專(zhuān)利名稱(chēng)：：Pedf基因plga納米復(fù)合物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及PEDF基因PLGA納米復(fù)合物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
：色素上皮衍生因子(pigmentepithelium-derivedfactor,PEDF)是目前已知最強(qiáng)的抗血管生成抑制劑，抑制血管生成的效果是血管他丁(angiostatin)的2倍，是內(nèi)皮他丁(endostatin)的7倍多；而且對(duì)生理性血管生成及增殖沒(méi)有明顯抑制作用，安全性較好。PEDF是一種在全身廣泛表達(dá)的分子量為50KD(千道爾頓)的分泌型糖蛋白，對(duì)肺癌、肝癌、黑色素瘤、骨肉瘤等多種腫瘤都有較好的治療作用。PEDF主要通過(guò)抑制腫瘤血管生成發(fā)揮其抗癌活性，此外還可通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化成熟、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移等多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，PEDF用于腫瘤治療的臨床應(yīng)用還面臨許多困難，因?yàn)樗饕獜牟溉閯?dòng)物細(xì)胞如HEK293細(xì)胞中獲得，價(jià)格昂貴，且體內(nèi)用量高達(dá)毫克級(jí)，臨床上難以大規(guī)模應(yīng)用。直接用PEDF基因進(jìn)行治療，具有用藥劑量小的優(yōu)點(diǎn)，是目前PEDF用于腫瘤臨床治療極具前景的給藥模式。目前，用于傳遞PEDF基因的載體報(bào)道的有逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、慢病毒、質(zhì)粒、陽(yáng)離子脂質(zhì)體、殼聚糖微球6種。逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和慢病毒這幾種病毒載體存在免疫原性、潛在的感染性及靶向性差等技術(shù)缺陷。質(zhì)粒具有簡(jiǎn)便、安全、價(jià)廉的特點(diǎn)，而且可以攜帶較大劑量的DNA，但由于體內(nèi)核酸酶等對(duì)裸DNA的降解作用，基因表達(dá)的時(shí)間很短，無(wú)法臨床應(yīng)用；陽(yáng)離子脂質(zhì)體是目前應(yīng)用較為廣泛的基因轉(zhuǎn)染載體，具有基因?qū)胄矢叩膬?yōu)點(diǎn)；殼聚糖也是一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的基因轉(zhuǎn)染載體，但是目前報(bào)道的載PEDF基因的載體是殼聚糖微球，存在粒徑較大，存在細(xì)胞攝取效率低的技術(shù)缺陷。乳酸/羥基乙酸共聚物(p0ly(D，L-laCtide-C0-glyC0lide)，PLGA)是一種具有優(yōu)良的生物相容性和可生物降解的聚合物，經(jīng)FDA批準(zhǔn)可用作醫(yī)學(xué)手術(shù)縫合線和注射用微膠囊，微球及埋植劑等制劑的材料；在體內(nèi)代謝最終產(chǎn)物是0)2和吐0，中間產(chǎn)物乳酸也是體內(nèi)正常糖代謝產(chǎn)物，因此不會(huì)在體內(nèi)形成聚積或產(chǎn)生毒性。PLGA納米復(fù)合物表面通常呈電中性或負(fù)電性，可以減少其在血液循環(huán)中與血漿蛋白、調(diào)理素等的結(jié)合，增加到達(dá)病變部位的機(jī)會(huì)，提高治療效果。PLGA納米復(fù)合物具有快速的內(nèi)吞體_溶酶體逃逸性能，能保護(hù)基因不被溶酶體降解，從而增加基因的轉(zhuǎn)染效率。此外，PLGA納米復(fù)合物還具有緩釋長(zhǎng)效的特點(diǎn)，作為基因載體，可以減少給藥劑量，降低治療費(fèi)用；也可減少給藥次數(shù)，增加病人的順應(yīng)性。迄今為止未見(jiàn)以PLGA納米復(fù)合物作為PEDF基因載體的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種抗癌治療效果好、毒副作用小的PEDF基因PLGA納米復(fù)合物。由于體內(nèi)核酸酶等對(duì)裸DNA的降解作用，基因表達(dá)的時(shí)間很短，鑒于質(zhì)粒具有簡(jiǎn)便、安全、價(jià)廉的特點(diǎn)，而且可以攜帶較大劑量的DNA，故本發(fā)明納米復(fù)合物采用質(zhì)粒作為PEDF基因的載體。