專利名稱：山竹果皮花色苷的提取方法及其在制備抗炎藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然藥物化學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及到一種具有特異靶向性的天然抗炎藥 物分子的分離提取及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
炎癥反應(yīng)在人體防御外來(lái)病原體入侵以及修復(fù)自身?yè)p傷組織中，扮演著相當(dāng)重要 的角色，它受到免疫系統(tǒng)高度精細(xì)的調(diào)控，一旦這種調(diào)節(jié)失控將會(huì)引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)或 發(fā)展成慢性炎癥，導(dǎo)致多種嚴(yán)重疾病，癥狀表現(xiàn)為從輕微的牛皮癬到哮喘和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 等。另外，還與動(dòng)脈粥樣硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎小球腎炎及急性心肌梗死等疾病有關(guān)，因 而被公認(rèn)為當(dāng)今危害人類健康的三大頑疾之一，預(yù)防和治療炎癥及相關(guān)綜合癥始終是醫(yī)學(xué) 領(lǐng)域的難題。大量的研究表明P-選擇素是參與炎癥反應(yīng)的重要粘附分子之一，它可以作為 抗炎藥物研發(fā)的新靶點(diǎn)。炎癥反應(yīng)是一個(gè)多步驟的過(guò)程，其中白細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的滾動(dòng)、粘附和滲 出是炎癥過(guò)程的重要環(huán)節(jié)，其分子基礎(chǔ)在于白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子之間的相 互作用。選擇素家族是參與炎癥反應(yīng)起始過(guò)程的重要粘附分子。選擇素家族包括三個(gè)成員 P-選擇素、E-選擇素和L-選擇素。其中P-選擇素主要分布于內(nèi)皮細(xì)胞的Webel-Palade 小體中。當(dāng)血管內(nèi)皮受到炎癥因子刺激后，P-選擇素在幾分鐘之內(nèi)就被轉(zhuǎn)運(yùn)到活化的內(nèi)皮 表面。P-選擇素糖蛋白配體-I(PSGL-I)是P-選擇素的高親和力配體，表達(dá)于所有的血源 性細(xì)胞表面，如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞表面的 P"選擇素與白細(xì)胞表面的PSGL-I結(jié)合后，使白細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞上發(fā)生起始粘附和滾 動(dòng)，進(jìn)而引發(fā)一系列炎癥事件。資料表明，P-選擇素參與了多種疾病的病理生理過(guò)程，其過(guò) 渡或持續(xù)表達(dá)已經(jīng)成為某些組織炎癥病變的標(biāo)志。阻斷P-選擇素與配體的結(jié)合，可以抑制 白細(xì)胞與血管內(nèi)皮的粘附作用，從而有效的阻斷炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生。篩選P-選擇素的高效拮 抗劑，阻斷白細(xì)胞粘附，可以為炎癥及其相關(guān)重大疾病的治療提供新的策略和手段。花色苷是植物天然色素，廣泛存在于植物的花、果實(shí)和葉中?；ㄉ帐且环N高效的 抗氧化劑，有研究證明其抗氧自由基的能力是維生素E的50倍，是維生素C的20倍?；ㄉ?苷作為無(wú)毒、高效的天然抗氧化劑，在保健食品及飲料中廣泛應(yīng)用，成為美國(guó)天然植物提取 物十大暢銷品種之一，有著廣闊的市場(chǎng)。除了極強(qiáng)的抗氧化能力外，它還可以降低心臟病、 癌癥、糖尿病的發(fā)病率，增強(qiáng)血管壁抵抗力，降低毛細(xì)血管脆性，保持毛細(xì)血管通透性，預(yù)防 并緩解靜脈曲張，減輕水腫和腿部腫脹。同時(shí)還能增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，抵御外來(lái)病原體入 侵。山竹是一種重要的熱帶水果，其果皮占果實(shí)總重量的70-80%左右，常常被作為廢 棄物扔掉。