專利名稱：一種干燥羊膜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種羊膜的制備方法，尤其是涉及一種干燥羊膜的制備方法。
背景技術(shù)：
羊膜來源于胚胎，是一種透明、無神經(jīng)、血管和淋巴管、低抗原性且具有韌性的組 織。該膜由上皮細胞層、基底膜、基質(zhì)層、纖維母細胞層、海綿層組成，厚約0. 02 0. 05mm。 羊膜上皮層為單層立方上皮，細胞表面及側(cè)面有很多微絨毛，有合成、分泌和沉積基底膜、 細胞外間質(zhì)成份的能力，具有分化的潛能，并可以分泌多種生長因子；而羊膜基質(zhì)含有豐富 的膠元纖維及多種形式的蛋白酶抑制劑；羊膜基底膜是人體最厚的基底膜(約0. 1 μ m)，含 有IV型膠原纖維網(wǎng)，層粘連蛋白和富含硫酸肝素的蛋白多糖，可以起屏障作用，減低了羊 膜的通透性。隨著新生血管、炎癥及傷口愈合等相關(guān)疾病的患者人數(shù)增多，羊膜的使用也越來 越多。羊膜的制備，尤其是羊膜活性成分的保存，也就成為目前研究的一個熱點問題。目前 市面上采用的多為直接經(jīng)過冷凍的干燥羊膜-生物凍干羊膜，它是將附有羊膜的紙片置于 凍干機，真空條件下用鈷-60輻射烘干，并在室溫下真空包裝，室溫下避光放置兩個月，使 用前需置于含慶大霉素的生理鹽水中浸泡:3min。該方法操作相對簡單，成本較低，便于規(guī)模 化批量生產(chǎn)，可長期保存，運輸方便，但需要用到特殊的設(shè)備，凍干羊膜組織結(jié)構(gòu)及上皮比 較容易被破壞。目前還有一種干燥羊膜-海藻糖浸泡羊膜，它是將分離出的羊膜置于10% 海藻糖溶液中浸泡，然后凍干，真空包裝，射線輻照滅菌后避光保存。該方法保存的羊膜在 形態(tài)學(xué)、生物學(xué)方面更接近于自然新鮮羊膜，但效果尚未得到更多證實。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種干燥羊膜的制備方法，制得的干燥羊膜安全無污染、性能與新鮮 羊膜接近、生物活性高、膠原破壞少、易于手術(shù)操作、運輸及保存方便，作為新鮮羊膜的替代 物，取材方便，實用性強，能被廣大患者接受并應(yīng)用于臨床。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種干燥羊膜的制備方法，包括如下步驟將反復(fù)漂洗的無病毒攜帶新鮮羊膜經(jīng) 過嚴格消毒，低溫下基質(zhì)重建及修復(fù)，鋪膜，干燥，鈷60消毒后保存?zhèn)溆谩Ｈ缰苽溆猩稍镅蚰?，需包括以下步驟將反復(fù)漂洗的無病毒攜帶新鮮羊膜經(jīng)過 嚴格消毒，低溫下基質(zhì)重建及修復(fù)，羊膜著色，鋪膜，干燥，鈷60消毒后保存?zhèn)溆谩Ｋ龅南臼菍⑿迈r羊膜用含抗菌素的PBS浸泡后，浸泡時間為5-lOmin，PBS沖 洗3次X 5min。所述的抗菌素包括5萬U/L青霉素，8萬U/L妥布霉素，100mg/L鏈霉素中 一種或兩種以上的組合。所述的基質(zhì)重建及修復(fù)是將新鮮羊膜浸泡于基質(zhì)膠內(nèi)，其中所需溫度 為-20°C _4°C，時間為15min-30min，基質(zhì)膠包括ECM膠，F(xiàn)N膠，Matrige膠，角叉菜膠，明膠， IV型膠原中的一種。采用本技術(shù)能使羊膜外面存在一層保護膜，使上皮和基質(zhì)活性成份能得到大部分保存，細胞表型和基底膜完整，基質(zhì)破壞極少。所述的羊膜著色的有色染料包括熒光素鈉，虎紅，臺盼藍，龍膽紫，結(jié)晶紫，麗絲胺 綠，酚紅，美藍，番紅，甲基藍及洋紅中的一種，其中溫度為16°c -37°c，染色時間30s-5min。 采用本技術(shù)能很好的幫助我們在手術(shù)應(yīng)用中分辨羊膜的折疊處和皺褶及邊緣。所述的鋪膜包括硝酸纖維素膜，乙酸纖維素膜，微孔濾膜，蓋玻片中的一種。采用 本技術(shù)能使羊膜充分展平，保持一定的拉伸度同時還可以辨別羊膜上皮面。