專利名稱：：pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈給藥膠束及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及藥物釋放系統(tǒng)，具體涉及一種pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈給藥膠束及其制備方法。
背景技術(shù)：
：腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性(multidrugresistance,MDR)是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，對(duì)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的其他抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥性的現(xiàn)象。MDR的形成機(jī)制很復(fù)雜，既與細(xì)胞膜上的多藥耐藥性相關(guān)蛋白(multidrugresistanceassociatedprotein,MRP)、P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、月市多藥耐藥性相關(guān)蛋白(LRP)、乳癌耐藥性相關(guān)蛋白(BCRP)等膜蛋白有關(guān)，同時(shí)也與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II(topoisomerase，TopoII)、蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-s-transferase，GST)等酶有關(guān)(AmbudkarSV，DeyS，HrycynaCA，RamachandraM，PastanI，Gottesman匪.An皿.Rev.Pharmacol.Toxicol.1999，39，361398;HunterJ，HirstBH.Adv.DrugDeliv.Rev.1997，25，129157;MeschiniS，MarraM，CalcabriniA.Toxicol.InVitro2002，16，389398)。MDR的產(chǎn)生是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要原因之一，特別是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的在腫瘤分化和增殖過程中起到核心作用的腫瘤干細(xì)胞(tumorstemcells,TSC)更是普遍具有多藥耐藥性，因此逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性就成為當(dāng)前癌癥研究和治療領(lǐng)域亟待解決的重要課題。盡管人們也已發(fā)現(xiàn)多種化學(xué)藥物能夠抑制與多藥耐藥性有關(guān)的膜蛋白的活性，然而由于這些藥物普遍具有很強(qiáng)的毒副作用從而限制了其臨床應(yīng)用；另一方面，利用基因治療逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的理論與實(shí)踐都還遠(yuǎn)未成熟。因此，目前針對(duì)MDR最為可行的對(duì)策就是盡可能的增加腫瘤細(xì)胞治療靶點(diǎn)處的藥物濃度從而抵消MDR對(duì)藥物的外排和解毒作用。理想的、能夠有效對(duì)抗腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的載藥體系應(yīng)當(dāng)能夠定向的富集于腫瘤組織處并隨即迅速地釋放出所攜帶的藥物從而克服MDR。脂質(zhì)體和膠束等納米給藥系統(tǒng)可以通過被動(dòng)、主動(dòng)或物理化學(xué)的作用機(jī)制實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向給藥，然而普通的納米給藥系統(tǒng)在釋藥行為上不具有特異性，藥物載體雖然能夠聚集在腫瘤部位，但包裹在載體內(nèi)部的藥物卻往往不能及時(shí)釋放出來(lái)，這使得治療效果大打折扣。近年來(lái)剌激響應(yīng)型(Stimuli-responsive)聚合物材料正在吸引研究人員越來(lái)越多的目光(JeongB，GutowskaA.Biotechnol.2002，20，305311)，這類聚合物材料能夠識(shí)別剌激信號(hào)，根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱做出響應(yīng)改變自身構(gòu)象。其中，在腫瘤治療研究領(lǐng)域最受關(guān)注的是能夠響應(yīng)環(huán)境PH值變化而改變?nèi)芙舛鹊木酆衔锊牧?，這主要是基于以下原因絕大部分腫瘤組織周圍的環(huán)境pH值(6.157.4)都比正常組織周圍的生理pH值(7.07.4)低(VaupelP，KallinowskiF，0kunieffP.CANCERRESEARCH1989，49，64496465)，而且細(xì)胞中的內(nèi)涵體與溶酶體中pH值更低(5.06.5)。利用這些特征，如果能夠設(shè)計(jì)合適的pH敏感聚合物作為抗癌藥物載體，就有可能實(shí)現(xiàn)在腫瘤部位定點(diǎn)釋放藥物。目前國(guó)際上在藥物控釋和生物材料領(lǐng)域，一些比較知名的研究組在pH響應(yīng)型聚合物研究中注意力都集中在聚弱堿類聚合物上。