充分利用這一廢棄資源，研發(fā)抗炎新藥，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前有關(guān)山竹果皮中花色苷的提取及其藥物用途未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本項(xiàng)發(fā)明目的是提供一種從山竹果皮中分離提取出天然花色苷成分的方法，通過(guò)體內(nèi)、體外炎癥模型，確證針對(duì)P-選擇素靶點(diǎn)，山竹果皮花色苷的抗炎效果，將其應(yīng)用于制 備預(yù)防和治療炎癥及相關(guān)疾病的藥物之中。本發(fā)明涉及到山竹果皮花色苷的分離提取方法、體內(nèi)急性腹腔炎小鼠模型、體外 模擬毛細(xì)血管層流實(shí)驗(yàn)等相關(guān)內(nèi)容。本發(fā)明采取山竹果皮花色苷的分離提取方法是先將山竹果皮風(fēng)干后粉碎，利用酸性乙醇提取，提取液減壓濃縮后，加水溶解加樣 到XAD-7大孔樹脂中，分別用水、乙醇洗脫，收集乙醇部分，濃縮后，加水凍干，得到總花色 苷成分，樣品呈現(xiàn)紫紅色粉末狀。利用急性腹腔炎小鼠模型檢測(cè)山竹果皮花色苷的抗炎活性，結(jié)果表明尾靜脈注 射山竹果皮花色苷后能夠有效抑制小鼠腹腔液中性粒細(xì)胞滲出，在劑量為0.01、0. Ulmg/ ml時(shí)，抑制率分別達(dá)到了 34%、77%、94%。此外，構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染P-選擇素的CHO細(xì)胞系 (CHO-P)，利用體外模擬毛細(xì)血管的層流實(shí)驗(yàn)，模擬生理?xiàng)l件下炎癥部位活化的血管內(nèi)皮細(xì) 胞表面的P-選擇素介導(dǎo)的白細(xì)胞與血管內(nèi)皮的粘附作用。通過(guò)層流模型研究發(fā)現(xiàn)，0.01、 0. Ulmg/ml劑量的山竹果皮花色苷在層流條件下對(duì)中性粒細(xì)胞的粘附抑制率分別達(dá)到 45%,71%,89%o本發(fā)明在分子水平、細(xì)胞水平和整體水平上，確證了山竹果皮花色苷的抗炎活性， 山竹果皮花色苷作為新型抗炎藥物有著良好的應(yīng)用前景。


附圖1為山竹果皮花色苷對(duì)小鼠急性腹腔炎的抑制作用示意圖；附圖2為山竹果皮花色苷對(duì)中性粒細(xì)胞與CHO-P在層流狀態(tài)下結(jié)合的抑制作用示 意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 山竹果皮花色苷的分離提取(1)花色苷粗提物的分離。將完全風(fēng)干的山竹果皮粉碎，在20 70°C的條件下， 加入10 40倍體積的20% 90%乙醇，調(diào)節(jié)PH值為1 5，反復(fù)提取3 8次，每次提取 1 5h，過(guò)濾后合并提取液。將得到的提取液在30 70°C、真空度-0. 03 -0. 09MPa下減 壓蒸餾回收醇溶劑，使濾液的醇濃度降至10%以下，經(jīng)離心、過(guò)濾，得到山竹果皮花色苷浸 提液。(2)大孔樹脂分離花色苷。XAD-7大孔樹脂用乙醇/水充分清洗預(yù)處理后裝柱，將 山竹果皮花色苷浸提液上樣到樹脂柱，在溫度為5 50°C、流速為0. 5 3BV/h條件下，緩 慢在大孔樹脂柱上進(jìn)行花色苷的吸附。吸附結(jié)束后，用2 5倍柱體積的蒸餾水洗脫未結(jié) 合的雜質(zhì)，注意不要洗掉色素物質(zhì)，此時(shí)樹脂柱顏色深紅紫色。在溫度為5 50°C、流速為 0. 5 3BV/h條件下，用30 100%乙醇洗脫大孔樹脂上的花色苷，直至樹脂柱變?yōu)闊o(wú)色， 收集洗脫液。在30 70°C、真空度-0. 03 -0. 09MPa下減壓蒸餾回收醇溶劑，濃縮液冷凍干燥后得到山竹果皮花色苷成分，樣品呈現(xiàn)紫紅色粉末狀。實(shí)施例2:山竹果皮花色苷對(duì)小鼠急性腹腔炎的抑制作用向雄性小鼠腹膜內(nèi)注射1 5mL的1 10% Thioglycollate broth (Sigma)或者無(wú)菌生理鹽水。5 30min后，于小鼠尾 靜脈分別注射無(wú)菌生理鹽水、0. 01,0. Ulmg/ml的山竹果皮花色苷的生理鹽水溶液。1 5h 后處死小鼠，用1 5mL的生理鹽水灌洗，收集腹腔液。500 2000rpm離心1 IOmin后， 一部分細(xì)胞用血球記數(shù)板進(jìn)行總腹腔細(xì)胞的雙盲(double blindly)記數(shù)；另一部分固定， 涂片和染色，記數(shù)每mL中性粒細(xì)胞的數(shù)目。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。結(jié)果顯示，與陰 性對(duì)照組相比，山竹果皮花色苷能夠顯著的抑制模型小鼠腹腔中白細(xì)胞的滲出，其不同劑 量山竹果皮花色苷的抑制率分別達(dá)到了 34%、77%、94%，見附圖1。實(shí)施例3:山竹果皮花色苷抑制中性粒細(xì)胞與CHO-P在層流狀態(tài)下的結(jié)合用體外模擬毛細(xì) 血管的層流實(shí)驗(yàn)測(cè)定中性粒細(xì)胞與牢固貼壁的CHO-P的粘附作用。