專利名稱：蚯蚓在制備趨化性細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及蚯蚓在制備趨化性細(xì)胞細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
中國(guó)民間有許多療效顯著的驗(yàn)方等待著人們?nèi)パ芯靠疾?，如民間經(jīng)常使用蚯蚓治療各種燙傷，方法如下挖適量蚯蚓，洗凈后置于容器內(nèi)，再將少許白糖灑在蚯蚓身上，蚯蚓遇見(jiàn)白糖，便融化成殷紅色液體，再將此液體涂于燙傷處，幾分鐘后，被燙傷部位的火辣辣的刺痛感就會(huì)消失，而燙傷部位的表面呈白色并帶有明顯的白糖顆粒狀，但感覺(jué)冰涼舒適。 每天涂數(shù)次，一星期后，基本能痊愈且不留疤痕。該方經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期使用，療效明顯。蚯蚓，藥名地龍，在中藥領(lǐng)域已經(jīng)有四千多年的利用史，具有清熱息風(fēng)、活血通絡(luò)、 消腫止痛的功效。長(zhǎng)期使用證明蚯蚓提取物對(duì)人體皮膚燒燙傷的部位能夠起到散熱、止痛、 消腫、解毒、生肌的作用，治療燙傷迅速而不留疤痕。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)蚯蚓的藥理作用和臨床效果不斷有新的進(jìn)展。如張鳳春等在新西蘭大白兔背部制作傷口模型，考察地龍?zhí)崛∫簩?duì)傷口愈合的影響， 結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組傷口的肉芽組織中含有更多的肌纖維母細(xì)胞，其內(nèi)有較多的肌動(dòng)蛋白、肌微絲和致密斑，傷口收縮明顯，修復(fù)較快，與對(duì)照組比較有顯著性差異。由此得出結(jié)論地龍可促進(jìn)肉芽組織中肌纖維母細(xì)胞增生，有利于傷口的收縮，對(duì)傷口的愈合有促進(jìn)作用。趨化性細(xì)胞因子對(duì)白細(xì)胞的趨化作用是炎癥發(fā)生過(guò)程中的重要起始步驟，也是機(jī)體防御和清除入侵病原體等異物先天性免疫功能的一個(gè)重要方面。受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞 ^達(dá)禾口分子(regulated uponactivation normal T cell expressed and secreted factor，RANTES)，是趨化性細(xì)胞因子cc家族的重要代表之一(CCU)。RANTES來(lái)源廣泛，可由CD8+T細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血小板等細(xì)胞表達(dá)和分泌，在免疫調(diào)節(jié)、炎癥、抗感染、自身免疫疾病等方面均有重要意義。它有多種生物學(xué)功能①對(duì)多種白細(xì)胞有趨化作用，可以募集特定的白細(xì)胞到達(dá)炎癥區(qū)域，執(zhí)行各自的功能，這種作用對(duì)防御感染和創(chuàng)傷修復(fù)非常有利。②RANTES可提高抗原特異性的抗體應(yīng)答，誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生。③RANTES 還可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。細(xì)胞因子檢測(cè)是判斷機(jī)體功能的一個(gè)重要指標(biāo)，在疾病的診斷、療效判斷及監(jiān)測(cè)方面有重要意義，研究細(xì)胞因子也有助于闡明分子水平的調(diào)節(jié)機(jī)制。生物芯片具有靈敏度高、特異性好、重復(fù)性佳、準(zhǔn)確性高、樣品用量少的優(yōu)點(diǎn)，可以快速而準(zhǔn)確地檢測(cè)樣本中多種生長(zhǎng)因子的表達(dá)情況，從而確定待測(cè)樣本中有關(guān)因子的表達(dá)變化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供。具體為，將蚯蚓用于制備趨化性細(xì)胞細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑。優(yōu)選的，趨化性細(xì)胞細(xì)胞因子為受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子。
3
蚯蚓包括鮮蚯蚓、蚯蚓分泌物和蚯蚓經(jīng)白糖處理的產(chǎn)物。趨化因子的主要作用是趨化吸引各白細(xì)胞亞群向創(chuàng)面轉(zhuǎn)移聚集。但在上皮再生和血管形成及組織重塑等過(guò)程中也起到了非常重要的作用。趨化因子可通過(guò)干預(yù)組織重塑而減少瘢痕的形成，提高預(yù)后質(zhì)量。目前，炎性細(xì)胞在創(chuàng)面愈合中的作用已得到公認(rèn)。燒(創(chuàng))傷發(fā)生后，趨化因子將各種炎性細(xì)胞招引到創(chuàng)面局部，發(fā)揮清創(chuàng)(吞噬變性壞死組織或衰老組織及微生物)和調(diào)節(jié)上皮再生、新生血管形成、細(xì)胞外基質(zhì)生成的作用，并參與組織重塑等。一方面，RANTES不僅可以誘導(dǎo)激活T細(xì)胞，還可作用于單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞在創(chuàng)面愈合中發(fā)揮作用。單核細(xì)胞在正常創(chuàng)面愈合過(guò)程中具有非常重要的作用，不僅有抗原呈遞和吞噬功能，還是生長(zhǎng)因子的重要來(lái)源。中性粒細(xì)胞可清除創(chuàng)面異物、入侵病原體、壞死組織等。另一方面，內(nèi)皮細(xì)胞在創(chuàng)面愈合過(guò)程中發(fā)揮了很大的作用。在接受一定的刺激后， 可表達(dá)多種趨化因子，其中就包括CC類中的RANTES。RANTES可以促進(jìn)損傷血管內(nèi)皮的修復(fù)，從而加快創(chuàng)面愈合。本發(fā)明利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，借助人血管生長(zhǎng)因子抗體芯片，檢測(cè)蚯蚓分泌物中多種生長(zhǎng)因子的表達(dá)情況。研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓白糖組、蚯蚓分泌物組和單獨(dú)蚯蚓組均可以誘導(dǎo)RANTES的表達(dá)，探尋到同蚯蚓治療燙傷相關(guān)的生長(zhǎng)因子，為闡明蚯蚓治療燙傷作用機(jī)制提供思路，在分子水平上闡明蚯蚓治療燙傷的作用機(jī)制，也為蚯蚓治療燙傷及傷口愈合等應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為利用現(xiàn)代技術(shù)對(duì)中醫(yī)藥民間驗(yàn)方進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供新的思路。


