專利名稱：一種新的肺炎球菌結合疫苗及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的肺炎球菌結合疫苗。具體而言，本發(fā)明涉及一種肺炎球菌多
個血清型莢膜糖與蛋白載體結合的新的肺炎球菌結合疫苗，來源于不同血清型的莢膜糖通
過與蛋白載體的化學結合后，以2價血清型莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型莢膜糖-蛋白結合體形式存在于疫苗中。本發(fā)明還涉及所述的新的肺炎球菌結合疫苗的制備方法，以及新的細菌莢膜糖蛋白結合疫苗的制備方法。
背景技術：
肺炎鏈球菌(Str印tococcus pneumoniae)引發(fā)的疾病是全球兒童尤其是發(fā)展中國家兒童發(fā)病率和死亡率的最主要病因，肺炎球菌的疾病負擔主要來自于2歲以下兒童和老年人，肺炎球菌疾病已成為全球一個嚴重的公共健康問題。全球每年約1，060萬5歲以下兒童罹患肺炎球菌疾病，WH0估計每年有160萬人死于肺炎球菌疾病，包括70 100萬5歲以下的兒童，其中大多數是生活在發(fā)展中國家的兒童(http:〃www.who. int/biologicals/areas/vaccines/pneumo/en/)。 全球通過接禾中疫苗可予頁防的小于5歲兒童死亡疾病中，肺炎球菌疾病為第l位，占28% (楊永弘，中國疫苗和免疫，2008 ;14:4:376-377)。肺炎球菌疾病死亡人數已超過艾滋病、瘧疾和麻疹死亡人數的總和(Obaro，Expert Rev Vaccines. 2009 ;8 (8) :1051-1061)。季節(jié)性流感病毒、H1N1流感病毒、HIV病毒感染和其他與免疫缺陷相關的病癥使罹患肺炎球菌病的幾率大增。美國CDC公布上世紀每次流感大流行，繼發(fā)的肺炎球菌疾病是發(fā)病和死亡的最主要病因，在季節(jié)性流感流行期間也觀察至Ll同樣的情況(http://www. cdc. gov/hlnlflu/vaccination/provider/provider_pneumococcal, htm)。 肺炎球菌誘發(fā)的嚴重疾病包括肺炎、腦膜炎和敗血癥，中耳炎、鼻竇炎和氣管炎也為常見，但感染的臨床癥狀略輕。暴露于肺炎球菌后，常出現暫時性鼻咽部細菌定植但并不發(fā)病，當機體抵抗力下降，肺炎球菌可造成呼吸系統(tǒng)的局部感染，如急性中耳炎、鼻竇炎等；肺炎球菌進入下呼吸道導致肺炎；進一步，肺炎球菌侵入血液、腦脊液或其他原本無菌的部位時所形成的感染性疾病，稱為侵襲性肺炎球菌疾病(Invasive Pneumococcal Disease,IPD)，菌血癥性肺炎、菌血癥發(fā)熱、敗血癥和腦膜炎是IPD的主要臨床表現。
肺炎球菌感染的高發(fā)人群是< 5歲兒童和^ 65歲的老人，其中< 2歲兒童發(fā)病率最高。美國在大規(guī)模使用肺炎球菌結合疫苗前，IPD在《12月齡幼兒中的年發(fā)病率為167/10萬，在6 11月齡幼兒中的發(fā)病率達到235/10萬的高峰，在12 23月齡幼兒中的發(fā)病率為203/10萬，而整體人群的發(fā)病率只有24/10萬。在歐洲和美國，IPD的年發(fā)病率為10 100例/10萬。發(fā)展中國家中5歲以下兒童中IPD的發(fā)病率要比工業(yè)化國家高好幾倍。我國1996 2000年< 5歲兒童死亡監(jiān)測結果分析中，肺炎是首位原因(773/10萬)，占全部死亡的19% (楊永弘，中國疫苗和免疫，2008 ;14 :4 :376-377)。
肺炎球菌是革蘭陽性、具有莢膜的雙球菌。莢膜多糖(Polysaccharides, PS)為其主要致病毒力因子。根據莢膜多糖的成份差異，將肺炎球菌區(qū)分46個血清群91個血清型。不同年齡、時間和地理區(qū)域的優(yōu)勢流行血清型分布譜也有所不同，但常見的血清型在全球各地都有所發(fā)現，且全球常見的致病血清型是一致的。從全球范圍來看，約20余種血清型與超過80%發(fā)生在各年齡段的IPD有關。全球最常見的血清群是6、14、19，然而在發(fā)展中國家幼兒IPD中主要是1、5、8血清群。 肺炎球菌對抗生素(如青霉素、頭孢菌素、復方新諾明、大環(huán)內酯類和氟喹諾酮類)的耐藥性在全世界已經成了一個相當嚴峻的、急劇發(fā)展的現象。隨著肺炎鏈球菌對常用抗生素的耐藥性日益增加，當前亟需有效的疫苗來控制肺炎球菌疾病(WHO. WeeklyEpidemiological Record. No. 12， 2007 ;93-104)。目前，有2個預防肺炎球菌疾病疫苗已上市，分別是含有23個血清型莢膜多糖抗原的疫苗(Pneumococcal PolysaccharideVaccine, PPV23)和含有7個血清型莢膜糖與蛋白載體結合的結合疫苗(PneumococcalConjugate Vaccine, PCV7)。 莢膜糖(包括莢膜多糖和莢膜寡糖)抗原是非T細胞依賴型抗原，不能產生免疫記憶反應，在2歲以下兒童中免疫原性弱。因此PPV23主要用于預防成人和^ 2歲兒童肺炎球菌性疾病。PPV23每劑0. 5毫升，含有23個血清型(1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F)的純化莢膜多糖，每個血清型莢膜多糖為25 ii g。這23個血清型在美國和其他一些工業(yè)化國家覆蓋大多數的成人IPD約90%， PPV23也包括最常見的耐藥血清型。30多年來，盡管進行了多個研究，PPV23在兒童和成人的效力和效果仍然難以定論，存在諸多爭議。對PPV23疫苗的效力和效果進行綜合性的meta分析(包括2007年WHO委托開展的meta分析和一個對RCTs的綜合分析)發(fā)現，在健康年輕人中PPV23對IPD和全因肺炎具有保護作用，在老年人中對IPD至少也有一定程度的保護。但這些試驗并未證實PPV23在高風險人群(如患有可增加感染風險的基礎疾病的成人和兒童、所有年齡段的嚴重免疫抑制者)對IPD和全因肺炎具有保護作用(Moberley S et al. Cochrane Database ofSystematic Reviews,2008 :1 ;CD000422，HussA et al. Canadian Medical Associationjournal, 2008.)。許多工業(yè)化國家推薦老人和其他高風險人群接種PPV23, WHO建議在資源有限的國家，現有證據不支持老人和高風險人群常規(guī)接種PPV23 (WHO. Weekly Epidemiological Record. No. 42， 2008 ;373-584)。
莢膜糖抗原和蛋白載體經化學鍵結合后，轉變?yōu)門細胞依賴型抗原，可誘導T細胞介導的免疫應答，其特征是促進保護性免疫力的形成，尤其是在嬰兒中產生保護，以及誘導免疫記憶。每0. 5ml劑量的PCV7含2 ii g血清型4、9V、 14、 19F和23F的莢膜多糖；2 y g血清型18C的寡糖；4 g血清型6B的多糖。每一血清型莢膜糖都與無毒性的白喉CRM. 197蛋白結合，并由磷酸鋁佐劑吸附。在美國，在引進該疫苗開展大規(guī)模免疫接種之前，該疫苗中包含的血清型約占兒童侵襲性肺炎鏈球菌株的86%。美國的大規(guī)?，F場研究表明，由PCV7疫苗血清型誘導的針對IPD的保護性免疫力在接種了至少3針次的兒童中可達97. 4%，在至少接種1針次的兒童中可達93. 9%。在將PCV7引進國家免疫接種規(guī)劃1年后，由該疫苗中含有的肺炎球菌血清型所致的IPD在所有1歲以下接種者中的發(fā)病率降低了 100%。在引進該疫苗3年后，1歲以下兒童中所有IPD的發(fā)病率降低了 84. 1%;在20 39歲成人中降低了52%，在60歲以上個體中降低了27%。后續(xù)監(jiān)測表明，在引進該疫苗2年后，IPD在5歲以下兒童中的發(fā)病率降低了 75% 。在5歲以上、未接種疫苗的人群中IPD發(fā)病率的下降可能是因為來自5歲以下、已接種疫苗的嬰幼兒的細菌傳播減少了 ，即所謂"群體免疫"現象。在美國，在所有被防止的IPD中約有68X可歸功于這種間接效應。PCV7已通過在全球 不同地區(qū)開展的試驗中接受了檢驗，并已被證實是有效的、安全的、耐受性好，即便是在HIV 患兒中也是如此。WHO全球疫苗安全咨詢委員會在2006年11月對PCV7的安全性進行了 評估，結論認為，有關PCV7和其他肺炎球菌結合疫苗的安全性的證據是令人信服的(WHO. Weekly Epidemiological Record. No. 12，2007 ;93—104)。 然而，PCV7大規(guī)模接種后，肺炎球菌血清型流行病確出現了變化，PCV7于2000 年在美國大規(guī)模接種后，在小于1歲兒童中觀察到非疫苗血清型IPD成為最大增長，達到 10. 8/10萬。在小于5歲兒童中19A血清型引發(fā)的IPD發(fā)病率從1998 1999年的2. 6/10 萬增長至2005年的9. 3/10萬。2005年，在小于5歲兒童中的IPD的40%是非疫苗血清型 19A引起的，19A成為發(fā)病率增長最高的血清型。2005年在小于5歲兒童中盡管PCV7疫苗 血清型疾病繼續(xù)下降，但是2002 2005年IPD總體發(fā)病率卻呈現平穩(wěn)狀態(tài)(Reingold et al.Morbidity & Mortality WeeklyR印ort. 2008 ;57 :6 :144-148.)。另一研究者也指出， 2002 2005年小于5歲兒童中每年IPD的72 91 %是非疫苗血清型菌株引發(fā)的(Pelton et al.Pediatr Infect DisJ. 2007 ;26 (6) :468-472.)。 有鑒于成功的疫苗對肺炎球菌疾病所帶來的巨大的公共衛(wèi)生影B向，WHO認為應優(yōu) 先開發(fā)安全、有效、價格適中，并能為肺炎球菌疾病提供更廣譜保護的肺炎球菌疫苗。需要 有更有效的結合疫苗或其他類型的疫苗，這些疫苗可涵蓋導致全球大齡兒童和成人嚴重疾 病的大多數肺炎球菌血清型(往往也是對常用抗菌藥物耐藥的血清型)。WH0支持當前正 在開展的這類疫苗產品的研發(fā)工作(WHO. Weekly Epidemiological Record. No. 42， 2008 ; 373-584)。因此，擴大PCV7疫苗血清型就凸顯為急迫的任務。 近年來，鑒于1 、3、5、6A、7F和19A血清型侵入性肺炎疾病的嚴重性和危害，在PCV7 疫苗基礎上增加血清型1和5的PCV9、繼續(xù)增加血清型7F的PCV10、再增加血清型3的 PCV11、進一步增加血清型6A和19A的PCV13相繼在開發(fā)中。PCV7在美國、歐洲、亞洲和拉 丁美洲的覆蓋率分別為80 90%、 60 80%、 40 80%。在PCV7中增加6個型別莢膜糖 蛋白結合物，成為13價結合疫苗。13價結合疫苗對美國和歐洲的覆蓋率均提升至90%以 上，對亞洲和拉丁美洲的覆蓋率也提升至70 80%。然而，相比較PPV23疫苗在全球的覆 蓋率和考慮到大規(guī)模接種疫苗后將出現非疫苗血清型流行增加的趨勢，PCV13覆蓋率仍需 要繼續(xù)擴大。 現有肺炎球菌結合疫苗在技術上均是將每一個血清型的莢膜糖獨立與蛋白載體 經化學鍵結合后，形成單價血清型莢膜糖_蛋白結合體，再將各個單價血清型莢膜糖_蛋白 結合體合并，進而配制成為含多個血清型莢膜糖的肺炎球菌結合疫苗。肺炎球菌結合疫苗 中各個莢膜糖抗原以單價莢膜糖-蛋白結合體獨立存在，彼此并無結構上的鏈接。例如， PCV7是將來源于7個血清型的不同莢膜糖分別與蛋白載體CRM197經化學鍵結合形成7個 單價莢膜糖_蛋白結合體，即4PS-CRM197、9VPS-CRM197、14PS-CRM197、19F PS-CRM197、23F PS-CRM197、6B PS-CRM197禾P 18C 0S-CRM197，再將上述7個單價莢膜糖-蛋白結合體按比 例合并配制成多價成品疫苗。因此，利用現有技術將超過13個血清型的更多血清型莢膜糖 與蛋白載體分別結合，形成多個單價的血清型莢膜糖-蛋白結合體，再將多個單價血清型 莢膜糖-蛋白結合體合并，并制成單一疫苗制劑，在技術上仍存在困難(中國專利申請?zhí)?200680053139. 6)。同時，現有的PCV7和即將上市的PCV13與Hib結合疫苗相比較，在生產
7過程和生產成本方面分別相當于7個和13個Hib結合疫苗。這些因素限制了肺炎球菌結合疫苗的進一步發(fā)展。 本發(fā)明提供的新型肺炎球菌結合疫苗，系將來源于2個不同血清型莢膜糖抗原或多個不同血清型莢膜糖抗原，與載體蛋白進行化學結合，形成2價血清型莢膜糖_蛋白結合體或多價血清型莢膜糖_蛋白結合體；再將一個或兩個或兩個以上這樣的結合體配制成肺炎球菌結合疫苗。因此，本發(fā)明的肺炎球菌結合疫苗繼承了現有肺炎球菌結合疫苗的安全性、良好的免疫原性、誘導免疫記憶的優(yōu)勢；又成功地解決了將更多的血清型莢膜糖抗原納入其中的技術困難，使疫苗覆蓋范圍更廣；進一步，顯著性地縮短了疫苗生產過程和降低了生產成本。

發(fā)明內容
