專利名稱：：人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明主要涉及一種人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的用途。尤其涉及人參皂苷Rd在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的用途。
背景技術(shù)：
：潰瘍性結(jié)腸炎(UlcerativeColitis,UC)是一種病因及發(fā)病機(jī)制均不明確的慢性結(jié)腸炎癥，腹痛、腹瀉、黏液便和血便是其主要臨床癥狀。UC急性暴發(fā)型病死率高，慢性持續(xù)型癌變率高、易反復(fù)發(fā)作，目前無特效藥物，故被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一。本病在歐美國家發(fā)病率較高，患病率為0.4%。1%。，在國內(nèi)未見精確的統(tǒng)計(jì)報告數(shù)據(jù)，但近年來呈明顯增加的趨勢。由于眾多醫(yī)療和科研工作者對UC的關(guān)注，治療UC的新藥不斷出現(xiàn)。目前，柳氮磺吡啶(SASP)作為臨床上普遍應(yīng)用的治療潰瘍性結(jié)腸炎的常用藥，療效較明顯，并且它及其代謝產(chǎn)物5-氨基水楊酸(5-ASA)被發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)的清除氧應(yīng)激反應(yīng)代謝產(chǎn)物的作用，但SASP可能在一些患者治療過程中產(chǎn)生與劑量相關(guān)的厭食、惡心、皮疹及血液毒性(主要包括中性粒細(xì)胞減少、粒細(xì)胞缺乏癥、溶血性貧血、血小板減少癥、兩種血細(xì)胞減少、各類血細(xì)胞減少或再生障礙性貧血)等不良反應(yīng)，部分男性患者可能會出現(xiàn)精子活動能力下降而致不育癥。上述不良反應(yīng)使得SASP用藥具有一定局限性。因此發(fā)現(xiàn)新的、副作用低的治療潰瘍性結(jié)腸炎的新藥，仍是目前國內(nèi)外新藥研究的一個重點(diǎn)。三七(Panaxnotoginseng)屬五加科人參屬植物，其主要活性成分為達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂苷，與人參成分相似，入藥部位多為根塊。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)理論證實(shí)三七具有強(qiáng)壯補(bǔ)虛和止血的作用，多用于治療一些心血管疾病、炎癥和各種身體疼痛、外傷及有外傷導(dǎo)致的體內(nèi)體外出血癥狀。大量的植物化學(xué)和藥理學(xué)研究證實(shí)達(dá)瑪烷型四環(huán)三鵬皂苷為其主要的藥理活性成分，其中人參皂苷Rd占總皂苷的4.07%，是其中主要具有顯著藥理活性成分的四種皂苷之一(Rgl、Rbl、Rl、Rd)。人參皂苷Rd是二醇型人參皂苷在人體腸道內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物之一，具有廣泛的生物活性，對心腦血管、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等作用獨(dú)特，在鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護(hù)作用方面作用顯著。人參皂苷Rd對腦缺血的保護(hù)作用的臨床III期研究業(yè)已完成，正在申請新藥生產(chǎn)批文。我們的前期工作還表明，Rd抑制有絲分裂原ConA誘導(dǎo)的人T細(xì)胞增殖、抑制遲發(fā)性超敏反應(yīng)，抑制膠叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎，有極強(qiáng)的抗炎作用(該項(xiàng)研究結(jié)果已由本發(fā)明人申請Rd治療關(guān)節(jié)炎等的發(fā)明專利，專利初審?fù)ㄟ^，見《人參皂苷-Rd丙二醇水溶液制備及其抗炎、免疫抑制與抗器官移植排斥的新用途》，受理號200810208119.2)。但具有抗炎作用的藥物(如乙酰水楊酸類)并不一定具有治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用，而關(guān)于人參皂苷Rd治療大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的研究國內(nèi)外未見報道，尚需實(shí)驗(yàn)證實(shí)。人參皂苷-Rd，是從中藥五加科植物三七中經(jīng)多步分離而得的一種單體化合物，屬原人參二醇型皂苷。它的中文化學(xué)名為20-(S)-原人參二醇-3-20-0-l3-D-吡喃葡萄糖苷，英文化學(xué)名為20(S)—Protopanaxadiol3_0_[P_D_glucopyranosyl(1—2)_P_D_glucopyranosyl]_20-O-P-glucopyranoside，化學(xué)結(jié)構(gòu)如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>C48H820183H20;1001.20關(guān)于從三七藥材中提取人參皂苷Rd的方法，首先提取粗總皂苷，然后通過大孔吸附樹脂乙醇梯度洗脫分離去大多數(shù)其它組分，獲得雜質(zhì)較少的Rd組分，再經(jīng)硅膠柱以"氯仿2甲醇2水"溶劑梯度洗脫，一次性得到純度達(dá)93.16%的Rd單體。最終純度可達(dá)95%以上。(中藥材第29巻第3期2006年3月，《從三七藥材中快速批量分離提取人參皂苷Rd的方法》劉德育，曾颯中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510080)
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過試驗(yàn)說明人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。所述的人參皂苷Rd在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用，是人參皂苷Rd在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。所述的人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用，是人參皂苷Rd在制備治療非細(xì)菌性慢性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。所述的人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用，是人參皂苷Rd口服制劑在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。所述的人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用，其特征是所述的口服制劑為為膠囊、微囊、脂質(zhì)體、顆粒劑、片劑、口服液。所述的人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用，人參皂苷Rd為從三七中提取的人參皂苷Rd單體化合物，其中人參皂苷Rd單體為95%以上；還包括從五加科人參屬植物人參、西洋參的根、莖、葉、花、果實(shí)中提取分離得到的人參皂苷Rd單體化合物。