專利名稱：甘薯Sporamin蛋白在制備預(yù)防和治療腫瘤藥物及保健品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甘薯Sporamin蛋白的新用途，具體涉及甘薯Sporamin蛋白在制備預(yù)防和治療腫瘤藥物及保健品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甘薯(Ipomoea batatas)是旋花科(Convolvulaceae)甘薯屬一年生或多年生蔓生草本，又名山芋、紅芋、番薯、紅薯、白薯、地瓜、紅苕等，因地區(qū)不同而有不同的名稱。甘薯營養(yǎng)豐富，富含淀粉和可溶性糖，還含有蛋白質(zhì)、脂肪酸、多種維生素、多酚類物質(zhì)及鈣、磷、 鐵等礦物質(zhì)。其蛋白含量約為1. 2-10g/100g干物質(zhì)，但不同品種之間蛋白含量可有較大差
已Sporamin蛋白是甘薯塊根中一組特殊蛋白質(zhì)，1985年由Maeshima等發(fā)現(xiàn)，它主要存在于甘薯塊莖中，占甘薯可溶性蛋白的60% 80%，而其它器官中幾乎沒有。它是甘薯特異性的貯藏蛋白，在植株發(fā)育中為萌發(fā)的幼苗提供氮源。成熟的sporamin蛋白由 sporamin A和sporamin B兩種組分構(gòu)成，相對分子量分別為31kD和22kD，不含糖基，不屬于糖蛋白類型，在植物體內(nèi)主要以單體形式存在。研究表明Sporamin蛋白具有消除DPPH 自由基和羥基自由基的活性，還具有Kimitz型的胰蛋白酶抑制劑活性。但是到目前為止， 還沒有甘薯Sporamin蛋白在抑制腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移方面的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供甘薯Sporamin蛋白的新用途。本發(fā)明所提供的甘薯Sporamin蛋白的用途是其在制備預(yù)防和/或治療腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述產(chǎn)品具體可為藥物或保健品。所述腫瘤為癌；所述癌包括身體各系統(tǒng)的癌癥， 如結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、腦癌、卵巢癌、子宮癌、睪丸癌、皮膚癌、胃癌、鼻咽癌、膀胱癌、肛門癌或直腸癌，優(yōu)選為結(jié)腸癌或肺癌。以甘薯Sporamin蛋白為有效成分制備的預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物或保健品，也屬于本發(fā)明的保護范圍。需要的時候，在上述藥物或保健品中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。所述預(yù)防和/或治療腫瘤藥物或保健品可以制成注射液、片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。根據(jù)制備的不同劑型，可通過注射、噴射、滴鼻、滴眼、滲透、吸收、物理或化學(xué)介導(dǎo)的方法將藥物導(dǎo)入機體如肌肉、皮內(nèi)、皮下、靜脈、粘膜組織；或是被其他物質(zhì)混合或包裹后導(dǎo)入機體。
本發(fā)明提供的甘薯Sporamin蛋白的新用途還為甘薯Sporamin蛋白在制備真核生物腫瘤細胞增殖抑制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明中所述真核生物為哺乳動物。所述腫瘤細胞為癌細胞；所述癌細胞具體可為結(jié)腸癌細胞、肺癌細胞、乳腺癌細胞、肝癌細胞、胰腺癌細胞、腦癌細胞、卵巢癌細胞、子宮癌細胞、睪丸癌細胞、皮膚癌細胞、胃癌細胞、鼻咽癌細胞、膀胱癌細胞、肛門癌細胞或直腸癌細胞；優(yōu)選為結(jié)腸癌細胞(如HCT-8細胞、SW480細胞)或肺癌細胞(如Lewis肺癌細胞)。本發(fā)明所述的甘薯Sporamin蛋白是從旋花科(Convolvulaceae)甘薯屬一年生或多年生蔓生草本植物甘薯中提取的可溶性蛋白質(zhì)，以sporamin蛋白為主要成分，還包括少量的糖蛋白；在非還原條件下，SDS-PAGE電泳顯示其中存在著三種不同的分子形式22kDa，31kDa及50kDa ；但在還原條件下，只顯示出25kDa—種蛋白分子形式。該甘薯 Sporamin蛋白是通過現(xiàn)有的任何可行方法獲得的一類蛋白質(zhì)類物質(zhì)。