專利名稱：：3,5-二咖啡?？崴峒柞サ闹苽浞椒捌渌幬锝M合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及中藥化學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及菊科、忍冬科等植物中的一種或多種植物的提取物作為中間體，采用半合成的方式，得到3，5-二咖啡?？崴峒柞?3，5-DCQAME)的制備方法、3，5-DCQAME的抗流感和抗肝炎用藥物組合物。
背景技術(shù)：
：流行性感冒(Influenza)，簡稱流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。主要通過空氣飛沫傳播。流感病毒屬于正黏病毒科，為有包膜的RNA病毒，分甲、乙、丙3型。其中甲型容易發(fā)生變異，它所引起的流感流行最為廣泛和嚴(yán)重，是國際間重點監(jiān)測的傳染病之一。流感一旦流行、傳播快、波及面廣，對人民健康及勞動生產(chǎn)力有很大影響，而且對年老體弱多病者及嬰幼兒的威脅很大，常因?qū)е虏l(fā)癥而死亡。流感病人治療一般采用對癥治療，大多用解熱鎮(zhèn)痛藥和抗過敏藥。對年老體弱多病者及嬰幼兒注意防止肺炎等并發(fā)癥。病人隔離至退熱后2天。目前治療的主要藥物為金剛烷胺和金剛乙胺，僅對甲型有效，但藥物副作用較多且可產(chǎn)生耐藥性。正在開發(fā)進入臨床研究的有扎那米韋(Zanamivir)和奧司他韋(Osetamivir)，均為神經(jīng)氨酸酶抑制劑，雖對甲、乙型流感有效，但對流感的全身感染無效，有惡心、嘔吐等副作用。目前正在研發(fā)的抗流感病毒藥物還有抑制病毒脫殼的普可那利(Pleconaril)和蛋白酶抑制劑戸普林曲韋(Ruprinhivir)，此兩藥均未進入臨床應(yīng)用。中醫(yī)藥對流感的治療，具有獨特的療效。從中藥中篩選抗流感病毒的有效成分，或進一步做化學(xué)修飾，是抗流感病毒藥物開發(fā)的一種新嘗試。我國是病毒性肝炎的高發(fā)地區(qū)，以乙型肝炎病毒HBV感染為主。乙肝病毒攜帶者超過1.2億，現(xiàn)在有約3000萬患者需要治療，每年因肝病死亡約30萬人，至少帶來直接經(jīng)濟損失500億人民幣。此外，慢性乙肝病人經(jīng)5-20年后約有12%可發(fā)展為肝硬化，在肝硬化病人中大約20%患者最終發(fā)展為肝功能衰竭，5%發(fā)展為肝癌。因此，慢性病毒性肝炎的治療不僅給國家和患者家庭造成巨大的經(jīng)濟負擔(dān)，同時也引起就業(yè)、升學(xué)等嚴(yán)重社會問題。肝炎病毒利用宿主細胞的DNA、RNA及蛋白合成系統(tǒng)進行復(fù)制，并將自身的核酸信息整合到宿主細胞的DNA中，與宿主細胞同時復(fù)制并在復(fù)制過程中不斷產(chǎn)生錯誤而形成變異，上述過程是肝炎病毒重要的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，也是抗肝炎病毒藥物，包括抗病毒、保肝(抗纖維化)、免疫調(diào)控等仍存在諸多問題。核苷類藥物及干擾素為主的藥物雖具有一定的抗病毒作用，但是其對共價閉環(huán)HBVDNA的清除作用尚不確定，停藥后易反跳，況且用藥后發(fā)生不同程度的病毒變異。干擾素臨床上有效率僅有30-50%，且與核苷類一樣有副作用。從我國遼闊藥物資源中發(fā)掘活性天然產(chǎn)物，研制新型特色抗乙肝病毒藥物是尋找具有自主知識產(chǎn)權(quán)新藥的關(guān)鍵和突破口。綠原酸(chlorogenicacid)是由咖啡酸(caffeicacid)與奎尼酸(雞納酸，quinicacid)組成的一取代的縮酚酸，異名咖啡鞣酸，化學(xué)名5-氧-咖啡酰奎尼酸(5-0-Caffeoylquinicacid)，是植物在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物。綠原酸為眾多藥材(如金銀花、茵陳、杜仲)以及中成藥(如復(fù)肝寧、雙花注射劑、粉剌口服液)中抗菌解毒、消炎利膽的主要有效成分，同時是某些中藥制劑質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。它是一種重要的生物活性物質(zhì)，具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用，尤其是在病毒防治領(lǐng)域有重要用途。二咖啡?？崴?Dicaffeoylquinicacid，DCQA)，也稱二咖啡酰奎尼酸。它們是奎尼酸的二咖啡酸酯，根據(jù)咖啡酰基取代位置不同，可以有1，5-二咖啡?？崴?，1，3二咖啡?？崴?，l，4-二咖啡?？崴?，3，5-二咖啡?？崴幔?，4-二咖啡?？崴?，4，5-二咖啡?？崴?。二咖啡?？