所述的干燥技術(shù)處理為真空凍干，真空晾干，無水Cacl2真空干燥，自然晾干，吹 干，30-60°C溫箱內(nèi)烘干中的一種或一種以上的組合，干燥至羊膜材料的含水量在0. 1-5% 之間后取出。所述的羊膜材料消毒技術(shù)采用鈷60消毒。我們采用本發(fā)明技術(shù)方案制作的羊膜材料，植入于兔皮下1個月，兔眼前房內(nèi)和 兔角膜基質(zhì)囊袋內(nèi)平鋪術(shù)后1月均顯示其具有良好組織相容性，沒有見明顯的炎癥反應(yīng)和 排斥反應(yīng)，同時將其用于羊膜結(jié)膜修補術(shù)后2周發(fā)現(xiàn)其羊膜基底膜尚完整，羊膜上有兔結(jié) 膜上皮長入，無明顯的排斥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，說明其能作為結(jié)膜上皮的細胞基底膜用于結(jié)
膜重建。與現(xiàn)有的羊膜材料相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)本發(fā)明制作流程簡單、可靠， 且易于實施；(2)成本相對較低，易于推廣；(3)可常溫下保存，運輸方便；(4)病原菌培養(yǎng)、 生物學(xué)性質(zhì)檢測及顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)較長時間保存(12月)的羊膜材料無污染，將其應(yīng)用 于人結(jié)膜修補術(shù)中，術(shù)后發(fā)現(xiàn)羊膜植片能存活2周-2月，并能促進結(jié)膜上皮在其表面生長， 遠期效果理想；(4)本發(fā)明加入了基質(zhì)膠，在羊膜外面存在一層保護膜，使上皮和基質(zhì)活性 成份能得到大部分保存，細胞表型和基底膜完整，基質(zhì)破壞極少，優(yōu)于同時間保存的單純凍 干羊膜；( 本發(fā)明加入了染色成分，能很好的幫助我們在手術(shù)應(yīng)用中分辨羊膜的折疊處 和皺褶及邊緣。(6)本發(fā)明不僅有利于優(yōu)化羊膜特性，同時能為組織工程羊膜產(chǎn)業(yè)化提供重 要的技術(shù)支持。


圖1為本發(fā)明制備方法制得的干燥羊膜(經(jīng)過熒光素鈉著色)保存12月的裂隙 燈照片(100X)。圖2為本發(fā)明制備方法制得的干燥羊膜(經(jīng)過龍膽紫著色)保存12月的裂隙燈 照片(100X)。圖3為本發(fā)明制備方法制得的干燥羊膜保存12月的羊膜HE染色照片Q00X)。圖4為經(jīng)過單純凍干保存12月的羊膜HE染色照片Q00X)。圖5為本發(fā)明制備方法制得的干燥羊膜保存12月的羊膜Laminin 5染色照片
(200X)ο圖6為經(jīng)過單純凍干保存12月的羊膜Laminin 5染色照片Q00X)。圖7為本發(fā)明制備方法制得的干燥羊膜保存12月的羊膜Collagen IV染色照片
(200X)ο圖8為經(jīng)過單純凍干保存12月的羊膜Collagen IV染色照片Q00X)。圖9為本發(fā)明制備方法制得的干燥羊膜保存12月的羊膜β -catenin染色照片
圖10為經(jīng)過單純凍干保存12月的羊膜β -catenin染色照片QOO X)。圖11為本發(fā)明制備方法制得的干燥羊膜保存12月的羊膜MUC 16染色照片
(200X)ο圖12為經(jīng)過單純凍干保存12月的羊膜MUC 16染色照片Q00X)。圖13為本發(fā)明制備方法制得的干燥羊膜保存12月后兔角膜層間植入后1月的裂 隙燈照片。圖14為本發(fā)明制備方法制得的干燥羊膜保存12月后兔角膜層間植入后1月的HE 照片。圖15為本發(fā)明制備方法制得的干燥羊膜保存12月后兔前房內(nèi)植入后1月的裂隙 燈照片。圖16為本發(fā)明制備方法制得的干燥羊膜保存12月后兔前房內(nèi)植入后1月的HE 照片。圖17為本發(fā)明制備方法制得的干燥羊膜保存12月后兔羊膜-結(jié)膜修補術(shù)后2周 的裂隙燈照片。