該納米復(fù)合物是以載有PEDF基因的重組質(zhì)粒為原料，與PLGA形成的納米復(fù)合物；載有PEDF基因的重組質(zhì)粒與PLGA的質(zhì)量比為0.510100。進(jìn)一步地，根據(jù)包封率優(yōu)選載有PEDF基因的重組質(zhì)粒與PLGA的質(zhì)量比為0.56100。為了降低免疫原性并攜帶較大劑量的PEDF基因，使其持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，選擇PAAV2、pGenesil2.1、pGenesil2.4三種質(zhì)粒作為PEDF基因的載體，即載有PEDF基因的重組質(zhì)粒為pAAV2-PEDF重組質(zhì)粒、pGenesil2.I-PEDF重組質(zhì)?；騪Genesil2.4-PEDF重組質(zhì)粒中的一種。本發(fā)明還提供了該納米復(fù)合物的制備方法，具體地，它是由如下方法制備A、取PEDF基因，以PAAV2為載體制成PAAV2-PEDF重組質(zhì)粒，或以pGenesil2.1為載體制成pGenesil2.I-PEDF重組質(zhì)粒，或以pGenesil2.4為載體制成pGenesil2.4-PEDF重組質(zhì)粒；B、將步驟A所述的任意一種載有PEDF基因的重組質(zhì)粒與縮合物混合，得質(zhì)粒復(fù)合物；C、取PLGA，用氯仿-丙酮溶液溶解，得PLGA氯仿-丙酮溶液；D、混合PLGA氯仿-丙酮溶液和質(zhì)粒復(fù)合物，以單乳法或復(fù)乳法制成納米復(fù)合物；其中，具體使用的縮合物為PLL、魚(yú)精蛋白、精氨酸、PEG、Ca2+中的任意一種或幾種。在制備縮合物時(shí)，載有PEDF基因的重組質(zhì)粒投料的初始濃度為0.55mg/ml；載有PEDF基因的重組質(zhì)粒與縮合物的重量配比為10.520。步驟C所述PLGA分子量為10IOOkD(千道爾頓)，通過(guò)篩選，選取氯仿-丙酮溶液作為PLGA的溶劑，氯仿-丙酮溶液中丙酮與氯仿體積比為0.121;所得PLGA氯仿_丙酮溶液中PLGA濃度為5200mg/ml。步驟D中所述單乳法是由如下步驟完成a、在PLGA氯仿-丙酮溶液中加入質(zhì)粒復(fù)合物；b、加入表面活性劑溶液，超聲；C、除盡有機(jī)溶劑，即得納米復(fù)合物。步驟D中所述復(fù)乳法是由如下步驟完成a、在PLGA氯仿-丙酮溶液中加入質(zhì)粒復(fù)合物；b、超聲，形成初乳，再加入表面活性劑溶液中，超聲；C、除盡有機(jī)溶劑，即得納米復(fù)合物。為除去有機(jī)溶劑，可采用水浴減壓旋蒸的方式，水浴溫度范圍可控制在2550"C。單乳法和復(fù)乳法中采用的表面活性劑為F68、PVA、TPGS中的任意一種；其中，PVA分子量為20，00070，000道爾頓，PVA使用時(shí)配制成濃度為0.5%6%的溶液(即IOOml溶液中含有0.56g的PVA)；F68使用時(shí)配制成濃度為0.3%的溶液(即IOOml溶液中含有0.13g的F68)；TPGS使用時(shí)配制成濃度為0.5%5%的溶液(即IOOml溶液中含有0.55g的TPGS)。或表面活性劑為F68、PVA、TPGS中至少兩種的混合物，PVA分子量為2000070000道爾頓、PVA使用時(shí)配制成濃度為0%6%的溶液，F(xiàn)68使用時(shí)配制成濃度為0%3%的溶液，TPGS使用時(shí)配制成濃度為0%5%的溶液；兩兩混合時(shí)，第三種為0%；三者混合時(shí)，三者均不取0%。單乳法中水相與油相體積比為1101；復(fù)乳法中初乳油相與水相體積比1201，復(fù)乳水相與油相水相體積比1201。超聲條件為超聲時(shí)間為IOs5min，超聲功率為IOW200W。采用上述方法制備而得的納米復(fù)合物粒徑較小，粒徑分布均勻。本發(fā)明還提供了PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的新用途，即其在制備治療抗腫瘤的藥物中的用途。綜上，本發(fā)明提供的納米復(fù)合物制備方法制得的PEDF基因PLGA納米復(fù)合物，包封率高達(dá)60%，制得的納米復(fù)合物粒徑較小，粒徑分布均勻，工藝重現(xiàn)性好。應(yīng)用本發(fā)明納米復(fù)合物還可以克服了現(xiàn)有病毒類(lèi)載體、脂質(zhì)體和殼聚糖載體的毒副作用；且抑制癌細(xì)胞增長(zhǎng)效果明顯，為臨床治療癌癥，有效應(yīng)用PEDF基因提供了一種新的選擇。