崴嶙鳛橐环N藥理活性成分，其作用范圍較為廣泛，具有抗病毒(CN1087508;EP1008344;US5331565;US20020111382)、抗氧化(CN1136434)、提高免疫力(CN1136434)、抗肝損傷(CN1476842;孫燕榮，董俊興，等軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2002,26(1):39)、抗誘變(Yosh翻toM.，ETAL.，BiosciBiotecchnolBiochem，2002，66(11):2336)等作用，在病毒感染、心血管疾病(CN1136434;CN1381236;CN1462620;KR20022085507)等方面有一定療效。特別是對乙肝病毒(CN1087608;EP1008344;US6331565)、艾滋病毒(CN1087608;EP1008344;US6331565)、冠狀病毒感染(CN1449751)，二咖啡?？崴嵊刑厥庵委熥饔?。也有人將其用于化妝品(EP577516;US5445816)。二咖啡?？崴峥梢酝ㄟ^從含有該成分的植物中分離得到(EP0299107)，也可以由化學(xué)合成得到。含有二咖啡?？岚彼岬闹参锘蛑参锊课挥薪疸y花、山銀花、旋覆花、北劉寄奴、燈盞花草、杜仲、咖啡豆、葵花籽等?；瘜W(xué)合成的方法可參考CN1270955和US5401858。作為對抗病毒藥物研究的一部分工作，我們對這類重要天然產(chǎn)物進行了研究。我們選擇先從植物中分離出中間體，再對其進行合成和結(jié)構(gòu)改造，得到了一系列的咖啡?？崴犷惢衔?，并測試了其對HBVDNA和/或HbsAg的抑制活性，以期尋找對乙肝病毒生在顯示抑制作用的先導(dǎo)化合物。從中我們篩選并得到3，5-二咖啡?？崴峒柞?3，5-DCQAME)，發(fā)現(xiàn)它在抗甲型流感和乙型肝炎病毒方面具有顯著的療效。由于3，5-DCQAME在多數(shù)植物中含量極低，而它的去甲基酸3，5-DCQA含量相對較高。本發(fā)明采用半合成的方式制備3，5-DCQAME，用于抗甲流病毒和抗乙肝病毒。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>3，5-二咖啡酰奎尼酸甲酯
發(fā)明內(nèi)容鑒于上述情況，本發(fā)明的目的在于提供以菊科/忍冬科植物為原材料提取中間體，最終合成抗乙型肝炎、甲型流感病毒用途的3，5-二咖啡酰奎尼酸甲酯。為了完成本發(fā)明目的，本發(fā)明采取如下的技術(shù)方案本發(fā)明提供一種下式(1)所示的3，5-二咖啡?？崴峒柞サ闹苽浞椒?，包括提取步驟，是對作為原藥材的忍冬科/菊科植物，用溶劑法進行提取，濃縮，再經(jīng)純化得到前體物的步驟；禾口合成步驟，是對所述提取步驟中獲得的前體物進行甲酯化而合成3，5-二咖啡?？崴峒柞サ牟襟E。所述提取步驟中，所述溶劑法進行提取，優(yōu)選是對作為原藥材的菊科/忍冬科植物的地上部分進行干燥并適當(dāng)?shù)姆鬯?，用水、醇類、或水與醇類的混合物進行提取。其中，所述原藥材菊科/忍冬科植物優(yōu)選為忍冬科植物灰氈毛忍冬。所述地上部分包括莖、葉子、花蕾、花和種子，優(yōu)選是花蕾，經(jīng)干燥并適當(dāng)?shù)姆鬯?，以增大與溶劑的接觸面積，提高效率。所述醇類、或水與醇類的混合物中，優(yōu)選醇類，尤其是低分子量的醇，包括甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇等，等優(yōu)選的是乙醇。提取溶劑量優(yōu)選為原藥材重量的5-30倍。并且，提取前可以浸泡。提取可以在靜態(tài)或動態(tài)下，優(yōu)選在動態(tài)條件下。為了提高提取效率，可以使用超聲波等。提取的溫度是從室溫(20°C)到溶劑回流溫度的范圍內(nèi)，優(yōu)選在回流的溫度下。提取可連續(xù)或間歇進行，間歇提取時可重復(fù)1-4次。所述濃縮是指，合并和過濾如上獲取的提取液，濾去藥渣，濾液在動態(tài)狀態(tài)下，在常壓或減壓加熱濃縮至沒有溶劑的浸膏。再對所述浸膏石油醚脫油后，乙酸乙酯萃取?；厥找宜嵋阴ィ酶煞?。所述純化是指，對如上所得干粉進行柱層析，經(jīng)硅膠柱層析和結(jié)晶技術(shù)，得3，5-DCQAME前體化合物3，5-DCQA。其中，柱層析可以通過大孔樹脂、離子樹脂、吸附柱層析，優(yōu)選吸附柱層析，更優(yōu)選的是大孔吸附樹脂，可以層析得到有效部位。