本發(fā)明的有益效果(1)通過實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了人參皂苷Rd對實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的治療作用。(2)人參皂苷及其活性代謝物在大鼠口服給藥后生物利用低、吸收少，但具有大量聚集在結(jié)腸部位的特點(diǎn)，結(jié)合其具有的強(qiáng)大的抗炎作用，充分展示了人參皂苷Rd對結(jié)腸炎的治療作用，揭示了具有抗氧化作用的鈣池操縱的鈣離子通道阻滯劑對結(jié)腸炎的治療價值，立意新奇。(3)采用形態(tài)與生化測定(MP0活性測定)相結(jié)合，定性、定量觀察藥物對潰瘍性結(jié)腸炎愈合的影響，使對藥物療效的評價更為可靠。機(jī)理研究指標(biāo)緊密結(jié)合結(jié)腸炎的已知有關(guān)病理生理機(jī)制和人參皂苷Rd抗氧化特性，如炎細(xì)胞浸潤(MP0)、氧化損傷與抗氧化能力變化(SOD、GSH-Px)、脂質(zhì)過氧化物(MDA)生成，深入、系統(tǒng)、全方位地揭示人參皂苷Rd抗氧化治療與促進(jìn)潰瘍性結(jié)腸炎愈合的關(guān)系，進(jìn)而闡明人參皂苷Rd在腸粘膜抗損傷及修復(fù)過程中的調(diào)節(jié)作用，思路獨(dú)特，構(gòu)思新穎。(4)目前UC的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制特別是細(xì)胞因子發(fā)病機(jī)制越來越受到人們的重視。而促炎性細(xì)胞因子與抑炎性細(xì)胞因子之間的平衡失調(diào)所致的免疫異常被視為UC的重要發(fā)病機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了人參皂苷Rd能顯著抑制促炎細(xì)胞因IL-113、TNF-a的生成，以及促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，從免疫學(xué)角度闡述了人參皂苷Rd治療結(jié)腸炎與其能抑制結(jié)腸組織致炎因子的表達(dá)，促進(jìn)抑炎因子生成及調(diào)節(jié)免疫平衡密切相關(guān)，其觀點(diǎn)新穎。(5)最新研究資料表明，人參皂苷Rd是一種新型的電位非依賴型膜受體鈣激活通道(ROCC)和f丐池操縱的f丐離子通道(SOC)阻滯劑，可以通過ROCC和SOC途徑顯著地抑制受體操縱性Ca"內(nèi)流?，F(xiàn)有的抗炎藥如乙酰水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類與及抗UC藥柳氮磺吡啶也均不具鈣拮抗作用。用特異性的SOC阻滯劑來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)必將為炎癥的防治提供一個新的靶點(diǎn)，結(jié)合本課題研究結(jié)果，我們預(yù)測人參皂苷Rd這一新型的非電位依賴性鈣離子通道阻滯劑可能會成為治療潰瘍性結(jié)腸炎及其它炎癥的新型的治療藥物，為結(jié)腸炎這一被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治疾病的治療提供了一種新的思路。(6)通過系統(tǒng)、全面研究人參皂苷Rd對實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的治療作用機(jī)理，全方位的揭示了人參皂苷Rd對結(jié)腸炎的治療作用機(jī)理，為潰瘍性結(jié)腸炎的藥物治療提供了新的論據(jù)及觀點(diǎn)。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合最佳實(shí)施例作進(jìn)一步詳述實(shí)施例1:人參皂苷Rd治療大鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎的量效關(guān)系及作用機(jī)理1.材料與方法1.1藥物和動物Wistar大白鼠，體重180200g，c^，購自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號醫(yī)動字第SCXK(甘)2009-0004。人參皂苷Rd(純度>95%，制備方法參照已公開專利《化合物(1)，其提取方法及包含所述化合物的藥物組合物》，授權(quán)公告號CN1176101C):廣東泰禾生物藥業(yè)有限公司批號080312;柳氮磺吡啶上海信誼嘉華有限公司產(chǎn)品，批號081013。1.2主要試齊U2，4，6-三石肖基苯磺酸(2，4，6_Trinitrobenzenesulfonicacidsolution，TNBS)購于Sigma公司，5%(W/V)水溶液，貨號P2297-10ML，批號20070315);無水乙醇(天津市博迪化工有限公司天津光復(fù)研究所，20080327分析純)；冰醋酸(北京化工廠，批號000108，分析純)；GSH-PX試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，批號20080416;髓過氧化物酶(MP0)、超氧化物歧化酶(SOD)、氧化型谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)及考馬斯亮藍(lán)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，試劑批號20090730。1.3主要儀器TGL-16型低溫高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠制造；DY_2型電動玻璃勻漿機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司制造；722S型紫外分光光度儀，上海精密科學(xué)儀器有限公司制造KA-1000型臺式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠制造。2方法2.1分組大鼠70只，按體重隨機(jī)分為6組，分別為正常對照組(8只)、模型對照組(14只)、陽性對照組(12只)和人參皂苷Rd低劑量組(12只)、中劑量組(12只)、高劑量組(12只)。2.2急性潰瘍性結(jié)腸炎模型的制備各組大鼠禁食不禁水48h，記錄體重，腹腔注射(i.P)戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉。麻醉后，大鼠頭部朝下、肛門朝上倒置，用灌胃針(16號)緩慢插入大鼠結(jié)腸部(深度為距肛門8cm處)，緩慢注入TNBS/50%乙醇溶液(0.4ml/100g大鼠體重，TNBS100mg/kg大鼠體重)。推注耗時約lmin(推注期間防止大鼠腹部被擠壓)。致炎劑推注完畢后緩慢抽出灌胃針，用木夾夾住大鼠肛門，懸掛大鼠尾巴，使整個鼠身傾斜大約60。，保持約30min，取下夾子，把大鼠放歸籠中，保持大鼠體位為頭低臀高狀態(tài)，待自然清醒。正常對照組大鼠分別緩慢注入等體積的生理鹽水，其余操作同前。2.3給藥致炎24h后，正常對照組、模型對照組用注射用水灌胃(lml/100g)，陽性對照組大鼠給予SASP(30mg/kg，lml/100g大鼠體重)溶液灌胃，Rd低、中、高劑量組大鼠分別按人參皂苷Rd20、40、80mg/kg，lml/100g灌胃。連續(xù)給藥7d，每天給藥1次。2.4結(jié)腸炎癥的評價，標(biāo)本的采集及處理2.4.1每日測體重，觀察腹瀉及糞便性狀，精神活動，食量等。