本發(fā)明一方面提供一種肺炎球菌結合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多個血清型莢膜糖，這些來源于不同血清型的莢膜糖與蛋白載體進行化學鍵結合，莢膜糖通過與蛋白載體的化學鍵結合與其它型莢膜糖相互間建立結構上的鏈接，以2價血清型莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型莢膜糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中。換言之，本發(fā)明包括來源于不同肺炎球菌血清型的莢膜糖抗原與蛋白載體結合所組成的肺炎球菌結合疫苗，所述莢膜糖以2價和/或多價被蛋白載體通過化學鍵相互間在結構上建立鏈接的形式存在于疫苗中。本發(fā)明提供的肺炎球菌結合疫苗用于嬰幼兒、兒童及成人預防肺炎球菌感染引發(fā)的疾病。 本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌結合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多個血清型莢膜多糖，這些來源于不同血清型的莢膜多糖與蛋白載體進行化學鍵結合，莢膜多糖通過與蛋白載體的化學鍵結合與其它型莢膜多糖相互間建立結構上的鏈接，以2價血清型莢膜多糖_蛋白結合體和/或多價血清型莢膜多糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中。因此，本發(fā)明包括來源于不同肺炎球菌血清型的莢膜多糖抗原與蛋白載體結合所組成的肺炎球菌結合疫苗，所述莢膜多糖以2價和/或多價被蛋白載體通過化學鍵相互間在結構上建立鏈接的形式存在于疫苗中。 本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌結合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多個血清型莢膜寡糖，這些來源于不同血清型的莢膜寡糖與蛋白載體進行化學鍵結合，莢膜寡糖通過與蛋白載體的化學鍵結合與其它型莢膜寡糖相互間建立結構上的鏈接，以2價血清型莢膜寡糖_蛋白結合體和/或多價血清型莢膜寡糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中。因此，本發(fā)明包括來源于不同肺炎球菌血清型的莢膜寡糖抗原與蛋白載體結合所組成的肺炎球菌結合疫苗，所述莢膜寡糖以2價和/或多價被蛋白載體通過化學鍵相互間在結構上建立鏈接的形式存在于疫苗中。 本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌結合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多個血清型莢膜多糖和寡糖，這些來源于不同血清型的莢膜多糖和寡糖與蛋白載體進行化學鍵結合，莢膜多糖和寡糖通過與蛋白載體的化學鍵結合與其它型莢膜多糖和寡糖相互間建立結構上的鏈接，以2價血清型莢膜多糖和寡糖_蛋白結合體和/或多價血清型莢膜多糖和寡糖-蛋白結合體形式存在于疫苗中。因此，本發(fā)明包括來源于不同肺炎球菌血清型的莢膜多糖和寡糖抗原與蛋白載體結合所組成的肺炎球菌結合疫苗，所述莢膜多糖和寡糖以2價和/或多價被蛋白載體通過化學鍵相互間在結構上建立鏈接的形式存在于疫苗中。
本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌結合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多個血清型莢膜多糖和寡糖，這些來源于一組不同血清型的莢膜多糖與蛋白載體進行化學鍵結合，這組莢膜多糖通過與蛋白載體的化學鍵結合相互間建立結構上的鏈接，以2價血清型莢膜多糖_蛋白結合體和/或多價血清型莢膜多糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中。這些來源于另外一組的不同血清型的莢膜寡糖與蛋白載體進行化學鍵結合，這組莢膜寡糖通過與蛋白載體的化學鍵結合相互間建立結構上的鏈接，以2價血清型莢膜寡糖_蛋白結合體和/或多價血清型莢膜寡糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中。因此，本發(fā)明包括來源于一組不同肺炎球菌血清型的莢膜多糖和來源于另外一組不同血清型的莢膜寡糖抗原分別與蛋白載體結合所組成的肺炎球菌結合疫苗，所述各型莢膜多糖以2價和/或多價被蛋白載體通過化學鍵彼此間在結構上建立鏈接的形式存在于疫苗中，所述各型莢膜寡糖以2價和/或多價被蛋白載體通過化學鍵彼此間在結構上建立鏈接的形式存在于疫苗中。2價或多價血清型莢膜多糖_蛋白結合體和2價或多價血清型莢膜寡糖_蛋白結合體分別獨立存在疫苗中，相互間沒有結構上的鏈接。 本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌結合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多個血清型莢膜糖，這些來源于不同血清型的莢膜糖任選地以每2 45個血清型莢膜糖與蛋白載體進行化學鍵結合，此2 45個血清型莢膜糖通過與蛋白載體的化學鍵結合相互間建立結構上的鏈接，以一個或兩個或兩個以上2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中。因此，本發(fā)明包括來源于不同肺炎球菌血清型的莢膜糖抗原與蛋白載體結合所組成的肺炎球菌結合疫苗，所述莢膜糖任選地以每2 45個血清型莢膜糖被蛋白載體通過化學鍵彼此間在結構上建立鏈接的形式存在于疫苗中。來源于不同血清型的莢膜糖以一個或兩個或兩個以上2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體獨立存在疫苗中，換言之，本發(fā)明疫苗中包含的每個2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體與其他2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體相互間沒有結構上的鏈接。 本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌結合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多個血清型莢膜糖，這些來源于不同血清型的莢膜糖任選地以每2 45個血清型莢膜糖與蛋白載體進行化學鍵結合，此2 45個血清型莢膜糖通過與蛋白載體的化學鍵結合相互間建立結構上的鏈接，以一個或兩個或兩個以上2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中，其中，所述兩個或兩個以上2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體分別含有相等價數的血清型莢膜糖，并且該價數均介于2 45之間。因此，本發(fā)明包括來源于不同肺炎球菌血清型的莢膜糖抗原與蛋白載體結合所組成的肺炎球菌結合疫苗，所述莢膜糖任選地以每2 45個血清型莢膜糖被蛋白載體通過化學鍵彼此間在結構上建立鏈接的形式存在于疫苗中。來源于不同血清型的莢膜糖以一個或兩個或兩個以上2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體獨立存在疫苗中，其中，所述兩個或兩個以上2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體以相等價數的血清型莢膜糖_蛋白結合體形式獨立存在于疫苗中，并且該相等價數均介于2 45之間。換言之，本發(fā)明疫苗中包含相等價數的血清型莢膜糖-蛋白結合體的組合，例如，包含兩個以上2價血清型莢膜糖_蛋白結合體；或包含兩個或兩個以上3價血清型莢膜糖-蛋白結合體；或包含兩個或兩個以上4價血清型莢膜糖-蛋白結合體；或包含兩個或兩個以上5價血清型莢膜糖_蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上6價血清型莢膜
9糖-蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上7價血清型莢膜糖-蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上8價血清型莢膜糖_蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上9價血清型莢膜糖_蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上10價血清型莢膜糖_蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上11價血清型莢膜糖_蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上12價血清型莢膜糖_蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上13價血清型莢膜糖_蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上14價血清型莢膜糖_蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上15價血清型莢膜糖-蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上16價血清型莢膜糖_蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上17價血清型莢膜糖_蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上18價血清型莢膜糖_蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上19價血清型莢膜糖_蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上20價血清型莢膜糖_蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上21價血清型莢膜糖_蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上22價血清型莢膜糖_蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上23價血清型莢膜糖_蛋白結合體；或包含一個或兩個或兩個以上24價血清型莢膜糖_蛋白結合體；以此類推，直至包含一個或兩個45價血清型莢膜糖_蛋白結合體；并且，每個2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體與其他2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體相互間沒有結構上的鏈接。 本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌結合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多個血清型莢膜糖，這些來源于不同血清型的莢膜糖任選地以每2 45個血清型莢膜糖與蛋白載體進行化學鍵結合，此2 45個血清型莢膜糖通過與蛋白載體的化學鍵結合相互間建立結構上的鏈接，以一個或兩個或兩個以上2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中，其中，所述兩個或兩個以上2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體以不相等價數的血清型莢膜糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中，且該不相等價數介于2 45之間。因此，本發(fā)明包括來源于不同肺炎球菌血清型的莢膜糖抗原與蛋白載體結合所組成的肺炎球菌結合疫苗，所述莢膜糖任選地以每2 45個血清型莢膜糖被蛋白載體通過化學鍵彼此間在結構上建立鏈接的形式存在于疫苗中。來源于不同血清型的莢膜糖以一個或兩個或兩個以上2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體獨立存在疫苗中，其中，所述兩個或兩個以上2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體以不相等價數的血清型莢膜糖_蛋白結合體形式獨立存在于疫苗中，且該不相等價數介于2 45之間。換言之，本發(fā)明疫苗中同時包含不相等價數的血清型莢膜糖_蛋白結合體的組合，既可包含2價血清型莢膜糖_蛋白結合體，也包含3價血清型莢膜糖_蛋白結合體、4價血清型莢膜糖_蛋白結合體、5價血清型莢膜糖_蛋白結合體、直至45價血清型莢膜糖_蛋白結合體的任選組合。并且，每個2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體與其他2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體相互間沒有結構上的鏈接。
本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌結合疫苗，所述疫苗的抗原包括肺炎球菌多個血清型莢膜糖，這些來源于不同血清型的莢膜糖任選地以每2 45個血清型莢膜糖與蛋白載體進行化學鍵結合，此2 45個血清型莢膜糖通過與蛋白載體的化學鍵結合相互間建立結構上的鏈接，以一個或兩個或兩個以上2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中，其中，所述兩個以上2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體以部分相等價數的血清型莢膜糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中，且該相等價數介于2 45之間。因此，本發(fā)明包括來源于不同肺炎球菌血清型的莢膜糖抗原與蛋白載體結合所組成的肺炎球菌結合疫