洗脫系統(tǒng)可以選擇甲醇_水、乙醇_水、丙酮_水等進行，更優(yōu)選的是乙醇_水系統(tǒng)，將制得的黑綠色浸膏用水溶解后，上預(yù)先處理好的D-lOl、HPD-IOO、D-201、XDA-1、XDA-5、LSA-20、LSA-IO、LSI-311、LSI-208、S-8、X-5/D4020、AB-8等類型的大孔吸附樹脂，優(yōu)選D101型或HPD-100型，AB-80收集主含異綠原酸的部分；大孔吸附樹脂的洗脫條件以D101型為例大孔樹脂使用前先用5%NaOH、10X醋酸和95%乙醇分別處理，待用蒸餾水將樹脂洗到無醇味時，上樣，上樣濃度為0.5g生藥/ml最佳，上樣量與樹脂的比例為1:2-4，其中l(wèi):2最佳，上樣流速控制在0.5倍樹脂柱體積(BV)/h最佳。先用水于3倍樹脂柱體積，按照流速為lBV/h，洗脫，再用10X乙醇，5BV按照流速為lBV/h洗脫，后用30-40%乙醇于3BV，最佳洗脫濃度為35%，按照流速為lBV/h收集該部分，減壓真空濃縮干燥后在進行下一步的分離。然后，35%乙醇洗脫部分提取物溶解在蒸餾水里，濃度為0.5-lg生藥/ml，0.7g生藥/ml為最佳，調(diào)節(jié)pH至1-4范圍，其中2-3為最佳，通過乙酸乙酯萃2-5次，其中最佳為3次，得到異綠原酸類化合物，減壓濃縮得干粉，干粉經(jīng)硅膠柱層析和結(jié)晶技術(shù)，得3，5-DCQAME前體化合物3，5_DCQA。所述合成步驟中，優(yōu)選在對甲苯磺酸或二甲氨基吡啶作催化劑的條件下，使前體化合物3，5-DCQA與甲醇反應(yīng)制得3，5-DCQAME。詳細如下在反應(yīng)瓶中加入過量的甲醇，在對甲苯磺酸或二甲氨基吡啶作催化劑的條件下回流反應(yīng)，并不斷攪拌，回流反應(yīng)20h，加入等體積水，減壓蒸干甲醇，用乙酸乙酯(2BV)萃取，合并萃取液，用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑得到3，5-DCQAME根據(jù)本發(fā)明的3，5-二咖啡?？崴峒柞サ闹苽浞椒?，可從3，5-DCQAME含量極低的多數(shù)植物中，大量生產(chǎn)3，5-二咖啡?？崴峒柞ィ⑶移浼兌雀哌_90%以上。另外，本發(fā)明還提供一種抗流感和抗肝炎用藥物組合物，其作為有效成分含有3，5-二咖啡?？崴峒柞ゼ捌溲苌?、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、多晶形物、酯、鹽和溶劑化物。其中，所述3，5-二咖啡?？崴峒柞ナ峭ㄟ^對忍冬科/菊科植物提取物進行甲酯化而制備的。其中，所述忍冬科/菊科植物提取物是對作為原藥材的忍冬科/菊科植物優(yōu)選對山銀花，用溶劑法進行提取，濃縮，再經(jīng)純化得的3，5-二咖啡酰奎尼酸甲酯前體物。提取物的具體制備方法同于上述的"提取步驟"，所以在此省略其相關(guān)描述。所述的甲酯化是在對甲苯磺酸或二甲氨基吡啶作催化劑的條件下，使所述忍冬科/菊科植物提取物，經(jīng)甲酯化合成制得3，5-DCQAME的步驟。具體步驟同于上述的"合成步驟"，所以在此省略其相關(guān)描述。并且，本發(fā)明的抗流感和抗肝炎用藥物組合物中，對所含的3，5_二咖啡?？崴峒柞サ牧繜o特別限制，有效劑量即可，通常含有O.1_95%重量。對于其它組分，也無特別限制，可與一種或多種固體或液體藥物賦形劑和/或輔料結(jié)合，制成可作為人藥或獸藥使用的適當(dāng)?shù)氖┯眯问交蛴嬃啃问健１景l(fā)明的抗流感和抗肝炎用藥物組合物可以單位劑量形式給藥，給藥途徑可為腸道或非腸道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮膚、腹膜或直腸等，優(yōu)選口服給藥。還可以注射給藥。注射包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射等。給藥劑型可以是液體劑型、固體劑型。如液體劑型可以是真溶液類、膠體類、微粒劑型、乳劑劑型、混懸劑型。其它劑型例如片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、栓劑、凍干粉針劑等。本發(fā)明的抗流感和抗肝炎用藥物組合物可以制成普通制劑、也可以是緩釋制劑、控釋制劑、靶向制劑及各種微粒給藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等；濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素納、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、糖酸鈣、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙6基纖維素等；崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等；吸收促進劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。