專利名稱：：一種新石蒜異喹諾酮類生物堿及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于天然藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及從石蒜科植物蔥蓮中提取分離一種新石蒜異喹諾酮類生物堿，以及該化合物的制備方法和在醫(yī)藥領(lǐng)域中的用途，尤其是在制備治療白血病等抗腫瘤藥物方面的用途。二、技術(shù)背景腫瘤是一大類嚴(yán)重威脅人民生命和健康的多發(fā)病和常見病之一。手術(shù)治療、放射治療、藥物治療仍然是最常用最重要的腫瘤治療手段。近年來，隨著喜樹堿、長春新堿、青蒿素、紫杉醇、鬼白毒素、雷公藤甲素等一系列具有良好抗腫瘤活性天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和成功應(yīng)用，世界各國越來越將目光轉(zhuǎn)向在天然產(chǎn)物中尋找新的藥物來源。目前，臨床應(yīng)用的抗腫瘤藥物中，來源于植物的約占1/3。最近，國外對目前臨床試驗(yàn)中的抗癌新藥的來源進(jìn)行了總結(jié)報(bào)道，在294種正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的抗癌藥物中，有60%來自天然產(chǎn)物。由于天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎、種類豐富，從中尋找生物活性顯著、毒副作用小、新作用機(jī)制的先導(dǎo)物，并開發(fā)成為具有自主知識產(chǎn)權(quán)抗癌新藥，是創(chuàng)新藥物研制的突破口。石蒜科(Amaryllidaceae)植物數(shù)量眾多，分布于全世界熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)。石蒜科植物含有獨(dú)特的具有多種生物活性或藥理活性的生物堿類化合物，并引起了世界各國藥物研究人員的注意。迄今為止，已從石蒜科植物中發(fā)現(xiàn)生物堿500余種，并成功從中開發(fā)出石蒜內(nèi)銨(治療晚期宮頸癌、卵巢癌)，加蘭他敏(治療小兒麻痹癥，老年性癡呆癥)等藥物。江蘇省中國科學(xué)院植物研究所在對石蒜科蔥蓮屬植物蔥蓮[Z印hyranthesCandida(Lindl.)Herb]化學(xué)成分的研究過程中，得到一種抗腫瘤活性明顯的新石蒜異喹諾酮類生物堿--Dihydronarciclaside(DHN)。在目前發(fā)現(xiàn)的所有石蒜異喹諾酮類生物堿中，trans-dihygrona-rciclasine是抗腫瘤活性最好的化合物，但是存在水溶性不好和生物利用度差的缺點(diǎn)。而DHN則是trans-dihygrorciclasine的4位葡萄糖苷化產(chǎn)物，并且是其第一個(gè)天然的糖苷化產(chǎn)物，具有較好的水溶性和抗腫瘤活性，因此DHN有望開發(fā)成具有良好抗腫瘤活性的藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明公開了一種新石蒜異喹諾酮類生物堿，及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。化合物命名為Dihydronarciclaside(縮寫DHN)，分子式為=C2tlH25NO12，化學(xué)名為4_0-β-D_glucopyranosyl_trans_dihydronarciclasine，U學(xué)結(jié)構(gòu)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>上述化合物的制備方法，其特征在于以蔥蓮[Z印hyranthesCandida(Lindl.)Herb]為原料，經(jīng)甲醇、乙醇、甲醇-水混合溶液或乙醇-水混合溶液提取；甲醇、乙醇、甲醇_水混合溶液或乙醇_水混合溶液的提取液濃縮后加水溶解過大孔樹脂吸附；大孔樹脂吸附物經(jīng)柱層析分離而得。其中，大孔樹脂包括D101、AB-8或HP-20；柱層析用擔(dān)體選自硅膠、凝膠和反相硅膠中的一種或幾種制得。本發(fā)明中的新石蒜異喹諾酮類生物堿DHN與醫(yī)學(xué)上可接受的藥用輔料組成藥物組合物及其制劑。如片劑、膠囊劑、以及注射劑。本發(fā)明提供了新石蒜異喹諾酮類生物堿DHN在制備治療白血病等抗腫瘤藥物方面的用途。