10苗，所述莢膜糖任選地以每2 45個血清型莢膜糖被蛋白載體通過化學鍵彼此間在結構上建立鏈接的形式存在于疫苗中。來源于不同血清型的莢膜糖以一個或兩個或兩個以上2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體獨立存在疫苗中，其中，所述兩個以上2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體以部分相等價數的血清型莢膜糖_蛋白結合體形式獨立存在于疫苗中，且該相等價數介于2 45之間。換言之，本發(fā)明疫苗中同時包含相等價數的血清型莢膜糖_蛋白結合體和不相等價數的血清型莢膜糖_蛋白結合體的組合，并且，每個2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體與其他2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體相互間沒有結構上的鏈接。 本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌_腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，所述聯(lián)合疫苗抗原包括肺炎球菌多個血清型莢膜糖、腦膜炎球菌4群(A、C、W135、Y)莢膜糖和b型流感嗜血桿菌莢膜糖，這些來源于不同細菌血清型(群)的莢膜糖與蛋白載體進行化學鍵結合，各型(群)莢膜糖通過與蛋白載體的化學鍵結合相互間建立結構上的鏈接，以2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中。因此，本發(fā)明包括來源于肺炎球菌多個血清型、腦膜炎球菌4群(A、C、W135、Y)和b型流感嗜血球菌的不同血清型(群)的莢膜糖抗原與蛋白載體結合所組成的聯(lián)合疫苗，所述各型(群)莢膜糖以2價和/或多價被蛋白載體通過化學鍵彼此間在結構上建立鏈接的形式存在于疫苗中。 本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌_腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，所述聯(lián)合疫苗抗原包括肺炎球菌多個血清型莢膜糖、腦膜炎球菌2群(A、 C)莢膜糖和b型流感嗜血桿菌莢膜糖，這些來源于不同細菌血清型(群)的莢膜糖與蛋白載體進行化學鍵結合，各型(群)莢膜糖通過與蛋白載體的化學鍵結合相互間建立結構上的鏈接，以2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中。因此，本發(fā)明包括來源于肺炎球菌多個血清型、腦膜炎球菌2群(A、 C)和b型流感嗜血球菌的不同血清型(群)的莢膜糖抗原與蛋白載體結合所組成的聯(lián)合疫苗，所述各型(群)莢膜糖以2價和/或多價被蛋白載體通過化學鍵彼此間在結構上建立鏈接的形式存在于疫苗中。 本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌_腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，所述聯(lián)合疫苗抗原包括肺炎球菌多個血清型莢膜糖、腦膜炎球菌4群(A、C、W135、Y)莢膜糖和b型流感嗜血桿菌莢膜糖，這些來源于肺炎球菌不同血清型的莢膜糖通過與蛋白載體的化學鍵結合形成彼此間結構上的鏈接，以2價血清型莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型莢膜糖-蛋白結合體形式存在于疫苗中。這些來源于腦膜炎球菌不同血清群的莢膜糖通過與蛋白載體的化學鍵結合形成各群莢膜糖彼此間結構上的鏈接，以4價血清群莢膜糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中。來源于b型流感嗜血桿菌的莢膜糖通過與蛋白載體的化學鍵結合，以單價血清型莢膜糖-蛋白結合體形式存在于疫苗中。因此，本發(fā)明包括來源于肺炎球菌多個血清型、腦膜炎球菌4群(A、C、W135、Y)和b型流感嗜血球菌的不同血清型(群)的莢膜糖抗原與蛋白載體結合所組成的聯(lián)合疫苗，所述肺炎球菌以每2價和/或多價血清型莢膜糖被蛋白載體通過化學鍵彼此間在結構上建立鏈接的形式存在于疫苗中，所述腦膜炎球菌各群莢膜糖以被蛋白載體通過化學鍵彼此間在結構上建立鏈接的形式存在于疫苗中，所述b型流感嗜血桿菌莢膜糖以被蛋白載體結合的形式存在于疫苗中。肺炎球菌莢膜糖、腦膜炎球菌莢膜糖、b型流感嗜血桿菌莢膜糖相互間沒有結構上的鏈接。
本發(fā)明又一方面提供一種肺炎球菌_腦膜炎球菌_b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，所述聯(lián)合疫苗抗原包括肺炎球菌多個血清型莢膜糖、腦膜炎球菌2群(A、 C)莢膜糖和b型流感嗜血桿菌莢膜糖，這些來源于肺炎球菌不同血清型的莢膜糖通過與蛋白載體的化學鍵結合形成彼此間結構上的鏈接，以2價血清型莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型莢膜糖-蛋白結合體形式存在于疫苗中。這些來源于腦膜炎球菌不同血清群的莢膜糖通過與蛋白載體的化學鍵結合形成各群莢膜糖彼此間結構上的鏈接，以2價血清群莢膜糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中。來源于b型流感嗜血桿菌的莢膜糖通過與蛋白載體的化學鍵結合，以單價血清型莢膜糖-蛋白結合體形式存在于疫苗中。因此，本發(fā)明包括來源于肺炎球菌多個血清型、腦膜炎球菌2群(A、 C)和b型流感嗜血球菌的不同血清型(群)的莢膜糖抗原與蛋白載體結合所組成的聯(lián)合疫苗，所述肺炎球菌以每2價和/或多價血清型莢膜糖被蛋白載體通過化學鍵彼此間在結構上建立鏈接的形式存在于疫苗中，所述腦膜炎球菌各群莢膜糖以被蛋白載體通過化學鍵彼此間在結構上建立鏈接的形式存在于疫苗中，所述b型流感嗜血桿菌莢膜糖以被蛋白載體結合的形式存在于疫苗中。肺炎球菌莢膜糖、腦膜炎球菌莢膜糖、b型流感嗜血桿菌莢膜糖相互間沒有結構上的鏈接。 本發(fā)明又一方面提供一種制備含有2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體的多價細菌莢膜糖結合疫苗的方法，所述方法包括以下步驟 (a)從不同血清型(群)細菌培養(yǎng)物中分別提取、純化莢膜糖，制成單一血清型(群)莢膜糖，即單價血清型(群)莢膜糖； (b)將步驟(a)所得的單價血清型(群)莢膜糖按兩個或兩個以上血清型(群)的莢膜糖依據比例合并，成為2價或多價血清型(群)莢膜糖； (c)將步驟(b)的2價或多價血清型(群)莢膜糖與蛋白載體進行化學鍵結合并純化，制成2價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體抗原或多價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體抗原； (d)將步驟(c)的2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體抗原和/或多價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體抗原配制成疫苗。 在本發(fā)明術語中，莢膜糖包括莢膜多糖和莢膜寡糖；所述莢膜寡糖是莢膜多糖經水解法(包括酸、堿、酶水解)、氧化法和消除法(包括堿或裂解酶介導的P消除法)等化學方法降解后的莢膜寡糖；進一步，所述莢膜寡糖還包括莢膜多糖經超聲波降解法和機械剪切等物理方法降解后的莢膜寡糖。 在本發(fā)明術語中，單價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體是指一個單一血清型
(群)莢膜糖與蛋白載體經化學鍵結合形成的結合物，該莢膜糖與其它型(群)莢膜糖沒有結構上的鏈接。2價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體是指2個不同血清型(群)莢膜糖與蛋白載體經化學鍵結合形成結合物，此2個型(群)莢膜糖經與蛋白載體生成化學鍵彼此間建立結構上的鏈接。換言之，蛋白載體經化學鍵將2個不同型(群)莢膜糖鏈接在一起。多價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體是指3個或3個以上的不同血清型(群)莢膜糖與蛋白載體經化學鍵結合形成結合物，此3個或3個以上的型(群)莢膜糖經與蛋白載體生成化學鍵相互間建立結構上的鏈接。換言之，蛋白載體經化學鍵將3個或3個以上的不同型(群)莢膜糖鏈接在一起。 本發(fā)明提供來源于肺炎球菌多個血清型并被蛋白載體鏈接的莢膜糖抗原所組成 的肺炎球菌結合疫苗。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，制備莢膜糖的肺炎球菌血清型選自于 肺炎球菌全部血清型菌株，優(yōu)選45個型菌株，更優(yōu)選1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、 11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型菌株，最優(yōu)選1、2、3、4、5、6A、6B、 7F、9V、 14、 18C、 19A、 19F、23F型菌株。進一步，制備莢膜糖的肺炎球菌血清型菌株是依據流 行病學流行優(yōu)勢血清型菌株而確定的。 本發(fā)明提供來源于肺炎球菌多個血清型并被蛋白載體鏈接的莢膜糖抗原所組成 的肺炎球菌結合疫苗。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，來源于多個血清型菌株的莢膜糖抗原 任選地以2價血清型莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型莢膜糖_蛋白結合體形式存在 于疫苗中。優(yōu)選45價血清型莢膜糖_蛋白結合體；更優(yōu)選24價血清型莢膜糖_蛋白結合 體；最優(yōu)選14價血清型莢膜糖_蛋白結合體；進一步，優(yōu)選12價血清型莢膜糖_蛋白結合 體；優(yōu)選11價血清型莢膜糖_蛋白結合體；優(yōu)選10價血清型莢膜糖_蛋白結合體；優(yōu)選9 價血清型莢膜糖-蛋白結合體；優(yōu)選8價血清型莢膜糖-蛋白結合體；優(yōu)選7價血清型莢膜 糖_蛋白結合體；優(yōu)選6價血清型莢膜糖_蛋白結合體；優(yōu)選5價血清型莢膜糖_蛋白結 合體；優(yōu)選4價血清型莢膜糖_蛋白結合體；優(yōu)選3價血清型莢膜糖_蛋白結合體；優(yōu)選2 價血清型莢膜糖-蛋白結合體。換言之，例如，來源于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、 11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型菌株的莢膜糖優(yōu)選地以24價血清 型莢膜糖_蛋白結合體形式存在；更優(yōu)選以12價血清型莢膜糖_蛋白結合體形式存在；最 優(yōu)選以8價血清型莢膜糖_蛋白結合體形式存在；進一步，優(yōu)選以6價血清型莢膜糖_蛋 白結合體形式存在；優(yōu)選以4價血清型莢膜糖_蛋白結合體形式存在；優(yōu)選以3價血清型 莢膜糖_蛋白結合體形式存在；優(yōu)選以2價血清型莢膜糖_蛋白結合體形式存在。所述來 源于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、 33F型菌株的莢膜糖是以任選方式劃分為24價(l組)；12價(2組)；8價(3組)；6價(4 組)；4價(6組)；3價(8組)；2價(12組)。每組莢膜糖與蛋白載體結合后再混合組成本 發(fā)明疫苗。因此，24價血清型莢膜糖_蛋白結合體疫苗是由1個24價血清型莢膜糖_蛋 白結合體所組成；12價血清型莢膜糖-蛋白結合體疫苗是由2個不同的12價血清型莢膜 糖_蛋白結合體所組成；8價血清型莢膜糖_蛋白結合體疫苗是由3個不同的8價血清型莢 膜糖_蛋白結合體所組成；6價血清型莢膜糖_蛋白結合體疫苗是由4個不同的6價血清 型莢膜糖_蛋白結合體所組成；4價血清型莢膜糖_蛋白結合體疫苗是由6個不同的4價 血清型莢膜糖_蛋白結合體所組成；3價血清型莢膜糖_蛋白結合體疫苗是由8個不同的3 價血清型莢膜糖_蛋白結合體所組成；2價血清型莢膜糖_蛋白結合體疫苗是由12個不同 的2價血清型莢膜糖_蛋白結合體所組成。 本發(fā)明提供來源于肺炎球菌多個血清型并被蛋白載體鏈接的莢膜糖抗原所組成 的肺炎球菌結合疫苗。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，來源于多個血清型菌株的莢膜糖抗原 任選地以2價血清型莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型莢膜糖_蛋白結合體形式并以 組合方式存在于疫苗中。在本發(fā)明疫苗中，抗原優(yōu)選2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體 進行組合；更優(yōu)選2 24價血清型莢膜糖_蛋白結合體進行組合；最優(yōu)選2 14價血清型 莢膜糖_蛋白結合體進行組合；進一步，優(yōu)選2 12價血清型莢膜糖_蛋白結合體進行組合；優(yōu)選2 11價血清型莢膜糖_蛋白結合體進行組合；優(yōu)選2 10價血清型莢膜糖_蛋 白結合體進行組合；優(yōu)選2 9價血清型莢膜糖_蛋白結合體進行組合；優(yōu)選2 8價血清 型莢膜糖_蛋白結合體進行組合；優(yōu)選2 7價血清型莢膜糖_蛋白結合體進行組合；優(yōu) 選2 6價血清型莢膜糖_蛋白結合體進行組合；優(yōu)選2 5價血清型莢膜糖_蛋白結合 體進行組合；優(yōu)選2 4價血清型莢膜糖_蛋白結合體進行組合；優(yōu)選2 3價血清型莢膜 糖-蛋白結合體進行組合。換言之，例如，來源于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、 12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型菌株的莢膜糖優(yōu)選地以2 24價血清 型莢膜糖_蛋白結合體的組合形式存在；更優(yōu)選以2 14價血清型莢膜糖_蛋白結合體的 組合形式存在；最優(yōu)選以2 12價血清型莢膜糖_蛋白結合體的組合形式存在；進一步， 優(yōu)選以2 11價血清型莢膜糖_蛋白結合體的組合形式存在；優(yōu)選以2 10價血清型莢 膜糖_蛋白結合體的組合形式存在；優(yōu)選以2 9價血清型莢膜糖_蛋白結合體的組合形 式存在；優(yōu)選以2 8價血清型莢膜糖_蛋白結合體的組合形式存在；優(yōu)選以2 7價血 清型莢膜糖_蛋白結合體的組合形式存在；優(yōu)選以2 6價血清型莢膜糖_蛋白結合體的 組合形式存在；優(yōu)選以2 5價血清型莢膜糖_蛋白結合體的組合形式存在；優(yōu)選以2 4 價血清型莢膜糖_蛋白結合體的組合形式存在；優(yōu)選以2 3價血清型莢膜糖_蛋白結合 體的組合形式存在。