例如為了將給藥單元制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等；粘合劑，如阿拉伯膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干這淀粉、海藻酸鹽、十二烷基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。例如為了將給藥單元制成膠囊，將有效成分本發(fā)明提取物、合成物與上述的各種載體混合，并將由此得到的混合物置于硬的明膠膠囊或軟膠囊中。也可將有效成分制成微囊劑，混懸于水性介質(zhì)中形成混懸劑，亦可裝入硬膠囊中火制成注射劑應(yīng)用。例如，可將本發(fā)明的抗流感和抗肝炎用藥物組合物制成注射劑用制劑，如溶液劑、混懸劑溶液劑、乳劑、凍干粉針劑，這種制劑可以是含水或非水的，可含一種和/或多種藥效學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、粘合劑、潤滑劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑。如稀釋劑可選自水、乙醇、聚乙二醇、l，3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、PH調(diào)節(jié)劑等。這些輔料是本領(lǐng)域常用的。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香料、矯味劑、甜味劑或其它材料。為達到用藥目的，增強治療效果，本發(fā)明的藥物組合物用任何公知的給藥方法給藥。本發(fā)明的抗流感和抗肝炎用藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預(yù)防或治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，患者或動物的性別、年齡、體重、性格及個體反應(yīng)，給藥途徑、給藥次數(shù)、治療目的，因此本發(fā)明的治療劑量可以有大范圍的變化?！銇碇v，本發(fā)明中藥學(xué)成分的使用劑量是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明提取物、合成物組合物中最后的制劑中所含有的實際藥物數(shù)量，加以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以達到其治療有效量的要求，完成本發(fā)明的預(yù)防或治療目的。本發(fā)明提取物、化合物的每天的合適劑量范圍本發(fā)明的提取物、合成物的用量為0.001-100mg/Kg體重，優(yōu)選為0.01-60mg/Kg體重，更優(yōu)選為0.05-10mg/Kg體重，最優(yōu)選為0.l-lmg/Kg體重。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥著受限于給藥醫(yī)生的臨床經(jīng)驗以及包括運用其它治療手段的給藥方案。每一種治療所需總劑量可分成多次或按一次劑量給藥。本發(fā)明的提取物或合成物可以單獨服用，或與其他治療藥物或?qū)ΠY藥物合并使用并調(diào)整劑量。本發(fā)明的3，5-DCQAME有良好的抗病毒作用，尤其是抗肝炎病毒作用。3，5-DCQAME加入2.2.15細胞培養(yǎng)液中能明顯抑制HbsAg和HbeAg的復(fù)制和表達，說明本發(fā)明的化合物對乙型肝炎病毒有抑制作用。雛鴨感染鴨乙型肝炎病毒(DHBV)后給予3，5-DCQAME，0.3g/一天2次，10天對感染鴨乙型肝炎病毒感染的鴨血清中DHBVDNA水平的抑制效果有顯著性作用。實驗結(jié)果表明3，5-DCQAME對乙肝病毒具有較強的抑制作用。本發(fā)明的3，5-DCQAME有良好的抗流感病毒作用。3，5-DCQAME具有抗型病毒的活性，其抗&^的SI為22.9，相當(dāng)于陽性對照藥奧斯他韋。具有顯著的抗流感病毒活性。本發(fā)明的有益之處是本發(fā)明涉及的該類化合物化合物3，5-DCQAME具有抑制乙型肝炎病毒核糖核酸復(fù)制和降低乙肝病毒表面抗原表達的功能。該類化合物來源于對天然產(chǎn)物異綠原酸的結(jié)構(gòu)改造，而他們對于正常細胞的毒性較低，且經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造后的化合物具有較好的抑制乙肝病毒活性，可以預(yù)期作為防治病毒性乙肝的藥物。本發(fā)明涉及的化合物合成方法簡單、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率較好、成本較低，因此具有較可行的市場化前景。并且，本發(fā)明也包括通式化合物(1)的衍生物，它們的立體異構(gòu)體，它們的多晶形物，它們的藥學(xué)上可接受的鹽，它們的藥學(xué)上可接受的溶劑化物。