該甘薯Sporamin蛋白是一種水提物或其它形式的提取物；也包括將甘薯Sporamin蛋白經(jīng)任何方法降解制得的不同分子量的產(chǎn)物和通過基因工程生產(chǎn)的sporamin蛋白質(zhì)。如可按照下述a)或b)的方法制備甘薯Sporamin蛋白a)將甘薯切碎，置于緩沖溶液A中浸泡、打漿、漿液離心、取上清液，冰浴下向所述上清液中添加硫酸銨至50%至70%的飽和度、靜置、離心、收集沉淀，并將沉淀溶于蒸餾水或Tris-HCl緩沖溶液中，冷凍干燥，即得甘薯Sporamin蛋白；其中，所述緩沖液A由NaHSO3 和50-500mmol · Γ1 Tris-HCl緩沖溶液組成，所述緩沖液A中NaHSO3的質(zhì)量濃度為0. 1% 至5%，所述緩沖溶液A的ρΗ值為7.0-8.0;所述甘薯與緩沖溶液A的配比為Ikg (1-5) L；b)將甘薯切碎，置于亞硫酸氫鈉冰水溶液中，然后將薯塊打成漿狀，過濾，將濾液離心，收集上清液并用鹽酸調(diào)PH至4-6，再次離心，收集沉淀；將所述沉淀用1-20倍體積的質(zhì)量濃度為至10%的氯化鈉溶液稀釋后，用氫氧化鈉調(diào)pH至中性，經(jīng)過截留分子量為 8000以上的透析膜透析后冷凍干燥，即得甘薯Sporamin蛋白。為了得到高純度的甘薯Sporamin蛋白，可采用下述方法進行純化1)將甘薯Sporamin蛋白加水溶解，離心收集上清液，所述上清液經(jīng)0. 22um 微孔濾膜過濾后，上DEAE-52離子交換層析柱；用緩沖溶液B進行洗脫，流速為 0. 10-0. 50ml .HIirT1,收集洗脫液中280nm波長的吸光度曲線上的第二吸收峰的組分， 即為初步純化的sporamin蛋白；所述緩沖溶液B的pH值為7. 5，其由EDTA、NaCl和 50mmol · L^1Tris-HCl 組成，其中 EDTA 濃度為 Immol · Λ NaCl 濃度為 0. 2mol · Γ1 ；2)將步驟1)制備的初步純化的sporamin蛋白用超濾杯濃縮后，用kphadex G-75 凝膠層析柱進一步純化；用緩沖溶液C進行洗脫，流速為0. 10-0. 50ml · mirT1，收集洗脫液中280nm波長的吸光度曲線上的第一吸收峰的組分，冷凍干燥，即得到純化的sporamin蛋白；所述緩沖溶液C的pH值為7. 5，其由EDTA、NaCl和50mmol -L^Tris-HCl組成，其中EDTA 濃度為 Immol · L—1，NaCl 濃度為 0. Imol · L—1。所述甘薯包括各種品種的甘薯屬植物，如徐薯55-2、北京553(玉豐、濟薯5號、泰薯2號等)、冀薯98、徐薯18、商薯19、遺字138、冀薯4號、徐薯23、京薯6號、冀薯99、西農(nóng) 431、豫薯10號(商52-7)、冀薯6-8、蘇薯8號、豫薯10號、徐紫薯1號、煙紫薯1號、寧紫薯1號(寧P-4)、高胡蘿卜素甘薯-“維多麗”、臺農(nóng)71、福薯7-6、莆薯53、無糖1號、冀薯 71、冀5-53、冀3-32、濟薯18、冀紫7_1等甘薯品種中的一種或幾種。抗癌活性試驗結(jié)果表明，甘薯Sporamin蛋白能抑制人結(jié)腸癌細胞株SW480細胞、 HCT-8細胞、Lewis肺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，抑制其對基底膜的侵襲，具有顯著的抗癌作用。 此外，甘薯Sporamin蛋白來源于糧食作物甘薯，其高安全性可以保證病人長期用藥的需要；且甘薯Sporamin蛋白的必需氨基酸組成合理，具有改善營養(yǎng)的作用，可以從多角度提高癌癥患者的健康狀況。


圖1為實施例1中甘薯Sporamin蛋白DEAE-52離子交換層析的洗脫曲線圖。圖2為實施例1中DEAE-52離子交換層析組分的SDS-PAGE圖譜，圖2_a為添加 β -巰基乙醇的圖譜，圖2-b為未添加β -巰基乙醇的圖譜；其中，條帶1為第M管洗脫液， 條帶2為第25管洗脫液，條帶3為第32管洗脫液，條帶4為第35管洗脫液，條帶5為第40 管洗脫液。圖3為實施例1中離子交換層析組分2 Wkphadex G_75凝膠層析的洗脫曲線圖。圖4為實施例1中kphadex G_75凝膠層析組分的SDS-PAGE圖譜，其中，條帶1 為第30管洗脫液，條帶2為第38管洗脫液，條帶3為第43管洗脫液，條帶4為第46管洗脫液，條帶5為第74管洗脫液。圖5為甘薯Sporamin蛋白對裸鼠腹膜彌散型人結(jié)腸瘤HCT-8細胞移植瘤的抑制作用。圖6為甘薯Sporamin蛋白對Lewis肺癌細胞在C57小黑鼠體內(nèi)自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移的抑制作用。圖7為甘薯Sporamin蛋白在體外對人結(jié)腸癌SW480細胞的增殖的抑制作用。