2.4.2大鼠在給藥7d后，腹腔注射戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉，腹主動脈取血，取出肛門至結(jié)腸末端(回盲瓣水平，不含盲腸和闌尾)的整個結(jié)腸和直腸段，沿腸系膜緣剪開腸腔，用冷生理鹽水沖凈腸內(nèi)容物，用濾紙拭干凈后平鋪于塑膠板上(腸粘膜面朝上)，按表1所列評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行大體評分后稱結(jié)腸濕重、量所取腸段長度。取一小塊病變部位結(jié)腸組織，平鋪于紙板上后用4%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，按表2所列評分標(biāo)準(zhǔn)(參考Dieleman等提出的評分標(biāo)準(zhǔn)，并稍作修改)進(jìn)行組織學(xué)評分。再取部分病變部位結(jié)腸組織準(zhǔn)確稱重，用眼科剪剪碎，加入冷生理鹽水，低溫下制成10%組織勻漿，取部分未離心的勻漿組織用以測MPO，余下的以3000r/min離心10min，取上清液，-20°〇冰箱保存，待測MDA、SOD、GSH-PX等各項(xiàng)生化指標(biāo)。取出的血液4t:放置2h后，以3000r/min離心10min，分離血清，-2(TC冰箱保存，待測生化指標(biāo)。表1結(jié)腸大體與組織學(xué)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)CN101791316A大體評分標(biāo)準(zhǔn)0無損傷01充血水腫，但無潰瘍12有潰瘍但無明顯的炎癥23有潰瘍，僅有一處出現(xiàn)炎癥34有兩處或以上潰瘍和炎癥，潰瘍大小4<lcm5有兩處或以上潰瘍或炎癥，至少一處潰5瘍或炎癥部位"cm_正常結(jié)腸組織炎癥或潰瘍病灶限于粘膜層炎癥或潰瘍病灶限于粘膜與粘膜下層炎癥或潰瘍病灶深入固有肌層透壁性炎癥或潰瘍病灶深入漿膜層透壁性炎癥或大面積潰瘍深入漿膜層并穿IL_2.4.3檢測指標(biāo)的測定1)組織中髓過氧化物酶(MPO)活力測定用分光光度法測定。該酶為髓性過氧化物酶，該酶具有使過氧化氫還原的能力，利用這一特點(diǎn)可以分析酶的活力，并定量測定中性白細(xì)胞的數(shù)目。取未離心的10%結(jié)腸組織勻漿901，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，通過供氫體鄰連茴香胺供氫后生成黃色化合物，在460nm處通過比色測定吸光度，從而推算出MPO酶活力單位。組織中酶活力單位定義為每克組織濕片在37t:的反應(yīng)體系中H202被分解lymol為一個酶活力單位。血清中MPO活力測定測定原理同上，取血清90iU，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，在460nm處通過比色測定吸光度，從而推算出MP0酶活力單位。血清中酶活力單位定義為每升血清在37。C的反應(yīng)體系中H202被分解1mol為1個酶活力單位。2)Rd對UC大鼠結(jié)腸組織氧化損傷及抗氧化能力的影響組織中丙二醛(MDA)含量測定MDA為脂質(zhì)過氧化物，用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定。過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物丙二醛可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收峰。取10%結(jié)腸組織勻漿上清200測定，以每毫克組織蛋白納摩爾數(shù)(nmol/mgprot)表不。組織中超氧化物岐化酶(SOD)活力測定用黃嘌呤_黃嘌呤氧化酶法檢測。通過黃嘌呤_黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見分光光度計(jì)在550nm處測定其吸光度。當(dāng)被測樣品中含SOD時，則對超氧陰離子有轉(zhuǎn)移性抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計(jì)算可求出被測樣品中的SOD活力。取1%結(jié)腸組織上清70按試劑盒說明書進(jìn)行操作。組織勻漿中總SOD活力單位(U)定義為每毫克組織蛋白在1ml反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位。組織中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)含量測定GSH-Px可以促進(jìn)過氧化氫(H202)與還原型GSH反應(yīng)生成H202及氧化型谷胱甘肽(GSSG)，谷胱甘肽過氧化物酶的活力可用其酶促反應(yīng)的速度來表示，測定此酶促反應(yīng)中還原型谷胱甘肽的消耗，則可求出酶的活力。GSH-Px的活力以催化GSH的反應(yīng)速度來表示，由于這兩個底物在沒有酶的條件下，也能進(jìn)行氧化還原反應(yīng)(稱非酶促反應(yīng))，所以最后計(jì)算此酶活力時必須扣除非酶促反應(yīng)所引起的GSH減少的部分。取10X結(jié)腸組織勻漿上清60ia，按試劑盒說明書操作。3)Rd對UC大鼠結(jié)腸組織中致炎細(xì)胞因子釋放的影響組織中TNF-a測定采用雙抗體夾心ELISA法檢測。操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋將標(biāo)準(zhǔn)品(360ng/L)分別稀釋成240ng/L，160ng/L，80ng/L，740ng/L，20ng/L5個濃度。2.加樣分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品空中先加樣品稀釋液40iU，然后再加待測樣品10iU(樣品最終稀釋濃度為5倍)。加樣時將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3.溫育用封板膜封板后置37t:溫育30分鐘。4.配液將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。5.洗滌小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6.加酶每孔加入酶標(biāo)試劑50ii1，空白孔除外。7.溫育操作同3。8.洗滌操作同5。9.顯色每孔先加入顯色劑A50iil，再加入顯色劑B50ia，輕輕震蕩混勻，37t:避光顯色15分鐘。10.終止每孔加終止液50ii1，終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。11.測定以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。組織中IL-113的測定采用雙抗體夾心ELISA法檢測。操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋將標(biāo)準(zhǔn)品(45ng/L)分別稀釋成30ng/L，20ng/L，10ng/L，5ng/L，2.5ng/L5個濃度。2.加樣分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品空中先加樣品稀釋液40iU，然后再加待測樣品10iU(樣品最終稀釋濃度為5倍)。加樣時將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3.