本發(fā)明涉及如通式(1)所示化合物藥效上可接受的衍生物或前藥，意思是如通式(1)所示化合物的任何可接受的鹽，酯和酯的鹽；或者本發(fā)明化合物的其它衍生物，其在給予受者時，能直接或間接的提供本發(fā)明的化合物。尤其優(yōu)選的衍生物和前藥是，當(dāng)這種化合物給予哺乳動物時，能增加本發(fā)明化合物穩(wěn)定性的，和/或能增加本發(fā)明化合物生物利用度的(例如，使口復(fù)給藥的化合物更易于吸收入血)，和/或能增加本化合物在相關(guān)本物種的生物隔室(例如，肝臟，腫瘤)的分布。前藥是任何和載體的通過共價鍵的相連的，當(dāng)這種前藥給予哺乳動物患者時，其在體內(nèi)釋放如通式(1)活性的化合物。優(yōu)選的前藥包括，但不限定于，增加水溶性或通過生物膜的活性透過性基團連上如通式(1)的結(jié)構(gòu)而形成的衍生物。通式(1)化合物的前藥的制備是通過修飾在化合物中存在的取代基，用這樣的方法，這種修飾對于本化合物是能分離的，無論使用常規(guī)的方法或內(nèi)。前藥包括通式(1)的化合物中羥基連上任何的取代基，當(dāng)給予哺乳動物患者時，分離后形成自由的羥基。前藥的實施例包括但不限于通式(1)化合物中羥基的乙?；?，甲酰化等。如通式(1)所示的化合物的各種多晶型物構(gòu)成本發(fā)明的部分并且可以通過在不同的條件下的化合物結(jié)晶制備。例如，使用不同的通常使用餓溶劑或它們的混合物來結(jié)晶；在不同的溫度下結(jié)晶；各種不同的模式來冷卻；在結(jié)晶過程中，從非常快到非常慢的范圍。多晶型物可以通過加熱或熔融化合物接著漸進的或快速的冷卻獲得。多晶型物的存在可以NMR，IR，熱差掃描，X-光粉末衍射或其它的技術(shù)來確證。本發(fā)明的化合物可以修飾通過連上相似的功能基來增加選擇的生物性能。這種修飾在本領(lǐng)域是公知的，包括但不限于，那些增加穿透進入特定的生物隔室(例如肝)，增加口服或靜脈內(nèi)的生物利用度，增加溶解性允許通過注射劑給藥，改變代謝，改變排泄的速率等。圖1為實施列的l-DCQAME的制備方法工藝流程圖。具體實施例方式下面的實施例及藥物活性演示用來進一步說明本發(fā)明，但并不意味著對本發(fā)明的任何限制。實施例1:3，5-DCQAME的制備取灰氈毛忍冬干燥花蕾20kg，置于圓底燒瓶內(nèi)，加入12倍重量的蒸餾水回流提取，第一次煎煮1.5小時，濾過，濾渣加入10倍量蒸餾水回流提取1.5小時，濾過，濾渣加入IO倍量蒸餾水回流提取1小時，合并三次提取液，提取液經(jīng)減壓濃縮干燥后，制得淺黃色浸膏；將制得的淺黃色浸膏用水溶解后，上預(yù)先處理好的D101型大孔吸附樹脂，結(jié)合HPLC色譜分析，收集含有異綠原酸的部分；大孔吸附樹脂的洗脫條件大孔樹脂使用前先用5%Na0H、10X醋酸和95%乙醇分別處理，待用蒸餾水將樹脂洗到無醇味時，上樣，上樣濃度為0.5g生藥/ml，上樣量與樹脂的比例為1:3，上樣流速控制在0.5BV/h。先用3倍柱體積水按照流速為lBV/h沖洗，再用5倍量10%乙醇按照流速為lBV/h沖洗綠原酸，后用35%乙醇洗脫，按照流速為lBV/h收集該部分作為下一步的分離對象。35%乙醇洗脫部分溶解在蒸餾水里，調(diào)整濃度為0.7g生藥/ml，調(diào)節(jié)pH至23范圍，然后加入2倍量體積的乙酸乙酯萃取3次，得到較純的異綠原酸類化合物。得到的異綠原酸類化合物，經(jīng)減壓濃縮真空或冷凍干燥后得干粉，干粉經(jīng)硅膠柱層析和結(jié)晶，得3，5-DCQAME的制備中間體化合物3，5-DCQA(110g)。取中間體100g，在反應(yīng)瓶中加入過量的甲醇，在對甲苯磺酸作催化劑的條件下回流反應(yīng)，并不斷攪拌，回流反應(yīng)20h，加入等體積水，加壓蒸干甲醇，水溶液用乙酸乙酯(2BV)萃取2次，合并萃取液，用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑得到咖啡酰奎尼酸類甲酯類化合物。層析分離，重結(jié)晶，制得3，5-DCQAME(50g)。制得的化合物經(jīng)LC-MSHNMR并結(jié)合相關(guān)文獻，結(jié)構(gòu)鑒定為3，5_二咖啡酰奎尼酸甲酉旨(3，5-Dicaffeoyquinicacidmethylester)，即3，5-DCQAME。3，5-DCQAME為淡黃色粉末，易溶于甲醇，難溶于水。MS:m/e529,HNMR:5.20(H_3)，3.84(H_4)，5.13(H_5)，6.26(1H，J=15.3，Ca-H)，6.24(1H，J=15.3，Ca_H)，7.44(1H，J=15.3，Ce_H)，7.47(1H，J=15.3，Ce-H)，9.59(0H-4，)，9.18(0H_3，)，3.81(3H，0CH3)。實施例2:3，5-二咖啡?？