Gast，AP等人報(bào)導(dǎo)了以聚甲基丙烯酸-2-(N，N-二乙氨基)乙酯(PDEAEMA)為疏水鏈段的嵌段共聚物的合成及其膠束結(jié)構(gòu)的pH依賴性(LeeAS，ButunV，VamvakakiM，ArmesSP，PopleJA，GastAP.Macromolecules2002，35，85408551);Langer，R小組發(fā)展了以P_氨基酯為pH敏感鏈段的新型聚合物作為藥物載體(Ly皿DM，LangerR.J.Am.Chem.Soc.2000，122，1076110768);Bae領(lǐng)導(dǎo)的課題組則在聚組氨酸嵌段共聚物及其給藥膠束方面開展了廣泛的研究工作(LeeES，NaK，BaeYH.NanoLett.，2005，5，325329)。這些作為藥物載體的pH敏感聚合物幾乎均為嵌段共聚物，其合成主要采取活性聚合反應(yīng)，條件苛刻而且往往需要使用相當(dāng)劑量的重金屬作為催化劑看，這些問題使得它們的醫(yī)療應(yīng)用受到很大的限制。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種以pH敏感型兩親接枝聚膦腈為載體構(gòu)建核的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈給藥膠束，該給藥膠束具有很好的靶向性和藥物的釋放效果。—種pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈給藥膠束，含有pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈和至少一種疏水性藥物；以藥物和pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的總重量計(jì)，藥物的重量百分含量為0.001%30%，pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的重量百分含量為70%99.999%;所述的疏水性藥物為疏水性抗腫瘤藥物或者疏水性化療藥物，所述的疏水性抗腫瘤藥物優(yōu)選紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、柔紅霉素、甲氨喋呤、絲裂霉素C中的一種或多種，最優(yōu)選紫杉醇、阿霉素中的一種或兩種。所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈以具有生物降解性的聚膦腈鏈段為骨架，通過向聚膦腈主鏈上接枝親水性聚合物鏈段、pH敏感基團(tuán)和能夠增強(qiáng)聚合物材料與藥物親和力的疏水基團(tuán)最終構(gòu)成完整的PH敏感型兩親接枝聚膦腈。所述的親水性聚合物一般可選用生物相容性好的端氨基聚乙二醇(NH2_PEG)，其結(jié)構(gòu)式如下所述的pH敏感疏水性基團(tuán)可選用具有叔胺結(jié)構(gòu)的分子團(tuán)，這類分子在pH值低于一定值時(shí)會(huì)發(fā)生質(zhì)子化從而實(shí)現(xiàn)由疏水到親水的轉(zhuǎn)變。所述的用來(lái)增強(qiáng)材料與藥物親和力的疏水基團(tuán)可選用可生物降解的氨基酸酯，如N-(乙酸乙酯基)氨基、N-(苯甲酸乙酯基)-4-氨基、N-[3-(l3-吲哚)丙酸乙酯基]-2-氨所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈，具有式(1)所示的結(jié)構(gòu)通式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中，R1、R2、R3和R4是接枝基團(tuán)，Rl為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>式中，n＝20200;<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>R2選自pH敏感基團(tuán)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>中的一種；R3、R4相同或者不同，選自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>以pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的質(zhì)量計(jì)，Rl的質(zhì)量百分含量為2%94.5%，R2的質(zhì)量百分含量為5%97%，R3的質(zhì)量百分含量為090%，R4的質(zhì)量百分含量為090%。為保證藥物膠束具有良好的載藥量、控制釋放、穩(wěn)定性、凍干粉的再分散性及聚合物的及時(shí)降解性能，所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的數(shù)均分子量為4000100000，優(yōu)選500050000。pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈中Rl的含量越高聚合物水溶性越高，R2含量越高聚合物pH敏感性能越強(qiáng)，其它基團(tuán)的加入主要是提高膠束與藥物的親和力。作為優(yōu)選所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈，以pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的質(zhì)量計(jì)，Rl的質(zhì)量百分含量為60%70%，R2的質(zhì)量百分含量為5%39%，R3的質(zhì)量百分含量為034.5%，R4的質(zhì)量百分含量為034.5%。所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的分子量分布為1.54.0。所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈，具有式(2)、式(3)或者式(4)所示的結(jié)構(gòu)通式HNOR3V/s^-fsj:=:pt/V^fsj=PR4-O-0CH，ONH匕C——NH，式(2)中，n20(2)200，R3、R4相同或者不同，選自9<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>式(4)中，n=20200。