專利名稱：3,5-二甲基補骨脂素在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及3，5_ 二甲基補骨脂素在制備抗腫瘤藥物中 的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
3，5- 二甲基補骨脂素(簡稱DMFC)，分子式為C13HltlO3是補骨脂素衍生物，其合成 方法見參考文獻1，具有式(I)的結(jié)構(gòu)， 迄今為止，沒有文獻報道3，5- 二甲基補骨脂素在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用。惡性腫 瘤是當(dāng)今威脅人類身心健康最嚴(yán)重的疾病，死亡率高，目前尚無高效低毒的抗腫瘤藥物報 道，因此急需開發(fā)這類藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種3，5_ 二甲基補骨脂素在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。3，5_二甲基補骨脂素(簡稱DMFC)，具有式(I)的結(jié)構(gòu)式本發(fā)明所制備的3，5_二 甲基補骨脂素藥物，可在制備治療肝癌、乳腺癌、子宮頸癌、皮膚癌、鼻咽癌、結(jié)腸癌等藥物 中的應(yīng)用。本發(fā)明的3，5_ 二甲基補骨脂素可以和藥學(xué)上允許的任意一種輔料或藥物賦形劑 制成藥物，其制劑可以是藥學(xué)上允許的任意一種劑型，包括但不限于液體制劑、顆粒劑、片 劑、沖劑、軟膠丸、軟膠囊、滴丸劑或注射劑。本發(fā)明提供的藥物，其給藥形式主要包括口服給藥或注射給藥。實驗證明本發(fā)明提供的3，5_ 二甲基補骨脂素，具有體外抑制腫瘤細胞增殖的作 用，經(jīng)四甲基偶氮唑鹽(簡稱MTT法)檢測，48小時處理腫瘤細胞后，對肝癌H印G2的半數(shù) 抑制增值率IC50約為8. 46 士0. 28 μ Μ，對乳腺癌MCF-7為33. 5 士4. 95 μ Μ、對子宮頸癌SIHA 為 68. 5 士9. 19 μ Μ，對上皮癌 Α431 為 32. 33 士4. 21 μ Μ、對鼻咽癌 CNE2 為 105. 5 士8. 91 μ Μ、 對結(jié)腸癌CaCo2為124. 5 士 7. 62，并且3，5- 二甲基補骨脂素殺死肝癌!fepG2細胞的機理是 誘導(dǎo)其產(chǎn)生凋亡，因此其與藥用敷料組合，可在制備治療惡性腫瘤藥物中應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明公開了 3，5-二甲基補骨脂素在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用， 尤其是抗肝癌、抗乳腺癌、抗宮頸癌、抗上皮癌、抗鼻咽癌及抗結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用，為上述 癌癥的治療提供了更多選擇，且3，5_ 二甲基補骨脂素對正常細胞的毒性小，有利于臨床應(yīng) 用。


圖1為DMFC對肝癌!fepG2細胞的細胞毒性試驗。圖2為DMFC誘導(dǎo)肝癌!fepG2細胞產(chǎn)生凋亡的DNA梯狀條帶凝膠電泳圖。圖3為DMFC誘導(dǎo)肝癌H印G2細胞產(chǎn)生凋亡的ArmexinV-PI雙染流式圖。圖4為Caspase-8和Caspase-9抑制劑逆轉(zhuǎn)DMFC誘導(dǎo)的H印G2細胞凋亡作用。
具體實施例方式以下將結(jié)合具體實施例和附圖對本發(fā)明做進一步闡述，這些實例僅用于說明目 的，而不用于限制本發(fā)明范圍。
實施例一 3，5-二甲基補骨脂素(DMFC)的合成及鑒定 (1)合成香豆素衍生物1間苯二酚(3.96克，36毫摩爾)、乙酰乙酸乙酯(5. 59克，43毫摩爾)和12M硫酸 (60毫升)的混合物在室溫下攪拌15小時，然后將該反應(yīng)后的混合液倒入冰水(50毫升) 中，沉淀物經(jīng)過濾和水洗后，用甲醇重結(jié)晶得純的香豆素衍生物1(5. 70克，90%產(chǎn)率)。產(chǎn) 物為白色粉末狀固體，熔點182-184°C。(2)合成香豆素衍生物2上述的香豆素衍生物1(5. 46克，31毫摩爾)溶解于干燥的丙酮(75毫升)和二氯 甲烷(75毫升)，加入碳酸鉀(8. 