崴峒柞セ衔锏哪z囊劑制備處方3，5-DCQAME15gPVPK3。1.5g微晶纖維素4.5g低取代羥丙纖維素0.45g羧甲基淀粉鈉0.45g硬酯酸鎂適量_100粒將上述藥物組合物與輔料混合，加入蒸餾水適量，充分?jǐn)嚢杌靹?，探頭超聲(4000r/min)5min后，高壓乳勻(壓力lOOObar)10圈，得混懸液;真空干燥，過80目篩，70%乙醇制粒，干燥，裝膠囊，制成IOO粒，即得。實驗例3:3，5-DCQAME的抗肝炎病毒作用試驗藥物3，5-DCQAME(按實施例1中制備的化合物，批號20091115)試劑DMEM(美國Gibco公司產(chǎn)品)；胎牛血清(美國Gibco產(chǎn)品)；G_418(美國Sigma公司產(chǎn)品)；HbeAg，HbsAg固定相放射免疫測定盒(中國同位素公司北方免疫試劑研究所產(chǎn)品)；2.2.15細胞為了轉(zhuǎn)染HBV(Aayw亞基)全基因組，能分泌HbeAg、HbsAg、HBV-DNA顆粒的人肝母瘤細胞系，(美國Mountsinai醫(yī)學(xué)中心構(gòu)建，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)9所病毒室傳代培養(yǎng))。實驗方法以每毫升10萬個2.2.15細胞接種24孔培養(yǎng)板，每孔lml，37°C5%C02培養(yǎng)24小時，加無毒濃度以下2倍稀釋試驗藥液，5個稀釋度分別為4、2、1、0.5、0.25mg/ml，每濃度3孔，37t:5%C02培養(yǎng)，收集第8天含藥培養(yǎng)液，-2(TC冰凍保存。參照固相放射免疫測定盒說明書測定，用Y計數(shù)儀測定每孔cpm值。實驗設(shè)HBeAg，HBsAg陽性和陰性對昭。表13，5-DCQAME在2.2.15細胞中對HBsAg的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表23，5-DCQAME在2.2.15細胞中對HBeAg的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實驗表明3，5-DCQAME加入2.2.15細胞培養(yǎng)8天，明顯抑制HBsAg和HBeAg的分泌，能抑制2.2.15細胞HBsAg和HBeAg的復(fù)制和表達。本發(fā)明化合物對2.2.15細胞培養(yǎng)內(nèi)對乙型肝炎病毒有抑制作用，說明其對乙型肝炎病毒有較強的抑制作用。實驗例4:3，5-DCQAME的體內(nèi)抗肝炎病毒作用試驗藥物3，5-DCQAME(按實施例1中制備的化合物，批號20091115)試劑拉米夫啶(英國葛蘭素威康有限公司B022306);a-32P_dCTP(北京福瑞生物技術(shù)工程公司，批號081206);缺口翻譯藥盒(Promega公司，批號080426);鴨乙型肝炎病毒為鴨乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)強陽性上海麻鴨血清(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)所病毒室提供，-7(TC保存)動物1日齡北京維鴨購自北京南苑養(yǎng)鴨場實驗方法1日齡北京鴨，經(jīng)腿脛靜脈注射上海麻鴨DHBV-DNA陽性鴨血清，每只0.3ml，感染后7天取血，分離血清，檢測血清中DHBV-DNA含量。雛鴨血清脛檢測DHBV呈陽性后，將鴨隨機分為5組，病毒對照組、拉米夫啶組(50mg/kg)、3，5-DCQAME(160、80、40mg/kg)三個計量組，每組6只。灌胃給藥，1.5ml/只，每天2次。對照組給予同體積生理鹽水，連續(xù)給藥10天。分別于藥物治療后5天(T5)、10天(T1Q)和停藥后3天(P3)自鴨脛靜脈取血，分離血清，按缺口翻譯試劑和說明書方法，用32P標(biāo)記DHBV-DNA探針，并作鴨血斑點雜交，放射自顯影膜片斑點，酶標(biāo)儀測定0D值(濾光片為490nm)，計算血清DHBV-DNA光密度，以雜交斑點OD值作為標(biāo)本DHBV-DNA水平值。表3:3，5-DCQAME治療組與病毒感染對照組鴨血清DHBV-DNA水平抑制比較<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>統(tǒng)計結(jié)果給藥治療組DHBV-DNA抑制率與病毒對照組同時間的DHBV-DNA抑制率比較(成組t檢驗)。試驗結(jié)果表明，3，5-DCQAME0.3g/kg，一天2次，10天對感染鴨乙型肝炎病毒感染的鴨血清中DHBV-DNA水平的抑制效果有顯著作用，無毒性反應(yīng)。與陽性藥拉米夫啶口服DHBV-DNA的抑制作用比較，0.30/kg組在10天時抑制作用較強，且反跳慢，但統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異。