溫育用封板膜封板后置37t:溫育30分鐘。4.配液將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。5.洗滌小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6.加酶每孔加入酶標(biāo)試劑50ii1，空白孔除外。7.溫育操作同3。8.洗滌操作同5。9.顯色每孔先加入顯色劑A50iil，再加入顯色劑B50ia，輕輕震蕩混勻，37t:避光顯色15分鐘。10.終止每孔加終止液50ii1，終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。11.測定以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。3)Rd對UC大鼠結(jié)腸組織中抑炎細(xì)胞因子IL-10釋放的影響采用雙抗體夾心ELISA法檢測。8操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋將標(biāo)準(zhǔn)品(72ng/L)分別稀釋成48ng/L，32ng/L，16ng/L，8ng/L，4ng/L5個濃度。2.加樣分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品空中先加樣品稀釋液40iU，然后再加待測樣品10iU(樣品最終稀釋濃度為5倍)。加樣時將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3.溫育用封板膜封板后置37t:溫育30分鐘。4.配液將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。5.洗滌小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6.加酶每孔加入酶標(biāo)試劑50iU，空白孔除外。7.溫育操作同3。8.洗滌操作同5。9.顯色每孔先加入顯色劑A50iil，再加入顯色劑B50ia，輕輕震蕩混勻，37t:避光顯色15分鐘。10.終止每孔加終止液50ii1，終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。11.測定以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理參數(shù)檢驗(yàn)用Student'st檢驗(yàn)，均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(；±s)表示P<0.01，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，非參數(shù)檢驗(yàn)用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。3.結(jié)果3.1大鼠外觀體征一般觀察用TNBS-50%乙醇建立大鼠潰瘍性結(jié)腸炎，動物于造模第2d出現(xiàn)稀便、消瘦、食欲減退、蜷縮、毛發(fā)不光澤、活動減少等。各給藥組動物外觀癥狀均輕于模型對照組。3.2人參皂苷Rd對大鼠體重變化的影響在實(shí)驗(yàn)期間，正常對照組體重呈增加趨勢，平均增加18.4%;模型對照組體重先減后增，但增長緩慢，平均增加9.4%;SASP組、GSPE低、中、高劑量組體重先減后增，但增加速度較模型對照組快，分別平均增加14.7%、12.2%、13.8%和12.3%。對各組大鼠處死前體重作統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，模型對照組大鼠體重明顯低于正常對照組及各給藥組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，結(jié)果見表2表2人參皂苷Rd對UC大鼠體重變化的影響G士s，n=8_14)組別造模前體重(g)處死前體重(g)正常對照組172±10.86203±14.44模型對照組171±6.91187±5.78**陽性對照組172±9.76198±11.78#Rd低劑量組174±8.56195±8.67#Rd中劑量組174±11.94193±19.57#Rd高劑量組177±11.89196±14.88#模型對照組與正常對照組比較rp<0.01;給藥組與模型對照組比較<0.05，##p<0.013.3人參皂苷Rd對大鼠結(jié)腸濕重變化的影響與正常對照組相比，各給藥組大鼠結(jié)腸濕重指數(shù)都有所增加，其中模型對照組結(jié)腸濕重指數(shù)(結(jié)腸重量/結(jié)腸長度，mg/mm)增加最大，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);各給藥組與模型對照組比較結(jié)腸濕重指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，見表3。表3人參皂苷Rd對UC大鼠結(jié)腸濕重指數(shù)變化的影響G±s，n=8_14)組別重量(g)長度(mm)結(jié)腸濕重指數(shù)(mg/mm)正常對照組1.33±0.22109.94±10.0612.13±1.50模型對照組2.03±0.54109.25±10.7020.00±4.94**陽性對照組1.62±0.41103.55±10.0513.48±5.19##Rd低劑量組1.68±0.41105.56±12.515.29±2.29#Rd中劑量組1.678±0.24107.00±5.12315.72±2.36#Rd高劑量組1.59±0.37105.56±6.5713.95±1.75"模型對照組與正常對照組比較**p<0.01;各給藥組與模型對照組比較#p<0.05，##p<0.013.4大體觀察評分結(jié)果與正常對照組比較，模型對照組結(jié)腸組織損傷明顯加重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與模型對照組比較，各給藥組結(jié)腸組織損傷明顯減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果顯示見表4。表4人參皂苷Rd治療后UC大鼠結(jié)腸大體損傷評分結(jié)果(n=8_12)10評分/只數(shù)組別012345正常對照組8模型對照組"12423陽性對照組##72Rd低劑量組"2321Rd中劑量組^1Rd高劑量組"2513模型對照組與正常對照組比較,p<0.01;各給藥組與模型對照組比較，p<0.013.5病理組織學(xué)評分結(jié)果光鏡下觀察，模型對照組結(jié)腸粘膜組織內(nèi)可見大量炎性滲出物和組織壞死；人參皂苷Rd各劑量組潰瘍面可見大量再生上皮組織和新生腺體；與正常對照組比較，模型對照組結(jié)腸組織損傷明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.01)，與模型對照組比較，各給藥組大鼠結(jié)腸組織損傷程度減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表5。表5人參皂苷Rd治療后UC大鼠結(jié)腸組織學(xué)損傷評分結(jié)果(n=8_12)評分/只數(shù)組別012345正常對照組8模型對照組"121陽性對照組##72Rd低劑量組"63Rd中劑量組"41Rd高劑量組^46模型對照組與正常對照組比較,p<0.01;各給藥組與模型對照組比較，p<0.013.6Rd對白細(xì)胞浸潤程度的影響3.6.1Rd對大鼠血清中MPO活性的影響實(shí)驗(yàn)各組大鼠血清中MPO含量值見表6，由表可見與正常對照組比較，模型對照組MPO活力明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P11<0.01);SASP給藥組，Rd低、中、高各劑量中MPO與模型對照組比較活力明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。