專利名稱：：片葉苔素d在制備抗腫瘤藥物和抗腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及片葉苔素D的一種新用途，尤其涉及其在制備抗腫瘤藥物和抗腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：腫瘤，是目前嚴(yán)重危害人類健康和生活質(zhì)量的一類疾病，抗腫瘤藥物的發(fā)現(xiàn)與研制一直是藥物研究人員們的工作重點(diǎn)與熱點(diǎn)。目前我國(guó)患腫瘤人數(shù)眾多，每年死于腫瘤的人數(shù)超過160萬。在近二十年來，我國(guó)腫瘤死亡率上升了29.42%。在3559歲的中壯年人群中，腫瘤列居各類死因之首，已成為造成我國(guó)最佳勞動(dòng)力損失的重要原因。因此開發(fā)和研制新型抗腫瘤藥物是一件具有極其重要意義的工作。我國(guó)現(xiàn)已批準(zhǔn)上市的抗腫瘤藥物大約有200多種，但隨著腫瘤化療藥物的廣泛應(yīng)用，腫瘤的多藥耐藥性問題越來越突出，已成為腫瘤化療失敗最常見而又最難解決的問題之一，據(jù)估計(jì)90%以上的腫瘤患者死于不同程度的耐藥。腫瘤的多藥耐藥性(multipledrugresistance,MDR)是指腫瘤細(xì)胞接觸某種抗腫瘤藥物后，不僅對(duì)該藥物產(chǎn)生耐藥性，而且對(duì)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的多種抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥，從而大大降低了抗腫瘤藥物的療效。因此發(fā)現(xiàn)和研究新型多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑同樣具有非常重要而又深遠(yuǎn)的意義。天然產(chǎn)物一直是抗腫瘤藥物的重要來源之一，如紫杉醇，長(zhǎng)春新堿等。片葉苔素D是從干地錢(MarchantiapolymorpaL.)中分離得到的環(huán)狀雙聯(lián)節(jié)類化合物，呈無色塊狀結(jié)晶，分子式為(:28112404，分子量為424，熔點(diǎn)為194-196t:，易溶于氯仿、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑中，結(jié)構(gòu)式如下OH目前，在檢索的諸多報(bào)道中，未見有片葉苔素D在抗腫瘤和腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)方面的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了片葉苔素D的一種新用途，即片葉苔素D在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，和在制備抗腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)藥物中的應(yīng)用。以片葉苔素D進(jìn)行對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I(Topol)和拓?fù)洚悩?gòu)酶II(TopoII)活性的測(cè)定，片葉苔素D可以選擇性地抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶11的活性。T0P0II有TopolIa和TopolIP兩種亞型，腫瘤組織內(nèi)TopoIIa高表達(dá)，臨床上已逐漸以TopoIIa表達(dá)水平高低來判斷腫瘤的增殖程度。TopoII13與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系目前還不太明確。實(shí)驗(yàn)顯示片葉苔素D10iiM，20iiM，30iiM可分別降低TopolIa基因表達(dá)40%，51%，52%。取慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562及其耐藥株K562/A02，2X104/孔接種于96孔板中，分別加入不同濃度的阿霉素和較低濃度(2、4和8iig/ml)的片葉苔素D，培養(yǎng)48h。以MTT法測(cè)定加入片葉苔素D后，阿霉素對(duì)耐藥細(xì)胞株K562/A02的抑制作用，結(jié)果表明8yg/ml片葉苔素D對(duì)腫瘤耐藥的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)達(dá)8.5。P-糖蛋白泵出實(shí)驗(yàn)表明片葉苔素D會(huì)對(duì)P-糖蛋白活性的產(chǎn)生抑制。由上述研究結(jié)果可知，片葉苔素D能夠抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II基因a亞型的表達(dá)，并且能夠選擇性的抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性，具有明顯的抗腫瘤作用，同時(shí)該化合物還可抑制P-糖蛋白，表現(xiàn)出較好的腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)活性，是一種非常具有開發(fā)前景的化療藥物，可以以其為主成分制備抗腫瘤口服制劑、注射劑，多藥耐藥逆轉(zhuǎn)口服制劑、注射劑等。