2價血清型莢膜糖_蛋白結合體和多價血清型莢膜糖_蛋白結合體混 合后組成本發(fā)明疫苗。因此，本發(fā)明疫苗可同時包含2價血清型莢膜糖_蛋白結合體和多 價血清型莢膜糖_蛋白結合體。 本發(fā)明提供由2價血清型肺炎球菌莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型肺炎球 菌莢膜糖-蛋白結合體的組成的肺炎球菌結合疫苗，在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，預先將 肺炎球菌莢膜糖劃分為2個和/或多個組，每個組包含2個血清型莢膜糖或多個血清型莢 膜糖。每個組所含的血清型莢膜糖經合并后再與蛋白載體進行化學鍵結合，形成2價血清 型莢膜糖_蛋白結合體或多價血清型莢膜糖_蛋白結合體，進而配制成疫苗成品。因此，將 血清型莢膜糖劃分成組的數量并且確定每組包含2個血清型莢膜糖或多個血清型莢膜糖 是依據莢膜糖分子量大小、總氮、磷、糖醛酸、己糖胺、甲基戊糖、0-乙?；縿澐?。進一 步，隨機地任選血清型莢膜糖進行組合。 本發(fā)明提供來源于肺炎球菌多個血清型并被蛋白載體鏈接的莢膜糖抗原所組成 的肺炎球菌結合疫苗，莢膜糖抗原任選地以2價血清型莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血 清型莢膜糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中。其中，所述的2價血清型莢膜糖_蛋白結合 體的制備是預先將2個來源于不同血清型莢膜糖合并，然后再與蛋白載體進行化學結合， 形成2價血清型莢膜糖_蛋白結合體。2個血清型莢膜糖均與載體蛋白產生化學鍵鏈接， 載體蛋白又依據化學鍵將2個莢膜糖在結構上形成鏈接。所述的多價血清型莢膜糖_蛋白 結合體的制備是預先將多個來源于不同血清型莢膜糖合并，然后再與蛋白載體進行化學結 合，形成多價血清型莢膜糖-蛋白結合體。多個血清型莢膜糖均與載體蛋白產生化學鍵鏈 接，載體蛋白又依據化學鍵將多個莢膜糖在結構上形成鏈接。因此，來源于不同血清型莢膜 糖預先合并的相互間比例是確定本發(fā)明結合疫苗成品中各型抗原含量的主要條件之一，莢 膜糖合并比例根據莢膜糖種類(多糖或寡糖)、莢膜糖結構特征、莢膜糖_蛋白結合體價數、 結合方法及工藝條件等因素而變化。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，莢膜糖相互間合并重量 比優(yōu)選為l : 0.05 20(w/w)(本發(fā)明所述w/w系指重量比，例如iig/iig)的比例合并，更
14優(yōu)選的合并重量比為i : o. i 10(w/V)，最優(yōu)選的合并重量比為i : o. 2 5(w/w)。莢 膜糖合并有多種其它的重量比，在此所述重量比僅僅是用于說明本發(fā)明。所以，可以采用各
種等同的莢膜糖合并重量比實現本發(fā)明所述的2價血清型莢膜糖-蛋白結合體或多價血清
型莢膜糖-蛋白結合體。 本發(fā)明提供來源于肺炎球菌多個血清型并被蛋白載體鏈接的莢膜糖抗原所組成 的肺炎球菌結合疫苗。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述蛋白載體選自破傷風類毒素(TT)、 白喉類毒素(DT)、白喉毒素無毒變異體(CRM197) 、 B群腦膜炎球菌外膜蛋白(OMP)、肺炎球 菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)、肺炎球菌溶血素(Ply)、流感嗜血桿菌 D蛋白(PD)、百日咳毒素(PT)、霍亂毒素(CT)、結核菌素純蛋白衍生物(PPD)、銅綠假單胞菌 外毒素A(PEA)、匙孔血藍蛋白(KLH)。更優(yōu)選TT、DT、CRM197和0MP。最優(yōu)選DT和CRM197。 總之，選用上述蛋白作為最常見的載體和細菌類莢膜糖結合制備結合疫苗是本領域技術人 員公知的方案，例如選用這些蛋白載體制備b型流感嗜血桿菌結合疫苗、制備肺炎球菌結 合疫苗、制備腦膜炎球菌結合疫苗(Lee， Chi-Jen等人Infect Medl9(3) : 127-133， 2002)。 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，結合肺炎球菌多糖的蛋白載體最優(yōu)選為DT。如果滿足需要，也 可采用其它蛋白載體，此處給出的蛋白載體僅僅是為了例示性說明本發(fā)明。
本發(fā)明的肺炎球菌結合疫苗的又一方案，將來源于肺炎球菌的蛋白PspA、 PsaA、
Ply等合并成為肺炎球菌蛋白復合物，再將此蛋白復合物作為蛋白載體與莢膜糖進行結合。
一方面，肺炎球菌蛋白復合物發(fā)揮蛋白載體的功效，將莢膜糖由T細胞非依賴型抗原轉變 成T細胞依賴型抗原，產生免疫記憶反應。另一方面，肺炎球菌蛋白復合物又作為蛋白抗原 參與免疫應答反應，并且擴大了結合疫苗交叉免疫保護范圍，增強疫苗的免疫效力。
在本發(fā)明中，肺炎球菌莢膜糖的制備和質量控制的方法及標準是本領域技術人員 所公知的。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，技術人員可依據世界衛(wèi)生組織正式頒布的肺炎球 菌結合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005)和中華人民共 和國藥典三部(2005年版)等技術文件制備莢膜糖并進行質量檢定。 在本發(fā)明中，單價莢膜糖和蛋白載體結合的方法以及對單價莢膜糖-蛋白結合 體進行質量控制的方法及標準是本領域技術人員所公知的(Pawlowski et al. Vaccine 2000 ;18 :1873-1885 ;Wessels et al. J. Clin. Invest. 1990 ;86 :1428-1433 ;WHOTechnical Report Series.No. 897. 2000 ;WHO Technical Report Series. No. 924. 2004 ;WHO Technical R印ort Series. No. 927. 2005 ;羅賓遜等，疫苗關鍵技術詳解。化學工業(yè)出版社， 2006年，165-178頁；張延齡等，疫苗學?？茖W出版社，2004年，506_517、652-653、679_681、 699-700、896-902、918-925、943-945、961-964、968-978頁；)。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案 中，2價或多價莢膜糖和蛋白載體結合方法可選用任何已知的單價莢膜糖和蛋白載體結合 的方法進行制備，優(yōu)選自還原胺法、酰胺縮合法、硫醚縮合法、二硫化反應法、硫代氨甲酰反 應法、0-烷基異脲化反應法、重氮結合反應法，更優(yōu)選還原胺法和酰胺縮合法，最優(yōu)選2種 法或多種方法的聯(lián)合應用。技術人員可參照世界衛(wèi)生組織正式頒布的肺炎球菌結合疫苗制 造及檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005)制備2價或多價莢膜糖-蛋 白結合體并進行質量檢定。在本發(fā)明優(yōu)選的一個實施方案中，先用溴化氰(CNBr)或氰化劑 (1-氰基_4- 二甲基氨基-吡啶四氟硼酸，CDAP)對2價莢膜糖或多價莢膜糖進行活化處 理，再以己二酰肼(ADH)為雙功能親核間隔基加入已活化的莢膜糖中，形成莢膜糖-ADH衍生物，再經過碳二亞胺(EDAC)介導的縮合作用與蛋白載體共價結合，形成2價莢膜糖-蛋 白結合體或多價莢膜糖_蛋白結合體，再經純化獲得用于配制肺炎球菌結合疫苗的抗原組 分。莢膜糖與蛋白的結合有多種已知的方法，在此所述的結合方法僅僅是用于說明本發(fā)明。 所以，可以采用各種等同的方法實現本發(fā)明所述的結合，因此任何用于莢膜糖與蛋白載體 結合的方法和工藝或者過程都有可能用于實施本發(fā)明。 本發(fā)明提供制備含有2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型 (群)莢膜糖-蛋白結合體的細菌莢膜糖結合疫苗的方法。其中，所述細菌包括但不限于肺 炎球菌、腦膜炎球菌、b型流感嗜血桿菌、傷寒沙門氏菌、葡萄球菌、B群鏈球菌等具有莢膜 糖的細菌。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，細菌優(yōu)選肺炎球菌、腦膜炎球菌、b型流感嗜血桿 菌。在本發(fā)明中，制備莢膜糖的細菌菌種購自中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學細菌保藏管理 中心(CMCC)或美國標準生物收藏中心(ATCC)。 本發(fā)明提供制備含有2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型 (群)莢膜糖-蛋白結合體的細菌莢膜糖結合疫苗的方法。在本發(fā)明優(yōu)選的一個實施方案 中，兩個或兩個以上血清型(群)莢膜糖依據重量比合并后，對其進行勻化處理，益于不同 血清型(群)莢膜糖與蛋白載體的結合較為均衡。優(yōu)選的勻化處理方法是超聲處理；優(yōu)選 的參數是25 75Hz 2 10分鐘。 本發(fā)明提供制備含有2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型 (群)莢膜糖-蛋白結合體的細菌莢膜糖結合疫苗的方法。在本發(fā)明優(yōu)選的一個實施方案 中，對2價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體抗原或多價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合 體抗原進行脫毒處理，益于降低多價細菌莢膜糖結合疫苗在大量增加莢膜糖抗原價數后的 副反應。脫毒劑優(yōu)選自甲醛、戊二醛、過氧化氫，更優(yōu)選戊二醛。 因此，本發(fā)明提供制備含有2價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體和/或多價血 清型(群)莢膜糖-蛋白結合體的細菌莢膜糖結合疫苗的方法。所述方法進一步包括以下 步驟 (a)從不同血清型(群)細菌培養(yǎng)物中分別提取、純化莢膜糖，制成單一血清型 (群)莢膜糖，即單價血清型(群)莢膜糖。其中，所述細菌包括但不限于肺炎球菌、腦膜炎 球菌、b型流感嗜血桿菌、傷寒沙門氏菌、葡萄球菌、B群鏈球菌等具有莢膜糖的細菌；
(b)將步驟(a)所得的單價血清型(群)莢膜糖按兩個或兩個以上血清型(群) 的莢膜糖依據比例合并，成為2價或多價血清型(群)莢膜糖。其中，所述莢膜糖合并后進 一步經勻化處理； (c)將步驟(b)的2價或多價血清型(群)莢膜糖與蛋白載體進行化學結合，制 成2價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體抗原或多價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體抗 原； (d)將步驟(c)的產物脫毒處理并純化制成2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合 體抗原或多價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體抗原； (e)將步驟(d)的2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體抗原和/或多價血清型 (群)莢膜糖_蛋白結合體抗原配制成疫苗。 在本發(fā)明提供的肺炎球菌結合疫苗和細菌莢膜糖結合疫苗中，疫苗劑量按照藥學 領域一般技術人員所公知的技術標準來確定。例如，在確定劑量時應考慮到抗原特性、佐劑
16性質、接種者的年齡、疫苗接種途徑等諸因素。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，成品疫苗優(yōu)選 的每一血清型(群)莢膜糖劑量為0. 1 50 g，更優(yōu)選的每一血清型(群)莢膜糖劑量為 1 25 i！ g，最優(yōu)選的每一血清型(群)莢膜糖劑量為2 10 i！ g。 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，肺炎球菌結合疫苗和細菌莢膜糖結合疫苗還可包含 本領域常用的佐劑。優(yōu)選的佐劑有鋁佐劑、磷酸鈣佐劑、霍亂毒素B亞單位(CTB)、皁角素 Q21、類脂體、單磷酸類脂A(MPL)、 MF59、大腸桿菌不耐熱毒素(LT)，更優(yōu)選的佐劑是鋁佐 劑，如氫氧化鋁、磷酸鋁或硫酸鋁。 在本發(fā)明提供的肺炎球菌結合疫苗和細菌莢膜糖結合疫苗中，疫苗的劑型和配伍 按照藥學領域一般技術人員所公知的技術標準來確定。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，疫苗 劑型優(yōu)選是液體劑型、凍干劑型、丸劑、片劑、膠囊劑型，更優(yōu)選是液體劑型或凍干劑型，最 優(yōu)選是液體劑型。 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，肺炎球菌結合疫苗和細菌莢膜糖結合疫苗可以是無 防腐劑疫苗。在本發(fā)明優(yōu)選的另一實施方案中，聯(lián)合疫苗包含防腐劑，優(yōu)選的防腐劑是硫柳 汞、2_苯氧乙醇、苯甲醇。 本發(fā)明提供的肺炎球菌結合疫苗和細菌莢膜糖結合疫苗，接種途徑包括皮內注 射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射，還包括經鼻腔、口腔、肛門、陰道、黏膜途徑給藥。