55克，62毫摩爾)。攪拌下滴加氯代丙酮(5. 7克，62毫摩 爾)，滴完后混合物攪拌回流24小時。反應(yīng)結(jié)束后，混合液冷卻、過濾，用丙酮和二氯甲烷洗 滌濾渣各一次。濾液合并、旋干，用甲醇重結(jié)晶或柱層析(石油醚乙酸乙酯=1 1作為 洗脫液，硅膠為固定相)得純的香豆素衍生物2 (5. 61克，78%產(chǎn)率)。產(chǎn)物為白色粉末狀固 體，熔點=147-1490C ο(3)合成補骨脂素衍生物(DMFC) I將上述的香豆素衍生物2 (5. 33克，23毫摩爾)和1. OM氫氧化鈉(140毫升)的混 和液在氮氣保護下回流24小時。反應(yīng)混合液冷卻后用2. OM鹽酸酸化，沉淀物經(jīng)過濾和水 洗后，用甲醇重結(jié)晶或柱層析(石油醚乙酸乙酯=1 2作為洗脫液，硅膠為固定相)得 純的補骨脂素衍生物I，根據(jù)氫核磁共振數(shù)據(jù)及熔點，對比參考文獻[2]即知其為3，5_二甲 基補骨脂素(4. 04克，82%產(chǎn)率)。產(chǎn)物為白色粉末狀固體，熔點220-222°C ；氫核磁共振 (300MHz, CDCl3) δ (ppm) :7· 67 (s，1H)，7· 46 (s，1H)，7· 39 (s，1H)，6· 25 (s，1H)，2· 52 (s，3H)，2. 29(s，3H)。實施例二 3，5- 二甲基補骨脂素對人腫瘤細胞增殖抑制活性試驗實驗方法肝癌細胞H印G2、乳腺癌細胞MCF-7、宮頸癌細胞SIHA、上皮癌A431、鼻咽癌CNE2、 結(jié)腸癌CaCo2均購自美國American Type Culture Collection。細胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基 (Invitrogene)，添加 5%小牛血清(Invitrogene)，2mM 谷氨酰胺，37°C，10% CO2 培養(yǎng)箱。四甲基偶氮唑鹽(簡稱MTT法)檢測藥物對腫瘤細胞增殖的影響選擇對數(shù)生長 期細胞，以7000/孔的密度接種于96孔板中，置37°C，10%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后加入不 同濃度的藥物，每個濃度設(shè)復(fù)孔6個，分別培養(yǎng)24、48和72小時，吸出孔板中培養(yǎng)液，往每 孔中加入濃度為lmg/ml的MTT 50 μ 1，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3_4小時，取出加過MTT的96 孔板，每孔加入150 μ 1的DMS0，輕輕震蕩孔板30min，待孔底部的結(jié)晶物完全溶解后，將孔 板放入酶標(biāo)儀中測波長在570nm的各孔的光吸收值，記錄結(jié)果，實驗至少重復(fù)三次，用IC5tl 軟件計算半數(shù)增殖抑制濃度ic5。。附圖Ia結(jié)果顯示24、48和72小時的DMFC處理后，肝癌!fepG2細胞的IC50分別 為 16. 33 士 0. 13 μ M for 24h，8· 46 士 0· 28 μ M for 48h and 5. 97 μ M士 0.55?？梢?DMFC 對 肝癌細胞H印G2細胞的細胞毒性表現(xiàn)為劑量和時間的依賴性，而對正常肝細胞MIHA的細胞 毒性IC50為40. 75 士 1. 06 μΜ(附圖lb)，較肝癌細胞小5倍，表明DMFC對正常細胞的毒性 小，可以在臨床上應(yīng)用。此外，DMFC處理48小時，對乳腺癌MCF-7的IC50為33. 5士4. 95 μ M、對宮頸癌 SIHA 的 IC50 為 68. 5 士9. 19 μ Μ，對上皮癌 Α431 的 IC50 為 32. 33 士4. 21 μ Μ、對鼻咽癌 CNE2 的IC50為105. 5士8. 9 μ Μ、對結(jié)腸癌的CaCo2的IC50為124. 5士7. 62表明DMFC可以在制 備治療上述惡性腫瘤中應(yīng)用。實施例三3，5- 二甲基補骨脂素誘導(dǎo)肝癌細胞!fepG2產(chǎn)生凋亡(I)DNA梯狀條帶實驗?zāi)[瘤細胞H印G2經(jīng)不同濃度的DMFC處理48h后收集細胞， 加裂解液在 37°C裂解過夜(5mM Tris-HCl，IOOmM EDTA, 1% (w/v) SDS，and 蛋白酶 K)，基因 組DNA用酚/氯仿/異戊醇(25 24 1)抽提，70%酒精_20°C下沉淀，用RNA酶除去RNA 后，加40μ g DNA在1. 