所有用于層流實(shí)驗(yàn)的單 細(xì)胞懸液密度均為1 5X 106cells/mL。將長(zhǎng)滿CHO-P的35mm培養(yǎng)皿裝配于平行板流動(dòng)小 室，然后放置在倒置顯微鏡的載物臺(tái)上(在與中性粒細(xì)胞作用前，表達(dá)P-selectin的CHO-P 細(xì)胞分別與0. 01,0. Ulmg/ml的山竹果皮花色苷作用10 120分鐘)。倒置顯微鏡連接有 彩色視頻攝像裝置，可以將視頻圖像傳送到錄像機(jī)，并可用相連的計(jì)算機(jī)顯示器同步觀察。 首先用注射泵(Cole-Parmer Instrument Co.)注入PBS沖洗平行板流動(dòng)小室1 5min， 注入中性粒細(xì)胞單細(xì)胞懸液(1 5X 106cells/mL)，以適合的流速維持層壁剪切壓0. 1 0. 5dyn/Cm2，模擬體外微循環(huán)和后毛細(xì)血管靜脈的流體機(jī)械環(huán)境。整個(gè)系統(tǒng)保持在15 30°C，當(dāng)中性粒細(xì)胞進(jìn)入視野1 5min后，隨機(jī)選定10 20個(gè)區(qū)域(0. 1266mm2)，記錄粘 附于CHO-P表面的中性粒細(xì)胞，最后通過(guò)觀看錄像帶人工計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，山竹果皮花色苷 可以明顯地抑制中性粒細(xì)胞與CHO-P在層流狀態(tài)下的結(jié)合。與陽(yáng)性對(duì)照相比，其抑制效果 分別達(dá)到45%、71%、89%，見附圖2。
權(quán)利要求
山竹果皮花色苷的提取方法，其特征在于具體步驟是(1)花色苷粗提物的分離將完全風(fēng)干的山竹果皮粉碎，在20～70℃的條件下，加入10～40倍體積的20％～90％乙醇，調(diào)節(jié)pH值為1～5，反復(fù)提取3～8次，每次提取1～5h，過(guò)濾后合并提取液，將得到的提取液在30～70℃、真空度-0.03～-0.09MPa下減壓蒸餾回收醇溶劑，使濾液的醇濃度降至10％以下，經(jīng)離心、過(guò)濾，得到山竹果皮花色苷浸提液；(2)大孔樹脂分離花色苷XAD-7大孔樹脂用乙醇/水充分清洗預(yù)處理后裝柱，將山竹果皮花色苷浸提液上樣到樹脂柱，在溫度為5～50℃、流速為0.5～3BV/h條件下，緩慢在大孔樹脂柱上進(jìn)行花色苷的吸附，結(jié)束后，用2～5倍柱體積的蒸餾水洗脫未結(jié)合的雜質(zhì)，保持色素物質(zhì)，此時(shí)樹脂柱顏色深紅紫色，在溫度為5～50℃、流速為0.5～3BV/h條件下，用30～100％乙醇洗脫大孔樹脂上的花色苷，至樹脂柱變?yōu)闊o(wú)色，收集洗脫液，在30～70℃、真空度-0.03～-0.09MPa下減壓蒸餾回收醇溶劑，濃縮液冷凍干燥后得到山竹果皮花色苷成分，呈現(xiàn)紫紅色粉末狀。
2.按權(quán)利要求1的方法提取的山竹果皮花色苷，其特征在于其為具有吸濕性的呈紫 紅色粉末狀物質(zhì)，色苷含量到達(dá)60-95 %，水溶性好，易容于甲醇，微溶于三氯甲烷，不溶于 甲苯、乙醚、石油醚；在可見光區(qū)最大吸收波長(zhǎng)為532nm;水溶液呈現(xiàn)的顏色，隨溶液從酸到 堿，而呈現(xiàn)由深紫紅一深紅一淺紅一淺黃一深黃的變化。
3.山竹果皮花色苷在制備針對(duì)P-選擇素靶點(diǎn)的抗炎藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于天然藥物化學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及到一種天然抗炎藥物分子的分離提取及其應(yīng)用。本發(fā)明利用酸性乙醇提取，減壓濃縮，加水溶解加樣到XAD-7大孔樹脂中，洗脫，收集濃縮，凍干等方法，提取山竹果皮花色苷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明尾靜脈注射山竹果皮花色苷后能夠有效抑制小鼠腹腔液中性粒細(xì)胞滲出，在劑量為0.01、0.1、1mg/ml時(shí)，抑制率分別達(dá)到了34％、77％、94％。利用體外模擬毛細(xì)血管的層流實(shí)驗(yàn)，表明0.01、0.1、1mg/ml劑量的山竹果皮花色苷在層流條件下對(duì)中性粒細(xì)胞的粘附抑制率分別達(dá)到45％、71％、89％。確證了山竹果皮花色苷的抗炎活性，山竹果皮花色苷作為新型抗炎藥物有著良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P29/00GK101816687SQ20101013239
公開日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者佟海濱, 曾憲錄 申請(qǐng)人:東北師范大學(xué)