圖8為甘薯Sporamin蛋白在體外對人結(jié)腸癌SW480細胞的遷移能力以及對人工基底膜的侵襲能力的抑制作用。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步地說明。下述實施例僅用來說明本發(fā)明， 本領(lǐng)域技術(shù)人員在理解本發(fā)明精神的前提下，可以根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)和公認知識對本發(fā)明進行相應(yīng)變換，這些技術(shù)方案均落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實施例1、從55-2甘薯制備并純化甘薯Sporamin蛋白甘薯粗蛋白的制備將鮮薯(品種55_2，蛋白含量0.5 3.0g/100g鮮重)清洗、稱重、切碎，在含 0. 1% NaHSO3 的 50mmol · L—1 Tris-HCl 緩沖溶液(pH 7. 5)中浸泡(1L · kg—1 鮮重)、打漿、 漿液離心(3000g離心IOmin)、取上清液，冰浴下向上清液中添加硫酸銨至60%的飽和度、 靜置、離心(3000g離心30min)、沉淀回溶于蒸餾水或50mmol · L^Tris-HCl緩沖溶液中、冷凍干燥，得甘薯Sporamin蛋白粗蛋白粉，蛋白含量為40% 60%。
甘薯sporamin蛋白的純化稱取適量的甘薯粗蛋白粉，加入IOOml蒸餾水使其溶解，IOOOOg離心40min。上清液經(jīng)孔徑為0. 22um微孔濾膜過濾后，上DEAE-52離子交換層析柱(柱規(guī)格1. 5cmX 30cm)。 用含 lmmol .171 EDTA 禾Π 0. 2mol .廠1 NaCl 的 50mmol .171 Tris-HCl 緩沖液(pH 7. 5)洗脫， 流速0. 30ml IirT1,將洗脫液(每管:3ml)在^Onm波長下測吸光值并繪制洗脫曲線(見圖1)。如圖1所示，甘薯粗蛋白經(jīng)DEAE-52層析純化后得到2種組分(圖1中峰1和峰 2)。分別對其進行了電泳分析(見圖幻。在未添加巰基乙醇的條件下(圖2-b)，峰 1(圖2中的1、2、3)主要有小于66kD和大于20kD等多條染色帶被檢出，而峰2(圖2中的 4、5)主要有22kD和31kD這2條染色帶。當(dāng)添加β -巰基乙醇時(圖2_a)，峰2主要檢出 1條約25kD的染色帶，這與甘薯sporamin蛋白的分子量是一致的，因此收集峰2組分(洗脫液第35至40管)作為初步純化的sporamin蛋白組分，進行下一步的純化。然后，將初步純化后的sporamin蛋白用超濾杯濃縮后，用kphadex G-75凝膠層析柱(柱規(guī)格5cmX 100cm)進一步純化；用含0. Imol ·廠1 NaCl和1謹ο · Γ1 EDTA的 50mmol .L—1 Tris-HCl 緩沖液(pH 7. 5)洗脫，流速 0. 45ml .mirT1，4°C操作。洗脫液(每管 5ml)在^Onm波長下測吸光值繪制洗脫曲線(見圖3)。如圖3所示，DEAE-52層析后回收到的峰2溶液用kphadexG-75凝膠進一步純化后得到1、2兩峰，分別對其進行了電泳分析(見圖4)。從圖4可見，第30管(泳道1)以及峰2中的第74管(泳道幻未檢出任何染色條帶；而峰1中分別有22kD和31kD的染色帶被檢出(泳道2、3、4)，說明經(jīng)過凝膠過濾層析進一步純化處理后，可以得到近似100%純度的sporamin蛋白，且全部集中于峰1。因此，回收峰1溶液(洗脫液第31至M管)，凍干后，-20°C保存。實施例2從紅冬甘薯制備甘薯Sporamin蛋白甘薯粗蛋白的制備將洗凈的甘薯(品種:55_2，蛋白含量0.5 3.0g/100g鮮重)切成2cm見方的小塊，放入濃度0. 5g/Kg的亞硫酸氫鈉冰水溶液中以防止其褐變。然后將薯塊用粉碎機打成漿狀，過濾。將濾液在3000g、室溫離心30min沉淀其中的淀粉。取上清液用2M鹽酸調(diào)pH 至4，在3000g，室溫離心30min ；將沉淀用10倍的5%氯化鈉溶液稀釋后，用2M氫氧化鈉調(diào) PH至中性；經(jīng)過透析膜(截留分子量8000以上，在還原條件下甘薯蛋白分子量為25000)透析后冷凍干燥，獲得干燥的甘薯Sporamin蛋白粉末，蛋白含量58. 9% 69. 0%。按照實施例1中的純化方法對粗蛋白粉進行純化。得到了純度為99%以上的甘薯 sporamin蛋白。收集sporamin蛋白純品凍干，_20°C保存。實施例3、甘薯Sporamin蛋白沖劑的制備在干燥的甘薯Sporamin粗蛋白粉末(Sporamin含量為55% )中加入0. 