本發(fā)明的肺炎球菌結合疫苗及細菌莢膜糖結合疫苗制備方法與現有肺炎球菌結 合疫苗及其制備方法相比較，包括與當前已上市的肺炎球菌結合疫苗例如PCV7和即將上 市的PCV13及其制備方法的比較，進一步與已公開的專利文本所述的肺炎球菌結合疫苗及 制備方法例如中國專利200680017776. 8、00807773. 8、92100700. 0、00807759. 2、02827993. X、01815748. 3、200680052954. 0、200680053139. 6、200610054832. 7的比較，更進一步與中 國專利03141407. 9的比較，其區(qū)別及有益效果在于 (1)本發(fā)明疫苗所含抗原結構不同?，F有肺炎球菌結合疫苗在技術上均是將來源 于每一個血清型的莢膜糖獨立與蛋白載體經化學結合后，形成單價的血清型莢膜糖-蛋白 結合體，再將各個單價血清型莢膜糖-蛋白結合體混合，進而配制成為含多血清型莢膜糖 的肺炎球菌結合疫苗。因此，現有肺炎球菌結合疫苗中所含各個血清型莢膜糖抗原以單價 莢膜糖-蛋白結合體獨立存在，各個血清型莢膜糖彼此并無結構上的鏈接。本發(fā)明疫苗是 將不同血清型的莢膜糖按兩個或兩個以上的血清型莢膜糖預先合并后再與蛋白載體經化 學鍵結合后，形成2價血清型莢膜糖_蛋白結合體或多價血清型莢膜糖_蛋白結合體，再將 各個2價血清型莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型莢膜糖_蛋白結合體混合，進而配 制成為含多血清型莢膜糖的肺炎球菌結合疫苗。因此，本發(fā)明疫苗中所含各個血清型莢膜 糖抗原以2價血清型莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型莢膜糖_蛋白結合體存在，并 且，2價血清型莢膜糖_蛋白結合體和多價血清型莢膜糖_蛋白結合體中各個血清型莢膜糖 彼此有結構上的鏈接。 (2)本發(fā)明疫苗所含抗原分子量更大。本發(fā)明疫苗所含的2價血清型莢膜糖_蛋 白結合體和/或多價血清型莢膜糖_蛋白結合體，由于依據與蛋白載體的化學鍵結合2價 或多價莢膜糖在結構上相互間形成鏈接，莢膜糖抗原分子量間接被增大。因此，本發(fā)明疫苗 較單價血清型莢膜糖-蛋白結合體有更好的免疫原性。 (3)本發(fā)明疫苗減少蛋白載體免疫競爭。本發(fā)明疫苗所含抗原是2價血清型莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型莢膜糖_蛋白結合體，不同血清型莢膜糖依據與蛋白載 體的化學鍵結合在結構上相互間形成鏈接。因此，較單價血清型莢膜糖-蛋白結合體而言， 本發(fā)明疫苗所含的2價血清型莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型莢膜糖_蛋白結合體 抗原中的蛋白載體總量減少，導致與莢膜糖應答的B細胞較與蛋白載體應答的B細胞占優(yōu) 勢，并競爭更多Th細胞參與到B細胞應答莢膜糖的過程中，從而減少蛋白載體誘導的表位 抑制效應。 (4)本發(fā)明疫苗所含抗原更穩(wěn)定。本發(fā)明疫苗所含的2價血清型莢膜糖_蛋白結 合體和/或多價血清型莢膜糖_蛋白結合體，由于依據與蛋白載體的化學鍵結合2價血清 型莢膜糖或多價血清型莢膜糖在結構上相互間形成鏈接，因此，本發(fā)明疫苗所含莢膜糖抗 原較現有技術的單價莢膜糖更具穩(wěn)定性。 (5)本發(fā)明提供了一種制備含有2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體和/或多 價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體的細菌莢膜糖結合疫苗的方法，所述方法包括以下步 驟 (a)從不同血清型(群)細菌培養(yǎng)物中分別提取、純化莢膜糖，制成單一血清型 (群)莢膜糖，即單價血清型(群)莢膜糖； (b)將步驟(a)所得的單價血清型(群)莢膜糖按兩個或兩個以上血清型(群) 的莢膜糖依據比例合并，成為2價或多價血清型(群)莢膜糖； (c)將步驟(b)的2價或多價血清型(群)莢膜糖與蛋白載體進行化學鍵結合并 純化，制成2價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體抗原或多價血清型(群)莢膜糖-蛋白 結合體抗原； (d)將步驟(c)的2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體抗原和/或多價血清型 (群)莢膜糖_蛋白結合體抗原配制成疫苗。 (6)本發(fā)明進一步提供一種制備含有2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體和/ 或多價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體的細菌莢膜糖結合疫苗的方法，所述方法包括以 下步驟 (a)從不同血清型(群)細菌培養(yǎng)物中分別提取、純化莢膜糖，制成單一血清型 (群)莢膜糖，即單價血清型(群)莢膜糖。其中，所述細菌包括但不限于肺炎球菌、腦膜炎 球菌、b型流感嗜血桿菌、傷寒沙門氏菌、葡萄球菌、B群鏈球菌等具有莢膜糖的細菌；
(b)將步驟(a)所得的單價血清型(群)莢膜糖按兩個或兩個以上血清型(群) 的莢膜糖依據比例合并，成為2價或多價血清型(群)莢膜糖。其中，所述莢膜糖合并后進 一步經勻化處理； (c)將步驟(b)的2價或多價血清型(群)莢膜糖與蛋白載體進行化學鍵結合，制 成2價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體抗原或多價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體抗 原； (d)將步驟(c)的產物脫毒處理并純化制成2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合 體抗原或多價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體抗原； (e)將步驟(d)的2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體抗原和/或多價血清型 (群)莢膜糖_蛋白結合體抗原配制成疫苗。 本發(fā)明通過如下實施例，但非限制，舉例進一步描述本發(fā)明的核心內容，所述實施例闡述本發(fā)明的概念和幾個優(yōu)選的實施方案。本發(fā)明的其它實施例在不背離本發(fā)明的核心 的前提下為本領域技術人員所預見。
具體實施例方式
本發(fā)明可通過如下實施例進一步了解，所述實施例選擇了幾個優(yōu)選實施方案，僅 為了更好展示本發(fā)明，而非對發(fā)明內容進行限制。
實施例 實施例1肺炎球菌發(fā)酵培養(yǎng)及莢膜多糖的制備 將低溫保藏的肺炎球菌凍干菌種啟開，用生理氯化鈉溶液復溶后，接種至5 10%羊血瓊脂斜面培養(yǎng)基，置5 8% C02環(huán)境中，于35 37t:培養(yǎng)16 24小時。轉種至 肺炎球菌液體基礎培養(yǎng)基，于35 37t:培養(yǎng)10 18小時。繼續(xù)轉種至肺炎球菌液體基礎 培養(yǎng)基進行增菌培養(yǎng)，于35 37t:培養(yǎng)10 18小時。按5 10%接種量將增菌后的肺炎 球菌液體培養(yǎng)物接種至已加入液體基礎培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內，攪拌、通氣培養(yǎng)，于35 37°C 培養(yǎng)8 12小時，pH控制在6. 0 7. 4之間。發(fā)酵培養(yǎng)期間監(jiān)測細菌濃度變化，鏡檢培養(yǎng) 物純度及菌體形態(tài)特征。發(fā)酵培養(yǎng)結束時，按發(fā)酵罐內培養(yǎng)基的量加入終濃度為0.05 0. 20%去氧膽酸鈉裂解菌體細胞，攪拌20 60分鐘，終止發(fā)酵培養(yǎng)。 用連續(xù)流離心機離心去除菌體細胞碎片，收集上清液。對上清液進行超濾濃縮，超 濾膜規(guī)格選用50 IOOKD，濃縮倍數至原體積的1/5 1/20。置超濾后的濃縮液于生理氯 化鈉溶液中進行透析。向透析后的濃縮液加入乙酸鈉至終濃度3 10%，攪拌至充分溶解， pH調至4. 8 6. 4。繼續(xù)于2 8t:環(huán)境中緩慢加入預先冷卻的乙醇至終濃度15 60%， 攪拌15 45分鐘，經12， 000 16， 000g、2 8"超速離心，收集上清液。于上清液中繼續(xù) 加入乙酸鈉至終濃度5 15X，攪拌至充分溶解，pH維持4. 8 6. 4。繼續(xù)于2 8"環(huán)境 中緩慢加入預先冷卻的乙醇至終濃度30 80%，攪拌15 45分鐘，經2， 200 2， 800g、 2 『C離心，收集粗多糖沉淀物。抽真空，_201:儲存，待進一步純化。
將粗多糖加入0. 3 0. 6M的乙酸鈉溶液中，pH調至6. 5 7. 2，于2 8T環(huán)境 中攪拌至完全溶解。再加入冷酚至終濃度65 75%進行抽提，經14， 000 18， 000超速離 心，收集上清液。重復冷酚抽提步驟2 4次。收集的上清液于2 『C經透析，除去殘留 酚，透析液為注射用水。于2 『C環(huán)境中緩慢加入預先冷卻的乙醇至終濃度40 90%， 攪拌15 45分鐘，經2， 200 2， 800g、2 8t:離心，收集多糖沉淀物。多糖沉淀物經無水 乙醇和丙酮浸泡、洗滌各2 4次，干燥后用注射用水溶解，再經0. 22 ii m除菌過濾得到純 化多糖，以液體或凍干形式儲存于-2(TC以下。按世界衛(wèi)生組織正式頒布的肺炎球菌結合疫 苗制造及檢定規(guī)程(WHO TechnicalR印ort Series, No. 927,2005)規(guī)定方法和標準對純化 多糖進行檢定。 按照上述方法分別制備肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、 12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜多糖。
實施例2肺炎球菌莢膜寡糖的制備 將純化多糖溶解于0. 2 1. 0M乙酸溶液中至終濃度1 4mg/ml，浸入70 IO(TC 油浴或水浴中水解6 40小時。水解后將pH調至7. 0，于2 8"透析。再經S印harose 4FF層析柱純化，用15mM NaCl液洗脫，收集寡糖。通過0. 22 y m除菌過濾得到純化寡糖，以液體或凍干形式儲存于-20°C以下。按世界衛(wèi)生組織正式頒布的肺炎球菌結合疫苗制造及 檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005)規(guī)定方法和標準對純化寡糖進行 檢定。 按照上述方法分別制備肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、
12F、 14、 15B、 17F、 18C、 19A、 19F、20、22F、23F、33F純化莢膜寡糖。 實施例3腦膜炎球菌莢膜糖和b型流感嗜血桿菌莢膜糖的制備 按照中國專利200710007045. 1方法制備A群、C群、W135群、Y群腦膜炎球菌莢膜
多糖和b型流感嗜血桿菌莢膜多糖。 再按照本發(fā)明實施例2方法制備A群、C群、W135群、Y群腦膜炎球菌莢膜多糖和 b型流感嗜血桿菌莢膜寡糖。 按世界衛(wèi)生組織正式頒布的腦膜炎球菌多糖疫苗制造及檢定規(guī)程(WHOTechnical R印ort Series, No. 658， 1980)和b型流感嗜血桿菌結合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 897， 2000)規(guī)定方法和標準對純化多糖和寡糖進行檢定。
實施例4蛋白載體_白喉類毒素(DT)的制備 將低溫保存的白喉桿菌凍干菌種啟開，用生理氯化鈉溶液復蘇，接種至血瓊脂斜 面培養(yǎng)基，于33 36t:培養(yǎng)16 20小時。轉種至改良林氏肉湯培養(yǎng)基，于33 36。C培 養(yǎng)16 20小時。再轉種至改良林氏肉湯培養(yǎng)基，于33 36t:培養(yǎng)16 20小時。繼續(xù)轉 種至含改良林氏肉湯培養(yǎng)基的菌種瓶內進行增菌培養(yǎng)，于33 36t:培養(yǎng)36 72小時。將 菌種瓶內培養(yǎng)物轉種至含改良林氏肉湯培養(yǎng)基的發(fā)酵罐內，在通氣、攪拌、PH7. 0 8. 5條 件下，于33 36t:培養(yǎng)40 56小時。發(fā)酵完畢，加入終濃度O. 1 0. 5%的甲醛滅菌處 理，經離心收集上清液。上清液經0. 22 ii m濾器除菌過濾，再經30 50KD膜超濾濃縮。分 別加入NaHC03至終濃度0. 45 0. 55%、活性碳至終濃度0. 72 0. 78 % 、 (NH4) 2S04至終濃 度28.0 30.0%，攪拌30分鐘，置室溫靜置12 18小時。離心收集上清液。于收集的上 清液中加入(NH4)2S04至終濃度42. 0 45. 0%，攪拌30分鐘，置室溫靜置4 8小時。離 心收集沉淀并溶于0. 1 % NaHC03溶液中。于2 8°C 、透析60 72小時后，再經0. 22 y m 濾器除菌過濾。除菌過濾后的液體加入賴氨酸至終濃度1. 0 2. 0%，再加入甲醛至終濃度 0. 4 0. 6%， pH調至6. 8 7. 0，置37 40。C脫毒42 48天。脫毒后的DT原液按《中 華人民共和國藥典》(2005年版)規(guī)定項目和方法檢定，檢定合格后原液置2 8t:保存?zhèn)?用。 實施例5莢膜糖-蛋白結合疫苗的制備 (1)肺炎球菌24價多糖結合疫苗的制備(24價多糖-蛋白結合體)