圖1為重組質(zhì)粒與PLGA質(zhì)量篩選圖。圖2為pAAV2-PEDF重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。圖3為pGenesil2.I-PEDF重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。圖4為pGenesil2.4-PEDF重組質(zhì)粒。圖5為PLGA分子量篩選圖。圖6為丙酮-氯仿比例篩選圖。圖7為PLGA濃度篩選圖。圖8為水浴溫度篩選圖。圖9為PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的粒徑分布圖，size=185。圖10為PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的zeta電位分布圖zetapotential=-6.32mV。圖11為PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的透射電鏡照片圖。圖12為PEDF基因PLGA納米復(fù)合物誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26凋亡率對(duì)比圖。圖13為PEDF基因PLGA納米復(fù)合物體外抑制HUVEC增殖活性對(duì)比圖。圖14為CT26腫瘤體積生長(zhǎng)曲線。圖15為L(zhǎng)ewis肺癌體積生長(zhǎng)曲線。圖16為PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的體外基因釋放特性。具體實(shí)施例方式以下通過(guò)對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式的描述說(shuō)明但不限制本發(fā)明。本發(fā)明提供的技術(shù)方案為以以載有PEDF基因的重組質(zhì)粒為原料，與PLGA形成的納米復(fù)合物，該納米復(fù)合物毒副作用小。單因素實(shí)驗(yàn)表明載有PEDF基因的重組質(zhì)粒與PLGA的比例會(huì)影響包封率，質(zhì)量比為0.510100時(shí)包封率較高，優(yōu)選質(zhì)量比為0.56100，篩選依據(jù)見(jiàn)圖1當(dāng)質(zhì)量比為0.510100時(shí)，包封率至少大于60%，一般都高于85%；而當(dāng)質(zhì)量比為0.56100時(shí)，包封率至少大于85%，甚至高達(dá)99%。為了降低免疫原性并攜帶較大劑量的PEDF基因，使其持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，選擇PAAV2、pGenesil2.l、pGenesil2.4三種質(zhì)粒作為載體，即載有PEDF基因的重組質(zhì)粒為pAAV2_PEDF重組質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2)、pGenesil2.I-PEDF重組質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3)或pGenesil2.4-PEDF重組質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4)。本發(fā)明納米復(fù)合物是由如下方法制備A、取PEDF基因，制成載有PEDF基因的重組質(zhì)粒；B、將步驟A所述的載有PEDF基因的重組質(zhì)粒與縮合物混合，得質(zhì)粒復(fù)合物；C、取PLGA，用氯仿-丙酮溶液溶解，得PLGA氯仿-丙酮溶液；D、混合PLGA氯仿-丙酮溶液和質(zhì)粒復(fù)合物，以單乳法或復(fù)乳法制成納米復(fù)合物；其中，步驟A中所述取PEDF基因，制成載有PEDF基因的重組質(zhì)粒的方法為a、選用pAAV2、pGenesil或pGenesil2.4作為載體，根據(jù)PEDF基因序列設(shè)計(jì)引物，選用適宜的酶酶切表達(dá)載體pAAV2、pGenesil或pGenesil〗.4，將擴(kuò)增后經(jīng)適宜的酶酶切純化后的PEDF基因cDNA片段與線性化的pAAV2、pGenesil或pGenesil2.4用DNA連接酶連接，即得pAAV2-PEDF重組質(zhì)粒、pGenesil2.I-PEDF重組質(zhì)?