90℃反應(yīng)5小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.5mL丙酮后，向該溶液中加入50mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物7； 化合物8的制備將6mmol卡鉑和25mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到60mL水中，加熱到80℃，攪拌反應(yīng)10小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至5mL并降溫至8℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物17；將30mmol丁二酸酐和3mmol化合物17于5mL DMF中加熱到90℃反應(yīng)5小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.5mL丙酮后，向該溶液中加入50mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物8； 化合物9的制備將6mmol卡鉑和25mL體積濃度為30％的過(guò)氧化氫水溶液加入到60mL水中，加熱到80℃，攪拌反應(yīng)10小時(shí)，白色固體慢慢溶解，溶液呈無(wú)色；濃縮反應(yīng)液至5mL并降溫至8℃，有白色的固體晶體固體析出，再在沸水中重結(jié)晶，得到白色固體產(chǎn)物化合物18；將30mmol丁二酸酐和3mmol化合物18于5mL DMF中加熱到90℃反應(yīng)5小時(shí)，固體原料慢慢溶解，至反應(yīng)液呈無(wú)色，用真空泵抽干DMF，剩余的油狀物溶于0.5mL丙酮后，向該溶液中加入50mL乙醚有白色產(chǎn)物沉淀出來(lái)，于真空干燥箱中干燥，得到白色的目的產(chǎn)物化合物9； 三、透膜肽修飾的金納顆粒的制備 按1g/mL向金納米顆粒溶液中(向700nm處紫外吸收值為100)加入透膜肽，然后攪拌反應(yīng)8hrs；反應(yīng)結(jié)束后，沒(méi)有反應(yīng)的肽通過(guò)離心的方法分離，將反應(yīng)液于20000rpm下離心3min，金納米顆粒顆粒被沉淀在離心管底部，去除上清液中未反應(yīng)的透膜肽；然后在將納米顆粒超聲分散于超純水中，即得到透膜肽結(jié)合的金納米顆粒的水溶液。
四、負(fù)載鉑類藥物的透膜肽修飾的金納米顆粒的制備 向700nm處紫外吸收為20的透膜肽結(jié)合的金納米顆粒溶液中加入化合物1或者化合物2或者化合物3或者化合物4或者化合物5或者化合物6或者化合物7或者化合物8或者化合物9的量為30mmol/mL及1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)40mmol/mL和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)40mmol/mL，在70℃反應(yīng)8小時(shí)，將反應(yīng)液在20000轉(zhuǎn)/分鐘離心3min，去除上清液，將被沉淀在離心管底部的結(jié)合透膜肽的金納米顆粒超聲分散于超純水中，即得到負(fù)載鉑類藥物的透膜肽結(jié)合的金納米顆粒的水溶液。負(fù)載到金納米顆粒表面的鉑濃度通過(guò)電感耦合等離子質(zhì)譜或原子吸收光譜來(lái)定量。
實(shí)施例4 一、Hela細(xì)胞培養(yǎng) 將HeLa宮頸癌細(xì)胞在含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。
二、MTT法測(cè)定細(xì)胞活性 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞2×104個(gè)/mL接種在96孔板內(nèi)，每孔100μL，培養(yǎng)24小時(shí)后更換新鮮的培養(yǎng)基，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度梯度的藥物，對(duì)照組不加入藥物，空白組沒(méi)有接種細(xì)胞且不加藥物；繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定細(xì)胞活性，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率，從而得到藥物的細(xì)胞毒性。
1、收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100μL，鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至2000個(gè)/孔，(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)。
2、5％CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度的藥物，每個(gè)濃度設(shè)3復(fù)孔。
3、5％CO2，37℃孵育72小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。
4、棄去舊的培養(yǎng)基加入新鮮培養(yǎng)基100μL，然后每孔加入25μLMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)2h。
6、每孔加入100μL細(xì)胞裂解液，5％CO2，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光度A值。
存活率(％)＝[實(shí)驗(yàn)組(S)的A值-空白(B)A值]/[對(duì)照組(C)的A值-空白(B)的A值] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的負(fù)載鉑藥物的透膜肽連接的金納米顆粒上面后，提高了它對(duì)HeLa的細(xì)胞毒性，IC50值(抑制率50％的時(shí)候藥物的濃度)為0.25μM，與鉑類藥物的IC50值(2.5μM)相比，提高了10倍。