將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜多糖用注射用水稀釋并按各型多糖1 : 1 5 (w/ w)重量比合并，合并后的多糖濃度為2.0 10. Omg/型多糖/ml。超聲勻化處理25 75Hz 2 10分鐘。加入溴化氰活化多糖至終濃度1. 0 4. Omg/mg總多糖，用NaOH調節(jié)pH并維持 pH9. 5 11. 5，于20 26。C攪拌30 60分鐘。再加入己二酰肼至終濃度12. 0 18. Omg/ ml，調節(jié)并維持pH8. 0 10. O，保持15 30分鐘。于20 26。C攪拌30 60分鐘，再置 在2 『C攪拌18 24小時，形成多糖_己二酰肼衍生物。將多糖_己二酰肼衍生物于 2 8。C透析72 96小時，再經0. 45 ii m濾器除菌過濾。將DT稀釋至1. 0 4. Omg/ml，按
20多糖_己二酰肼衍生物DT為1 : 0. 5 2比例(v/v)將DT加入多糖-己二酰肼衍生物 中，調節(jié)并維持pH5. 0 6. 0。加入碳二亞胺至終濃度20 30mg/ml，調節(jié)并維持pH5. 0 6. O，維持60 90分鐘后，調節(jié)并維持p朋.5 7. 5。加入戊二醛至終濃度0. 05 0. 15% 脫毒處理，維持4 6小時。置2 8"透析72 120小時，經100 300KD超濾膜超濾濃 縮。用S印harose 4FF層析柱純化多糖_DT結合物，收集多糖_DT結合物，再經0. 22 y m濾 器除菌過濾，獲得24價肺炎球菌多糖-DT結合體原液。用注射用水稀釋24價肺炎球菌多 糖-DT結合體原液、磷酸鋁、氯化鈉、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量分別為結合DT 的各血清型多糖2 lOii g/ml、磷酸鋁1. 0 1. 5mg/ml、氯化鈉7. 5 9. 5mg/ml、2_苯氧 乙醇5. 0 6. Omg/ml，pH調至5. 8 7. 2。按吸出量X). 5ml分裝西林瓶并封口 。按世界 衛(wèi)生組織正式頒布的肺炎球菌結合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 927,2005)規(guī)定方法和標準進行檢定，檢定合格后為肺炎球菌多糖結合疫苗。
(2)肺炎球菌24價寡糖結合疫苗的制備(24價寡糖-蛋白結合體)
將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜寡糖用注射用水稀釋并按各型寡糖1 : 1 5 (w/ w)重量比合并，合并后的寡糖濃度為2. 0 10. Omg/型寡糖/ml。加入溴化氰活化寡糖至 終濃度1. 0 4. Omg/mg總寡糖，用NaOH調節(jié)pH并維持pH9. 5 11. 5，于20 26。C攪拌 30 60分鐘。再加入己二酰肼至終濃度12. 0 18. Omg/ml，調節(jié)并維持pH8. 0 10. 0， 保持15 30分鐘。于20 26。C攪拌30 60分鐘，再置在2 8。C攪拌18 24小時， 形成寡糖_己二酰肼衍生物。將寡糖_己二酰肼衍生物于2 『C透析72 96小時，再 經0. 45 ii m濾器除菌過濾。將DT稀釋至1. 0 4. Omg/ml，按寡糖-己二酰肼衍生物DT 為1 : 0. 5 2比例(v/v)將DT加入寡糖-己二酰肼衍生物中，調節(jié)并維持pH5. 0 6. 0。 加入碳二亞胺至終濃度20 30mg/ml，調節(jié)并維持pH5. 0 6. 0，維持60 90分鐘后，調 節(jié)并維持P朋.5 7. 5。置2 8t:透析72 120小時，經100 300KD超濾膜超濾濃 縮。用S印harose 4FF層析柱純化寡糖-DT結合物，收集多糖-DT結合物，再經0. 22 y m濾 器除菌過濾，獲得24價肺炎球菌寡糖-DT結合體原液。用注射用水稀釋24價肺炎球菌寡 糖-DT結合體原液、磷酸鋁、氯化鈉、2-苯氧乙醇，使得成品疫苗各成分含量分別為結合DT 的各血清型寡糖2 10ii g/ml、磷酸鋁1. 0 1. 5mg/ml、氯化鈉7. 5 9. 5mg/ml、2-苯氧 乙醇5. 0 6. Omg/ml，pH調至5. 8 7. 2。按吸出量X). 5ml分裝西林瓶并封口 。按世界 衛(wèi)生組織正式頒布的肺炎球菌結合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 927,2005)規(guī)定方法和標準進行檢定，檢定合格后為肺炎球菌寡糖結合疫苗。
本實施例(1)方法與本實施例(2)方法不同之處在于，后者沒有超聲勻化處理和 戊二醛脫毒處理兩個步驟。 (3)肺炎球菌24價多糖結合疫苗的制備(12價多糖-蛋白結合體+12價多糖-蛋 白結合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜多糖分為2組；第1組包括1、2、3、4、5、6B、7F、9V、 14、 18C、 19F、23F，第2組包括6A、8、9N、IOA、IIA、 12F、 15B、 17F、 19A、20、22F、33F。分別用注 射用水稀釋合并各組多糖，按本實施例(1)方法制備2組不同血清型多糖的12價肺炎球菌 多糖-DT結合體原液，再將此2組不同血清型多糖的12價肺炎球菌多糖-DT結合體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗成品并進行檢定。 (4)肺炎球菌24價寡糖結合疫苗的制備(12價寡糖-蛋白結合體+12價寡糖-蛋 白結合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜寡糖分為2組；第1組包括1、2、3、4、6A、6B、7F、 10A、14、18C、20、23F，第2組包括5、8、9N、9V、IIA、 12F、 15B、 17F、 19A、 19F、22F、33F。分別用 注射用水稀釋合并各組寡糖，按本實施例(1)方法制備2組不同血清型寡糖的12價肺炎球 菌寡糖-DT結合體原液，再將此2組不同血清型寡糖的12價肺炎球菌寡糖-DT結合體原液 按本實施例(1)方法配制成疫苗成品并進行檢定。 (5)肺炎球菌24價莢膜糖結合疫苗的制備(12價多糖-蛋白結合體+12價寡 糖-蛋白結合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜糖分為2組；第1組包括1、2、3、4、5、7F、IOA、IIA、 14、15B、20、23F多糖，第2組包括6A、6B、8、9N、9V、12F、17F、18C、19A、19F、22F、33F寡糖。分
別用注射用水稀釋合并各組多糖和寡糖，按本實施例(1)方法制備一組不同血清型多糖的 12價肺炎球菌多糖-DT結合體原液和另一組不同血清型寡糖的12價肺炎球菌寡糖-DT結 合體原液，再將此2組不同血清型多糖和寡糖的12價肺炎球菌多糖-DT結合體原液和12 價肺炎球菌寡糖-DT結合體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗成品并進行檢定。
(6)肺炎球菌24價多糖結合疫苗的制備(8價多糖-蛋白結合體+8價多糖-蛋白 結合體+8價多糖_蛋白結合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜多糖分為3組；第1組包括1、3、4、7F、9V、 14、 18C、 19F，第2組包括6A、8、9N、12F、15B、17F、19A、22F，第3組包括2、5、6B、IOA、 11A、20、23F、
33F。分別用注射用水稀釋合并各組多糖，按本實施例(1)方法制備3組不同血清型多糖的 8價肺炎球菌多糖-DT結合體原液，再將此3組不同血清型多糖的8價肺炎球菌多糖-DT結 合體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗成品并進行檢定。 (7)肺炎球菌24價寡糖結合疫苗的制備(8價寡糖-蛋白結合體+8價寡糖-蛋白 結合體+8價寡糖_蛋白結合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜寡糖分為3組；第1組包括1、3、4、7F、9N、9V、 18C、 20，第2組包括2、6A、6B、12F、14、15B、17F、22F，第3組包括5、8、IOA、IIA、 19A、 19F、23F、
33F。分別用注射用水稀釋合并各組寡糖，按本實施例(1)方法制備3組不同血清型寡糖的 8價肺炎球菌寡糖-DT結合體原液，再將此3組不同血清型寡糖的8價肺炎球菌寡糖-DT結 合體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗成品并進行檢定。 (8)肺炎球菌24價莢膜糖結合疫苗的制備(8價多糖-蛋白結合體+8價寡糖-蛋 白結合體+8價多糖_蛋白結合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜糖分為3組；第1組包括1、3、4、7F、IOA、IIA、 14、20 多糖，第2組包括6A、6B、9N、9V、18C、19A、19F、23F寡糖，第3組包括2、5、8、 12F、 15B、 17F、
2222F、33F多糖。分別用注射用水稀釋合并各組多糖和寡糖，按本實施例(1)方法制備2組不 同血清型多糖的8價肺炎球菌多糖-DT結合體原液和另一組不同血清型寡糖的8價肺炎球 菌寡糖-DT結合體原液，再將此3組不同血清型多糖和寡糖的8價肺炎球菌多糖-DT結合 體原液和8價肺炎球菌寡糖-DT結合體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗成品并進行檢 定。 (9)肺炎球菌24價多糖結合疫苗的制備(6價多糖-蛋白結合體+6價多糖-蛋白 結合體+6價多糖_蛋白結合體+6價多糖-蛋白結合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜多糖分為4組；第1組包括1、3、4、7F、 18C、 19F，第 2組包括6A、8、9N、 12F、 17F、 19A，第3組包括2、9V、 IIA、 14、23F、33F，第4組包括5、6B、 IOA、 15B、20、22F。分別用注射用水稀釋合并各組多糖，按本實施例(1)方法制備4組不同血清 型多糖的6價肺炎球菌多糖-DT結合體原液，再將此4組不同血清型多糖的6價肺炎球菌 多糖-DT結合體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗成品并進行檢定。
(10)肺炎球菌24價寡糖結合疫苗的制備(6價寡糖-蛋白結合體+6價寡糖-蛋 白結合體+6價寡糖_蛋白結合體+6價寡糖-蛋白結合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜寡糖分為4組；第1組包括3、4、7F、9N、 12F、 18C，第 2組包括5、6A、8、17F、19A、19F，第3組包括2、9V、 IOA、 11A、22F、23F，第4組包括1、6B、14、 15B、20、33F。分別用注射用水稀釋合并各組寡糖，按本實施例(1)方法制備4組不同血清 型多糖的6價肺炎球菌寡糖-DT結合體原液，再將此4組不同血清型寡糖的6價肺炎球菌 寡糖-DT結合體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗成品并進行檢定。
(11)肺炎球菌24價莢膜糖結合疫苗的制備(6價多糖-蛋白結合體+6價寡糖-蛋 白結合體+6價多糖_蛋白結合體+6價寡糖-蛋白結合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜糖分為4組；第1組包括1、3、4、 11A、20、33F多糖， 第2組包括6A、6B、 18C、 19A、 19F、23F寡糖，第3組包括2、5、8、 15B、 17F、22F多糖，第4組包 括7F、9N、9V、10A、12F、14寡糖。分別用注射用水稀釋合并各組多糖和寡糖，按本實施例(1) 方法制備2組不同血清型多糖的6價肺炎球菌多糖-DT結合體原液和另2組不同血清型寡 糖的6價肺炎球菌寡糖-DT結合體原液，再將此4組不同血清型多糖和寡糖的6價肺炎球 菌多糖-DT結合體原液和6價肺炎球菌寡糖-DT結合體原液按本實施例(1)方法配制成疫 苗成品并進行檢定。 (12)肺炎球菌24價多糖結合疫苗的制備(12價多糖-蛋白結合體+6價多糖-蛋 白結合體+4價多糖-蛋白結合體+2價多糖-蛋白結合體) 將月市炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F純化莢膜多糖分為4組；第1組包括1、2、3、4、6A、6B、7F、 10A、14、18C、20、23F，第2組包括IIA、 12F、 15B、 17F、22F、33F，第3組包括5、8、9N、9V，第4 組包括19A、19F。分別用注射用水稀釋合并各組多糖，按本實施例(1)方法制備4組不同血 清型多糖的12價肺炎球菌多糖-DT結合體原液、6價肺炎球菌多糖-DT結合體原液、4價肺 炎球菌多糖-DT結合體原液和2價肺炎球菌多糖-DT結合體原液，再將此4組不同血清型
23多糖的12價肺炎球菌多糖-DT結合體原液、6價肺炎球菌多糖-DT結合體原液、4價肺炎球 菌多糖-DT結合體原液和2價肺炎球菌多糖-DT結合體原液按本實施例(1)方法配制成疫 苗成品并進行檢定。 (13)肺炎球菌14價多糖結合疫苗的制備(14價多糖-蛋白結合體)將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜多糖
用注射用水稀釋合并，按本實施例(1)方法制備14價肺炎球菌多糖-DT結合體原液，再將
此14價肺炎球菌多糖-DT結合體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗成品并進行檢定。 本實施例(1)方法與本實施例(12)方法不同之處在于，后者成品疫苗配制時不添