；騪Genesil2.4-PEDF重組質(zhì)粒；b、再將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，擴(kuò)增培養(yǎng)后，用高純度大量質(zhì)粒抽提試劑盒提取純化PAAV2-PEDF重組質(zhì)粒、pGenesil2.I-PEDF重組質(zhì)粒或pGenesil2.4-PEDF重組質(zhì)粒。步驟B中，將載有PEDF基因的重組質(zhì)粒與縮合物混合的目的是濃縮基因，使基因伸展的雙鏈變成緊縮狀，從而粒徑變小才能被PLGA納米復(fù)合物高效的包裹。若不濃縮，則包封率很低，影響臨床使用。選擇PLL、魚(yú)精蛋白、精氨酸、PEG、Ca2+等縮合物是因其能以最小的用量濃縮基因，并且濃縮后得到的產(chǎn)物粒徑較小，易被PLGA納米復(fù)合物包裹。此外，采用上述縮合物，最后得到的PEDF基因PLGA納米復(fù)合物基因轉(zhuǎn)染效率較高。本發(fā)明采用的縮合物中PLL的分子量為1000080000道爾頓，使用時(shí)配制成濃度為0.55mg/ml的溶液；所述的魚(yú)精蛋白使用時(shí)配制成濃度為0.510mg/ml的溶液；所述的精氨酸使用時(shí)配制成濃度為0.550mg/ml的溶液；所述的PEG使用時(shí)配制成濃度為0.520mg/ml的溶液；所述的Ca2+使用時(shí)配制成濃度為120mM的溶液。在制備縮合物時(shí)，載有PEDF基因的重組質(zhì)粒投料的初始濃度為0.55mg/ml。載有PEDF基因的重組質(zhì)粒與縮合物的重量配比為10.520。步驟C所述PLGA分子量為10lOOkD，篩選依據(jù)見(jiàn)圖5；氯仿-丙酮溶液中丙酮與氯仿體積比為0.121，篩選依據(jù)見(jiàn)圖6;所得PLGA氯仿-丙酮溶液中PLGA濃度為5200mg/ml，篩選依據(jù)見(jiàn)圖7。PLGA可以溶于乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯甲烷-丙酮溶液和氯仿中，單因素實(shí)驗(yàn)比較了乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯甲烷-丙酮溶液、氯仿、氯仿_丙酮溶液這5種溶劑，最后發(fā)現(xiàn)以乙酸乙酯作為溶劑，不能制得納米復(fù)合物，二氯甲烷、二氯甲烷-丙酮溶液和氯仿三種溶劑制得的納米復(fù)合物粒徑高達(dá)500nm左右，通過(guò)優(yōu)化其他工藝參數(shù)亦不能減小粒徑，因此，最后選擇氯仿_丙酮溶液作為PLGA的溶劑，并進(jìn)一步確定丙酮-氯仿最佳體積比0.10.51。單乳法中水相與油相體積比為1101；所述的復(fù)乳法中初乳油相與水相體積比1201，復(fù)乳水相與油相水相體積比1201。采用的表面活性劑為F68、PVA,TPGS中的至少一種。單乳法和復(fù)乳法中以水浴減壓旋蒸的方式除去有機(jī)溶劑時(shí)，水浴溫度范圍可控制在2550°C，選擇依據(jù)見(jiàn)圖8。通過(guò)上述方法制得的PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的平均粒徑為208nm士52nm，粒徑較小，且從標(biāo)準(zhǔn)偏差52nm，由此可以看出納米復(fù)合物的制備工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性好；多分散系數(shù)(polydispersityindex,PDI)為0.12士0.05，說(shuō)明所制得的納米復(fù)合物粒徑分布均勻；zeta電位為-8.12士2.38，呈弱負(fù)電性，不會(huì)非選擇性地與正常細(xì)胞吸附；透射電鏡照片顯示納米復(fù)合物表面圓整、光滑，粒度均勻。以下通過(guò)實(shí)施例及實(shí)驗(yàn)例說(shuō)明本發(fā)明的有益效果。實(shí)施例1載有PEDF基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建、擴(kuò)增和提取純化(1)pAAV2-PEDF重組質(zhì)粒的構(gòu)建工序如下通過(guò)PCR技術(shù)從質(zhì)粒pBLAST49_hPEDF上克隆人的全長(zhǎng)PEDF基因cDNA片段，根據(jù)PEDF基因序列設(shè)計(jì)引物，上游5'GGAATTCATGCAGGCCCTGGTGCTACTC3'；下游5'ACGCGTCGACTTAGGGGCCCCTGGGGTCCAG3'，此引物設(shè)計(jì)有EcoRI和SalI兩個(gè)酶切位點(diǎn)，分別在5'端和3'端。