圖1為實(shí)施例1中，蚯蚓白糖組、蚯蚓分泌物組和單獨(dú)蚯蚓組的人血管生長(zhǎng)因子抗體芯片實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果
具體實(shí)施例方式藥品與試劑1、蚯蚓內(nèi)容物的提取取蚯蚓適量，洗凈后置于容器內(nèi)，按蚯蚓白糖=2 1的比例將白糖灑在蚯蚓身上，待蚯蚓融化成殷紅色液體后，收集液體。2、蚯蚓分泌物的收集取蚯蚓適量，洗凈后置于容器內(nèi)，一段時(shí)間后，收集蚯蚓分泌物。3、人血管生成抗體芯片購(gòu)自美國(guó)RayBio公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)自配；其它所用試劑均為分析純。實(shí)施例1生長(zhǎng)因子抗體芯片實(shí)驗(yàn)(1)蛋白樣品制備取完整蚯蚓、收集到的液體和分泌物適量，各加入一定的裂解液，搖勻置于冰上裂解30min，期間使用針管反復(fù)抽吸液體，使DNA斷裂，細(xì)胞充分裂解。于4°C下HOOOrpm離心15min。將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒1. 5ml離心管中保存。(2)洗膜將 Angiogenesis Antibody Array 膜放入 8 孑L 板中，力口入 3ml IXBlockingBuffer，確保膜蛋白面向上，室溫孵化lh。移去IXBlocking Buffer，用IXffash Buffer II洗膜兩次，棄去多余液體。(3)孵化加500 μ 1步驟⑴所得的各樣品于膜的蛋白面，室溫孵化1 池。傾去樣品液， 用4ml IXffash Buffer I在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。用4ml IXffash Buffer II在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。用濾紙吸去殘留液。(4)免疫反應(yīng)取出膜，用濾紙吸去殘留液，裝入新孔中，將Biotin-ConjugatedAnti-Angiogenes is Mix用IXWash Buffer II稀釋至適當(dāng)濃度加入孔中。室溫下孵育2h后，用IXffash Buffer I在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。用IXffash Buffer II在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。用濾紙吸去殘留液。同上方法準(zhǔn)備1 X Streptavidin-HRP Conjugate稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育 Ih后，用IXffash Buffer I在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。用IXffash Buffer II在室溫下脫色搖床上洗三次，每次5min。用濾紙吸去殘留液。(5)化學(xué)發(fā)光，顯影，定影將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合后加在膜的蛋白面上，使其與混合液充分接觸；5min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。在暗室中，將IX顯影液和定影液分別到入塑料盤(pán)中；在紅燈下取出X-光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大??；打開(kāi)X-光片夾，把X-光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上 X-光片夾，開(kāi)始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，以達(dá)最佳效果；曝光完成后，打開(kāi)χ-光片夾，取出χ-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影結(jié)束后，馬上把χ-光片浸入定影液中，以膠片透明為止；用自來(lái)水沖去殘留的定影液后， 室溫下晾干。(6)凝膠圖象分析將膠片進(jìn)行掃描，并進(jìn)行分析.結(jié)果如圖1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蚯蚓白糖組、蚯蚓分泌物組和單獨(dú)蚯蚓組均可以誘導(dǎo)趨化性細(xì)胞因子之一“受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分 ^必因子，，(regulated uponactivation normal T cell expressed and secreted factor, RANTES)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。其中，蚯蚓白糖組中RANTES的表達(dá)最為明顯，蚯蚓分泌物組和單獨(dú)蚯蚓組中RANTES的表達(dá)均較弱。
權(quán)利要求
1.蚯蚓在制備趨化性細(xì)胞細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑方面的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的趨化性細(xì)胞細(xì)胞因子為受激活調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子。
3.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的蚯蚓包括鮮蚯蚓、蚯蚓分泌物和蚯蚓經(jīng)白糖處理的產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及了蚯蚓的用途。借助人血管生長(zhǎng)因子抗體芯片，檢測(cè)蚯蚓分泌物中多種生長(zhǎng)因子的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，可將蚯蚓用于制備趨化性細(xì)胞細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑；在分子水平上闡明蚯蚓治療燙傷的作用機(jī)制，也為蚯蚓治療燙傷及傷口愈合等應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為利用現(xiàn)代技術(shù)對(duì)中醫(yī)藥民間驗(yàn)方進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供新的思路。
文檔編號(hào)A61P17/02GK102210714SQ20101014110
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2010年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月6日
發(fā)明者盧煦樂(lè), 裴明 申請(qǐng)人:上海市七寶中學(xué)