2倍質(zhì)量的乳糖，0. 1倍質(zhì)量的微晶纖維素，每IOOOg加入3 5g天然果品香精添加劑，5 6g甜味劑，混勻后，用90%乙醇潤濕、加壓成型，再經(jīng)整粒機整粒得到顆粒劑。采用復(fù)合鋁箔袋進行包裝。實施例4、甘薯Sporamin蛋白片劑的制備在干燥的甘薯Sporamin粗蛋白粉末中加入0. 2倍質(zhì)量的乳糖，0. 1倍質(zhì)量的微晶纖維素，每IOOOg加入3 5g天然果品香精添加劑，5 6g甜味劑，混勻后，用90%乙醇潤濕、制粒，干燥、再經(jīng)壓片機壓片、包衣既得到甘薯Sporamin蛋白片劑。實施例5甘薯Sporamin蛋白對裸鼠腹膜彌散型人結(jié)腸癌HCT-8細胞移植瘤生長的抑制作用該實施例通過人結(jié)腸癌HCT-8細胞裸鼠腹膜擴散性轉(zhuǎn)移模型，以腹腔內(nèi)生長的 HCT-8移植瘤數(shù)量、重量、腹水量、和血清癌胚抗原水平為指標，研究甘薯Sporamin蛋白對人結(jié)腸癌HCT-8細胞移植瘤生長的抑制作用。1、試驗材料本試驗所用甘薯Sporamin蛋白是按照實施例1的方法從收獲約1周的“55_2”種甘薯(蛋白含量8g/100g干重)中提取得到的。非還原的SDS-PAGE顯示其由分子量分別為31-kDa和22-kDa的兩條帶構(gòu)成，分別對應(yīng)于Sporamin A和Sporamin B。本試驗灌胃用蛋白純度為65% (其它成分淀粉15%，脂肪8%，灰分6%，其它 6%),腹腔注射用蛋白純度為89 % (其它成分脂肪3 %，灰分5 %，其它3 % )，文中所示劑量均為換算成純Sporamin蛋白后的劑量。2、試驗方法將15只雌性C57BL/6nu/nu裸鼠(5周齡，14士2g/只)隨機分為對照組、灌胃給藥(i.g.)組和腹腔注射(i.P.)組，每組5只。無菌條件下，將HCT-8荷瘤鼠瘤體取下、剪碎，加生理鹽水(瘤重生理鹽水=1 3)于勻漿器中勻漿，過80目篩，細胞計數(shù)，用生理鹽水調(diào)節(jié)細胞濃度至1 X 106/ml ；用Iml注射器以0. 2ml/只的量將癌細胞接種到裸鼠腹腔； 從第二天開始給予甘薯Sporamin蛋白生理鹽水溶液(i. g.，2000mgSpOramin蛋白/kg體重 天；i. p.，50mg/kg體重 天)，對照組以同體積生理鹽水腹腔注射。9天后，摘除裸鼠眼球采血，離心分離血清于-20°C冰箱保存以備測量癌胚抗原(CEA)含量；然后處死裸鼠， 解剖，觀察腹腔內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)生長情況并拍照；切下、收集所有腫瘤結(jié)節(jié)并稱重，甲醛固定并切片HE染色觀察。3、試驗結(jié)果結(jié)果見圖5 ；其中，A.為裸鼠腹腔內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)的生長情況；B.為腸系膜上的腫瘤結(jié)節(jié)；C.為裸鼠腹腔內(nèi)腫瘤結(jié)節(jié)的總重量；D.為裸鼠腹腔內(nèi)的腹水量；E.為裸鼠血清癌胚抗原(CEA)含量；F.為裸鼠處死前的體重。i. p.代表腹腔注射；i. g.代表灌胃給藥.η = 5， *，P < 0. 05，**，P < 0. 01。如圖5-Α顯示，將人直腸結(jié)腸癌HCT-8細胞株接種到裸鼠腹腔后若不進行任何干預(yù)，9天后對照組裸鼠腹腔內(nèi)臟器表面、腹腔內(nèi)膜、腸系膜(圖5-B)等各部位將會形成肉眼可見的、密集的、大小不等的腫瘤結(jié)節(jié)，伴有血性腹水。但是灌胃或者腹腔注射甘薯 Sporamin蛋白后，肉眼即可見腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少。剝離、收集各組裸鼠腹腔內(nèi)壁、內(nèi)臟表面及腸系膜等上面的腫瘤結(jié)節(jié)并稱重，可發(fā)現(xiàn)i.g.或者i.P.給予甘薯Sporamin蛋白后瘤體總重明顯降低，從對照組的1.31 士 0. 17g/ 只降低到 i.g.組的 0. 76 士 0. IOg/只(下降 41.98%，P<0.01)和 i. p.組的 0. 57 士 0. 12g/ 只(下降 56. 49%, P < 0. 01)(圖 5-C)。對照組5只裸鼠均出現(xiàn)血性腹水(0. 17士0. 04ml/只)，但i. g.給予甘薯Sporamin 蛋白后腹水量減少為0. 07士0. 04ml/只；而i. p.組裸鼠未觀察到出現(xiàn)腹水(圖5-D)。
