專(zhuān)利名稱(chēng)：南瓜蛋白在制備治療胰腺癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及南瓜蛋白在制備治療胰腺癌藥物中的應(yīng)用，尤其涉及南瓜蛋白與吉西 他濱聯(lián)合應(yīng)用治療胰腺癌的用途。
背景技術(shù)：
胰腺癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升。由于發(fā)病隱襲和高度進(jìn) 展性，胰腺癌早期診斷十分困難，大多數(shù)患者在確診時(shí)已是晚期(局部晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn) 移)，手術(shù)切除率低(< 15%)，即使行根治性切除術(shù)，多數(shù)病人出現(xiàn)術(shù)后短期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，治 療棘手，病死率高，90%的病人在確診后1年內(nèi)死亡，5年生存率不到5%?；熓鞘中g(shù)后病 人和失去手術(shù)機(jī)會(huì)的病人提高生存率的主要治療手段，也是胰腺癌綜合治療的重要組成部 分。多年來(lái)用于胰腺癌化療的主要是細(xì)胞毒類(lèi)抗腫瘤藥物(氟尿嘧啶、吉西他濱和鉬類(lèi)等) 和近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的靶向藥物(如EGFR及VEGF的單抗及相應(yīng)的酪氨酸激酶抑制劑)，其 中，吉西他濱療效最好，美國(guó)NCCN指南已將吉西他濱和以其為基礎(chǔ)的聯(lián)合方案推薦為晚期 胰腺癌治療及術(shù)后輔助化療的標(biāo)準(zhǔn)方案。但目前療效并不令人滿意，尤其對(duì)晚期胰腺癌，吉 西他濱的客觀緩解率也僅12%，而且無(wú)論是吉西他濱單藥化療還是聯(lián)合化療，患者的中位 生存期均未能超過(guò)9個(gè)月。因此積極開(kāi)發(fā)高效、低毒、多靶點(diǎn)作用的新藥，尤其是能與現(xiàn)有 化療藥物產(chǎn)生協(xié)同作用的藥物與聯(lián)合治療方案已成為胰腺癌治療的迫切任務(wù)與研究熱點(diǎn)。核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating protein, RIP)廣泛存在于高等植物 中，通常按結(jié)構(gòu)不同分為兩型I型RIP為單鏈蛋白，如天花粉蛋白(TCS)，在植物RIP中占 多數(shù)；II型RIP是通過(guò)二硫鍵連接的雙鏈蛋白，如蓖麻毒素(ricin)。I型RIP與II型RIP 的A鏈一樣，是一類(lèi)RNA N-糖苷酶或多核苷酸腺苷糖苷酶，能專(zhuān)一地水解真核細(xì)胞核糖體 28S rRNA第4324位上的腺嘌呤堿基與核糖之間的N-C糖苷鍵，釋放出一個(gè)腺嘌呤堿基，從 而阻遏了延長(zhǎng)因子與核糖體的結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的生物合成，具有抗生育、抗病毒和抗腫瘤 等多種生物學(xué)活性[21’22]。由于II型RIP的B鏈具有凝集素的功能，可識(shí)別正常細(xì)胞表面的 D-半乳糖，因而有很大的毒性，限制了其在人體內(nèi)的應(yīng)用。而I型RIP由于不具有B鏈，對(duì) 人體的毒性較小，作為抗腫瘤藥物更具應(yīng)用前景。然而，不同的I型RIP其抗腫瘤活性并不 相同(相差可達(dá)10倍以上)，因而從植物中篩選高活性的I型RIP成為有關(guān)研究人員努力 的方向。南瓜蛋白(cucurmosin，CUS)是從南瓜瓜瓤中提取的新的1型核糖體失活蛋白， 為堿性單肽鏈糖蛋白。我們測(cè)定了其氨基酸序列和DNA順序，培養(yǎng)出單晶并測(cè)定了其結(jié)構(gòu) (Chen MH，Ye XM，Cai JH，et al. Crystallization andpreliminary crystallographic study of cucurmosin， a ribosome-inactivating proteinfrom the sarcocarp of cucurbita moschata[J]. Acta Cryst 2000 D56 665-666 ；Shi XL, Zhou EX, Ye XM, et al.Molecular replacement studies of cucurmosin from Cucurbitamoschata structure homology with trichosanthin[J]. Chinese J Struct Chem,2003,22 165-168;陳明晃，葉曉明.一種多肽-具有南瓜蛋白的N端順序的多肽[P].中國(guó)，發(fā)明專(zhuān)利，03135045. 