圖1為瓊脂糖凝膠電泳示意圖(拓?fù)洚悩?gòu)酶I);圖2為瓊脂糖凝膠電泳示意圖(拓?fù)洚悩?gòu)酶II);圖3為片葉苔素D對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶II基因中a亞型表達(dá)的抑制作用示意圖；圖4為片葉苔素D對(duì)K562/A02細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用示意圖；圖5為K562/A02細(xì)胞中加入不同濃度的片葉苔素D后對(duì)羅丹明123熒光強(qiáng)度的影響示意圖；圖6為片葉苔素D對(duì)K562/A02細(xì)胞將羅丹明123泵出效果的影響示意圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明實(shí)施例1:片葉苔素D對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I(TopoI)和拓?fù)洚悩?gòu)酶II(TopoII)活性的測(cè)定(1)片葉苔素D的配成用分析天平秤取5mg片葉苔素D，加入DMSO(細(xì)胞培養(yǎng)級(jí))1179.24iU，得到10mM貯存液，保存于-20°C(臨用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋成所需濃度)。(2)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的提取收集K562細(xì)胞約1X108，以4。C預(yù)冷的PBS洗滌兩遍，加裂解液(20mMTris，ImMEGTA，25mMKCI，5mMMgCl2，250mM蔗糖，0.5%NP40，pH7.2)lml，4。C裂解10min，6000rpm離心2min，沉淀加50ii1核提取液(20mMTris，ImMEGTA，2mMEDTA，2mMDTT，400mMNaCl，pH7.2)吹打均勻，冰上孵育30min，14000rpm離心15min，小心吸取上清，以考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白含量，分裝后-2(TC保存。此提取液為同時(shí)含有Topol和TopoII粗酶溶液。(3)負(fù)超螺旋pBR322質(zhì)粒的提取pBR322轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli，于LB培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行抽提。(4)實(shí)驗(yàn)方法10ii1反應(yīng)體系包括10mMTris-HCl(pH7.9)，0.15MNaCl，lmMEDTA，O.lmM亞精胺，O.1%BSA，5%甘油，200ngpBR322DNA，含1UTOPOI酶(1U定義為在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下使200ngpBR322完全解旋的酶量)的酶粗提液及不同濃度的片葉苔素D。將此反應(yīng)液置于37。C水浴中溫育30min。加入5iU反應(yīng)終止液(50mMEDTA，50X甘油，0.25mg/ml溴酚蘭)終止反應(yīng)。在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳lh，O.5g/ml溴化乙錠溶液染色30min，260nm紫外燈下觀察結(jié)果。10ii1反應(yīng)體系包括50mMTris-HCl(pH8.0)，120mMKCl，O.5mMDTT，O.5mMATP，10mMMgCl2，30iig/mlBSA，200ngpBR322DNA，含1UTOPOII酶(1U定義為在標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)條件下使200ng負(fù)超螺旋pBR322完全解旋的酶量)的酶粗提液及不同濃度的片葉苔素D。將此反應(yīng)液置于37。C水浴中溫育30min。加入5iU反應(yīng)終止液(50mMEDTA，50X甘油，0.25mg/ml溴酚蘭)終止反應(yīng)。在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳lh，O.5g/ml溴化乙錠溶液染色30min，260nm紫外燈下觀察結(jié)果。(5)結(jié)果TOPOI在體外可使DNA雙鏈中的單鏈斷裂，使另一單鏈從缺口處穿過，從而可催化超螺旋的DNA松弛解旋。如圖1所示，泳道1是pBR322對(duì)照，其余泳道加入了1UTOPOI酶粗提液反應(yīng)；泳道2為加酶反應(yīng)后，超螺旋全部消失轉(zhuǎn)化為解旋DNA;泳道3-5是片葉苔素D對(duì)TOPOI介導(dǎo)的負(fù)超螺旋pBR322解旋作用的影響，可見200yM，400yM，800yMPLE都不能抑制TOPOI對(duì)pBR322的解旋作用。TOPOII在體外利用ATP提供能量，切斷雙鏈DNA形成DNA-酶復(fù)合物，引起單鏈或雙鏈DNA的解旋斷裂。如圖2所示，泳道1是負(fù)超螺旋pBR322對(duì)照，其余泳道加入1UTOPOII酶粗提液反應(yīng)；泳道2為超螺旋全部消失轉(zhuǎn)化為解旋DNA;泳道3-8為片葉苔素D對(duì)TOPOII介導(dǎo)的負(fù)超螺旋pBR322解旋作用的影響，當(dāng)片葉苔素D的濃度達(dá)到200yM時(shí)可抑制TOPOII的活性從而出現(xiàn)負(fù)超螺旋DNA條帶，400yM，800yM片葉苔素D具有同樣作用，片葉苔素D100iiM，50iiM，25iiM對(duì)T0P0II無抑制活性。(6)結(jié)論上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明片葉苔素D可以選擇性地抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性。實(shí)施例2:實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)片葉苔素D對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IIa亞型(TopoIIa)的抑制作用(l)RNA提取a.