用EcoRI和SalI酶切表達(dá)載體pAAV2，將擴(kuò)增后經(jīng)EcoRI和SalI酶切純化后的PEDF基因cDNA片段與線性化的PAAV2用T4DNA連接酶連接，即得pAAV2_PEDF重組質(zhì)粒。再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，擴(kuò)增培養(yǎng)后，用高純度質(zhì)粒大量提取試劑盒提取純化PAAV2-PEDF重組質(zhì)粒。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，通過(guò)A260/A280的測(cè)定和瓊脂糖凝膠電泳分析pAAV2_PEDF的純度，制備的PAAV2-PEDF260/A280=1.82.O；同時(shí)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，無(wú)染色體DNA、蛋白質(zhì)及RNA污染，條帶整齊清晰。(2)參照上述方法，選用pGenesil或pGeneSil2.4作為載體，根據(jù)PEDF基因序列設(shè)計(jì)引物，選用適宜的酶酶切表達(dá)載體PGenesil或pGenesil2.4，將擴(kuò)增后經(jīng)適宜的酶酶切純化后的PEDF基因cDNA片段與線性化的pGenesil或pGenesil2.4用DNA連接酶連接，即得pGenesil2.I-PEDF重組質(zhì)?；騪Genesil2.4-PEDF重組質(zhì)粒。對(duì)比pAAV2_PEDF重組質(zhì)粒、pGenesil2.I-PEDF重組質(zhì)粒和pGenesil2.4-PEDF重組質(zhì)粒三種不同重組質(zhì)粒制備的納米復(fù)合物在粒徑、zeta電位、包封率及體外釋藥特性方面皆沒(méi)有顯著性差異。同時(shí)發(fā)明人用pAAV2-PEDF、pGenesil2.I-PEDF和pGenesil2.4-PEDF3種重組質(zhì)粒分別制備了PLGA納米復(fù)合物，預(yù)試驗(yàn)研究顯示，3種納米復(fù)合物在體外轉(zhuǎn)染效率及體內(nèi)抑瘤效果方面均沒(méi)有顯著性差異，故選擇了其中一種重組質(zhì)粒即PAAV2-PEDF進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)染效率、體內(nèi)抑瘤效果方面等研究。以下均是以PAAV2-PEDF重組質(zhì)粒制備的納米復(fù)合物進(jìn)行制劑學(xué)研究。實(shí)施例2PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的制備將pAAV2-PEDF重組質(zhì)粒與PLL(分子量為25kd)按15(質(zhì)量比)比例混合，形成縮合物后，再與40mg/ml的PLGA氯仿-丙酮溶液(10.l，v/v)按101(體積比)比例混合，80W超聲30s，制得初乳；將初乳與3%PVA(分子量為50kd)溶液按201(體積比)比例混合，300W超聲2min，制得復(fù)乳；室溫條件下磁力攪拌除盡有機(jī)溶劑，即得PEDF基因PLGA納米復(fù)合物膠體溶液(PEDF-PLGANP)，該溶液帶有淡藍(lán)色乳光、呈半透明。平行制備三批樣品，測(cè)定得到PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的平均粒徑為208nm士52nm，多分散系數(shù)(polydispersityindex,PDI)為0.12士0.05，粒徑分布圖見(jiàn)圖9;zeta電位為-8.12士2.38，分布圖見(jiàn)圖10，透射電鏡照片圖見(jiàn)圖11，包封率為98.25%士1.08%。以實(shí)施例2制備的納米復(fù)合物用于以下制劑學(xué)性質(zhì)研究。試驗(yàn)例IPEDF基因PLGA納米復(fù)合物體外誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26凋亡的作用取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的CT26細(xì)胞，胰酶消化后制成濃度為2X105/ml的細(xì)胞懸液，接種于六孔板，每孔加入2ml，使其均勻分布在孔內(nèi)，于37°C、5%CO2孵箱中繼續(xù)孵育24h。