3.6.2Rd對大鼠結(jié)腸組織中MPO活性的影響實(shí)驗(yàn)各組大鼠結(jié)腸組織中MPO含量值見表6，由表可見與正常對照組比較，模型對照組MPO活力明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);SASP給藥組，Rd低、中、高各劑量中MPO活力與模型對照組比較明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。表6人參皂苷Rd對TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸組織及血清中MPO活力的影響(；±s，n=8-12)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>模型對照組與正常對照組比較**p<0.01，*p<0.05;各給藥組與模型對照組比<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>3.7Rd對UC大鼠結(jié)腸組織氧化損傷及抗氧化能力的影響3.7.lRd對大鼠結(jié)腸組織中MDA含量的影響實(shí)驗(yàn)各組大鼠結(jié)腸組織中MDA含量測定值見表7，由表可見與正常對照組比較，模型對照組MDA含量明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型對照組比較，各給藥組結(jié)腸組織中MDA含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。3.7.2Rd對大鼠結(jié)腸組織GSH-PX活性的影響實(shí)驗(yàn)各組大鼠結(jié)腸組織中GSH-PX活性測定值見表7，由表可見與正常對照組比較，模型對照組GSH-PX活性明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);SASP給藥組，Rd低、中、高劑量中GSH-PX活性較模型對照組明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。3.7.3Rd對大鼠結(jié)腸組織SOD活性的影響實(shí)驗(yàn)各組大鼠結(jié)腸組織中SOD活性測定值見表7，由表可見與正常對照組比較，模型對照組SOD活性明顯降低差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);SASP給藥組，Rd低、中、高劑量中GSH-PX活性較模型對照組明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。表7人參皂苷Rd對TNBS誘導(dǎo)的大鼠UC結(jié)腸組織MDA含量、GSH-Px與SOD活力的影響(；士s，n=8-12)組別結(jié)腸組織GSH-PX活力(U/mgprot)結(jié)腸組織MDA含量(nmol/mgprot)結(jié)腸組織SOD活力(U/mgprot)正常對照組80.74±31.021.06±0.48106.71±21.64模型對照組55.01±23.04**1.94±0.76**89.90±9.66*陽性對照組48.40±10.81##1.03±0.48##130.16±18.59##Rd低劑量組75.41±14.75##0.97±0.33##129.50±20.92##Rd中劑量組74.88士8.05##0.85±0.53##142.99±18.68##Rd高劑量組78.39±26.48##0.82±0.32##144.39±41.34##3.8Rd對UC大鼠結(jié)腸組織中致炎細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響3.8.1Rd對大鼠結(jié)腸組織TNF-a表達(dá)水平的影響實(shí)驗(yàn)各組大鼠結(jié)腸組織中TNF-a表達(dá)水平測定值見表8，由表可見與正常對照組比較，模型對照組TNF-a表達(dá)水平顯著增加(P<0.01);SASP給藥組，Rd低劑量、中、高劑量中TNF-a表達(dá)水平較模型對照組明顯降低(P<0.01)。3.8.2Rd對大鼠結(jié)腸組織IL-IP表達(dá)水平的影響實(shí)驗(yàn)各組大鼠結(jié)腸組織中IL-IP水平測定值見表8，由表可見與正常對照組比較，模型對照組IL-113表達(dá)水平明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);SASP給藥組，Rd低、中、高劑量中IL-IP表達(dá)水平較模型對照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。3.9Rd對UC大鼠結(jié)腸組織中抑炎細(xì)胞因子IL-10水平的影響實(shí)驗(yàn)各組大鼠結(jié)腸組織中IL-10水平測定值見表8，由表可見與正常對照組比較，模型對照組IL-10表達(dá)水平顯著降低(P<0.01);SASP給藥組，Rd低劑量組與高劑量中IL-10表達(dá)水平較模型對照組明顯增加(P<0.05)。Rd中劑量組IL-10表達(dá)水平值與模型對照組相比較有增加的趨勢但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表8人參皂苷Rd對TNBS誘導(dǎo)的大鼠UC結(jié)腸組織IL_1P、TNF_a、IL-10表達(dá)水平的影響(；±s，n=6-12)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>模型對照組與正常對照組比較**p<0.01，*p<0.05;各給藥組與模型對照組比較抑p<0.01，#p<0.054.結(jié)論近來國內(nèi)外學(xué)者對于人參皂苷進(jìn)行了大量研究，研究發(fā)現(xiàn)這些皂苷類活性成分具有血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)，物質(zhì)代謝系統(tǒng)，以及抗炎、抗衰老、抗腫瘤等多方面的藥理活性。本課題研究的對象是其主要活性成分之一人參皂苷Rd，研究了其對于TNBS-50X乙醇誘導(dǎo)的大鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用，并對其抗炎機(jī)理進(jìn)行了初步研究。大鼠結(jié)腸濕重指數(shù)(結(jié)腸重量/長度)被認(rèn)為是可以指示TNBS-50X誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性大鼠潰瘍性結(jié)腸炎嚴(yán)重程度的較為穩(wěn)定和可靠的指標(biāo)之一，本研究結(jié)果表明不同劑量人參皂苷Rd給藥組大鼠結(jié)腸濕重指數(shù)與模型對照組相比較顯著降低。人參皂苷Rd還能防止TNBS-50%誘導(dǎo)的UC大鼠體重下降；從大體和病理學(xué)評分也可以看到人參皂苷Rd能夠減輕大體形態(tài)學(xué)及病理學(xué)病變，顯著減少了組織壞死和潰瘍的形成、減輕炎性細(xì)胞浸潤，促進(jìn)上皮細(xì)胞和潰瘍面的修復(fù)。