DHN具有較好的水溶性，初步的體外抗腫瘤活性測試表明，DHN對腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，尤其是對白血病細(xì)胞株U937及HL-60的作用較為顯著，其半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為38.57μΜ,39.18μM；體內(nèi)試驗(yàn)表明，當(dāng)DHN劑量為12.5mg/kg時(shí)對小鼠微小殘留白血病的有顯著治療作用，并有望開發(fā)成一類新的治療白血病等腫瘤的藥物。四以下圖可作為附件材料上報(bào)。圖1、DHN的結(jié)構(gòu)式圖2、DHN的MS譜圖3、DHN的1H-NMR譜圖4、DHN的13C-NMR譜圖5、DHN的COSY譜圖6、DHN的HSQCi普圖7、DHN的HMBCi普圖8、DHN的ROESY譜五具體實(shí)施例方式結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不僅僅限于所列舉的實(shí)施方式。實(shí)施例1.從蔥蓮中分離和鑒定化合物DHN將蔥蓮新鮮全草50kg，用400kg95%(體積比)乙醇-水溶液回流提取3次，每次2小時(shí)，濃縮至無醇味得浸膏(干重1.7kg)；所得浸膏加10倍體積的水溶解，濾紙過濾除去水不溶物，濾液用大孔樹脂HP-20進(jìn)行吸附，再以水，30%，50%，90%乙醇溶液洗脫，合并50%乙醇溶液洗脫液，濃縮得總石蒜異喹諾酮類生物堿20g。所得總石蒜異喹諾酮類生物堿進(jìn)行硅膠柱層析，洗脫劑依次為氯仿-甲醇-水(1730.2—410.1—730.5—330.5)、甲醇；其中氯仿-甲醇-水(410.1)部分進(jìn)行反復(fù)反相硅膠C-18柱層析(洗脫劑為40%乙醇-水溶液)分離及凝膠S印hdexLH-20柱層析純化(洗脫劑為35%乙醇_水溶液)得到化合物DHN1.2g，得率為0.0024%,純度為97%(HPLC面積歸一化法)。化合物DHN的鑒定，白色粉末，Molish反應(yīng)陽性。難溶于氯仿，甲醇，易溶于DMSO溶液?；衔锝Y(jié)構(gòu)經(jīng)MSJHJ3C-NMRJD-NMR等圖譜確定?；衔锖舜判盘枤w屬見表1，經(jīng)CA網(wǎng)絡(luò)版檢索為新化合物。表1化合物DHN的苷元與糖鏈部分的NMR數(shù)據(jù)(δ，ppm,0=TMS,DMS0_d6)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>實(shí)施例2、用甲醇冷浸提取法從蔥蓮中制備DHN蔥蓮新鮮全草10Kg，用甲醇冷浸提取三次，甲醇用量為100升，提取時(shí)間為20天，提取溫度為室溫，提取液濃縮至無醇味得浸膏(干重為80g)；所得浸膏加10倍體積的水溶解，濾紙過濾除去水不溶物，濾液用大孔樹脂AB-8進(jìn)行吸附，再以水，10%，60%，90%乙醇溶液洗脫，合并60%乙醇溶液洗脫液，濃縮得總生物堿Sg。所得總堿部位再經(jīng)柱層析(硅膠柱層析氯仿-甲醇-水梯度洗脫系統(tǒng)，RP-C18柱層析水-甲醇系統(tǒng)，凝膠柱層析水-甲醇系統(tǒng))分離后，得到化合物DHN0.5克，純度為98%(外標(biāo)法)。實(shí)施例3、用甲醇加熱回流提取法從蔥蓮中制備DHN蔥蓮新鮮全草10Kg，用80kg甲醇回流提取3次，每次2小時(shí)，提取液濃縮至無醇味得浸膏(干重為120g)；所得浸膏加10倍體積的水溶解，濾紙過濾除去水不溶物，濾液用大孔樹脂DlOl進(jìn)行吸附，再以水，10%，75%乙醇溶液洗脫，合并75%乙醇溶液洗脫液，濃縮得總生物89g。所得總堿部位再經(jīng)柱層析(硅膠柱層析氯仿_甲醇-水梯度洗脫系統(tǒng)，RP-C18柱層析水-甲醇系統(tǒng)，凝膠柱層析水-甲醇系統(tǒng))分離后，得到化合物DHN0.6克，純度為96%(外標(biāo)法)。實(shí)施例4、用高濃度的甲醇-水混合溶液提取法從蔥蓮中制備DHN蔥蓮新鮮全草10Kg，用IOOkg95%(體積比)甲醇-水的混合溶液回流提取3次，每次2小時(shí)，提取液濃縮至無醇味得浸膏(干重為150g)；所得浸膏加9倍體積的水溶解，濾紙過濾除去水不溶物，濾液用大孔樹脂HP-20進(jìn)行吸附，再以水，10%,75%乙醇溶液洗脫，合并75%乙醇溶液洗脫液，濃縮得總生物堿91g。所得總堿部位再經(jīng)柱層析(硅膠柱層析氯仿-甲醇-水梯度洗脫系統(tǒng)，RP-C8柱層析水-甲醇系統(tǒng)，凝膠柱層析水-甲醇系統(tǒng))分離后，得到化合物DHN0.65克，純度為97%(外標(biāo)法)。實(shí)施例5、DHN的體外抗腫瘤活性評價(jià)實(shí)驗(yàn)5.1目的研究DHN對腫瘤細(xì)胞抑制作用。5.2材料四甲基唑氮藍(lán)(MTT)；DHN(自制)。