細(xì)胞處理分別取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞K562接種于6孔板，細(xì)胞數(shù)2X105個(gè)/孑L同時(shí)加入不同濃度片葉苔素D，終濃度分別為10，20，30iiM。置37°〇，5%0)2孵箱中培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞至1.5mlEp管中，PBS洗滌兩次，3000rpmX5min。b.總RNA提取取上述沉淀加入0.5mlTrizol充分混勻后，加入100ii1氯仿，上下顛倒數(shù)次混勻，室溫5min。4"離心，12000GX15min。然后小心吸取上層含總RNA的水相至一新的DEPC處理過的Ep管中，切忌吸入中間層任何物質(zhì)。lmlTrizol可吸取約400y1上清。c.醇沉RNA:按所吸取的上層水相量加入等體積異丙醇，上下顛倒數(shù)次混勻，靜置10min，4t:離心，10000GX10min，在管底可見凝膠樣透明RNA沉淀，小心棄去上清液。d.溶解RNA:加入用DEPC水配制的75X乙醇lml，稍混勻，4。C離心，7500GX5min，小心棄取上清液，空氣干燥5-10min，加入30y1—50yl0.1%DEPC水溶解。e.RNA濃度測(cè)定取上述提取的總RNA溶液10，加入9900.1%DEPC水混勻，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定280nm及260nm處的吸光值，計(jì)算A260/A280比值及總RNA的濃度。所有試驗(yàn)樣品要求比值在1.82.0之間，以保證提取RNA的純度。[OO38](2)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA反應(yīng)a.取所提取RNA2iig，加入Oliog-dt引物1，補(bǔ)ddH20至12。b.65t:反應(yīng)5min，快速冰浴2min，點(diǎn)動(dòng)離心，將所有溶液收集到管底。依次加入下列試劑后混勻。5XRTbuffer4ii1dNTPMix(10mM)2ii1RNaseinhibitor(10U/u1)lulReverTraAce1li142t:反應(yīng)2min，99t:反應(yīng)5min，4t:反應(yīng)5min，點(diǎn)動(dòng)離心，RT產(chǎn)物存于-8(TC備用。(3)實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)a.實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系建立在20ii1反應(yīng)體系中，SYBRGreenRealtimePCRMasterMix10ul，引物8ul，上述RT產(chǎn)物2ul。b.實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件95。C預(yù)變性3min;95。C變性25s，60。C退火20s，經(jīng)45個(gè)循環(huán)；72。C延伸30s。c.引物序列T0P0II-aF:5'—TGACAGTGAAGAAGACAGC—3，R:5'-GAGAGACACCAGAATTCAA—3，；MdrlF:5'-AGACATGACCAGGTATGCCTAT-3R:5'-AGCCTATCTCCTGTCGCATTA-3，；P-actinF:5'—TTGCCGACAGGATGCAGAAGGA—3R:5，-AGGTGGACAGCGAGGCCAGGAT-3';(4)結(jié)果TOPOII有TopoIIa和TopoIIP兩種亞型，腫瘤組織內(nèi)TopoIIa高表達(dá)，臨床上已逐漸以TopoIIa表達(dá)水平高低來判斷腫瘤的增殖程度。TopoIiP與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系目前還不太明確。本實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)片葉苔素D對(duì)TopoIIa基因表達(dá)的影響。由圖3可見，片葉苔素D10iiM，20iiM，30iiM可分別降低TopoIIa基因表達(dá)40%，51%，52%，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白對(duì)照比較，*P<0.05，**P<0.01。實(shí)施例3:片葉苔素D對(duì)K562/A02細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用方法MTT法取慢性粒細(xì)胞白血病耐藥細(xì)胞株K562/A02，2XIOV孔細(xì)胞接種于96孔板中，分別加入0.4%匿SO和不同濃度的片葉苔素D，培養(yǎng)24、48和72h后，每孔加入5mg/mlMTT20y1繼續(xù)孵育4h，離心并小心吸取上清液，加入200y1匿SO并輕微振蕩，使生成的甲臜完全溶解顯色后，用Bio-RadModel550MicroplateReader以570nm波長(zhǎng)測(cè)OD值。實(shí)驗(yàn)在不同培養(yǎng)時(shí)間條件下分別進(jìn)行3次，算出平均值。結(jié)果如圖4所示，由圖可知，片葉苔素D在2至10g/ml條件下分別培養(yǎng)24、48和72h對(duì)K562/A02細(xì)胞沒有明顯的抑制作用。