所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的合成方法，包括如下步驟(1)主鏈聚合將氯代膦腈環(huán)狀三聚體((PNC12)3)在245°C255t:開環(huán)聚合反應(yīng)3小時(shí)5小時(shí)，制得聚(二氯代膦腈)；(2)接枝反應(yīng)將上述聚(二氯代膦腈)溶于四氫呋喃中，滴加含有接枝用化合物和三乙胺(TEA)的四氫呋喃(THF)溶液，反應(yīng)至少8h后，過濾除去不溶物，濾液濃縮后用乙醚沉淀，真空干燥得到白色粉末狀的聚合物，即pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈；其中，所述的接枝用化合物選用N，N-二異丙基乙二胺(DPA)、l-丁基-4-(甲基氨基)哌啶(PPMA)、2-氨基苯并咪唑(ABI)、l-(3-氨基丙基)咪唑(API)、a-氨基-p-咪唑基丙酸乙酯(即組氨酸乙酯，HiSE)中的一種或多種以及端氨基聚乙二醇(NH2-PEG);或者，所述的接枝用化合物選用N，N-二異丙基乙二胺、l-丁基-4-(甲基氨基)哌啶、2_氨基苯并咪唑、1_(3-氨基丙基)咪唑、a-氨基-13-咪唑基丙酸乙酯中的一種或多種、4-氨基苯甲酸乙酯(EAB)、氨基乙酸乙酯(即甘氨酸乙酯，EtGly)、!3-羥基丙氨酸乙酯(即絲氨酸乙酯，SEE)中的一種或多種以及端氨基聚乙二醇。所述的端氨基聚乙二醇中聚乙二醇的數(shù)均分子量?jī)?yōu)選為3505000，進(jìn)一步優(yōu)選11002000，特別優(yōu)選2000。由于三乙胺量過少會(huì)造成反應(yīng)不完全，過多則導(dǎo)致聚合物沉淀，因此，接枝用化合物與三乙胺的摩爾比優(yōu)選為1:1。四氫呋喃是溶解范圍很大的有機(jī)溶劑，可溶解聚(二氯代膦腈)和各種接枝用化合物，作為反應(yīng)體系的溶劑，其用量對(duì)接枝反應(yīng)沒有太大影響，因而不做具體限定。本發(fā)明的接枝反應(yīng)過程須在高度無(wú)水的環(huán)境中進(jìn)行，反應(yīng)溫度沒有特別的限定，例如常溫或者室溫均可，對(duì)于合成取代基位阻較大的聚合物，在合成反應(yīng)過程中一般需要進(jìn)行加熱回流反應(yīng)，更利于反應(yīng)的進(jìn)行。根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈上的取代基，所述的接枝化合物優(yōu)選按照預(yù)定的順序滴加。一般為了在聚(二氯代膦腈)上更加方便地接枝各種預(yù)先設(shè)計(jì)的取代基，可按照預(yù)加入取代基的位阻大小，先滴加位阻較大的取代基，再滴加位阻較小的取代基。所述的白色粉末狀的聚合物進(jìn)行純化處理，其純化處理包括將白色粉末狀的聚合物在水中透析，以除去未反應(yīng)的2_(聚乙二醇氨基)乙基氨基，可采用透析袋進(jìn)行透析，11再經(jīng)冷凍干燥收集產(chǎn)物。以N，N-二異丙基乙二胺為例，N，N-二異丙基乙二胺的結(jié)構(gòu)式如式a所示，其伯胺上脫去一個(gè)氫后，接枝到聚膦腈主鏈的P原子上，成為pH敏感基團(tuán)(即接枝基團(tuán))N-[2-(N'，N'-二異丙氨基)乙基]氨基，其結(jié)構(gòu)式如式b，該基團(tuán)僅是在N，N-二異丙基乙二胺的伯胺上脫去一個(gè)氫。式a式b。其余pH敏感基團(tuán)也僅是在l-丁基-4-(甲基氨基)哌啶、2-氨基苯并咪唑、1-(3-氨基丙基)咪唑、a-氨基-13-咪唑基丙酸乙酯的伯胺上脫去一個(gè)氫形成的，其結(jié)構(gòu)式依次為CH2NH<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(N-[3-(l3-吲哚)丙酸乙酯基]-2-氨基)。其它接枝用化合物的基團(tuán)也僅是在對(duì)氨基苯甲酸乙酯、甘氨酸乙酯、絲氨酸乙酯的伯胺上脫去一個(gè)氫形成的N-(苯甲酸乙酯基)-4-氨基、N-(乙酸乙酯基)氨基、N-[!3-羥基丙酸乙酯基]氨基，其結(jié)構(gòu)式依次為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈給藥膠束的粒徑為10納米300納米。所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈給藥膠束可通過薄膜水化法或透析法制備，膠束可以是以水分散液或凍干粉狀態(tài)存在，其水分散液的制備方法，包括以下步驟將疏水性藥物和pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈共同溶解在有機(jī)溶劑中，形成混合物的溶液，以加熱或減壓的方式除去有機(jī)溶劑后，形成聚合物與藥物的均勻薄膜，加入純水或pH值7.07.4的緩沖鹽溶液水化溶解薄膜，得到pH響應(yīng)型聚膦腈給藥膠束溶液。所述的有機(jī)溶劑優(yōu)選甲醇、丙酮、四氫呋喃、二氯甲烷中的一種或多種。所述的緩沖鹽溶液選用本領(lǐng)域常用的緩沖鹽溶液即可。所述的混合物的溶液中pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的濃度為lmg/ml2g/ml。所述的pH響應(yīng)型聚膦腈給藥膠束溶液的重量百分濃度為1%50%。所述的pH響應(yīng)型聚膦腈給藥膠束溶液經(jīng)冷凍干燥，可制得pH響應(yīng)型聚膦腈給藥膠束凍干粉。該凍干粉可自分散于水中，形成聚合物藥物膠束的水分散液，膠束尺寸一般在10納米300納米。以阿霉素為例，所述的含有阿霉素的pH響應(yīng)型聚膦腈給藥膠束，優(yōu)選，阿霉素重量為阿霉素和PH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的總重量的2%30%，pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈中聚乙二醇質(zhì)量占聚合物總質(zhì)量的40%以上。