3，2003-09-29 ；陳明晃，謝捷明，等.南瓜蛋白及其編碼基因[P].中國(guó)，發(fā)明 專(zhuān)利，200710008402. 6，2007-01-10)。我們前期的研究表明能顯著抑制多種腫瘤(肝癌、 胃癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌和黑色素瘤)細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡(謝捷明，陳明晃，等.南瓜 蛋白在制藥中的應(yīng)用[P].中國(guó)，發(fā)明專(zhuān)利，200510119741. 2,2005-11-03)，且活性比同類(lèi) 的天花粉蛋白強(qiáng)4-7倍，而對(duì)人正常肝細(xì)胞株和外周血淋巴細(xì)胞的抑制作用較小，表現(xiàn)出 明顯的選擇性。我們近期發(fā)現(xiàn)，南瓜蛋白對(duì)AsPC-l、BxPC-3、CFPAC-l和PANC-1等多株人胰 腺癌細(xì)胞均具有顯著的增殖抑制作用，南瓜蛋白與吉西他濱具有協(xié)同抗PANC-1細(xì)胞作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過(guò)研究南瓜蛋白單用及南瓜蛋白與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的抗 胰腺癌活性，提供南瓜蛋白在制備治療胰腺癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)明人的研究表明，南瓜蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的多種人胰腺癌細(xì)胞株均具有 顯著的增殖抑制作用，對(duì)人胰腺癌小鼠皮下移植瘤及胰腺原位移植瘤均具有明顯的抑制作 用；南瓜蛋白與吉西他濱聯(lián)用時(shí)，對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，具有協(xié)同作用。 因而，南瓜蛋白可單用及與吉西他濱聯(lián)合用于治療胰腺癌。
具體實(shí)施例方式下面用具體的實(shí)施例分別說(shuō)明南瓜蛋白單用及南瓜蛋白與吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用時(shí) 對(duì)人胰腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用。實(shí)施例1 南瓜蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的人胰腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用(一 )南瓜蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的人胰腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖抑制作用(MTT法)方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔接種量為 3000/160 uL0培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組加不同濃度的南瓜蛋白40 y L，每個(gè)濃度做6個(gè)復(fù)孔； 陰性對(duì)照組加營(yíng)養(yǎng)液40 y L，空白對(duì)照孔加營(yíng)養(yǎng)液200 y L，用于儀器調(diào)零。作用不同時(shí)間 (24h、48h和72h)后，每孔加5g/L的MTT 20 y L，繼續(xù)培養(yǎng)4h，甩去上清，每孔加二甲亞砜 150 uL.用酶標(biāo)儀(BI0-RAD產(chǎn)品)測(cè)定570nm各孔的吸光度值(A57C1)，各組取平均值，計(jì)算 抑制率抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A5TO/對(duì)照組A57(i)X100%。用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并 計(jì)算IC5〇。結(jié)果見(jiàn)表1和表3。南瓜蛋白對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞具有顯著的增殖抑制作用， 并且表現(xiàn)為明顯的時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性。南瓜蛋白作用24h、48h和72h的IC5Q分別為 40. 245 mg/L(1. 427u mol/L)、8. 249 mg/L(0. 292u mol/L)和 1. 778mg/L(0. 063u mol/L)。表1不同濃度和不同時(shí)間CUS對(duì)胰腺癌細(xì)胞PNCA-1的抑制率(n = 4)