對照組裸鼠血清CEA 水平為 1. 39士0. llng/ml，i. g.組為 1. 40士0. 10ng/ml， i.p.組為0. 85士0. 02ng/ml，與對照組相比顯著下降38. 85% (P < 0. 05)(圖5-E)。此外，給與甘薯Sporamin蛋白對裸鼠的體重并無顯著影響(圖5-F)。這些結(jié)果都說明甘薯 Sporamin蛋白能抑制腹腔內(nèi)移植瘤的生長，且與i.g.相比，i.p.的效果更明顯。實施例6甘薯Sporamin蛋白對Lewis肺癌細胞向肺部自發(fā)性轉(zhuǎn)移的抑制作用。該實施例通過Lewis肺癌細胞自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移動物模型，以后退皮下原發(fā)瘤重量及肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為主要指標，研究甘薯Sporamin蛋白在模型動物體內(nèi)對Lewis肺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。1、試驗材料本試驗所用甘薯Sporamin蛋白是按照實施例1的方法從收獲約1周的“55_2”種甘薯(蛋白含量8g/100g干重)中提取得到的。非還原的SDS-PAGE顯示其由分子量分別為31-kDa和22-kDa的兩條帶構(gòu)成，分別對應(yīng)于Sporamin A和Sporamin B。本試驗灌胃用蛋白純度為65 % (其它成分淀粉15 %，脂肪8 %，灰分6 %，其它 6%),腹腔注射用蛋白純度為89 % (其它成分脂肪3 %，灰分5 %，其它3 % )，文中所示劑量均為換算成純Sporamin蛋白后的劑量。2試驗方法將18只雌性C57小黑鼠(5周齡，14士2g/只)隨機分成對照組、i. g.和i. p.組， 每組6只。無菌條件下取Lewis肺癌荷瘤鼠的瘤體，剪碎，加生理鹽水(瘤重生理鹽水 =1:3)于勻漿器中勻漿，過80目篩，細胞計數(shù)，用生理鹽水調(diào)細胞濃度為lX106/ml，以 0. Iml/只的量接種于C57小黑鼠右后腿根部皮下。從接種后第二天開始給予Sporamin蛋白生理鹽水溶液(i. g. , 3000mg/kg體重 天；i. p. , 50mg/kg體重 天)，對照組以同體積生理鹽水腹腔注射。治療25天后斷頸法處死小鼠，剝離腿部瘤體并稱重、固定和切片；同時取肺臟用多聚甲醛固定后在體式顯微鏡(SZX16，日本Olympus公司)(XlO)下計數(shù)肺表面轉(zhuǎn)移灶數(shù)，并切片觀察。3、試驗結(jié)果結(jié)果見圖6 ；其中，A為C57小黑鼠肺部自發(fā)性腫瘤轉(zhuǎn)移灶的形成情況。體式顯微鏡(X 10)下觀察并拍照，左側(cè)為肺正面，右側(cè)為肺背面；B為C57小黑鼠肺表面Lewis肺癌細胞自發(fā)性轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量；C為C57小黑鼠后腿根部皮下移植瘤(原發(fā)灶)的重量；D為C57 小黑鼠處死前的體重。由結(jié)果可知，Sporamin蛋白抑制了 Lewis肺癌細胞在C57小黑鼠體內(nèi)自發(fā)性的肺轉(zhuǎn)移，在C57小黑鼠后腿根部皮下接種Lewis肺癌細胞7天后，所有小鼠后腿根部均明顯隆起，形成實體移植瘤(原發(fā)灶)。給予Sporamin蛋白生理鹽水溶液25天后將小黑鼠處死并取肺臟并在體式顯微鏡(XlO)下觀察發(fā)現(xiàn)所有肺表面均出現(xiàn)明顯囊狀轉(zhuǎn)移灶，正反面均可見(圖6-A)。但與對照組轉(zhuǎn)移灶數(shù)量5士4. 5個/只)相比，i. g.組Ol. O士 12. 3g/ 只)和i. p.組、2 . 3士 12. 7個/只)均明顯減少，分別較對照組減少50. 59%和35. 76% (P < 0. 05)，且i. g.組效果更佳(圖6-B)。對照組部移植瘤(原發(fā)灶)的重量為8. 2士 1. 3g/只，i. p.給藥使其明顯降低到 6. 1 士 1. 4g/只，降低了 25. 61% (P < 0. 05)；灌胃組為7. 1 士 1. 5g/只，雖然比對照組略輕， 但并無顯著性差異(P > 0. 05)，說明i. g.給藥不如i. p.給藥對腿局部移植瘤(原發(fā)灶)的抑制作用強(圖6-C)。除此之外。與腹腔接種試驗的結(jié)果類似，給與Sporamin蛋白25天后各組小黑鼠的體重并無顯著性差異(圖6-D，i.g.組和i.p.組的P值分別為0.53和0.57)，說明本實施了所用劑量的Sporamin蛋白對荷瘤小黑鼠的生長沒有顯著影響。實施例7甘薯Sporamin蛋白在體外對人結(jié)腸癌SW480細胞增殖和侵襲能力的抑制作用。