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1)兩親性接枝共聚物中疏水基團(tuán)通過疏水作用能夠有效包載難溶于水的抗癌藥物；2)上述制備的載藥聚合物膠束凍干粉適用注射給藥，而且具有易于儲(chǔ)存、運(yùn)輸、應(yīng)用方便的優(yōu)點(diǎn)，可根據(jù)病人的需要，采用含有不同成分的水進(jìn)行分散。3)該給藥體系最重要的特征是當(dāng)藥物載體到達(dá)腫瘤組織周圍或被腫瘤細(xì)胞吞噬進(jìn)入內(nèi)涵體和溶酶體時(shí)，由于環(huán)境pH值降低，原本處于膠束疏水內(nèi)核處的pH響應(yīng)性基團(tuán)發(fā)生質(zhì)子化，破壞了原有給藥膠束的穩(wěn)定性從而導(dǎo)致膠束解體并將包載的藥物在短時(shí)間內(nèi)大量釋放出來(lái)。通過選取合適的pH敏感基團(tuán)以及控制其在接枝聚合物中的取代度理論上可以調(diào)節(jié)聚合物所響應(yīng)的PH值，這使得該給藥體系可以具有十分靈活的釋藥特征當(dāng)體系包載的是針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面的抗體或膜蛋白抑制劑時(shí)，可以選擇能響應(yīng)腫瘤組織外圍環(huán)境pH值的聚合物作為載體，而當(dāng)包載的是需要進(jìn)入細(xì)胞漿或細(xì)胞核起作用的藥物時(shí)則選擇響應(yīng)較低pH值的聚合物作載體。此外，如果在親水鏈外端連接腫瘤靶向分子則能進(jìn)一步提高載體的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)效果?；谝陨咸攸c(diǎn)，該給藥膠束體系有望大幅度提高抗腫瘤藥物的治療效果、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性并能夠有效降低毒副作用。4)由于pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的降解特性和與藥物的親和力主要取決于其疏水取代基，因此，通過添加適當(dāng)?shù)氖杷〈涂梢哉{(diào)節(jié)膠束的降解特征和載藥性能。同時(shí)，通過改變載藥過程中的方法和參數(shù)可以比較容易的控制膠束的載藥量和粒徑大小，從而可以較容易地滿足不同藥物和制劑的要求。5)本發(fā)明給藥膠束的藥物釋放具有pH響應(yīng)性，能定點(diǎn)地在腫瘤組織附近或腫瘤細(xì)胞內(nèi)快速釋放藥物具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的功能，同時(shí)該兩親性聚膦腈接枝共聚物的生物相容性好毒性極小，適合作為抗腫瘤藥物靶向載體。圖1、圖2均為不同聚合物制備的pH響應(yīng)型聚膦腈載阿霉素膠束的體外藥物釋放曲線；其中圖1-1代表實(shí)施例6制備的Pl載藥膠束于在pH=7.4條件下的釋放曲線；131-2代表實(shí)施例7制備的P2載藥膠束于在pH=7.4條件下的釋放曲線1-3代表實(shí)施例8制備的P3載藥膠束于在pH=7.4條件下的釋放曲線1-4代表實(shí)施例6制備的PI載藥膠束于在pH=5.5條件下的釋放曲線1-5代表實(shí)施例7制備的P2載藥膠束于在pH=5.5條件下的釋放曲線1-6代表實(shí)施例8制備的P3載藥膠束于在pH=5.5條件下的釋放曲線2-7代表實(shí)施例9制備的P4載藥膠束于在pH=7.4條件下的釋放曲線2-8代表實(shí)施例10制備的P5載藥膠束于在pH=7.4條件下的釋放曲線；2-9代表實(shí)施例9制備的P4載藥膠束于在pH=5.5條件下的釋放曲線；2-10代表實(shí)施例10制備的P5載藥膠束于在pH=5.5條件下的釋放曲線。3為本發(fā)明幾種具有典型化學(xué)結(jié)構(gòu)的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的核磁共振氫^並l曰；It圖位滴定法)。^並l曰^並l曰^並l曰^並l曰It中，譜圖3-1為實(shí)施例1制備的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的核磁共振氫譜；圖3-2為實(shí)施例2制備的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的核磁共振氫譜；圖3-3為實(shí)施例3制備的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的核磁共振氫譜；圖3-4為實(shí)施例4制備的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的核磁共振氫譜；圖3-5為實(shí)施例5制備的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的核磁共振氫譜；4為pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的pH滴定曲線；中，圖4-1為實(shí)施例1制備的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的pH滴定曲線；4-2為實(shí)施例2制備的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的pH滴定曲線(采用酸式電具體實(shí)施例方式實(shí)施例1pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈合成方法(1)以三氯化鋁為催化劑制備聚(二氯代膦腈)稱取4g經(jīng)升華純化的氯代膦腈環(huán)狀三聚體和0.2g無(wú)水三氯化鋁到預(yù)先嚴(yán)格清洗干燥的聚合管中，抽真空并封管，聚合反應(yīng)在25(TC進(jìn)行5h，待反應(yīng)物的粘度幾乎不變時(shí)，停止聚合并取出聚合管冷卻。開封聚合管，加入適量干燥甲苯溶液溶解反應(yīng)物。