實(shí)施例4:片葉苔素D的腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)作用方法取慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562及其耐藥株K562/A02，2X104/孔接種于96孔板中，分別加入不同濃度的阿霉素和較低濃度(2、4和8iig/ml)的片葉苔素D，培養(yǎng)48h。以MTT法測(cè)定加入片葉苔素D后，阿霉素對(duì)耐藥細(xì)胞株K562/A02的抑制作用。實(shí)驗(yàn)在不同培養(yǎng)時(shí)間條件下分別進(jìn)行3次，算出平均值。按下式計(jì)算抑制率抑制率(％)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均0D值/對(duì)照組平均0D值)X100%。用Bliss軟件精細(xì)計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)50%的阿霉素的濃度，以IC50表示。按下式計(jì)算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=單獨(dú)使用阿霉素的IC50/與片葉苔素D聯(lián)用時(shí)阿霉素的IC50。結(jié)果如表l所示。表1.與片葉苔素D聯(lián)用后阿霉素對(duì)耐藥細(xì)胞株K562/A02的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>結(jié)論由表1可以看出片葉苔素D在濃度為8iig/ml條件下，能夠明顯逆轉(zhuǎn)K562/A02對(duì)阿霉素的耐藥，其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(RF)為8.50，較第一代耐藥逆轉(zhuǎn)劑維拉帕米(RF=2.50)有顯著提高。實(shí)施例5:片葉苔素D對(duì)P-糖蛋白活性的抑制作用方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人慢性髓細(xì)胞樣白血病細(xì)胞K562及其耐藥株K562/A02，各以2X105/ml接種于6孔板中，分別加入濃度為0，2，4和8iig/ml的片葉苔素D孵育lh，然后加入濃度為5iiM的羅丹明123(Rhl23)37。C孵育lh，細(xì)胞再用冷PBS洗兩遍。FACScan用488nm激發(fā)光測(cè)定熒光強(qiáng)度，并設(shè)不加片葉苔素D的為對(duì)照組。結(jié)果如圖5所示，由圖5可以看出，K562細(xì)胞中羅丹明123的熒光強(qiáng)度不受片葉苔素D的影響，但K562/A02細(xì)胞中羅丹明123的熒光強(qiáng)度與片葉苔素D的濃度成正相關(guān)，說明片葉苔素D會(huì)對(duì)P-糖蛋白活性的產(chǎn)生抑制。實(shí)施例6:P-糖蛋白泵出實(shí)驗(yàn)方法K562/A02以2X105/ml接種于6孔板中，加入濃度5yM的羅丹明123培養(yǎng)90分鐘，然后棄去培養(yǎng)基，并用不含羅丹明的培養(yǎng)基沖洗3遍，然后在37t:條件下與濃度為8Pg/ml的片葉苔素D分別培養(yǎng)15、30、45、60和90分鐘，并設(shè)不加片葉苔素D的為對(duì)照組。結(jié)果如圖6所示，圖中，參代表K562細(xì)胞空白對(duì)照組的羅丹明123熒光強(qiáng)度O代表代表K562/A02細(xì)胞空白對(duì)照組的羅丹明123熒光強(qiáng)度A代表K562/A02細(xì)胞加入8yg/ml片葉苔素D后羅丹明123熒光強(qiáng)度B代表K562/A02細(xì)胞加入8yg/ml維拉帕米后羅丹明123熒光強(qiáng)度由圖可以看出，K562/A02細(xì)胞中加入片葉苔素D后，細(xì)胞中羅丹明123的熒光強(qiáng)度較不加藥時(shí)有明顯提高，且熒光強(qiáng)度高于對(duì)照藥品維拉帕米，說明片葉苔素D對(duì)羅丹明123的泵出有明顯抑制作用。權(quán)利要求片葉苔素D在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。2.片葉苔素D在制備抗腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)藥物中的應(yīng)用。3.片葉苔素D在制備抗腫瘤口服制劑、注射劑和多藥耐藥逆轉(zhuǎn)藥物口服制劑、注射劑中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了提供了片葉苔素D的一種新用途，即片葉苔素D在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，和在制備抗腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)藥物中的應(yīng)用。經(jīng)研究結(jié)果得知，片葉苔素D能夠抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II基因α亞型的表達(dá)，并且能夠選擇性的抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性，具有明顯的抗腫瘤作用，同時(shí)該化合物還可抑制P-糖蛋白，表現(xiàn)出較好的腫瘤多藥耐藥逆轉(zhuǎn)活性，是一種非常具有開發(fā)前景的化療藥物，可以以其為主成分制備抗腫瘤口服制劑、注射劑，多藥耐藥逆轉(zhuǎn)口服制劑、注射劑等。文檔編號(hào)A61K31/335GK101780068SQ20101013294公開日2010年7月21日申請(qǐng)日期2010年3月26日優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日發(fā)明者婁紅祥,孫斌,李霞,沈濤,范培紅,薛霞申請(qǐng)人:山東大學(xué)