本實施例通過在體外細胞培養(yǎng)體系中用不同濃度甘薯Sporamin蛋白處理人結(jié)腸癌SW480細胞，并于不同時間后觀察細胞的增殖情況，及對人工基底膜的侵襲穿透情況，在體外研究甘薯Sporamin蛋白對惡性腫瘤細胞增殖和侵襲能力的影響。1、試驗材料本實施例所用甘薯Sporamin蛋白是按照實施例1的方法從收獲約1周的“55_2” 種甘薯(蛋白含量8g/100g干重)中提取得到的，純度在99%以上；人結(jié)腸癌SW480細胞購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫(目錄號TCHul72)；胰蛋白酶、四氮甲基偶氮唑鹽(MTT)、DMSO及臺盼藍購自Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清(FBS) 購自杭州四季青生物工程和材料研究所，插入式細胞培養(yǎng)小室(Isopore 聚碳酸酯膜)和 CHEMICON 細胞侵襲試劑盒(ECM550)購自Millipore公司。高速離心機(上海興亞凈化材料廠)，微孔濾膜(孔徑0. 22 μ m，上海興亞凈化材料廠)，冷凍干燥機(LGJ-IO型，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠)，酶標儀(Multiscan MK3，芬蘭Thermo)，倒置顯微鏡0CDS-1B，重慶麥克光電儀器有限公司)。2、試驗方法用不同濃度的甘薯sporamin蛋白處理SW480細胞不同時間Q4、48、72小時)后， 采用血球計數(shù)法和MTT (四甲基氮唑鹽)法測量細胞數(shù)量；采用插入式細胞培養(yǎng)小室觀察 sw480細胞侵襲破壞穿過ECMatrix 人工基底膜的能力及sporamin的作用。試驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標準差(Mean士SD)表示，用DPS7. 55統(tǒng)計軟件進行方差分析，以P < 0. 05為具有顯著性意義。3、試驗結(jié)果結(jié)果見圖7和圖8。圖7中，A為血球計數(shù)法測定的lmg/ml Sporamin蛋白對人結(jié)腸癌SW480細胞增殖的抑制作用；B為MTT法測定的lmg/ml Sporamin蛋白對人結(jié)腸癌 SW480細胞增殖的抑制作用(以O(shè)D492表示)；C為MTT法測定的不同濃度Sporamin蛋白處理4 后SW480細胞的活力，并以對照組的OD值為100%進行比較。η = 8，*號表示與對照組相比P < 0. 05，不同字母表示組間相比P < 0. 05。圖8中，A為從插入式細胞培養(yǎng)小室的上室穿過聚碳酸酯膜(孔徑8 μ m)遷移到膜下表面的SW480細胞。顯微鏡下(X200)拍照，圖中空心透亮的點為聚碳酸酯膜上的小孔，深色污點為被染色的細胞。B為從插入式細胞培養(yǎng)小室的上室穿過聚碳酸酯膜遷移到膜下表面被染色的的SW480細胞數(shù)。顯微鏡下(X200)計數(shù)膜下表面被染色的細胞數(shù)，隨機計數(shù)5個視野，每個標本重復(fù)計3次，試驗重復(fù)2次，計算平均值。C為從ECM550侵襲檢測試劑盒的插入式細胞培養(yǎng)小室的上室穿過人工基底膜(ECMatrix )和聚碳酸酯膜(孔徑 Sum)遷移到膜下表面的SW480細胞。顯微鏡下(X200)拍照，圖中空心透亮的點為聚碳酸酯膜上的小孔，深色污點為被染色的細胞。D為從ECM550侵襲檢測試劑盒的插入式細胞培養(yǎng)小室的上室穿過人工基底膜(ECMatrix )和聚碳酸酯膜(孔徑8 μ m)遷移到膜下表面的 SW480細胞數(shù)。顯微鏡下(X200)計數(shù)膜下表面被染色的細胞數(shù)，隨機計數(shù)5個視野，每個標本重復(fù)計3次，試驗重復(fù)2次，計算平均值。*表示與對照組相比P < 0. 05。結(jié)果Sporamin抑制了 SW480細胞的增殖，血球計數(shù)法(hemacytometry)(圖7-A) 和MTT法(圖7-B)的結(jié)果均顯示lmg/ml的Sporamin蛋白能明顯抑制SW480細胞的增殖， 處理時間越長，效果越明顯。圖7-C顯示，0. 05mg/ml的Sporamin處理SW480細胞48h使細胞數(shù)降低為對照組的 88. 09% ；0. lmg/ml 的 Sporamin 使細胞數(shù)降為 80. 18% ；0. 25mg/ml 的 Sporamin 使細胞數(shù)降為 69. 13%；0. 5mg/ml 的 Sporamin 使細胞數(shù)降為 65. 