溶解后用石油醚沉淀，真空干燥得到白色彈性體，即聚(二氯代膦腈)。(2)通過逐步親核取代反應(yīng)合成pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈共聚物將0.5g上述制得的線形聚(二氯代膦腈)溶于20mlTHF中作為反應(yīng)體系，向其中緩慢滴加含有2.2gNH廠PEG(分子量為2000)和0.2mlTEA的THF溶液50ml，滴加完后常溫反應(yīng)8h。然后再向其中滴加含有1.lgN，N-二異丙基乙二胺(DPA)和1.0mlTEA的THF溶液lOml。磁力攪拌下室溫反應(yīng)12h后過濾除去不溶物，濾液濃縮后用乙醚沉淀，真空干燥，得到微黃色粉末狀的聚合物。利用透析袋(其截留分子量(麗CO)=14000)將所得聚合物在水中透析兩天，以除去未反應(yīng)的NH2-PEG2。。。，并經(jīng)冷凍干燥收集產(chǎn)物，得到pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈共聚物Pl，該共聚物中親水段端氨基聚乙二醇的質(zhì)量百分含量為65X，N-[2-(N'，N'-二異丙氨基)乙基]氨基的質(zhì)量百分含量為31%，其數(shù)均分子量為5000，分子量分布2.8，pKa值為6.30。該共聚物的核磁譜圖如圖3所示，其結(jié)構(gòu)式如下HN其中，n=20200，R3、R4相同或者不同，選自中的一種'實(shí)施例2pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈合成方法[OO98](1)聚(二氯代膦腈)的制備同實(shí)施例1。(2)除了依次向反應(yīng)體系中緩慢滴加含有2.2gNH廠PEG(分子量為2000)和0.2mlTEA的THF溶液50ml、含有0.5gN，N-二異丙基乙二胺(DPA)和0.5mlTEA的THF溶液10ml以及含有0.7g4-氨基苯甲酸乙酯(EAB)和0.5mlTEA的THF溶液10毫升之外，其余操作均同實(shí)施例1中的步驟(2)，得到pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈共聚物P2，該共聚物中親水段端氨基聚乙二醇的質(zhì)量百分含量為60%，N-[2-(N'，N'-二異丙氨基)乙基]氨基的質(zhì)量百分含量為15%，N-(苯甲酸乙酯基)-4-氨基的質(zhì)量百分含量為20%，其數(shù)均分子量為5000，分子量分布2.8，pKa值為6.34。該共聚物的核磁譜圖如圖3所示，其結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>式中，n=20200，R3選自/O<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>實(shí)施例3pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈合成方法(1)聚(二氯代膦腈)的制備同實(shí)施例1。(2)除了依次向反應(yīng)體系中緩慢滴加含有6gNH2-PEG(分子量為2000)和0.6mlTEA的THF溶液50ml、含有0.8gN，N-二異丙基乙二胺(DPA)和O.8mlTEA的THF溶液10ml、含有0.8g4-氨基苯甲酸乙酯(EAB)和0.7mlTEA的THF溶液10毫升以及2.OgP-羥基丙氨酸乙酯(SEE)和1.5mlTEA的THF溶液10毫升，并且每次滴加完一類原料后常溫反應(yīng)8h之外，其余操作均同實(shí)施例1中的步驟(2)，得到pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈共聚物P3，該共聚物中親水段端氨基聚乙二醇的質(zhì)量百分含量為70%，N-[2-(N'，N'-二異丙氨基)乙基]氨基的質(zhì)量百分含量為10%，N-(苯甲酸乙酯基)-4-氨基的質(zhì)量百分含量為6X，N-[13-羥基丙酸乙酯基]氨基的質(zhì)量百分含量為4%，其數(shù)均分子量為6600，分子量分布3.0，pKa值為6.50。該共聚物的核磁譜圖如圖3所示，其結(jié)構(gòu)式如下<vv<w-n=pn==p""^^式中，n二20200。實(shí)施例4pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈合成方法[O109](1)聚(二氯代膦腈)的制備同實(shí)施例1。(2)除了依次向反應(yīng)體系中緩慢滴加含有4gNH2-PEG(分子量為2000)和0.4mlTEA的THF溶液50ml以及含有1.OgN，N_二異丙基乙二胺(DPA)和1.OmlTEA的THF溶液lOml，并且每次滴加完一類原料后常溫反應(yīng)12h之外，其余操作均同實(shí)施例1中的步驟(2)，得到pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈共聚物P4，該共聚物中親水段端氨基聚乙二醇的質(zhì)量百分含量為80X，N-[2-(N'，N'-二異丙氨基)乙基]氨基的質(zhì)量百分含量為15%，其數(shù)均分子量為IIOOO，分子量分布2.O，pKa值為6.32。該共聚物的核磁譜圖如圖3所示，其結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>其中，n=20200，R3、R4相同或者不同，選自中的一種。實(shí)施例5pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈合成方法(1)聚(二氯代膦腈)的制備同實(shí)施例1。(2)除了依次向反應(yīng)體系中緩慢滴加含有2.2gNH2-PEG(分子量為2000)和0.2mlTEA的THF溶液50ml、含有0.2gN，N-二異丙基乙二胺(DPA)和0.2mlTEA的THF溶液10ml以及含有l(wèi).lg4-氨基苯甲酸乙酯(EAB)和0.9mlTEA的THF溶液10ml，并且每次滴加完一類原料后常溫反應(yīng)10h之外，其余操作均同實(shí)施例1中的步驟(2)，得到pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈共聚物P5，該共聚物中親水段端氨基聚乙二醇的質(zhì)量百分含量為64X，N-[2-(N'，N'-二異丙氨基)乙基]氨基的質(zhì)量百分含量為5X，N-(苯甲酸乙酯基)-4-氨基的質(zhì)量百分含量為30%，其數(shù)均分子量為10000，分子量分布3.0，pKa值為6.40。