加2-苯氧乙醇。因此本實施例(12)成品疫苗中不含任何防腐劑。 (14)肺炎球菌14價寡糖結合疫苗的制備(14價寡糖-蛋白結合體)將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜寡糖
用注射用水稀釋合并，按本實施例(1)方法制備14價肺炎球菌寡糖-DT結合體原液，再將
此14價肺炎球菌寡糖-DT結合體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗成品并進行檢定。 本實施例(1)方法與本實施例(13)方法不同之處在于，后者成品疫苗配制時不添
加2-苯氧乙醇。因此本實施例(13)成品疫苗中不含任何防腐劑。 (15)肺炎球菌14價多糖結合疫苗的制備(7價多糖-蛋白結合體+7價多糖-蛋 白結合體) 將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜多糖 分為2組；第1組包括1、2、3、4、5、9V、23F多糖，第2組包括6A、6B、7F、 14、 18C、 19A、 19F多
糖。分別用注射用水稀釋合并各組多糖，按本實施例(1)方法制備2組不同血清型多糖的7 價肺炎球菌多糖-DT結合體原液，再將此2組不同血清型多糖的7價肺炎球菌多糖-DT結 合體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗成品并進行檢定。 (16)肺炎球菌14價寡糖結合疫苗的制備(7價寡糖-蛋白結合體+7價寡糖-蛋 白結合體) 將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜寡糖 分為2組；第1組包括4、5、7F、9V、14、19A、19F寡糖，第2組包括1、2、3、6A、6B、 18C、23F寡 糖。分別用注射用水稀釋合并各組寡糖，按本實施例(1)方法制備2組不同血清型寡糖的7 價肺炎球菌寡糖-DT結合體原液，再將此2組不同血清型寡糖的7價肺炎球菌寡糖-DT結 合體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗成品并進行檢定。 (17)肺炎球菌14價莢膜糖結合疫苗的制備(7價多糖-蛋白結合體+7價寡糖-蛋 白結合體) 將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜糖分 為2組；第1組包括1、2、3、4、7F、9V、14多糖，第2組包括5、6A、6B、 18C、 19A、 19F、23F寡糖。 分別用注射用水稀釋合并各組多糖和寡糖，按本實施例(1)方法制備一組不同血清型多糖 的7價肺炎球菌多糖-DT結合體原液和另一組不同血清型寡糖的7價肺炎球菌寡糖-DT結 合體原液，再將此2組不同血清型多糖和寡糖的7價肺炎球菌多糖-DT結合體原液和7價 肺炎球菌寡糖-DT結合體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗成品并進行檢定。
(18)肺炎球菌14價多糖結合疫苗的制備(4價多糖-蛋白結合體+4價多糖-蛋 白結合體+4價多糖-蛋白結合體+2價多糖-蛋白結合體)
將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜多糖 分為4組；第1組包括1、7F、9V、18C多糖，第2組包括14、 19A、 19F、23F多糖，第3組包括2、 3、4、5多糖，第4組包括6A、6B多糖。分別用注射用水稀釋合并各組多糖，按本實施例(1) 方法制備3組不同血清型多糖的4價肺炎球菌多糖-DT結合體原液和1組不同血清型多糖 的2價肺炎球菌多糖-DT結合體原液，再將此4組不同血清型多糖的4價肺炎球菌多糖-DT 結合體原液和2價肺炎球菌多糖-DT結合體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗成品并進 行檢定。 (19)肺炎球菌14價寡糖結合疫苗的制備(4價寡糖-蛋白結合體+4價寡糖-蛋 白結合體+4價寡糖-蛋白結合體+2價寡糖-蛋白結合體) 將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜寡糖 分為4組；第1組包括1、3、5、9V寡糖，第2組包括2、7F、18C、23F寡糖，第3組包括4、6A、 6B、 14寡糖，第4組包括19A、 19F寡糖。分別用注射用水稀釋合并各組寡糖，按本實施例(1) 方法制備3組不同血清型寡糖的4價肺炎球菌寡糖-DT結合體原液和1組不同血清型寡糖 的2價肺炎球菌寡糖-DT結合體原液，再將此4組不同血清型寡糖的4價肺炎球菌寡糖-DT 結合體原液和2價肺炎球菌寡糖-DT結合體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗成品并進 行檢定。 (20)肺炎球菌14價莢膜糖結合疫苗的制備(4價多糖-蛋白結合體+4價寡糖-蛋 白結合體+4價多糖-蛋白結合體+2價寡糖-蛋白結合體) 將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜糖分 為4組；第1組包括2、5、7F、23F多糖，第2組包括4、6A、6B、18C寡糖，第3組包括1、3、9V、 14多糖，第4組包括19A、19F寡糖。分別用注射用水稀釋合并各組多糖和寡糖，按本實施例 (1)方法制備2組不同血清型多糖的4價肺炎球菌多糖-DT結合體原液、1組不同血清型寡 糖的4價肺炎球菌寡糖-DT結合體原液和1組不同血清型寡糖的2價肺炎球菌寡糖-DT結 合體原液，再將此4組不同血清型多糖的4價肺炎球菌多糖-DT結合體原液、4價肺炎球菌 寡糖-DT結合體原液和2價肺炎球菌寡糖-DT結合體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗 成品并進行檢定。 (21)肺炎球菌14價多糖結合疫苗的制備(2價多糖-蛋白結合體+2價多糖-蛋 白結合體+2價多糖-蛋白結合體+2價多糖-蛋白結合體+2價多糖-蛋白結合體+2價多 糖_蛋白結合體+2價多糖_蛋白結合體) 將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜多糖 分為7組；第1組包括1、9V多糖，第2組包括7F、 18C多糖，第3組包括14、23F多糖，第4 組包括19A、19F多糖，第5組包括2、3多糖，第6組包括4、5多糖，第7組包括6A、6B多糖。 分別用注射用水稀釋合并各組多糖，按本實施例(1)方法制備7組不同血清型多糖的2價 肺炎球菌多糖-DT結合體原液，再將此7組不同血清型多糖的2價肺炎球菌多糖-DT結合 體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗成品并進行檢定。 (22)肺炎球菌14價寡糖結合疫苗的制備(2價寡糖-蛋白結合體+2價寡糖-蛋 白結合體+2價寡糖-蛋白結合體+2價寡糖-蛋白結合體+2價寡糖-蛋白結合體+2價寡 糖_蛋白結合體+2價寡糖_蛋白結合體)將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜寡糖分為7組；第1組包括1、3寡糖，第2組包括5、9V寡糖，第3組包括2、23F寡糖，第4組包 括7F、 18C寡糖，第5組包括6A、6B寡糖，第6組包括4、 14寡糖，第7組包括19A、 19F寡糖。 分別用注射用水稀釋合并各組寡糖，按本實施例(1)方法制備7組不同血清型寡糖的2價 肺炎球菌寡糖-DT結合體原液，再將此7組不同血清型寡糖的2價肺炎球菌寡糖-DT結合 體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗成品并進行檢定。 (23)肺炎球菌14價莢膜糖結合疫苗的制備(2價多糖-蛋白結合體+2價寡糖-蛋 白結合體+2價多糖-蛋白結合體+2價寡糖-蛋白結合體2價多糖-蛋白結合體+2價寡 糖_蛋白結合體+2價多糖_蛋白結合體) 將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜糖分 為7組；第1組包括2、23F多糖，第2組包括6A、6B寡糖，第3組包括5、7F多糖，第4組包 括4、 18C寡糖，第5組包括9V、 14多糖，第6組包括19A、 19F寡糖，第7組包括1、3多糖。分 別用注射用水稀釋合并各組多糖和寡糖，按本實施例(1)方法制備4組不同血清型多糖的 2價肺炎球菌多糖-DT結合體原液和3組不同血清型寡糖的2價肺炎球菌寡糖-DT結合體 原液，再將此7組不同血清型多糖的2價肺炎球菌多糖-DT結合體原液和2價肺炎球菌寡 糖-DT結合體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗成品并進行檢定。
(24)肺炎腦膜炎聯(lián)合疫苗的制備(15價多糖蛋白結合體) 將肺炎球菌血清型1、4、5、6A、6B、9V、 14、 18C、 19A、 19F、23F純化莢膜多糖和腦膜 炎球菌A群、C群、W135群、Y群純化莢膜多糖用注射用水稀釋合并，按本實施例(1)方法制 備15價多糖-DT結合體原液，再將此15價多糖-DT結合體原液按本實施例(1)方法配制成 疫苗成品。按世界衛(wèi)生組織正式頒布的肺炎球菌結合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 927,2005)和腦膜炎球菌結合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHO BS 06.2041， 2006 ;WH0 TechnicalR印ort Series, No. 924， 2004)規(guī)定方法和標準進行檢定。
(25)肺炎腦膜炎Hib聯(lián)合疫苗的制備(17價寡糖蛋白結合體)
將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜寡 糖、腦膜炎球菌A群純化莢膜寡糖、腦膜炎球菌C群純化莢膜寡糖、b型流感嗜血桿菌純化 莢膜寡糖用注射用水稀釋合并，按本實施例(1)方法制備17價寡糖-DT結合體原液，再將 此17價寡糖-DT結合體原液按本實施例(1)方法配制成疫苗成品。按世界衛(wèi)生組織正式 頒布的肺炎球菌結合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005) 和腦膜炎球菌結合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHO BS 06. 2041,2006 ;WHO Technical R印ort Series, No. 924,2004)及b型流感嗜血桿菌結合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 897,2000)規(guī)定方法和標準進行檢定。 (26)肺炎腦膜炎Hib聯(lián)合疫苗的制備(7價寡糖-蛋白結合體+7價寡糖-蛋白結 合體+5價寡糖-蛋白結合體) 將肺炎球菌血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F純化莢膜寡 糖、腦膜炎球菌A群純化莢膜寡糖、腦膜炎球菌C群純化莢膜寡糖、腦膜炎球菌W135群純化 莢膜寡糖、腦膜炎球菌Y群純化莢膜寡糖、b型流感嗜血桿菌純化莢膜寡糖分為3組；第1 組包括4、5、7F、9V、14、19A、19F寡糖，第2組包括1、2、3、6A、6B、 18C、23F寡糖，第3組包括 腦膜炎球菌A群、C群、W135群、Y群寡糖和b型流感嗜血桿菌寡糖。分別用注射用水稀釋 合并各組寡糖，按本實施例(1)方法制備2組不同血清型寡糖的7價肺炎球菌寡糖-DT結
26合體原液和1組不同血型(群)的5價腦膜炎Hib寡糖-DT結合體原液，再將此3組不同 血清型寡糖的7價肺炎球菌寡糖-DT結合體原液和5價腦膜炎Hib寡糖-DT結合體原液按 本實施例(1)方法配制成疫苗成品。按世界衛(wèi)生組織正式頒布的肺炎球菌結合疫苗制造及 檢定規(guī)程(WHO Technical R印ort Series, No. 927， 2005)和腦膜炎球菌結合疫苗制造及檢 定規(guī)程(WHO BS 06.2041,2006 ;WHO TechnicalR印ort Series, No. 924， 2004)及b型流感 嗜血桿菌結合疫苗制造及檢定規(guī)程(WHOTechnical R印ort Series, No. 897,2000)規(guī)定方 法和標準進行檢定。 實施例6結合疫苗特異性毒性檢查 對實施例5所制備的26種疫苗取樣分別等量合并成26份樣品，每份樣品選用體 重250 350g豚鼠4只，每只腹側皮下注射樣品2. 5ml，觀察30天，記錄體重變化。結果顯 示所有樣品注射局部無壞死、無脫皮、無脫毛，無晚期麻痹癥狀，每只豚鼠體重比注射前均 有增加。說明本發(fā)明制備的26種結合疫苗所使用的白喉類毒素載體經過結合工藝處理后 沒有發(fā)生白喉毒素特異性毒性反應，也沒有出現毒性逆轉現象。
實施例7結合疫苗安全性檢查 對實施例5所制備的26種疫苗取樣，每份樣品分別選用體重18 22g小鼠5只 和體重250 350g豚鼠2只，每只小鼠腹腔注射樣品0. 5ml，每只豚鼠腹腔注射5. 0ml，觀 察7天，記錄體重變化。結果顯示觀察期內所有小鼠、豚鼠均鍵存，且無異常反應，到期時每 只小鼠、豚鼠體重比注射前均有增加。說明本發(fā)明制備的26種疫苗中沒有污染外源性毒性 物質，也沒有存在意外的不安全因子。
實施例8結合疫苗免疫原性測定 取實施例5制備的26種疫苗、肺炎球菌24個血清型多糖、腦膜炎球菌各血清群多 糖、Hib多糖和生理氯化鈉溶液腹腔免疫體重12 14g的NIH小鼠，每一樣品按照0、14、 28天程序免疫10只小鼠3針。結合疫苗組免疫劑量為所含各血清型(群)莢膜糖2 10 ii g/0. 5ml/次，多糖組免疫劑量與疫苗組所含各血清型(群)莢膜糖等量。初免后第35 天采血，分離血清。用ELISA方法測定抗體GMT值。將各血清型(群)多糖包被于96孔酶 標板，置2 『C過夜。封閉后，加入系列稀釋的待測血清樣品，37t:反應45分鐘。再加入 辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG于37t:反應45分鐘，最后加入底物四甲基聯(lián)苯胺，于暗 處顯色15分鐘，用終止液終止反應。在酶標儀上測定，計算血清抗體GMT。結果顯示疫苗 所含各血清型(群)莢膜糖較單獨多糖GMT有顯著性增長。其中，肺炎球菌各血清型多糖 GMT為23 75，肺炎球菌結合疫苗中所含各血清型莢膜糖GMT為1864 8053。表1、表2 列舉了其中幾個疫苗免疫原性GMT測定數據。 綜上所述，說明本發(fā)明制備的由2價莢膜糖_蛋白結合體和/或多價莢膜糖_蛋