待細(xì)胞長(zhǎng)到約40-50%單層時(shí)，吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入Iml含有PEDF-PLGANP的雙無(wú)的1640培養(yǎng)基，PAAV2-PLGANP和NS作為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)48h后將上清液吸至流式管，6孔板中的細(xì)胞用胰酶消化后將其吸入流式管，離心，PBS洗細(xì)胞，棄上清后沉淀用于進(jìn)行流式分析，結(jié)果見(jiàn)圖12。結(jié)果表明PEDF基因PLGA納米復(fù)合物誘導(dǎo)的CT26細(xì)胞的凋亡率(c61.9%)明顯大于空載PLGA納米復(fù)合物組(b:15.2%)和生理鹽水組(a:13.2%)。試驗(yàn)例2PEDF基因PLGA納米復(fù)合物體外抑制臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)增殖作用為了驗(yàn)證PEDF基因PLGA納米復(fù)合物對(duì)血管生成的影響，選用HUVEC為模型細(xì)胞株，進(jìn)行增殖抑制實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)三組NS組生理鹽水組；PEDF-pAAV2-PLGANP組PEDF基因PLGA納米復(fù)合物組；pAAV2-PLGANP組載空質(zhì)粒的PLGA納米復(fù)合物組。并將納米復(fù)合物稀釋成12至164共6個(gè)濃度梯度，結(jié)果見(jiàn)圖13，可見(jiàn)PEDF基因PLGA納米復(fù)合物能顯著抑制HUVEC的增殖，且具有明顯濃度依賴(lài)性。試驗(yàn)例3PEDF基因PLGA納米復(fù)合物抑制小鼠結(jié)腸癌取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CT26細(xì)胞，按1X106/100μ1的濃度皮下接種BABL/C小鼠肋背部，待腫瘤長(zhǎng)至約3-5mm大小時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為3組NS組生理鹽水組；PEDF-pAAV2-PLGANP組PEDF基因PLGA納米復(fù)合物組；pAAV2-PLGANP組載空質(zhì)粒的PLGA納米復(fù)合物組。瘤內(nèi)注射，每周兩次，連續(xù)給藥8次，每三天測(cè)定腫瘤體積，考察腫瘤生長(zhǎng)曲線。結(jié)果見(jiàn)圖14。試驗(yàn)例4PEDF基因PLGA納米復(fù)合物抑制小鼠Lewis肺癌取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lewis肺癌細(xì)胞，按1X106/100μ1的濃度皮下接種C57小鼠肋背部，待腫瘤長(zhǎng)至約3-5mm大小時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為3組NS組生理鹽水組；PEDF-pAAV2-PLGANP組PEDF基因PLGA納米復(fù)合物組；pAAV2-PLGANP組載空質(zhì)粒的PLGA納米復(fù)合物組。瘤內(nèi)注射，每周兩次，連續(xù)給藥8次，每三天測(cè)定腫瘤體積，考察腫瘤生長(zhǎng)曲線。結(jié)果見(jiàn)圖15。試驗(yàn)例5PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的體外基因釋放特性從圖16可見(jiàn)，PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的體外基因釋放呈現(xiàn)顯著的緩釋特性，可使基因呈現(xiàn)較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá)，較少給藥次數(shù)，延長(zhǎng)給藥間隔，明顯增加患者用藥的順應(yīng)性，較目前已有的陽(yáng)離子脂質(zhì)體、殼聚糖納米復(fù)合物、PEI納米復(fù)合物等陽(yáng)離子載體等在緩釋方面具有明顯的優(yōu)越性。試驗(yàn)例6PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的毒性觀察選用健康昆明種小鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物，尾靜脈注射相同劑量的PEDF基因PLGA納米復(fù)合物、載PEDF基因的陽(yáng)離子脂質(zhì)體和殼聚糖納米復(fù)合物，每天給藥一次，連續(xù)給藥7天，觀察毒性反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表1。