81%；lmg/ml 的 Sporamin 使細胞數(shù)降為50. 92%,2. 5mg/ml的Sporamin使細胞量降為16. 63% ；均具有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義 (P < 0. 05)，說明Sporamin對SW480細胞增殖的抑制作用具有濃度依賴性。對試驗數(shù)據(jù)進行線性回歸，計算出其半抑制濃度(IC50)為0.97mg/ml。圖8顯示Sporamin抑制了 SW480細胞的遷移和對人工基底膜的侵襲能力。圖8-A， 8-B顯示，與Sporamin共培養(yǎng)后，SW480細胞的遷移能力下降，穿過8 μ m聚碳酸酯膜的細胞數(shù)減少，0. 2mg/ml的Sporamin即可顯著抑制其遷移能力(P < 0. 05)，且Sporamin濃度越高，抑制效果越明顯，具有濃度依賴性。圖8-C，8_D顯示，與Sporamin共培養(yǎng)后，SW480細胞對人工基底膜的侵襲能力下降，穿過ECMatrix 人工基底膜和8 μ m聚碳酸酯膜到膜下表面的細胞數(shù)減少，對照組穿過的細胞數(shù)為35士6個；0. 02mg/ml的Sporamin即可顯著抑制其遷移能力(P < 0. 05)，使侵襲過人工基底膜的細胞數(shù)下降到26士6個；且Sporamin濃度越高，抑制效果越明顯，當(dāng) Sporamin濃度為0. 2mg/ml和lmg/ml時，侵襲細胞數(shù)分別下降為20士5個和13士6個，具有濃度依賴性。
權(quán)利要求
1.甘薯Sporamin蛋白在制備預(yù)防和/或治療腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述產(chǎn)品為藥物或保健品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤為癌；所述癌為結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、胰腺癌、腦癌、卵巢癌、子宮癌、睪丸癌、皮膚癌、胃癌、鼻咽癌、膀胱癌、肛門癌或直腸癌，優(yōu)選為結(jié)腸癌或肺癌。
4.甘薯Sporamin蛋白在制備真核生物癌細胞增殖抑制劑中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述真核生物為哺乳動物；所述腫瘤細胞為癌細胞；所述癌細胞為結(jié)腸癌細胞、肺癌細胞、乳腺癌細胞、肝癌細胞、胰腺癌細胞、肺癌細胞、腦癌細胞、卵巢癌細胞、子宮癌細胞、睪丸癌細胞、皮膚癌細胞、胃癌細胞、鼻咽癌細胞、膀胱癌細胞、肛門癌細胞或直腸癌細胞；優(yōu)選為結(jié)腸癌細胞或肺癌細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的應(yīng)用，其特征在于所述甘薯Sporamin蛋白是按照包括下述a)或b)步驟的方法制備得到的a)將甘薯切碎，置于緩沖溶液A中浸泡、打漿、漿液離心、取上清液，冰浴下向所述上清液中添加硫酸銨至50%至70%的飽和度、靜置、離心、收集沉淀，并將沉淀溶于蒸餾水或 Tris-HCl緩沖溶液中，冷凍干燥，即得甘薯Sporamin蛋白；其中，所述緩沖液A由NaHSO3 和50-500mmol -L^Tris-HCl緩沖溶液組成，所述緩沖液A中NaHSO3的質(zhì)量濃度為0. 至 5%，所述緩沖溶液A的pH值為7.0-8.0;所述甘薯與緩沖溶液A的配比為Ikg (1-5) L ；b)將甘薯切碎，置于亞硫酸氫鈉冰水溶液中，然后將薯塊打成漿狀，過濾，將濾液離心， 收集上清液并用鹽酸調(diào)PH至4-6，再次離心，收集沉淀；將所述沉淀用1-20倍體積的質(zhì)量濃度為至10%的氯化鈉溶液稀釋后，用氫氧化鈉調(diào)pH至中性，經(jīng)過截留分子量為8000 以上的透析膜透析后冷凍干燥，即得甘薯Sporamin蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述甘薯Sporamin蛋白是按照包括下述 a)或b)步驟的方法制備得到的a)將甘薯切碎，置于緩沖溶液A中浸泡、打漿、漿液以3000g轉(zhuǎn)速離心IOmiru取上清液，冰浴下向所述上清液中添加硫酸銨至60%的飽和度、靜置、以3000g轉(zhuǎn)速離心lOmin， 收集沉淀，并將沉淀溶于蒸餾水或Tris-HCl緩沖溶液中，冷凍干燥，即得甘薯Sporamin蛋白；其中，所述緩沖液A由NaHSO3和50mmol · L^Tris-HCl緩沖溶液組成，所述緩沖液A中 NaHSO3的質(zhì)量濃度為0.1%，所述緩沖溶液A的pH值為7. 