圖18為本發(fā)明制備方法制得的干燥羊膜保存12月后兔羊膜-結(jié)膜修補術(shù)后2周 的手術(shù)區(qū)結(jié)膜K19染色照片。圖19為本發(fā)明制備方法制得的干燥羊膜(基質(zhì)膠為ECM膠)與常規(guī)冷凍干燥羊 膜保存12月后平均彈性模量對比情況。圖20為本發(fā)明制備方法制得的干燥羊膜(基質(zhì)膠為ECM膠)與常規(guī)冷凍干燥羊 膜材料保存12月后平均最大承受拉伸力對比情況。圖21為本發(fā)明制備方法制得的干燥羊膜(基質(zhì)膠為ECM膠)與常規(guī)冷凍干燥羊 膜材料保存12月后平均拉伸長度對比情況。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明所述的制備方法，包括以下步驟供體取自經(jīng)剖宮產(chǎn)術(shù)獲取的胎膜，產(chǎn)婦術(shù) 前病毒學(xué)檢驗結(jié)果均為陰性；獲得的胎膜在無菌潔凈環(huán)境內(nèi)，用無菌生理鹽水洗凈其表面 的血跡；術(shù)者雙手戴無菌手套，將羊膜自絨毛膜輕輕分離出來，無菌BSS液沖洗干凈，平鋪 在無菌的玻璃平板上，用細胞刮子刮除其海綿層、纖維母細胞層及漿液性滲出液等；將新鮮 羊膜用含5萬U/L青霉素，8萬U/L妥布霉素，100mg/L鏈霉素的PBS浸泡消毒3次X 5min ； 在-20°C -4°C溫度下，然后將無菌羊膜浸泡于ECM膠內(nèi)15min-30min ；在16°C _37°C通風(fēng)櫥 內(nèi)滴入0. 25%無菌熒光素鈉溶液0. 2ml于羊膜上染色5min，然后將染色后了羊膜平鋪于硝 酸纖維膜上，在無菌通風(fēng)櫥內(nèi)自然晾干，含水量約維持在0.5%左右時后取出，然后塑料包 裝，鈷60消毒，保存?zhèn)溆?。實施?本發(fā)明所述的制備方法，包括以下步驟供體取自經(jīng)剖宮產(chǎn)術(shù)獲取的胎膜，產(chǎn)婦術(shù) 前病毒學(xué)檢驗結(jié)果均為陰性；獲得的胎膜在無菌潔凈環(huán)境內(nèi)，用無菌生理鹽水洗凈其表面 的血跡；術(shù)者雙手戴無菌手套，將羊膜自絨毛膜輕輕分離出來，無菌BSS液沖洗干凈，平鋪在無菌的玻璃平板上，用細胞刮子刮除其海綿層、纖維母細胞層及漿液性滲出液等；將新鮮 羊膜用含5萬U/L青霉素，8萬U/L妥布霉素，100mg/L鏈霉素的PBS浸泡消毒3次X 5min ； 在-20°C -4°C溫度下，然后將無菌羊膜浸泡于FN膠內(nèi)15min-30min ；在16°C _37°C通風(fēng)櫥 內(nèi)滴入0. 無菌臺盼藍溶液0. 2ml于羊膜上染色5min，然后將染色后了羊膜平鋪于硝酸 纖維膜上，在無菌通風(fēng)櫥內(nèi)自然晾干，含水量約維持在0. 5%左右時后取出，然后塑料包裝， 鈷60消毒，保存?zhèn)溆?。實施?本發(fā)明所述的制備方法，包括以下步驟供體取自經(jīng)剖宮產(chǎn)術(shù)獲取的胎膜，產(chǎn)婦術(shù) 前病毒學(xué)檢驗結(jié)果均為陰性；獲得的胎膜在無菌潔凈環(huán)境內(nèi)，用無菌生理鹽水洗凈其表面 的血跡；術(shù)者雙手戴無菌手套，將羊膜自絨毛膜輕輕分離出來，無菌BSS液沖洗干凈，平鋪 在無菌的玻璃平板上，用細胞刮子刮除其海綿層、纖維母細胞層及漿液性滲出液等。將新鮮 羊膜用含5萬U/L青霉素，8萬U/L妥布霉素，100mg/L鏈霉素的PBS浸泡消毒3次X 5min ； 在-20°C -4°C溫度下，然后將無菌羊膜浸泡于Matrige膠內(nèi)15min-30min ；在16°C _37°C通 風(fēng)櫥內(nèi)滴入0. 5%無菌虎紅溶液0. 2ml于羊膜上染色5min，然后將染色后了羊膜平鋪于硝 酸纖維膜上，在無菌通風(fēng)櫥內(nèi)自然晾干，含水量約維持在0.5%左右時后取出，然后塑料包 裝，鈷60消毒，保存?zhèn)溆谩⒁妶D1 12，使用目前常用的冷凍干燥羊膜材料，保存12月可維持羊膜部分活 性。