5.3方法與結(jié)果試驗(yàn)方法為國際通用的MTT法將處于對數(shù)生長期的要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的腫瘤細(xì)胞按定量接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24小時(shí)后加入藥量，細(xì)胞在37°C、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，加入5mg/ml的MTT液20M1，再繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，加入DMSO溶解后迅速用酶標(biāo)儀在570nm處測定OD值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。生長抑制率(％)=(1-加藥孔平均A值/空白對照孔平均A值)X100%表2DHN體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果~濃度(μΜ)HeiaSK-OV-3LovoU937jurkatHL-60~108.34%0.58%13.21%11.64%12.49%82.45%~~2010.52%1.66%21.94%31.33%22.10%20.57%4018.24%13.10%40.11%58.02%50.15%60.01%10034.97%29.20%60.77%71.01%73.31%93.51%IC50(μΜ)>100>10062.6138.5743.2739.18用不同濃度的DHN處理各腫瘤細(xì)胞，可見癌細(xì)胞的生長均受到抑制，且呈濃度和時(shí)間依賴性。結(jié)果表明，DHN對對腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，尤其是對白血病細(xì)胞株U937及HL-60的作用較為顯著，其半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為38.57，39.18μΜ。實(shí)施例6.DHN的體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)6.1目的研究DHN對小鼠微小殘留白血病的治療作用。6.2材料=DBAA近交小鼠120只，雌雄各半，體重1820g；環(huán)磷酰胺(Cy)；DHN(自制)6.3方法與結(jié)果6.3.1微小殘留白血病小鼠模型的建立將DBA/2近交小鼠隨機(jī)分為6組，每組20只。正常對照組不做任何處理，其余各組小鼠腹腔注射L7212白血病細(xì)胞IXlO6/只，3天后分別注射環(huán)磷酰胺(Cy)250mg/kg。模型組造模后腹腔注射生理鹽水0.2ml；陽性對照組腹腔注射Cyl50mg/kg，兩天一次；DHN高劑量組腹腔注射25mg/kg，1次/d，連續(xù)5d；DHN中劑量組腹腔注射12.5mg/kg,1次/d，連續(xù)5d；DHN低劑量組腹腔注射6.25mg/kg,1次/d，連續(xù)5d。6.3.2外周血白細(xì)胞和血小板的變化情況于治療后第七天進(jìn)行外周血白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)，觀察外周血白細(xì)胞和血小板的變化情況。結(jié)果見表3。表3DHN對微小殘留白血病小鼠外周血白細(xì)胞和血小板的影響(η=20)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與模型組比較:*P<0.05，**P<0.01。結(jié)果表明DHN可顯著地降低微小殘留白血病小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的升高，對血小板變化有一定的影響。6.3.3小鼠生存期的觀察記錄各組小鼠的生存時(shí)間。結(jié)果見表4。表4DHN對微小殘留白血病小鼠生存期的影響(η=20)_組別生存天數(shù)_正常對照組-模型組13.9士2.7陽性對照組19.5士3·(ΓDHN高劑量組18.2士3·Γ*DHN中劑量組16.7士2.2**DHN低劑量組14.7士3.0_注與模型組比較:*Ρ<0.05，**Ρ<0.01。結(jié)果表明DHN可顯著地延長微小殘留白血病小鼠的存活時(shí)間。6.3.4T細(xì)胞亞群分布的變化分離單個(gè)核細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度至IX106/ml，分別加入抗CD3抗原單克隆抗體，抗CD4抗原單克隆抗體及抗CD8抗原單克隆抗體，4°C，45min，離心洗滌后，熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算熒光陽性細(xì)胞百分率。