該共聚物的核磁譜圖如圖3所示，其結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>式中，n=20200，R3選自實(shí)施例6給藥膠束的制備(l)Pl聚合物載藥膠束的制備和表征將30mg實(shí)施例l制備的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈Pl與6mg阿霉素一起溶于20mL二氯甲烷，裝入茄形瓶中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40攝氏度減壓條件揮干有機(jī)溶劑，得到藥物與共聚物的均勻薄膜，加入10ml純水將薄膜溶解并用0.45Pm濾膜過濾，得到清液即為pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈P1阿霉素給藥膠束(P1-D0X)的水分散液，該水分散液冷凍干燥得pH響應(yīng)型聚膦腈載阿霉素膠束凍干粉。用動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)定膠束的粒徑，所得到的藥物膠束的性質(zhì)見表2。(2)聚合物載藥膠束(P1-D0X)體外釋放實(shí)驗(yàn)稱取上述制備的pH響應(yīng)型聚膦腈載阿霉素膠束凍干粉5mg，在透析袋中用10mlpH=7.4或pH=5.5的磷酸鹽緩沖液溶解，然后置于20mlpH=7.4或pH=5.5磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)，攪拌。隔一定時(shí)間取透析袋外的磷酸鹽緩沖液，用紫外吸收光譜法分析其中藥物含量，同時(shí)補(bǔ)充等量的新鮮磷酸鹽緩沖液，結(jié)果如圖1所示，可以看到在低pH值環(huán)境(pH=6.04.0)中載藥膠束的釋藥速度大大提高。(3)聚合物載藥膠束(P1-D0X)的細(xì)胞毒性本發(fā)明以乳腺癌耐藥細(xì)胞(MCF7/ADR)為模型細(xì)胞，評(píng)價(jià)未載藥的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈PI膠束(PI聚合物膠束)及P1-D0X的細(xì)胞毒性。具體方法為以乳腺癌耐藥細(xì)胞(MCF7/ADR細(xì)胞)為模型細(xì)胞，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100iil含1X1QS個(gè)MCF7/ADR細(xì)胞的培養(yǎng)液，置于5X(體積百分比)。02，37t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞完全貼壁后，細(xì)胞中加入不同濃度的P1聚合物膠束溶液、P1-D0X溶液及游離阿霉素水溶液，以未經(jīng)處理的空白細(xì)胞為對(duì)照，每孔設(shè)4復(fù)孔。正常RMPI16401640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，每孔加入5mg/mL的3_(4，5_二甲基噻唑_2)_2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)31.5iU，置5XC02，37"培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)棄去上清液，每孔加入200iU二甲基亞砜溶液，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率計(jì)算公式如下細(xì)胞抑制率(％)=(空白對(duì)照組吸光值-實(shí)驗(yàn)組吸光值)/空白對(duì)照組吸光值X100%經(jīng)測(cè)定，P1聚合物膠束對(duì)二種細(xì)胞的細(xì)胞毒性非常小，在P1聚合物濃度為lmg/ml的條件下經(jīng)48小時(shí)的作用后細(xì)胞的存活率依然在85%以上，細(xì)胞毒性為0級(jí)，具有良好的生物相容性。載藥阿霉素聚合物膠束(P1-D0X)溶液及游離阿霉素對(duì)MCF7/ADR細(xì)胞的IC5。見表3，結(jié)果表明聚合物膠束可產(chǎn)生MCF7/ADR的阿霉素耐藥逆轉(zhuǎn)作用。表2不同聚合物制備的載藥聚合物膠束的性質(zhì)聚合物編號(hào)平均粒徑(nm)載藥量(%)包封率(%)PlPI-D0X19210.263P2P2-D0X28012.676P3P3-D0X29012.777P4P4-D0X27116.197P5P5-D0X11316.096表3處方IC50(iig/ml)MCF7/ADR游離阿霉素水溶液8.45P1-D0X0.63實(shí)施例7給藥膠束的制備(1)P2聚合物載藥膠束的制備和表征，除了采用實(shí)施例2制備的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈P2之外，其余操作同實(shí)施例6中的步驟(1)，所得到的藥物膠束的性質(zhì)見表2。(2)P2聚合物載藥膠束(P2-D0X)體外釋放實(shí)驗(yàn)，操作同實(shí)施例6中的步驟(2)，結(jié)果如圖1所示，可以看到在低PH值環(huán)境(pH=6.04.0)中載藥膠束的釋藥速度大大提高。19(3)聚合物載藥膠束(P2-D0X)的細(xì)胞毒性方法同實(shí)施例6中的步驟(3)。經(jīng)測(cè)定，P2聚合物膠束對(duì)二種細(xì)胞的細(xì)胞毒性非常小，在P2聚合物濃度為lmg/ml的條件下經(jīng)48小時(shí)的作用后細(xì)胞的存活率依然在100%以上，細(xì)胞毒性為0級(jí)，具有良好的生物相容性。