2%瓊脂糖凝膠上電泳并經(jīng)凝膠成像儀拍照。細胞凋亡最典型的特征之一，是細胞在接受藥物作用后，DNA會被核酸酶在核小體 連接處切斷，產(chǎn)生180-200bp或其整數(shù)倍大小的DNA碎片，瓊脂糖凝膠電泳時呈現(xiàn)有規(guī)則 的梯狀體條帶，這是區(qū)分凋亡與壞死的重要標(biāo)志。附圖2結(jié)果顯示瓊脂糖凝膠電泳時呈現(xiàn) 有規(guī)則的梯狀體條帶，DMFC以濃度0、8“11、16“11、32“11和64 μ M處理，可見DMFC可誘導(dǎo) HepG2產(chǎn)生典型的凋亡條帶，并呈劑量依賴性。(2) AnnexinV-PI雙染實驗約1. 5x10s個對數(shù)生長期的肝癌!fepG2細胞與DMFC共 同孵育48h，，胰酶消化收集細胞，PBS清洗一次，加入500 μ 1的ArmexinV-FITC結(jié)合緩沖 液，含2. 5 μ 1的AnnexinV-FITC和0. 5 μ 1的PI緩沖液，然后避光孵育15min,用FACSCanto 流式細胞儀(Becton Dickinson)分析結(jié)果。細胞凋亡早期，細胞膜上的磷脂酰絲氨酸(PS)會從細胞膜內(nèi)翻轉(zhuǎn)到細胞膜外， AnnexinV可與其結(jié)合，而凋亡細胞的細胞膜仍然保持完整，染料PI不能進入細胞進行染 色，因此通過ArmexinV-PI雙染實驗，可區(qū)分凋亡與壞死細胞。附圖3a中!fepG2細胞的5個不同DMFC濃度0、8 μ M、16 μ Μ、32 μ M和64 μ M處理。每張圖的右下角百分?jǐn)?shù)都表示該細 胞在對應(yīng)藥物濃度下的凋亡百分率，而右上角百分?jǐn)?shù)則代表相同條件下的死亡百分?jǐn)?shù)。從 圖中可以看到，DMFC可以誘導(dǎo)!fepG2細胞產(chǎn)生凋亡，并且這種作用呈現(xiàn)了劑量依賴性。圖 3b是圖3a的量化分析圖，圖中清楚地表明隨著DMFC濃度從0增至64 μ M,HepG2凋亡百分 率上升至24%。實施例四3，5- 二甲基補骨脂素誘導(dǎo)肝癌細胞!fepG2產(chǎn)生凋亡涉及的信號通路(1) Caspase-8和Caspase-9抑制劑逆轉(zhuǎn)DMFC誘導(dǎo)的!fepG2細胞凋亡作用在細胞凋亡的信號傳導(dǎo)過程中，caspase (半胱氨酸水解酶)起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié) 作用，因此它們的激活是凋亡的重要特征，兩個主要的caspase家族成員caspase-8和 caspase-9分別代表了兩條凋亡信號通路即死亡受體通路和線粒體通的啟動者。約1. 5x10s個對數(shù)生長期的IfepG2細胞分別與DMFC/caspase-8抑制劑 (Z-IETD-FMK)或DMFC/caspase-9抑制劑(Z-LEHD-FMK)共同孵育48小時，胰酶消化 收集細胞，PBS清洗一次，加入500 μ 1的Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液，含2. 5 μ 1的 AnnexinV-FITC和0. 5 μ 1的PI緩沖液，然后避光孵育15min,用FACSCanto流式細胞儀 (Becton Dickinson)分析結(jié)果。附圖4a中，H印G2細胞的對照、DMFC 32 μ M單獨處理、DMFC加caspase-8抑制劑 (81)組合處理以及DMFC加caspase-9抑制劑(91)組合處理。每張圖的右下角百分?jǐn)?shù)都表 示該細胞在對應(yīng)處理下的凋亡百分率?？梢钥闯?，DMFC 32 μ M作用于H印G2誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生 凋亡16. 19%，而添加caspase-8和-9抑制劑，可以逆轉(zhuǎn)這種凋亡的誘導(dǎo)，凋亡細胞百分比 相應(yīng)下調(diào)至8. 67%，9. 8%，附圖4b是圖4a的量化分析圖?？梢?，DMFC誘導(dǎo)!fepG2細胞產(chǎn)生凋亡確實涉及了兩條不同的通路，即細胞內(nèi)(死 亡受體)和細胞外(線粒體)通路。