美國等國目前臨床用的液態(tài)保存羊膜，保存條件要求較高，應(yīng)用前需保存6個月后再次 檢測，這段保存期可容許工作人員對供體羊膜進行詳細的檢查，以排除惡性腫瘤、傳染性疾 病，從而為臨床提供健康、優(yōu)質(zhì)的羊膜片，但這種液體保存羊膜周期較長，運輸不便，不易保 存。國內(nèi)已經(jīng)產(chǎn)品化的冷凍干燥羊膜，在冷凍干燥處理過程中大部分組織遭到破壞，導(dǎo)致 在維持羊膜活性方面及生物學(xué)方面存在缺陷，在臨床手術(shù)中羊膜容易撕裂，嚴整影響手術(shù) 效果。本發(fā)明所述的羊膜材料的制作方便，成本較低，可常溫下保存，運輸方便，易于推廣； 同時加入了染色成分(熒光素鈉圖1，結(jié)晶紫圖2)，能很好的幫助我們分辨羊膜的折疊 處和皺褶及邊緣。保存12月后經(jīng)HE染色(圖3)及各種熒光染色(Laminin 5染色圖5， Collagen IV染色圖7，β-catenin染色圖9，MUC 16染色圖11)檢查證實其保存的 效果(保存時間、活性成分及基底膜)優(yōu)于相應(yīng)天數(shù)的冷凍干燥羊膜材料(HE染色圖4， Laminin 5 染色圖 6，Collagen IV 染色圖 8，β-catenin 染色圖 10，MUC 16 染色圖 12)。圖13，14是經(jīng)過本發(fā)明所述羊膜材料在臨床應(yīng)用上的一個具體實施例。經(jīng)過本發(fā) 明常溫保存12月的羊膜應(yīng)用于兔角膜層間植入后經(jīng)過1個月的觀察，羊膜片尚未完全溶 解，植片透明，無明顯的排斥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。圖15，16是經(jīng)過本發(fā)明所述羊膜材料在臨床應(yīng)用上的另一個具體實施例。經(jīng)過本 發(fā)明常溫保存12月的羊膜應(yīng)用于兔前房內(nèi)植入后經(jīng)過1個月的觀察，發(fā)現(xiàn)其羊膜部分溶 解，體積變小，但基底膜尚完整，植片變白，但無明顯的排斥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。圖17，18是經(jīng)過本發(fā)明所述羊膜材料在臨床應(yīng)用上的另一個具體實施例。經(jīng)過本 發(fā)明常溫保存12月的羊膜應(yīng)用于兔羊膜-結(jié)膜修補術(shù)后2周的觀察，發(fā)現(xiàn)其羊膜基底膜尚 完整，羊膜上有兔結(jié)膜上皮長入，無明顯的排斥反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，說明其能作為結(jié)膜上皮的 細胞基底膜用于結(jié)膜重建。
實施例4以下所述為羊膜材料在臨床應(yīng)用上的一個具體實施例。目的對比經(jīng)過各種預(yù)處理的商用羊膜和實驗羊膜的拉伸強度和彈性特性。方法對經(jīng)過一種預(yù)處理的羊膜和現(xiàn)有商用羊膜進行對比研究。組1為ECM膠后 凍干處理的羊膜(20例)，組2為常規(guī)冷凍干燥羊膜組(20例)。羊膜被切割成細條，裝入 負荷傳感器中，并逐步延伸直至斷裂。記錄并比較最終破裂時兩種羊膜的彈性模量，位移， 最大耐受拉力。結(jié)果在彈性模量，位移，最大耐受拉力上，ECM膠組明顯大于冷凍干燥羊膜組，兩 組對比具有顯著性差異(P < 0. 05)。結(jié)論ECM膠組處理的凍干羊膜保持著更好的彈性特點，他將提供了一個更易于 操縱的移植組織片用于眼表，神經(jīng)及肌腱重建。圖19，20，21是經(jīng)過本發(fā)明所述羊膜材料在應(yīng)用上的一個具體實施例。ECM膠處理 的凍干羊膜常溫保存12月后，在彈性模量，最大耐受拉力上均明顯好于常規(guī)凍干羊膜保存 12月組但在平均拉伸位移上差異無顯著性意義。a 冷凍干燥羊膜組，b :ECM膠組.實施例5以下所述為羊膜材料在臨床應(yīng)用上的一個具體實施例。