結(jié)果見表5。表5DHN對微小殘留白血病小鼠T細(xì)胞亞群分布的影響(η=20)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注與模型組比較:*Ρ<0.05，**Ρ<0.01。結(jié)果表明微小殘留白血病小鼠免疫功能低下，T細(xì)胞亞群紊亂，陽性對照組雖然能延長小鼠的生存時(shí)間，但外周白血胞持續(xù)低下，免疫功能尚未能明顯恢復(fù)。DHN能明顯地升高CD4+、CD8+,調(diào)整紊亂的T細(xì)胞亞群，提高微小殘留白血病小鼠的免疫功能。6.3.5肝臟、脾臟指數(shù)的影響取小鼠的肝臟和脾臟稱重，計(jì)算肝臟和脾臟指數(shù)。結(jié)果見表6。肝臟指數(shù)=肝臟重量(mg)/體重(g)脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/體重(g)表6DHN對微小殘留白血病小鼠肝、脾指數(shù)的影響(η=20)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注與模型組比較廣P<0.05,**P<0.01ο結(jié)果表明各組小鼠死亡后肝臟指數(shù)無明顯差異；模型組小鼠的脾臟指數(shù)升高，DHN組脾臟指數(shù)降低，說明DHN可以減少白細(xì)胞的浸潤程度。實(shí)施例7、含本發(fā)明新生物堿單體DHN的片劑取DHN20g與乳糖200g及玉米淀粉50g混合，用適量30%乙醇做濕潤劑，制成軟材，常規(guī)方法制粒，加入適量硬脂酸鎂混合，制成片劑1000片。每片重275mg，含DHN20mg。實(shí)施例8、含本發(fā)明新生物堿單體DHN的膠囊劑取DHNlOg與淀粉100g，糊精20g，糖粉20g混合，用適量30%乙醇做濕潤劑，制成軟材，常規(guī)方法制粒，裝入2號硬膠囊中，制成1000粒，每粒150mg。本膠囊劑中每粒含DHN10mg。實(shí)施例9、含本發(fā)明新生物堿單體DHN的注射劑取DHN5g以普通注射劑制備方法，加入丙二醇和乙醇各200ml，攪拌使溶解，加注射用水稀釋至10000ml，NaCl調(diào)節(jié)等張，過0.22μm的微孔濾膜，灌封，10ml/支，流通蒸汽滅菌30min，檢驗(yàn)、包裝的注射劑。本注射劑IOml含DHN5mg。權(quán)利要求一種石蒜異喹諾酮類生物堿及其制備方法和用途，其特征在于化學(xué)名為4-O-β-D-glucopyranosyl-trans-dihydronarciclasiner，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為FSA00000095665400011.tif2.制備權(quán)利要求1所述化合物的方法，其特征在于以石蒜科植物蔥蓮[Z印hyranthesCandida(Lindl.)Herb]為原料，經(jīng)甲醇、乙醇或者甲醇-水、乙醇-水的混合溶液提??；甲醇、乙醇或者甲醇_水、乙醇_水的混合溶液的提取液濃縮后加水溶解過大孔樹脂吸附；大孔樹脂吸附物經(jīng)柱層析分離而得。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的大孔樹脂為D101、AB-8、HP-20中的一種；柱層析用擔(dān)體選自硅膠、凝膠、反相硅膠中的一種或幾種。4.權(quán)利要求1所述的化合物與醫(yī)學(xué)上可接受的藥用輔料組成藥物制劑。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制劑劑型是片劑、膠囊劑和注射劑。6.權(quán)利要求1所述的化合物在制備抗腫瘤藥物方面的用途。全文摘要本發(fā)明屬于天然藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，公開了從石蒜科植物蔥蓮中提取分離的一種新石蒜異喹諾酮類生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)，該化合物具有右式結(jié)構(gòu)，以及該化合物的制備方法和在醫(yī)藥領(lǐng)域中的用途，尤其是在制備治療白血病等抗腫瘤藥物方面的用途。文檔編號A61K9/48GK101805384SQ20101015486公開日2010年8月18日申請日期2010年4月26日優(yōu)先權(quán)日2010年4月26日發(fā)明者馮煦,單宇,王鳴,管福琴,趙友誼,陳雨申請人:江蘇省中國科學(xué)院植物研究所