以上實驗結(jié)果表明3，5-DCQAME對鴨乙型肝炎病毒感染鴨具有很好的治療作用。實施例5:藥物的抗甲型流感病毒作用試驗藥物3，5-DCQAME(按實施例1中制備的化合物，批號20091115)實驗材料DMEM(Gibco公司)，細胞維持液除含1%胎牛血清(FBS，美國Gibco產(chǎn)品)，其他成分同DMEM培養(yǎng)液。H印2細胞、MDCK細胞、流感病毒標(biāo)準(zhǔn)株(A/PR8/34)，流感A型病毒(FluA，H^)，由解放軍傳染病研究所提供。96孔細胞培養(yǎng)板，美國Calif產(chǎn)品。細胞毒性試驗H印2細胞或MDCK細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板，放在37t:的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d，待細胞長成單層后，去掉培養(yǎng)液，加入0.lml維持液對半稀釋的供試藥物溶液，同時設(shè)O.lmL維持液作為空白對照。繼續(xù)置于37t:的(A培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-5d，每天在光鏡下觀察供試藥品對H印2細胞或MDCK細胞的細胞病變(CPE)情況(0:0%CPE，1:1%-25%CPE，2:25%-50%CPE，3:50%-75%CPE，4:75%-100%CPE)包括細胞單層的脫落、變圓、皺縮、胞漿中顆粒和空泡的形成。半毒性濃度(CC5。)以Pg.m"表示，最大細胞無毒濃度(MNCC)是指在光鏡下觀察檢測到的對細胞不產(chǎn)生毒性的藥品的最大濃度?？共《驹囼濰印2細胞或MDCK細胞培養(yǎng)方法同上，去掉培養(yǎng)液，加入0.lml病毒懸液和O.lml的MNCC為最高濃度對半稀釋后的供試藥物溶液，同時以不含供試藥物的維持液作為空白對照。96孔板置于37t:的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-5d。光鏡下檢測病毒引起的細胞病變情況(CPE計分同上)。病毒繁殖的減少一病毒對照的百分?jǐn)?shù)(％，virUSCOntrol=CPEexperiment/CPEviruscontrol*100%)計算，半數(shù)抑制率濃度(IC5。)以iig.ml—1表示。治療指數(shù)SI=CC5。/IC5。。實驗中達菲(奧斯他韋)為平行陽性對照藥物。表4抗FluA諷N》感染的實驗結(jié)果(MDCKcells)藥物和對照藥ic50CC50SI("g,ml-1)(jug.ml-1)咖啡酰奎尼酸甲酯組分8.7200.022.9奧斯他韋8.3200.024.1結(jié)果表明，3，5-DCQAME具有顯著的抗流感病毒活性。實施例6:3，5-DCQAME化合物的制備按照如下步驟制備(以山銀花中的灰氈毛忍冬LoniceramacranthoidesHand.-Mazz.干燥藥材部位為例)取干燥藥材lkg，以10倍量水煎煮兩次，每次1小時，合并煎液，減壓濃縮至0.5g生藥/mL，加于D101型大孔吸附樹脂上(上樣量與樹脂體積比為l:24)，先用3倍柱體積水洗脫，棄去水液。再用5倍柱體積10%乙醇洗脫，棄去10%乙醇洗脫液。繼用5倍柱體積3040%乙醇洗脫，收集洗脫液，干燥，殘渣加水溶解至濃度為0.5lg生藥/ml，加稀鹽酸調(diào)pH至14后，用乙酸乙酯萃取35次，合并乙酸乙酯液，回收溶齊U，得原料藥提取物14g。干粉經(jīng)硅膠柱層析和結(jié)晶，得3，5-DCQAME的制備中間體化合物3，5_DCQA(5.6g)。在反應(yīng)瓶中加入過量的200mg二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和催化量的50mg4_二甲氨基吡啶(DMAP)，以100ml二氯甲烷做反應(yīng)溶劑在室溫下回流反應(yīng)，并不斷攪拌，反應(yīng)lh。之后，往反應(yīng)瓶中加入實施例1中原料藥提取物lg，室溫條件下回流反應(yīng)，并不斷攪拌，回流反應(yīng)24h，將反應(yīng)液減壓抽慮，減壓回收反應(yīng)溶劑。加入100ml甲醇，甲醇溶液用石油醚(2BV)萃取2次，石油醚層棄去。將甲醇層減壓回收，加入100ml乙酸乙酯，乙酸乙酯溶液用水(2BV)萃取兩次，水層棄去，減壓蒸干乙酸乙酯得產(chǎn)物800mg。層析和重結(jié)晶，得到目的化合物。制得的化合物經(jīng)LC-MSHNMR并結(jié)合相關(guān)文獻，結(jié)構(gòu)鑒定為3，5_二咖啡?？崴峒子现?3，5-Dicaffeoyquinicacidmethylester)，即3，5-DCQAME。3，5-DCQAME為淡黃色粉末，易溶于甲醇，難溶于水。