國內(nèi)外研究結(jié)果已證實(shí)炎性介質(zhì)和活性氧的代謝產(chǎn)物與炎癥性腸病的產(chǎn)生和發(fā)展有關(guān)。大量的動物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)活性氧的代謝產(chǎn)物可能與炎癥的發(fā)生密不可分，同時研究結(jié)果顯示炎性腸炎患者粘膜中過量、大量的活性氧的代謝產(chǎn)物可能與此類疾病的發(fā)病有關(guān)。這些代謝產(chǎn)物可能是導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎患者粘膜損傷的誘因之一。吞噬細(xì)胞是其主要來源，在炎癥發(fā)病期間這些細(xì)胞大量的滲入腸粘膜，發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)釋放大量的活性氧，而導(dǎo)致腸粘膜的氧化損傷。盡管腸粘膜具有很好的抗氧化損傷的防御機(jī)制，但與機(jī)體的其它器官如肝和肺相比能力比較低。氧應(yīng)激產(chǎn)物的過度釋放可能破壞腸道系統(tǒng)本身的粘膜防御機(jī)制。目前，腸粘膜中由于吞噬細(xì)胞應(yīng)激產(chǎn)生的過量活性氧和脂質(zhì)過氧化物的增加已作為描述炎性腸炎患者活檢標(biāo)本(IBD)的指標(biāo)。個別研究者還發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rd具有免疫佐劑活性，并且能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和表達(dá)來激發(fā)和平衡Thl和Th2免疫應(yīng)答反應(yīng)。由于細(xì)胞因子在免疫系統(tǒng)調(diào)控有著重要地位，目前UC的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制特別是細(xì)胞因子發(fā)病機(jī)制越來越受到人們的重視。而促炎性細(xì)胞因子與抑炎性細(xì)胞因子之間的平衡失調(diào)所致的免疫異常被視為UC的重要發(fā)病機(jī)制。本發(fā)明也證實(shí)了人參皂苷Rd在清除氧自由基、抗氧化，免疫調(diào)劑的作用，其對于大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制我們可從以下幾個方面進(jìn)行進(jìn)一步的探討和總結(jié)?！?、Rd對白細(xì)胞浸潤程度的影響①髓性過氧化物酶(MPO):是中性粒細(xì)胞中含量較高的一種酶，其含量的增高可以反映中性粒細(xì)胞在某一組織中浸潤，間接反映炎癥在組織中的存在，而炎癥組中MPO水平可反映中性粒細(xì)胞的浸潤數(shù)目和活性，MPO已被作為評價腸道炎癥嚴(yán)重程度的指標(biāo)之一^'^。本實(shí)驗(yàn)中正常對照組大鼠結(jié)腸及血清樣本中MPO活力在各組中最低，模型對照組MPO活性在各組中最高，這也說明了模型對照組中性粒細(xì)胞浸潤及腸道炎癥損傷最嚴(yán)重。與模型對照組相比較，SASP組，人參皂苷Rd低、中、高劑量組UC大鼠結(jié)腸組織中的MPO活性明顯降低(呈劑量依賴關(guān)系)，[18]MP0檢測結(jié)果與病理學(xué)組織檢測結(jié)果相符。說明Rd能減輕中性粒細(xì)胞浸潤程度，緩解炎癥。二、Rd對UC大鼠結(jié)腸組織氧化損傷及抗氧化能力的影響①丙二醛(MDA)與超氧化物岐化酶(SOD):機(jī)體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸(PUFA)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物，如丙二醛(MDA)、羥基、羰基、酮基、氫過氧基或內(nèi)過氧基，以及新的氧自由基等。氧自由基不但通過生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化引起細(xì)胞損傷，而且還能通過脂氫過氧化物的分解產(chǎn)物引起細(xì)胞損傷。因而測試MDA的量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接的反應(yīng)出細(xì)胞的損傷程度；并且MDA與SOD有著密切聯(lián)系，SOD活力的高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA得高低又間接反應(yīng)了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)中，模型對照組大鼠結(jié)腸組織MDA含量較正常對照組明顯升高，而SOD活力明顯降低，各用藥組與模型對照組相比較結(jié)腸組織中的MDA含量明顯降低，而SOD活力顯著升高且呈劑量依賴關(guān)系。這一結(jié)果表明Rd在治療潰瘍性結(jié)腸炎損傷中有較強(qiáng)的抗氧化作用，且其抗炎作用可能與減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)。②谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px):是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，它的生理功能主要是催化GSH參與過氧化反應(yīng)，清除在細(xì)胞呼吸代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物和羥自由基，從而減輕細(xì)胞膜多不飽和脂肪酸的過氧化作用。從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害。因此GSH-Px活性的變化也可反映機(jī)體抗氧化能力的變化。本實(shí)驗(yàn)中，模型對照組大鼠結(jié)腸組織GSH-PX活力較正常對照組顯著降低，而SASP組及人參皂苷Rd低、中、高劑量與模型對照組相比較GSH-PX活力明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了人參皂苷Rd較強(qiáng)的抗氧化能力。三、人參皂苷Rd對細(xì)胞因子平衡的影響①抑制促炎因子的表達(dá)IL-113是一種前炎癥因子，它和TNF-a、IL_6、IL_8等細(xì)胞因子在誘導(dǎo)結(jié)腸粘膜炎癥中有重要作用，并參與炎癥的持續(xù)和放大。它通過激活免疫細(xì)胞級聯(lián)反應(yīng)使炎癥反應(yīng)加重。腹瀉是腸道炎癥的主要癥狀，而IL-ie似乎是腹瀉的主要剌激物。高劑量IL-IP引起上皮細(xì)胞壞死、水腫、中性粒細(xì)胞浸潤和杯狀細(xì)胞缺失。目前認(rèn)為其在UC中發(fā)病作用有4個方面(1)UC粘膜固有層中活化的巨噬細(xì)胞可釋放IL-113，激活樹突樣細(xì)胞，吞噬、消化外來抗原，釋放抗原片段并呈遞至T淋巴細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)；(2)IL-1P能增加由巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子如IL-6、TNF-a和IL_8，使得中性粒細(xì)胞向炎癥部位聚集，進(jìn)入腸道病變部位，從而引起一系列的腸道病變，如結(jié)腸上皮的損傷、小血管炎、隱窩膿腫等，最終造成UC的發(fā)?。?3)IL-1P與IL-1受體的失衡是UC發(fā)生的重要環(huán)節(jié)；(4)IL-113可以通過誘導(dǎo)釋放H202，影響的Ca2+釋放和NK-A的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的開關(guān)，從而導(dǎo)致UC患者的結(jié)腸平滑肌收縮功能紊亂。