其中，PEDF基因PLGA納米復(fù)合物由實(shí)施例2制備，陽(yáng)離子脂質(zhì)體和殼聚糖納米復(fù)合物均是由PAAV2-PEDF重組質(zhì)粒制備。載PEDF基因的陽(yáng)離子脂質(zhì)體的具體制備方法為購(gòu)買(mǎi)商品化的陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectin(Invitrogen公司，英國(guó))，以脂質(zhì)體與pAAV2_PEDF重組質(zhì)粒質(zhì)量比51混合，即得。載PEDF基因的殼聚糖納米復(fù)合物制備采用文獻(xiàn)報(bào)道的經(jīng)典方法，具體制備工藝為先將殼聚糖溶于稀醋酸溶液中，攪拌條件下滴加多聚磷酸鈉水溶液至殼聚糖醋酸溶液中，當(dāng)出現(xiàn)乳光時(shí)，即制得殼聚糖的空白納米粒；然后將殼聚糖空白納米粒與PAAV2-PEDF重組質(zhì)粒質(zhì)量比51混合，即得。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>發(fā)明人將pAAV2-PEDF重組質(zhì)粒分別用陽(yáng)離子脂質(zhì)體、殼聚糖納米復(fù)合物、PLGA納米復(fù)合物分別包載，①體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)比較研究發(fā)現(xiàn)，載PEDF基因的陽(yáng)離子脂質(zhì)體和殼聚糖納米復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率較PLGA納米復(fù)合物略高，但空白陽(yáng)離子脂質(zhì)體和殼聚糖納米復(fù)合物載體對(duì)正常細(xì)胞的毒性較大，而空白PLGA納米復(fù)合物沒(méi)有任何毒性；②體內(nèi)荷瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的抑瘤效果明顯好于陽(yáng)離子脂質(zhì)體和殼聚糖納米復(fù)合物，且具有明顯的緩釋長(zhǎng)效特點(diǎn)，可以減少給藥劑量，降低治療費(fèi)用，也可減少給藥次數(shù)，增加病人的順應(yīng)性；③健康昆明種小鼠的毒性研究結(jié)果顯示，載PEDF基因的陽(yáng)離子脂質(zhì)體和殼聚糖納米復(fù)合物在注射時(shí)具有明顯的刺激性，小鼠掙扎明顯，且注射部位及可見(jiàn)血管皆呈現(xiàn)紫色斑塊，主要是這兩種載體本身表面荷正電，會(huì)在血管壁吸附所致，而PLGA納米復(fù)合物沒(méi)有任何刺激性；3次給藥后，載PEDF基因的陽(yáng)離子脂質(zhì)體和殼聚糖納米復(fù)合物組的小鼠精神狀態(tài)顯著下降，而PLGA納米復(fù)合物沒(méi)有任何改變，連續(xù)給藥2個(gè)月也未觀察到任何不良反應(yīng)。綜上，本發(fā)明PEDF基因PLGA納米復(fù)合物就刺激性、細(xì)胞毒性、用藥劑量、釋放周期等方面均優(yōu)于陽(yáng)離子脂質(zhì)體和殼聚糖納米復(fù)合物，為臨床安全、有效應(yīng)用PEDF基因提供了一種新的手段。權(quán)利要求PEDF基因PLGA納米復(fù)合物，其特征在于它是以載有PEDF基因的重組質(zhì)粒為原料，與PLGA形成的納米復(fù)合物；其中，載有PEDF基因的重組質(zhì)粒與PLGA的質(zhì)量比為0.5～10∶100。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PEDF基因PLGA納米復(fù)合物，其特征在于載有PEDF基因的重組質(zhì)粒與PLGA的質(zhì)量比為0.56100。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的PEDF基因PLGA納米復(fù)合物，其特征在于所述質(zhì)粒為pAAV2>pGenesil2.1gpGenesil2.4。4.權(quán)利要求3所述的PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于它是由如下方法制備A、取PEDF基因，以pAAV2為載體制成pAAV2_PEDF重組質(zhì)粒，或以pGenesil2.1為載體制成pGenesil2.I-PEDF重組質(zhì)粒，或以pGenesil2.4為載體制成pGenesil2.4-PEDF重組質(zhì)粒；B、將步驟A所述的任意一種載有PEDF基因的重組質(zhì)粒與縮合物混合，得質(zhì)粒復(fù)合物；C、取PLGA，用氯仿-丙酮溶液溶解，得PLGA氯仿-丙酮溶液；D、混合PLGA氯仿-丙酮溶液和質(zhì)粒復(fù)合物，以單乳法或復(fù)乳法制成納米復(fù)合物；其中，縮合物為PLL、魚(yú)精蛋白、精氨酸、PEG、Ca2+中的任意一種或幾種。