實施例7:3，5-DCQAME的制備取灰氈毛忍冬干燥莖葉lkg，置于圓底燒瓶內(nèi)，加入12倍重量的蒸餾水回流提取，第一次10倍量蒸餾水煎煮1.0小時，濾過，濾渣加入10倍量蒸餾水回流提取1.0小時，濾過，合并二次提取液，提取液經(jīng)減壓濃縮干燥后，制得浸膏；將制得的浸膏用水溶解后，上預(yù)先處理好的D101型大孔吸附樹脂，結(jié)合HPLC色譜分析，收集含有異綠原酸的部分；大孔吸附樹脂的洗脫條件大孔樹脂使用前先用5%NaOH、10X醋酸和95X乙醇分別處理，待用蒸餾水將樹脂洗到無醇味時，上樣，上樣濃度為0.5g生藥/ml，上樣量與樹脂的比例為l:3，上樣流速控制在0.5BV/h。先用3倍柱體積水按照流速為lBV/h沖洗，再用5倍量10%乙醇按照流速為lBV/h沖洗綠原酸，后用35%乙醇洗脫，按照流速為lBV/h收集該部分作為下一步的分離對象。35%乙醇洗脫部分溶解在蒸餾水里，調(diào)整濃度為0.7g生藥/ml，調(diào)節(jié)pH至23范圍，然后加入2倍量體積的乙酸乙酯萃取3次，得到較純的異綠原酸類化合物。得到的異綠原酸類化合物，經(jīng)減壓濃縮真空或冷凍干燥后得干粉。干粉經(jīng)硅膠柱層析和結(jié)晶，得3，5-DCQAME的制備中間體化合物3，5-DCQA(5.Og)。取提取物lg，在反應(yīng)瓶中加入過量的甲醇，在對甲苯磺酸作催化劑的條件下回流反應(yīng)，并不斷攪拌，回流反應(yīng)20h，加入等體積水，加壓蒸干甲醇，水溶液用乙酸乙酯(2BV)12萃取2次，合并萃取液，用無水硫酸鈉干燥，減壓蒸干溶劑得產(chǎn)物(0.8g)。層析和重結(jié)晶，得到目的化合物。制得的化合物經(jīng)LC-MSHNMR并結(jié)合相關(guān)文獻，結(jié)構(gòu)鑒定為3，5_二咖啡?？崴峒柞?3，5-Dicaffeoyquinicacidmethylester)，即3，5-DCQAME。3，5-DCQAME為淡黃色粉末，易溶于甲醇，難溶于水。權(quán)利要求一種下式(1)所示的3，5-二咖啡?？崴峒柞サ闹苽浞椒?，包括提取步驟，是對作為原藥材的忍冬科/菊科植物，用溶劑法進行提取，濃縮，再經(jīng)純化得到前體物的步驟；和合成步驟，是對所述提取步驟中獲得的前體物進行甲酯化而合成3，5-二咖啡?？崴峒柞サ牟襟E；FSA00000024462300011.tif2.如權(quán)利要求1所述的3，5-二咖啡?？崴峒柞サ闹苽浞椒?，其特征在于，所述提取步驟中所述溶劑法提取，是對作為原藥材的菊科/忍冬科植物的地上部分進行干燥并適當(dāng)?shù)姆鬯椋盟?、醇類、或水與醇類的混合物進行提??；所述濃縮，是合并和過濾所述溶劑法提取中得的提取液，濾去藥渣，濾液在常壓或減壓狀態(tài)下加熱濃縮至沒有溶劑的浸膏，再對所述浸膏石油醚脫油后，乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯，得干粉；所述純化，是對所述干粉進行柱層析，經(jīng)硅膠柱層析和結(jié)晶，得前體物。3.如權(quán)利要求1所述的3，5_二咖啡?？崴峒柞サ闹苽浞椒?，其特征在于，所述合成步驟的甲酯化是在對甲苯磺酸或二甲氨基吡啶作催化劑的條件下進行的。4.如權(quán)利要求1所述的3，5_二咖啡酰奎尼酸甲酯的制備方法，其特征在于，所述忍冬科/菊科植物為山銀花。5.3，5-二咖啡?？崴峒柞ギa(chǎn)品，其特征在于，通過權(quán)利要求1至4中所述的任一制備方法制取。6.—種抗流感和抗肝炎用藥物組合物，作為有效成分含有權(quán)利要求5所述的3，5-二咖啡?？崴峒柞ギa(chǎn)品及藥效上可接受的衍生物或前藥、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、多晶形物、酯、鹽和溶劑化物。7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物在用于制備抗流感和抗肝炎藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種下式(1)所示的3，5-二咖啡?？崴峒柞サ闹苽浞椒捌淇沽鞲泻涂垢窝子盟幬锝M合物。本發(fā)明的制備方法通過以菊科、忍冬科等植物中的一種或多種植物的提取物作為中間體，采用半合成的方式，制備3，5-二咖啡?？崴峒柞ゼ捌淇沽鞲泻涂垢窝子盟幬锝M合物。根據(jù)本發(fā)明的3，5-二咖啡酰奎尼酸甲酯的制備方法，可從3，5-二咖啡?？崴峒柞ズ繕O低的植物中，大量生產(chǎn)高純度3，5-二咖啡?？崴峒柞ァＮ臋n編號A61P31/20GK101774920SQ20101011765公開日2010年7月14日申請日期2010年3月4日優(yōu)先權(quán)日2010年3月4日發(fā)明者張?zhí)鹛?肖小河,袁海龍申請人:中國人民解放軍第三○二醫(yī)院