綜上實施例所述，本發(fā)明提供的3，5_ 二甲基補骨脂素(DMFC)對肝癌H印G2、乳腺 癌MCF-7、宮頸癌SIHA，上皮癌A431、鼻咽癌CNE2、結(jié)腸癌CaCo2均具有強烈的增殖抑制效 果，DMFC殺死肝癌H印G2細胞的機理是通過細胞內(nèi)(死亡受體)和細胞外(線粒體)兩條 通路誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，且3，5- 二甲基補骨脂素對正常細胞的毒性小，有利于臨床應(yīng)用。 目前臨床上缺乏高效低毒的藥物，因此3，5-二甲基補骨脂素具有很好的制備抗腫瘤藥物 的應(yīng)用前景。本發(fā)明涉及的部分參考文獻1. 0. Gia, S. M. Magno, H. Gonazalez-Diaz, E. Quezada, L. Santana, E. Uniarte, L. D. Via, Bioorg. Med. Chem. 2005，13，809.2. Q. Shen, Q. Peng, J. Shao, X. Liu, Z. Huang, X. Pu, L. Ma, Y. M. Li, A. S. C. Chan, L. Gu, Synthesis and biological evaluation of functionalized coumarins asacetyIcholinesterase inhibitors, European Journal of Medicinal Chemistry, 2005,40(12)，1307-1315.
權(quán)利要求
一種3，5-二甲基補骨脂素在制備抗腫瘤藥物中應(yīng)用，所述化合物具有式(I)的結(jié)構(gòu)，F(xiàn)SA00000083870900011.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種3，5-二甲基補骨脂素的應(yīng)用，其特征在于，在制備抗肝 癌藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種3，5-二甲基補骨脂素的應(yīng)用，其特征在于，在制備抗子 宮頸癌藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種3，5-二甲基補骨脂素的應(yīng)用，其特征在于，在制備抗乳 腺癌藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種3，5-二甲基補骨脂素的應(yīng)用，其特征在于，在制備抗皮 膚癌藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種3，5-二甲基補骨脂素的應(yīng)用，其特征在于，在制備抗鼻 咽癌藥物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種3，5-二甲基補骨脂素的應(yīng)用，其特征在于，在制備抗結(jié) 腸癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬制藥領(lǐng)域，涉及3，5-二甲基補骨脂素在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的3，5-二甲基補骨脂素的分子式為C13H10O3，分子量為214.22，具有廣譜抗腫瘤活性，體外對多種人腫瘤細胞均有強烈的抑制效應(yīng)，其抑制肝癌細胞HepG2增殖的機理是誘導(dǎo)癌細胞凋亡。因此其與藥用敷料組合，可在制備抗腫瘤活性藥物中應(yīng)用，尤其是抗肝癌、抗乳腺癌、抗宮頸癌、抗皮膚癌、抗鼻咽癌及抗結(jié)腸癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明為上述癌癥的治療提供了更多選擇，且3，5-二甲基補骨脂素對正常細胞的毒性小，有利于臨床應(yīng)用。
文檔編號A61P35/00GK101879159SQ20101014672
公開日2010年11月10日 申請日期2010年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月15日
發(fā)明者馮國培, 劉非燕, 吳平, 孫建國, 郭添德, 黃志真 申請人:浙江大學(xué)