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于步驟B所述任意一種載有PEDF基因的重組質(zhì)粒與縮合物的重量配比為10.520。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于所述的PLL的分子量為10，00080，000道爾頓，使用時(shí)配制成濃度為0.55mg/ml的溶液；所述的魚(yú)精蛋白使用時(shí)配制成濃度為0.510mg/ml的溶液；所述的精氨酸使用時(shí)配制成濃度為0.550mg/ml的溶液；所述的PEG使用時(shí)配制成濃度為0.520mg/ml的溶液；所述的Ca2+使用時(shí)配制成濃度為120mM的溶液。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于步驟C中PLGA分子量為10IOOkD,氯仿-丙酮溶液中丙酮與CH2Cl2體積比為0.121；所得PLGA氯仿-丙酮溶液中PLGA濃度為5200mg/ml。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于步驟D所述單乳法是由如下步驟完成a、在PLGA氯仿-丙酮溶液中加入質(zhì)粒復(fù)合物；b、加入表面活性劑溶液，超聲；C、除盡有機(jī)溶劑，即得納米復(fù)合物；步驟D所述復(fù)乳法是由如下步驟完成a、在PLGA氯仿-丙酮溶液中加入質(zhì)粒復(fù)合物；b、超聲，形成初乳，再加入表面活性劑溶液中，超聲；C、除盡有機(jī)溶劑，即得納米復(fù)合物。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于步驟b所述表面活性劑為F68、PVA、TPGS中的任意一種，其中，PVA分子量為2000070000道爾頓、PVA使用時(shí)配制成濃度為0.5%6%的溶液，F(xiàn)68使用時(shí)配制成濃度為0.3%的溶液，TPGS使用時(shí)配制成濃度為0.5%5%的溶液；或步驟b所述表面活性劑為F68、PVA、TPGS中至少兩種的混合物，其中，PVA分子量為2000070000道爾頓、PVA使用時(shí)配制成濃度為0%6%的溶液，F(xiàn)68使用時(shí)配制成濃度為0%3%的溶液，TPGS使用時(shí)配制成濃度為0%5%的溶液；兩兩混合時(shí)，第三種為0%；三者混合時(shí)，三者均不取0%。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的PEDF基因PLGA納米復(fù)合物的制備方法，其特征在于所述的單乳法中水相與油相體積比為1101;所述的復(fù)乳法中初乳油相與水相體積比1201，復(fù)乳水相與油相水相體積比1201。11.PEDF基因PLGA納米復(fù)合物在制備治療抗腫瘤的藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及PEDF基因PLGA納米復(fù)合物及其制備方法和用途，所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種具有抗癌治療效果好、毒副作用小的載PEDF基因的PLGA納米復(fù)合物，它是以載有PEDF基因的重組質(zhì)粒為原料，與載體PLGA的質(zhì)量比為0.5～10∶100。制備方法為A、將PEDF基因制成載有PEDF基因的重組質(zhì)粒；B、將該重組質(zhì)粒與縮合物混合，得質(zhì)粒復(fù)合物；C、取PLGA，用氯仿-丙酮溶液溶解，得PLGA氯仿-丙酮溶液；D、混合PLGA氯仿-丙酮溶液和質(zhì)粒復(fù)合物，制成納米復(fù)合物。可克服病毒類(lèi)載體、脂質(zhì)體和殼聚糖等載體的毒副作用；抑癌效果明顯，為臨床有效應(yīng)用PEDF基因提供了一種新的選擇。文檔編號(hào)A61K48/00GK101804209SQ201010136539公開(kāi)日2010年8月18日申請(qǐng)日期2010年3月31日優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日發(fā)明者宋相容,楊莉,魏于全申請(qǐng)人:四川大學(xué)