4 ^ 與對(duì)照組 A57Q 比較，P < 0. 05。( 二)南瓜蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的人胰腺癌細(xì)胞系CFPAC-l、AsPC_l和BxPC_3的增殖 抑制作用(SRB法)方法分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AsPC-1、BxPC-3和CFPAC-1細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板 上，每孔接種分別為量為3000/100 u L,5000/100 y L禾口 6000/100 u L。培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組 加不同濃度的南瓜蛋白100 y L，每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔；陰性對(duì)照組加營(yíng)養(yǎng)液lOOy L，空白 對(duì)照孔加營(yíng)養(yǎng)液200 u L，用于儀器調(diào)零。作用72h后，棄上清，每孔加預(yù)冷的10%的三氯乙 酸100 iiL，4°C固定lh;倒掉固定液，小孔用去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥；每孔加SRB液 (Sulforhodamine B，用1 %醋酸配成0. 4%溶液)50uL，在室溫放置10分鐘；未與蛋白結(jié)合 的SRB用醋酸液洗5遍，空氣干燥；結(jié)合的SRB用150uL lOmmol/L非緩沖Tris堿液(pH 10. 5)溶解，用酶標(biāo)儀(BI0-RAD產(chǎn)品)在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定每個(gè)小孔的吸光度值(A57C1)，各 組取平均值，計(jì)算抑制率抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A570/對(duì)照組A570) X 100%。用SPSS12. 0進(jìn) 行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并計(jì)算IC5(1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)一次。結(jié)果見(jiàn)表2和表3。南瓜蛋白對(duì)人胰腺癌細(xì)胞系BxPC-3、AsPC-1和CFPAC-1均 具有明顯的的增殖抑制作用。南瓜蛋白對(duì)該三種細(xì)胞作用72h的IC5(1分別為0. 243umol/ L、0. 349 u mol/L 和 0. 387 u mol/L。表2 CUS對(duì)胰腺癌細(xì)胞CFPAC-1、AsPC-1和BxPC_3的增殖抑制作用(n = 3)
5 ^ 與對(duì)照組 A570 比較，P < 0. 05。表3南瓜蛋白對(duì)胰腺癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度 ^ 南瓜蛋白的分子質(zhì)量為28203 Da上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，南瓜蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的多種人胰腺癌細(xì)胞株(PANC-1、 BxPC-3、AsPC-1和CFPAC-1)均具有顯著的增殖抑制作用，作用72h的IC5(1分別為0. 063、 0. 243,0. 349和0. 387 y mol/L，說(shuō)明南瓜蛋白在體外具有抗胰腺癌作用。實(shí)施例2 南瓜蛋白對(duì)人胰腺癌小鼠移植瘤的抑制作用(一 )南瓜蛋白對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞N0D/SCID小鼠皮下移植瘤的抑制作用方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC_1，0. 125%胰酶消化后離心收集細(xì)胞， 用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，重懸成108/mL的細(xì)胞懸液。以75%酒精消毒NOD/ SCID小鼠皮膚后，將細(xì)胞懸液注射接種于小鼠右肩背部皮下，每只0. 2ml (含2 X 107細(xì)胞)。 待皮下移植瘤長(zhǎng)至約1cm3大小時(shí)，頸椎脫白處死荷瘤小鼠，碘酒酒精消毒后，無(wú)菌剝?nèi)×?