本實(shí)驗(yàn)中模型對照組大鼠結(jié)腸組織中IL-IP表達(dá)水平較正常對照組顯著升高，而人參皂苷Rd各劑量組能夠顯著降低潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中IL-IP表達(dá)水平，說明人參皂苷Rd減輕UC組織損傷的主要機(jī)制之一是降低病變部位的IL-113表達(dá)水平。腫瘤壞死因子(TNF-a)是一種重要的促炎癥因子和免疫調(diào)節(jié)因子，由活化的巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞分泌的一種參與UC發(fā)病的細(xì)胞因子，TNF-a引起腸道粘膜損傷的機(jī)制包括釋放血小板活化因子、生成白三烯和氧自由基，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)誘生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)四氫生物蝶呤(一種NO促生因子)的生成，使NO生成增加而引起細(xì)胞的損傷；TNF-a可調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增生、成熟和活化，并促進(jìn)其粘附、游走和脫顆粒，增強(qiáng)它們的吞噬殺傷功能，促進(jìn)它們釋放炎癥蛋白和炎癥介質(zhì)，直接參與腸粘膜的損傷；TNF-a上調(diào)的血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子和趨化性細(xì)胞因子IL_8的表達(dá)而增加炎癥細(xì)胞的聚集；TNF-a也能誘生IL-1P的生成而致腸粘膜的損傷；TNF-a過多還可通過激活半胱天冬蛋白酶(Caspases)導(dǎo)致腸道內(nèi)淋巴細(xì)胞凋亡，降低腸粘膜的免疫功能。TNF-a在TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用，TNF_a是一個具有顯著趨化活性細(xì)胞因子，在IL-113的協(xié)同作用下，使相關(guān)的酶激活(包括一氧化氮合酶，磷脂酶A、環(huán)氧化酶和蛋白酶等)，從而誘導(dǎo)粘附分子和其他炎性細(xì)胞因子表達(dá)，直接或間接導(dǎo)致粘膜損傷，這些細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)和控制炎癥反應(yīng)重要的生物活性蛋白，與潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中模型對照組大鼠結(jié)腸組織TNF-a含量較正常對照組顯著升高，而人參皂苷Rd各給藥組能夠顯著降低潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸組織中TNF-a表達(dá)水平。這一結(jié)果表明人參皂苷Rd治療TNBS誘導(dǎo)的大鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎有顯著的治療效果與其能降低組織內(nèi)致炎因子TNF-a表達(dá)及調(diào)節(jié)免疫平衡密切相關(guān)。②對抑炎因子的調(diào)控作用白介素10(IL-10)是1989年Fiorentino等發(fā)現(xiàn)具有多重功效的炎癥抑制性細(xì)胞因子，參與多種免疫反應(yīng)，其主要的生物學(xué)活性是免疫抑制作用，能抑制單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞等產(chǎn)生促炎性因子和趨化因子抑制IL-113、L-6、L-8、TNF-a，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子(GM-CSF)等的產(chǎn)生；阻止抗原特異T細(xì)胞的增殖，抑制抗原遞呈細(xì)胞(APC)表面的組織相容性復(fù)合物(MHC)-II類分子和某些剌激因子如B7的表達(dá)，降低APC的抗原遞呈能力，下調(diào)效應(yīng)細(xì)胞的IL-2mRNA的表達(dá)，抑制IL_2的產(chǎn)生，抑制炎性介質(zhì)一氧化氮、氧自由基、前列腺素等的合成；抑制巨噬細(xì)胞的炎癥相關(guān)酶iNOS(誘導(dǎo)型一氧化氮合酶)和C0X-2(環(huán)氧合酶)的表達(dá)；通過抑制IFN-Y的產(chǎn)生抑制自然殺傷NK細(xì)胞的活性，抑制ThO細(xì)胞向Thl細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，抑制炎癥細(xì)胞的遷移。還能抑制由LPS誘導(dǎo)的組織因子的表達(dá)，從而抑制凝血系統(tǒng)的活性。另外IL-10還具有免疫剌激作用，可促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和分化，產(chǎn)生大量IgG、IgA、IgM，還可增加靜止B細(xì)胞的存活率，在組織特異性自身免疫性損傷的啟動和發(fā)展中起著關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用。1993年，Kuhn，Lohler，Rennick，Rajewsky，和Muller等研究者發(fā)現(xiàn)IL-10基因敲除的小鼠會誘發(fā)腸道炎癥，并且IL-10的變化與潰瘍性結(jié)腸炎病情變化程度一致，也與治療效果一致。本實(shí)驗(yàn)中模型對照組大鼠結(jié)腸組織IL-10含量較正常對照組顯著降低，人參皂苷Rd低劑量組、高劑量與模型對照組相比較結(jié)腸組織中的IL-10含量顯著增加，這一結(jié)果表明Rd能夠顯著的促進(jìn)抑炎因子IL-10的表達(dá)。由上述結(jié)果可知，人參皂苷Rd治療TNBS/50X誘導(dǎo)的大鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎有明顯療效其主要機(jī)理之一是能顯著的抑制促炎細(xì)胞因子IL-113、TNF-a的生成，以及促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)。四、與鈣離子通道的關(guān)系最新研究結(jié)果證實(shí)人參皂苷Rd為一新型的非電位依賴性鈣離子通道阻滯劑，而電位非依賴性鈣通道是通過剌激細(xì)胞膜受體(膜受體鈣激活通道，ROCC)或者是肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子貯存池衰減(鈣池操縱的鈣離子通道，SOC)而完成細(xì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)控功能，并且對于多種細(xì)胞例如上皮細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞的功能起到非常重要的調(diào)控作用。炎癥細(xì)胞屬非興奮細(xì)胞，SOC是這些細(xì)胞胞外鈣內(nèi)流的主要通道。