5 ；所述甘薯與緩沖溶液A的配比為 Ikg IL ；b)將甘薯切碎，置于亞硫酸氫鈉冰水溶液中，然后將薯塊打成漿狀，過濾，將濾液以 3000g室溫離心30min，收集上清液并用鹽酸調(diào)pH至4，再次以3000g室溫離心30min，收集沉淀；將所述沉淀用10倍體積的質(zhì)量濃度為5%的氯化鈉溶液稀釋后，用氫氧化鈉調(diào)PH至中性，經(jīng)過截留分子量為8000以上的透析膜透析后冷凍干燥，即得甘薯Sporamin蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于所述方法還包括對所述步驟a)或步驟b)得到的甘薯Sporamin蛋白進行純化的步驟1)將甘薯Sporamin蛋白加水溶解，離心收集上清液，所述上清液經(jīng)0. 22um微孔濾膜過濾后，上DEAE-52離子交換層析柱；用緩沖溶液B進行洗脫，流速為0. 10-0. 50ml ^irT1, 收集洗脫液中280nm波長的吸光度曲線上的第二吸收峰的組分，即為初步純化的sporamin 蛋白；所述緩沖溶液B的pH值為7. 5，其由EDTA、NaCl和50mmol · L^Tris-HCl組成，其中EDTA 濃度為 Immol · Γ1，NaCl 濃度為 0. 2mol · Γ1 ；2)將步驟1)制備的初步純化的sporamin蛋白用超濾杯濃縮后，用kphadexG-75凝膠層析柱進一步純化；用緩沖溶液C進行洗脫，流速為0. 10-0. 50ml · mirT1，收集洗脫液中 ^Onm波長的吸光度曲線上的第一吸收峰的組分，冷凍干燥，即得到純化的sporamin蛋白； 所述緩沖溶液C的pH值為7. 5，其由EDTA、NaCl和50_1 · L^1Tris-HCl組成，其中EDTA 濃度為 Immol · L—1，NaCl 濃度為 0. Imol · L—1。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述方法還包括對所述步驟a)或步驟b) 得到的甘薯Sporamin蛋白進行純化的步驟1)將甘薯Sporamin蛋白加水溶解，離心收集上清液，所述上清液經(jīng)0.22um微孔濾膜過濾后，上規(guī)格為1. 5cmX30cm的DEAE-52離子交換層析柱；用緩沖溶液B進行洗脫，流速為0. 3ml ^irT1,收集洗脫液每管:3ml，繪制洗脫液在280nm波長的吸光度曲線，收集吸光度曲線上的第二吸收峰組分即第35至40管洗脫液，得到初步純化的sporamin蛋白；所述緩沖溶液B的pH值為7. 5，其由EDTA, NaCl和50_1 · L^1Tris-HCl組成，其中EDTA濃度為 Immol · ΙΛ NaCl 濃度為 0. 2mol · L-1 ；2)將步驟1)制備的初步純化的sporamin蛋白用超濾杯濃縮后，用規(guī)格5cmXIOOcm的 Sephadex G-75凝膠層析柱進一步純化；用緩沖溶液C進行洗脫，流速為0. 45ml · mirT1，收集洗脫液每管5ml，繪制洗脫液在^Onm波長的吸光度曲線，收集吸光度曲線上的第一吸收峰組分即第31至M管洗脫液，冷凍干燥，即得到純化的sporamin蛋白；所述緩沖溶液C的 PH 值為 7. 5，其由 EDTA、NaCl 和 50mmol · L^1Tris-HCl 組成，其中 EDTA 濃度為 Immol · Λ NaCl 濃度為 0. Imol · L—1。
全文摘要
本發(fā)明公開了甘薯Sporamin蛋白的新用途。該新用途是甘薯Sporamin蛋白在制備預(yù)防和/或治療腫瘤產(chǎn)品中的應(yīng)用以及在制備真核生物腫瘤細胞增殖抑制劑中的應(yīng)用?？拱┗钚栽囼灲Y(jié)果表明，甘薯Sporamin蛋白能抑制人結(jié)腸癌細胞株SW480細胞、HCT-8細胞、Lewis肺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，抑制其對基底膜的侵襲，具有顯著的抗癌作用。此外，甘薯Sporamin蛋白來源于糧食作物甘薯，其高安全性可以保證病人長期用藥的需要；且甘薯Sporamin蛋白的必需氨基酸組成合理，具有改善營養(yǎng)的作用，可以從多角度提高癌癥患者的健康狀況。
文檔編號A61K38/16GK102198263SQ20101013174
公開日2011年9月28日 申請日期2010年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月23日
發(fā)明者木泰華, 李鵬高, 鄧樂 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所