載藥阿霉素聚合物膠束溶液(P2-D0X)及游離阿霉素對(duì)MCF7/ADR細(xì)胞的IC5。見表4，結(jié)果表明聚合物膠束可產(chǎn)生MCF7/ADR的阿霉素耐藥逆轉(zhuǎn)作用。表4處方IC50(iig/ml)MCF7/ADR游離阿霉素溶液8.45P2-D0X0.13實(shí)施例8給藥膠束的制備(1)P3聚合物載藥膠束的制備和表征，除了采用實(shí)施例3制備的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈P3之外，其余操作同實(shí)施例6中的步驟(1)，所得到的藥物膠束的性質(zhì)見表2。(2)P3聚合物載藥膠束(P3-D0X)體外釋放實(shí)驗(yàn)，操作同實(shí)施例6中的步驟(2)，結(jié)果如圖1所示，可以看到在低PH值環(huán)境(pH=6.04.0)中載藥膠束的釋藥速度大大提高。(3)聚合物載藥膠束(P3-D0X)的細(xì)胞毒性方法同實(shí)施例6中的步驟(3)。經(jīng)測(cè)定，P3聚合物膠束對(duì)二種細(xì)胞的細(xì)胞毒性非常小，在P3聚合物濃度為lmg/ml的條件下經(jīng)48小時(shí)的作用后細(xì)胞的存活率依然在90%以上，細(xì)胞毒性為0級(jí)，具有良好的生物相容性。載藥阿霉素聚合物膠束溶液(P3-D0X)及游離阿霉素對(duì)MCF7/ADR細(xì)胞的IC5。見表5，結(jié)果表明聚合物膠束可產(chǎn)生MCF7/ADR的阿霉素耐藥逆轉(zhuǎn)作用。表5處方IC50(iig/ml)MCF7/ADR游離阿霉素溶液8.45P3-D0X0.85實(shí)施例9給藥膠束的制備(1)P4聚合物載藥膠束的制備和表征，除了采用實(shí)施例4制備的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈P4之外，其余操作同實(shí)施例6中的步驟(1)，所得到的藥物膠束的性質(zhì)見表2。(2)P4聚合物載藥膠束(P4-D0X)體外釋放實(shí)驗(yàn)，操作同實(shí)施例6中的步驟(2)，結(jié)果如圖2所示，可以看到在低pH值環(huán)境(pH=6.04.0)中載藥膠束的釋藥速度大大提高。(3)聚合物載藥膠束(P4-D0X)的細(xì)胞毒性方法同實(shí)施例6中的步驟(3)。經(jīng)測(cè)定，P4聚合物膠束對(duì)二種細(xì)胞的細(xì)胞毒性非常小，在P4聚合物濃度為lmg/ml的條件下經(jīng)48小時(shí)的作用后細(xì)胞的存活率依然在95%以上，細(xì)胞毒性為0級(jí)，具有良好的生物相容性。載藥阿霉素聚合物膠束溶液(P4-D0X)及游離阿霉素對(duì)MCF7/ADR細(xì)胞的IC5。見表5，結(jié)果表明聚合物膠束可產(chǎn)生MCF7/ADR的阿霉素耐藥逆轉(zhuǎn)作用。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實(shí)施例10給藥膠束的制備(1)P5聚合物載藥膠束的制備和表征，除了采用實(shí)施例5制備的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈P5之外，其余操作同實(shí)施例6中的步驟(1)，所得到的藥物膠束的性質(zhì)見表2。(2)P5聚合物載藥膠束(P3-D0X)體外釋放實(shí)驗(yàn)，操作同實(shí)施例6中的步驟(2)，結(jié)果如圖2所示，可以看到在低pH值環(huán)境(pH=6.04.0)中載藥膠束的釋藥速度大大提高。(3)聚合物載藥膠束(P5-D0X)的細(xì)胞毒性方法同實(shí)施例6中的步驟(3)。經(jīng)測(cè)定，P5聚合物膠束對(duì)二種細(xì)胞的細(xì)胞毒性非常小，在P5聚合物濃度為lmg/ml的條件下經(jīng)48小時(shí)的作用后細(xì)胞的存活率依然在88%以上，細(xì)胞毒性為0級(jí)，具有良好的生物相容性。載藥阿霉素聚合物膠束溶液(P5-D0X)及游離阿霉素對(duì)MCF7/ADR細(xì)胞的IC5。見表5，結(jié)果表明聚合物膠束可產(chǎn)生MCF7/ADR的阿霉素耐藥逆轉(zhuǎn)作用。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>無(wú)需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。此外，前面的優(yōu)選具體實(shí)施方案應(yīng)被理解為僅是舉例說(shuō)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求一種pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈給藥膠束，其特征在于，所述的給藥膠束中含有pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈和至少一種疏水性藥物；以藥物和pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的總重量計(jì)，藥物的重量百分含量為0.001％～30％，pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的重量百分含量為70％～99.999％；所述的疏水性藥物為疏水性抗腫瘤藥物或者疏水性化療藥物；所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈具有式(1)所示的結(jié)構(gòu)通式其中，R1、R2、R3和R4是接枝基團(tuán)，R1選自式中，n＝20～200；R2選自中的一種；R3、R4相同或者不同，選自中的一種。FSA00000045136300011.tif,FSA00000045136300012.tif,FSA00000045136300013.tif,FSA00000045136300021.tif,FSA00000045136300022.tif,FSA00000045136300023.tif2.