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)鈣濃度的升高可使炎性細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞激活或發(fā)揮作用，可使相關(guān)酶和炎癥介質(zhì)激活、釋放。調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞胞質(zhì)16內(nèi)Ca"濃度可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度。鈣拮抗劑有穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜和阻止脫顆粒、抑制淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及IL-2的產(chǎn)生，降低表皮郎格罕細(xì)胞數(shù)的作用，鈣通道阻滯劑如硝苯地平、維拉帕米能阻斷鈣通道，減少胞內(nèi)Ca2+濃度，抑制肥大細(xì)胞脫顆粒，抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放。但此類藥如硝苯地平阻滯電壓依賴性f丐通道(PDC)，而不影響SOC。由于炎癥細(xì)胞屬非興奮細(xì)胞，S0C抑制劑對炎細(xì)胞上的鈣離子通道較PDC阻滯藥更特異，應(yīng)能更有效地阻礙炎細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的上升而對炎癥產(chǎn)生抑制作用。已發(fā)現(xiàn)的S0C阻滯劑有陽離子、細(xì)胞色素P-450抑制劑、花生四烯酸代謝酶抑制劑等，但它們大多缺乏理想的特異性，或僅是工具藥。如前所述，現(xiàn)有的抗炎藥如乙酰水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類與及抗UC藥柳氮磺吡啶也均不具鈣拮抗作用。用特異性的S0C阻滯劑來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)必將為炎癥的防治提供一個新的靶點(diǎn)，尋找能治療UC炎癥的特異性的S0C阻滯劑的研究有重要的理論價值和應(yīng)用價值。實(shí)施例2:人參皂苷Rd治療大鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎最佳給藥途徑方法用炎癥誘導(dǎo)劑三硝基苯磺酸(TNBS)/50%乙醇溶液誘導(dǎo)法建立大鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎模型。將大鼠隨機(jī)分為模型對照組、Rd灌胃給藥組、Rd肌肉注射組。Rd給藥劑量為30mg/kg，每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。各項(xiàng)指標(biāo)具體檢測方法見實(shí)施實(shí)例1。結(jié)果①與模型對照組比，Rd灌胃給藥組及Rd肌肉注射組大鼠結(jié)腸濕重指數(shù)均明顯減輕，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)，其中灌胃給藥組大鼠結(jié)腸濕重指數(shù)最低。②與模型對照組相比，Rd灌胃給藥及Rd肌肉注射能夠明顯降低UC大鼠結(jié)腸大體觀察評分及病理組織學(xué)評分，減輕大鼠結(jié)腸的病理學(xué)損傷(P<0.01)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論人參皂苷Rd對TNBS誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎有明顯的治療作用，且灌胃給藥方式為治療潰瘍性結(jié)腸炎最佳的給藥途徑。權(quán)利要求人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求l所述的人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用，其特征是人參皂苷Rd在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。3.如權(quán)利要求l所述的人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用，其特征是人參皂苷Rd在制備治療非細(xì)菌性慢性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。4.如權(quán)利要求1或2或3所述的人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用，其特征是人參皂苷Rd口服制劑在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。5.如權(quán)利要求4所述的人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用，其特征是所述的口服制劑為膠囊、微囊、脂質(zhì)體、顆粒劑、片劑、口服液。6.如權(quán)利要求l-3、5任意之一所述的人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用，其特征是人參皂苷Rd為從三七中提取的人參皂苷Rd單體化合物，其中人參皂苷Rd單體為95%以上；還包括從五加科人參屬植物人參、西洋參的根、莖、葉、花、果實(shí)中提取分離得到的人參皂苷Rd單體化合物。7.如權(quán)利要求4所述的人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用，其特征是人參皂苷Rd從三七中提取的人參皂苷Rd單體化合物，其中人參皂苷Rd單體為95%以上；還包括從五加科人參屬植物人參、西洋參的根、莖、葉、花、果實(shí)中提取分離得到的人參皂苷Rd單體化合物。全文摘要本發(fā)明主要涉及一種人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的用途。尤其涉及人參皂苷Rd在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的用途。本發(fā)明通過試驗(yàn)說明人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用是人參皂苷Rd在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用是人參皂苷Rd在制備治療非細(xì)菌性慢性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。人參皂苷Rd在制備治療結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用是人參皂苷Rd口服制劑在制備治療潰瘍性結(jié)腸炎藥物的應(yīng)用。本發(fā)明利用人參皂苷Rd口服難吸收、主要進(jìn)入結(jié)腸內(nèi)這一特性，結(jié)合其具有的強(qiáng)大的抗炎作用，充分展示了人參皂苷Rd對結(jié)腸炎的治療作用，揭示了抗氧化劑對結(jié)腸炎的治療價值，立意新奇。文檔編號A61P1/00GK101791316SQ20101012940公開日2010年8月4日申請日期2010年2月16日優(yōu)先權(quán)日2010年2月16日發(fā)明者吳勇杰,范福林,黃艷輝申請人:蘭州大學(xué);廣東泰禾醫(yī)藥科技有限公司