白結合體組成的肺炎球菌莢膜糖結合疫苗及其與腦膜炎球菌、Hib組成的細菌聯(lián)合結合疫
苗具有良好的安全性和免疫原性。
表l.肺炎球菌結合疫苗免疫原性測定結果
疫苗 代碼
小鼠血清抗肺炎球菌各型莢膜糖抗體滴度(lgG GM'1')
4
6A 6B 7F
8
9N 9V 1 OA11A 12F 14 15B 17F 18C 19A 19F 20 22F 23F 3 3 F
(3) 3446 3046 5246 2735 4843 2054 2213 6845 2532 3786 4218 7263 3944 5446 5760 2256 5064 2484 4432 3049 6325 3354 2413 3286 (11) 2324 2430 6672 2014 5772 2588 簡 5327 3249 4012 3506 6337 4387 5962 7081 3562 3855 2916 3687 351S 5623 2996 2016 2424 (18) 4076 2683 4322 3247 4262 2857 2443 5126 3264 5735 2785 3775 3258 2576
(22) 3182 3514 5074 2695 4608 2283 2739 5724
肺炎 多糖
35
314533 57
27 72
44
郁
52 48
65
6057 2017 4273 3942 2947
5462552446263859663429 32
表2.細菌莢膜糖蛋白結合疫苗免疫原性測定結果
疫苗 代碼
小鼠血淸抗細菌莢膜糖抗體滴度(lgGGMT)
6A
6B
7F
9V
14
18C
19A
19F
23F
A
C
Hib
(25)
細菌 多糖
2071 1946 3854 3538 3157 2173 2086 2642 2904 4536 3187 3521 4017 2653 1742 2037 1264
35 31 45 33 57 36 27 -72 48 55 26 38 59 29 25 21 1權利要求
一種肺炎球菌結合疫苗，其特征在于，所述疫苗的抗原包括2價血清型肺炎球菌莢膜糖-蛋白結合體和/或多價血清型肺炎球菌莢膜糖-蛋白結合體，所述2價血清型肺炎球菌莢膜糖-蛋白結合體是指兩個不同的血清型莢膜糖與蛋白載體經化學鍵結合形成的結合物，蛋白載體通過化學鍵將此兩個不同血清型莢膜糖鏈接在一起，兩個不同的血清型莢膜糖依據與蛋白載體的化學鍵結合在結構上形成鏈接；所述多價血清型莢膜糖-蛋白結合體是指多個不同的血清型莢膜糖與蛋白載體經化學鍵結合形成的結合物，蛋白載體通過化學鍵將此多個不同的血清型莢膜糖鏈接在一起，多個不同血清型莢膜糖依據與蛋白載體的化學鍵結合在結構上形成鏈接。
2. 根據權利要求1所述的肺炎球菌結合疫苗，其特征在于，所述疫苗的抗原包括一個或兩個或兩個以上2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體。
3. 根據權利要求2所述的肺炎球菌結合疫苗，其特征在于，所述兩個或兩個以上2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體是指兩個或兩個以上的莢膜糖_蛋白結合體分別含有相等價數的血清型莢膜糖，并且其價數均介于2 45之間。
4. 根據權利要求2所述的肺炎球菌結合疫苗，其特征在于，所述兩個或兩個以上2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體是指兩個或兩個以上的莢膜糖_蛋白結合體分別含有不相等價數的血清型莢膜糖，并且其價數均介于2 45之間。
5. 根據權利要求2所述的肺炎球菌結合疫苗，其特征在于，所述兩個以上2 45價血清型莢膜糖_蛋白結合體是指兩個以上的莢膜糖_蛋白結合體分別含有相等和不相等價數的血清型莢膜糖，并且其價數均介于2 45之間。
6. —種肺炎球菌_腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，所述聯(lián)合疫苗抗原包括肺炎球菌多個血清型莢膜糖、腦膜炎球菌A群、C群、W135群、Y群莢膜糖和b型流感嗜血桿菌莢膜糖，這些不同細菌血清型(群)的莢膜糖與蛋白載體進行化學結合，以2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中。
7. —種肺炎球菌_腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，所述聯(lián)合疫苗抗原包括肺炎球菌多個血清型莢膜糖、腦膜炎球菌A群、C群莢膜糖和b型流感嗜血桿菌莢膜糖，這些不同細菌血清型(群)的莢膜糖與蛋白載體進行化學結合，以2價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體和/或多價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體形式存在于疫苗中。
8. —種肺炎球菌_腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，所述聯(lián)合疫苗抗原包括肺炎球菌多個血清型莢膜糖、腦膜炎球菌A群、C群、W135群、Y群莢膜糖和b型流感嗜血桿菌莢膜糖，這些肺炎球菌不同血清型的莢膜糖以2價血清型莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型莢膜糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中；這些腦膜炎球菌不同血清群的莢膜糖以4價血清群莢膜糖-蛋白結合體形式存在于疫苗中；所述b型流感嗜血桿菌的莢膜糖以單價血清型莢膜糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中。
9. 一種肺炎球菌_腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌聯(lián)合疫苗，所述聯(lián)合疫苗抗原包括肺炎球菌多個血清型莢膜糖、腦膜炎球菌A群、C群莢膜糖和b型流感嗜血桿菌莢膜糖；這些肺炎球菌不同血清型的莢膜糖以2價血清型莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型莢膜糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中；這些腦膜炎球菌不同血清群的莢膜糖以2價血清群莢膜糖-蛋白結合體形式存在于疫苗中；所述b型流感嗜血桿菌的莢膜糖以單價血清型莢膜糖_蛋白結合體形式存在于疫苗中。
10. 根據權利要求l-9任一項所述的結合疫苗，其特征在于，所述肺炎球菌血清型莢膜糖選自肺炎球菌全部血清型菌株制備的莢膜糖。
11. 根據權利要求l-9任一項所述的結合疫苗，其特征在于，所述肺炎球菌血清型莢膜糖選自肺炎球菌1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型菌株制備的莢膜糖。
12. 根據權利要求l-9任一項所述的結合疫苗，其特征在于，所述肺炎球菌血清型莢膜糖選自肺炎球菌1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F型菌株制備的莢膜糖。
13. 根據權利要求l-9任一項所述的結合疫苗，其特征在于，所述肺炎球菌血清型莢膜糖選自流行病學流行優(yōu)勢血清型菌株制備的莢膜糖。
14. 根據權利要求l-9任一項所述的結合疫苗，其特征在于，所述蛋白載體選自破傷風類毒素、白喉類毒素、白喉毒素無毒變異體、B群腦膜炎球菌外膜蛋白、肺炎球菌表面蛋白A、肺炎球菌表面粘附素A、肺炎球菌溶血素、流感嗜血桿菌D蛋白、百日咳毒素、霍亂毒素、結核菌素純蛋白衍生物、銅綠假單胞菌外毒素A、匙孔血藍蛋白。
15. 根據權利要求1-9任一項所述的結合疫苗，其特征在于，所述蛋白載體為來源于肺炎球菌的蛋白PspA、 PsaA、 Ply合并而成的肺炎球菌蛋白復合物。
16. 根據權利要求l-9任一項所述的結合疫苗，其特征在于，成品疫苗每一血清型(群)莢膜糖劑量為0.1 50iig。
17. 根據權利要求1-9任一項所述的結合疫苗，其特征在于，成品疫苗包含佐劑。
18. 根據權利要求17所述的結合疫苗，其特征在于，所述佐劑選自鋁佐劑、磷酸鈣佐劑、霍亂毒素B亞單位、皁角素Q21、類脂體、單磷酸類脂A、MF59、大腸桿菌不耐熱毒素。
19. 根據權利要求18所述的結合疫苗，其特征在于，所述的鋁佐劑選自氫氧化鋁、磷酸鋁或硫酸鋁。
20. 根據權利要求l-9任一項所述的結合疫苗，其特征在于，成品疫苗不含任何防腐劑。
21. 根據權利要求l-9任一項所述的結合疫苗，其特征在于，成品疫苗包含選自硫柳汞、2-苯氧乙醇、苯甲醇的防腐劑。
22. 根據權利要求1-9任一項所述的結合疫苗，其特征在于，所述的2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體中的莢膜糖是莢膜多糖和/或莢膜寡糖；所述的多價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體中的莢膜糖是莢膜多糖和/或莢膜寡糖。
23. —種制備含有2價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體和/或多價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體的細菌莢膜糖結合疫苗的方法，所述方法包括以下步驟a) 從不同血清型(群)細菌培養(yǎng)物中分別提取、純化莢膜糖，制成單一血清型(群)莢膜糖，即單價血清型(群)莢膜糖；b) 將步驟a)所得的單價血清型(群)莢膜糖按兩個或兩個以上血清型(群)的莢膜糖依據比例合并，成為2價或多價血清型(群)莢膜糖；c) 將步驟b)的2價或多價血清型(群)莢膜糖與蛋白載體進行化學鍵結合并純化，制成2價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體抗原或多價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體抗原；d)將步驟c)的2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體抗原和/或多價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體抗原配制成疫苗。
24. —種制備含有2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體和/或多價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體的細菌莢膜糖結合疫苗的方法，所述方法包括以下步驟a) 從不同血清型(群)細菌培養(yǎng)物中分別提取、純化莢膜糖，制成單一血清型(群)莢膜糖，即單價血清型(群)莢膜糖；b) 將步驟a)所得的單價血清型(群)莢膜糖按兩個或兩個以上血清型(群)的莢膜糖依據比例合并，成為2價或多價血清型(群)莢膜糖，其中，所述莢膜糖合并后進一步經勻化處理；c) 將步驟b)的2價或多價血清型(群)莢膜糖與蛋白載體進行化學鍵結合，制成2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體抗原或多價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體抗原；d) 將步驟c)的產物脫毒處理并純化制成2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體抗原或多價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體抗原；e) 將步驟d)的2價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體抗原和/或多價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體抗原配制成疫苗。
25. 根據權利要求23或24所述的方法，其中，所述細菌選自肺炎球菌、腦膜炎球菌、b型流感嗜血桿菌、傷寒沙門氏菌、葡萄球菌、B群鏈球菌。
26. 根據權利要求23或24所述方法，不同血清型(群)莢膜糖相互間合并重量比為1 : 0. 05 20 (w/w)。
27. 根據權利要求23或24所述的方法，其中所述的2價血清型(群)莢膜糖-蛋白結合體中的莢膜糖是莢膜多糖和/或莢膜寡糖；所述的多價血清型(群)莢膜糖_蛋白結合體中的莢膜糖是莢膜多糖和/或莢膜寡糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有2價血清型肺炎球菌莢膜糖-蛋白結合體和/或多價血清型肺炎球菌莢膜糖-蛋白結合體的新型肺炎球菌結合疫苗及其制備方法。所述2價血清型莢膜糖-蛋白結合體是指兩個不同血清型莢膜糖與蛋白載體經化學鍵結合形成的結合物，這兩個不同血清型莢膜糖依據與蛋白載體的化學鍵結合在結構上形成鏈接。所述多價血清型莢膜糖-蛋白結合體是指多個不同血清型莢膜糖與蛋白載體經化學鍵結合形成的結合物，這些多個不同血清型莢膜糖依據與蛋白載體的化學鍵結合在結構上形成鏈接。另外，本發(fā)明還提供了制備細菌莢膜糖-蛋白結合疫苗的方法。
文檔編號A61K39/112GK101785857SQ20101012940
公開日2010年7月28日 申請日期2010年3月5日 優(yōu)先權日2010年3月5日
發(fā)明者鄭玉清 申請人:鄭玉清