目的對比經(jīng)過各種預(yù)處理的商用羊膜和實驗羊膜的厚度變化。方法對經(jīng)過一種預(yù)處理的羊膜和現(xiàn)有商用羊膜進行對比研究。組1為為ECM膠 后凍干處理的羊膜(20例)，組2為常規(guī)冷凍干燥羊膜組(20例)。羊膜被切割成方塊，浸 泡于生理鹽水中30min。然后用角膜測厚儀測量相應(yīng)的羊膜厚度。記錄并比較兩種羊膜復(fù) 水前后的厚度。結(jié)果羊膜浸濕后幾乎沒有增加羊膜厚度。干燥羊膜平均厚度的是 19. 68士2. 75 μ m，而相應(yīng)的濕潤羊膜平均厚度為19. 84士 1.83μπι(ρ > 0. 05)，然而復(fù)水后 的ECM膠組64 士 2. 24 μ m)羊膜相比冷凍干燥羊膜組(19. 69 士 1.97μπι)更接近于新鮮 羊膜的厚度(20. 88 士 2. 33 μ m)，兩組對比具有顯著性差異(P < 0. 05)。結(jié)論ECM膠組處理的凍干羊膜保持著更好的厚度，他將提供一個更接近于生理 狀況的移植組織片用于眼表，神經(jīng)及肌腱重建。
權(quán)利要求
1.一種干燥羊膜的制備方法，其特征在于包括如下步驟將反復(fù)漂洗的無病毒攜帶新 鮮羊膜經(jīng)過嚴格消毒，低溫下基質(zhì)重建及修復(fù)，鋪膜，干燥，鈷60消毒后保存?zhèn)溆谩?br> 2.如權(quán)利要求1所述的一種干燥羊膜的制備方法，其特征在于包括如下步驟將反復(fù) 漂洗的無病毒攜帶新鮮羊膜經(jīng)過嚴格消毒，低溫下基質(zhì)重建及修復(fù)，羊膜著色，鋪膜，干燥， 鈷60消毒后保存?zhèn)溆谩?br> 3.如權(quán)利要求1、2所述的一種干燥羊膜的制備方法，其特征在于所述的消毒是將新 鮮羊膜用含抗菌素的PBS浸泡后，浸泡時間為5-lOmin，PBS沖洗3次X5min，所述的抗菌 素包括5萬U/L青霉素，8萬U/L妥布霉素，100mg/L鏈霉素中一種或兩種以上的組合。
4.如權(quán)利要求1、2所述的一種干燥羊膜的制備方法，其特征在于所述的基質(zhì)重建及 修復(fù)是將新鮮羊膜浸泡于基質(zhì)膠內(nèi)，其中所需溫度為-20°C _4°C，時間為15min-30min，基 質(zhì)膠包括ECM膠，F(xiàn)N膠，Matrige膠，角叉菜膠，明膠，IV型膠原中的一種。
5.如權(quán)利要求1、2所述的一種干燥羊膜的制備方法，其特征在于所述的羊膜著色的 有色染料包括熒光素鈉，虎紅，臺盼藍，龍膽紫，結(jié)晶紫，麗絲胺綠，酚紅，美藍，番紅，甲基藍 及洋紅中的一種，其中溫度為16°C -37°C，染色時間30s-5min。
6.如權(quán)利要求1、2所述的一種干燥羊膜的制備方法，其特征在于所述的鋪膜包括硝 酸纖維素膜，乙酸纖維素膜，微孔濾膜，蓋玻片中的一種。
7.如權(quán)利要求1、2所述的一種干燥羊膜的制備方法，其特征在于所述的干燥技術(shù)處 理為真空凍干，真空晾干，無水Cacl2真空干燥，自然晾干，吹干，30-60°C溫箱內(nèi)烘干中的一 種或一種以上的組合，干燥至羊膜材料的含水量在0. 1-5%之間后取出。
8.如權(quán)利要求1、2所述的一種干燥羊膜的制備方法，其特征在于所述的羊膜材料消 毒技術(shù)采用鈷60消毒。
全文摘要
一種干燥羊膜的制備方法，其特征在于包括如下步驟將反復(fù)漂洗的無病毒攜帶新鮮羊膜經(jīng)過嚴格消毒，低溫下基質(zhì)重建及修復(fù)，鋪膜，干燥，鈷60消毒后保存?zhèn)溆?。具有制作流程簡單、可靠，且易于實施；成本相對較低，易于推廣；可常溫下保存，運輸方便，羊膜細胞表型和基底膜完整，羊膜基質(zhì)破壞極少，優(yōu)于同時間保存的單純凍干羊膜等優(yōu)點。
文檔編號A61L27/36GK102133427SQ201010113960
公開日2011年7月27日 申請日期2010年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月21日
發(fā)明者周海華 申請人:周海華