如權(quán)利要求1所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈給藥膠束，其特征在于，以pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的質(zhì)量計(jì)，Rl的質(zhì)量百分含量為2%94.5%，R2的質(zhì)量百分含量為5%97%，R3的質(zhì)量百分含量為090%，R4的質(zhì)量百分含量為090%。3.如權(quán)利要求2所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈給藥膠束，其特征在于，以pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的質(zhì)量計(jì)，所述的PH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈中Rl的質(zhì)量百分含量為60%70%，R2的質(zhì)量百分含量為5%39%，R3的質(zhì)量百分含量為034.5%，R4的質(zhì)量百分含量為034.5%。4.如權(quán)利要求1所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈給藥膠束，其特征在于，所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的數(shù)均分子量為4000100000;或者，所述的PH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的分子量分布為1.54.0。5.如權(quán)利要求1所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈給藥膠束，其特征在于，所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈具有式(2)、式(3)或者式(4)所示的結(jié)構(gòu)通式"，R4NHLo.0oN-0CH，(2)式(2)中，n=20200，R3、R4相同或者不同，選自麗NH(3)式(3)中，n=20200，R3選自Ho-0、、CH，o3p——NHR——p-N<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(4)式(4)中，n=20200。6.如權(quán)利要求1所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈給藥膠束，其特征在于，所述的疏水性抗腫瘤藥物選用紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素、柔紅霉素、甲氨喋呤、絲裂霉素C中的一種或多種。7.如權(quán)利要求1所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈給藥膠束，其特征在于，所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈給藥膠束的粒徑為10納米300納米。8.如權(quán)利要求1所述的pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈給藥膠束的制備方法，包括以下步驟將疏水性藥物和PH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈共同溶解在有機(jī)溶劑中，形成混合物的溶液，以加熱或減壓的方式除去有機(jī)溶劑后，形成聚合物與藥物的均勻薄膜，加入純水或pH值為7.07.4的緩沖鹽溶液水化溶解薄膜，得到pH響應(yīng)型聚膦腈給藥膠束溶液。9.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述的有機(jī)溶劑選用甲醇、丙酮、四氫呋喃、二氯甲烷中的一種或多種；或者，所述的混合物的溶液中pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的濃度為lmg/ml2g/ml;或者，所述的PH響應(yīng)型聚膦腈給藥膠束溶液的重量百分濃度為1%50%。10.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述的pH響應(yīng)型聚膦腈給藥膠束溶液經(jīng)冷凍干燥，制得pH響應(yīng)型聚膦腈給藥膠束凍干粉。全文摘要本發(fā)明公開了一種pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈給藥膠束，所述的給藥膠束中含有pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈和至少一種疏水性藥物；以藥物和pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的總重量計(jì)，藥物的重量百分含量為0.001％～30％，pH響應(yīng)型兩親接枝聚膦腈的重量百分含量為70％～99.999％；所述的疏水性藥物為疏水性抗腫瘤藥物或者疏水性化療藥物。該膠束可通過薄膜水化法或透析法制備，膠束可以是以水分散液或凍干粉狀態(tài)存在。該膠束的藥物釋放具有pH響應(yīng)性，能定點(diǎn)地在腫瘤組織附近或腫瘤細(xì)胞內(nèi)快速釋放藥物具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的功能，同時(shí)該兩親性聚膦腈接枝共聚物的生物相容性好毒性極小，適合作為抗腫瘤藥物靶向載體。文檔編號(hào)A61K45/00GK101785865SQ20101011803公開日2010年7月28日申請(qǐng)日期2010年3月4日優(yōu)先權(quán)日2010年3月4日發(fā)明者邱利焱,鄭程申請(qǐng)人:浙江大學(xué)