權(quán)利要求
1.一種作為鉑類藥物載體的金納米顆粒，特征在于其中的透膜肽通過(guò)巰基以共價(jià)鍵結(jié)合在金納米顆粒的表面，且該透膜肽還通過(guò)氨基以酰氨鍵結(jié)合在鉑類藥物的前體藥物的羧基上；
所述透膜肽是序列中包含1個(gè)半胱氨酸和5到19個(gè)精氨酸的一段包含8個(gè)到20個(gè)氨基酸的肽；
所述鉑類藥物的前體藥物為順鉑的前體藥物或?yàn)榭ㄣK的前體藥物或?yàn)閵W沙利鉑的前體藥物；
所述順鉑的前體藥物選自如下所列的化合物1或化合物2或化合物3；所述卡鉑的前體藥物選自化合物4或化合物5或化合物6；所述奧沙利鉑的前體藥物選自化合物7或化合物8或化合物9；
所述化合物1到化合物9的結(jié)構(gòu)式為
其中1≤n≤5。
2.權(quán)利要求1所述作為鉑類藥物載體的金納米顆粒的的制備方法，其特征在于包括如下步驟
第一步，透膜肽結(jié)合的金納米顆粒的制備
金納米種子溶液的制備將0.25～1mL的0.005～0.01M氯金酸加入到5～10mL的0.1～0.2M CTAB溶液中混合均勻，至溶液為棕黃色；加入0.5～1mL的0.01～0.02M的NaBH4溶液，快速攪拌2～20min，至溶液呈棕色；于30～50℃水浴中靜置2～20小時(shí)，備用；
CTAB穩(wěn)定的金納米顆粒的制備先將5～10mL的0.1～0.2M CTAB和5～10mL的0.01～0.02M氯金酸在30～50℃水浴下用磁力攪拌器混合均勻；然后加入0.18～0.5mL的0.01～0.02M硝酸銀和0.2～0.4mL 0.1～0.2M的抗壞血酸，用漩渦振蕩器混合均勻，得到無(wú)色透明的生長(zhǎng)溶液；最后加入0.01～0.03mL上述制備的金納米種子溶液，用漩渦振蕩器混合10～50秒鐘后靜置于30～50℃水浴中2～24小時(shí)，得到金納米顆粒溶液；
透膜肽結(jié)合的金納米顆粒的制備向制備得到的金納米顆粒溶液中加入透膜肽1mg～1g/mL；反應(yīng)8小時(shí)～3天后，將反應(yīng)液在4000～20000轉(zhuǎn)/分鐘離心3～60min，去除上清液中未反應(yīng)的透膜肽；將被沉淀在離心管底部的與透膜肽結(jié)合的金納米顆粒超聲分散于超純水中，即得到透膜肽結(jié)合的金納米顆粒的水溶液；
第二步，制備負(fù)載鉑類藥物的透膜肽結(jié)合的金納米顆粒
向700nm處紫外吸收為1～20的透膜肽結(jié)合的金納米顆粒溶液中加入1～30mmol/mL化合物1或化合物2或化合物3或化合物4或化合物5或化合物6或化合物7或化合物8或化合物9，及1～40mmol/mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和1～40mmol/mL N-羥基丁二酰亞胺，在30～70℃反應(yīng)8～48小時(shí)，將反應(yīng)液在4000～20000轉(zhuǎn)/分鐘離心3～60min，去除上清液，將被沉淀在離心管底部的結(jié)合透膜肽的金納米顆粒超聲分散于超純水中，即得到負(fù)載鉑類藥物的透膜肽結(jié)合的金納米顆粒的水溶液；
所述化合物1到化合物9的結(jié)構(gòu)式為
其中1≤n≤5；
第三步，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種在96孔板內(nèi)，培養(yǎng)2～24小時(shí)后更換新鮮的培養(yǎng)基，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白組，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度梯度的藥物，對(duì)照組不加入藥物，空白組沒(méi)有接種細(xì)胞且不加藥物；繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后采用噻唑藍(lán)法測(cè)定細(xì)胞活性，計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率，從而得到藥物的細(xì)胞毒性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種作為藥物載體的金納米顆粒及其制備方法，特征是其中透膜肽通過(guò)巰基以共價(jià)鍵結(jié)合在金納米顆粒的表面且該透膜肽還通過(guò)氨基以酰氨鍵結(jié)合在鉑類藥物的前體藥物的羧基上；所述透膜肽是序列中包含1個(gè)半胱氨酸和5到19個(gè)精氨酸的一段包含8個(gè)到20個(gè)氨基酸的肽；所述鉑類藥物的前體藥物為順鉑的前體藥物或?yàn)榭ㄣK的前體藥物或?yàn)閵W沙利鉑的前體藥物；所述順鉑的前體藥物選自化合物1-3；所述卡鉑的前體藥物選自化合物4-6；所述奧沙利鉑的前體藥物選自化合物7-9。該連接鉑藥物和透膜肽的金納米顆粒對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性明顯增強(qiáng)且未連接鉑藥物的金納米顆粒本身無(wú)毒，本發(fā)明為金納米顆粒在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用開(kāi)辟了新的途徑。
文檔編號(hào)A61K31/282GK101816797SQ20101011344
公開(kāi)日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2010年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月12日
發(fā)明者劉揚(yáng)中, 閔元增 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)