塊；選擇生長(zhǎng)良好、無(wú)壞死、呈魚(yú)肉狀的瘤組織，剪切成直徑約2mm的小塊，用18號(hào)套管針接 種至其他N0D-SCID小鼠右肩背部皮下，如此反復(fù)進(jìn)行鼠間傳代。本實(shí)驗(yàn)以第6代皮下移植 瘤作為瘤源，皮下接種N0D/SCID小鼠[許可證編號(hào)SCXK(京)2005-0013]45只。14天后， 待皮下移植瘤長(zhǎng)至體積彡100mm3時(shí)，將N0D/SCID小鼠按瘤塊大小分群，并隨機(jī)分為5組 南瓜蛋白0. 5mg/kg、lmg/kg和2mg/kg三個(gè)劑量組，吉西他濱組和生理鹽水對(duì)照組。每2_3 天腹腔注射給藥1次，共5次，各組小鼠稱(chēng)重后頸椎脫白處死，剝?nèi)×鰤K并稱(chēng)重。按以下公 式計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率(％)腫瘤生長(zhǎng)抑制率％= (1-給藥組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤 重)X 100 ；并將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果給藥劑量為0. 5mg/kg、lmg/kg和2mg/kg的南瓜蛋白對(duì)PANC-1皮下移植瘤 均具有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為24. 06%,25. 90%和44. 55% (表4)。
表4南瓜蛋白對(duì)小鼠PANC-1瘤重的影響(x+s) ** 與對(duì)照組比較，p < 0. 01( 二)南瓜蛋白對(duì)PANC-1細(xì)胞的N0D/SCID小鼠胰腺原位移植瘤的抑制作用方法取上述第3代皮下移植瘤荷瘤N0D/SCID小鼠2只。待皮下移植瘤長(zhǎng)至約
1.5cm3大小，頸椎脫位法處死荷瘤鼠，消毒皮膚，剝?nèi)∧[瘤，浸入含100U/mL青霉素的無(wú)血 清培養(yǎng)基，去除中央壞死組織，選取周?chē)】的[瘤組織，剪成大小約1mm3的瘤塊供原位移植 用。10%水合氯醛溶液(50mg/kg)腹腔注射麻醉N0D/SCID小鼠，碘伏消毒皮膚，左上腹肋緣 下行1cm的斜行切口，仔細(xì)分開(kāi)胃與脾之間的薄膜，暴露胰腺，將脾及胰尾牽出腹腔外，輕 輕騷刮胰腺被膜，將1mm3瘤塊植入胰體尾處，將胰腺被膜向反折蓋住瘤塊并以ZT膠固定。 將胰腺輕輕送回腹腔，3-0外科縫線單層縫合腹壁肌層及皮膚。以上所有操作均在超凈臺(tái) 內(nèi)進(jìn)行。接種腫瘤后，小鼠按體重隨機(jī)分6組陽(yáng)性對(duì)照組，陰性對(duì)照組(2組)及不同劑 量南瓜蛋白組(3組)，每組8只。陽(yáng)性對(duì)照藥為吉西他濱(100mg/kg，小鼠尾靜脈iv)，陰 性對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，南瓜蛋白組給藥劑量分別為0. 625mg/kg、l. 25mg/kg和
2.5mg/kg。瘤塊接種后的第3天開(kāi)始給藥，每7 10天給藥1次，共4次(小鼠尾靜脈iv d4，ll，21，31d)。實(shí)驗(yàn)第49天，各組小鼠稱(chēng)重后處死，完整剝?nèi)∫认僭涣鰤K并稱(chēng)重。按下 列公式計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率(％)腫瘤生長(zhǎng)抑制率％= (1-給藥組平均瘤重/對(duì)照組平均 瘤重)X 100 ；并將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果南瓜蛋白3個(gè)劑量組(0. 25mg/kg、0. 5 mg/kg和lmg/kg)對(duì)PANC-1細(xì)胞的 N0D/SCID小鼠胰腺原位移植瘤均具有顯著的抑制作用，抑瘤率分別為45. 17%,50. 00%和 59. 68% (表 5)表5南瓜蛋白對(duì)小鼠胰腺移植瘤的抑制作用 ** 與對(duì)照組比較，p < 0. 01上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，南瓜蛋白對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞的N0D/SCID小鼠皮下 移植瘤及胰腺原位移植瘤均具有明顯的抑制作用，說(shuō)明南瓜蛋白在小鼠體內(nèi)具有抗胰腺癌 作用。實(shí)施例3 南瓜蛋白和吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)PANC-1細(xì)胞的增殖抑制作用方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC-1細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔接種量 3000/160ii L。培養(yǎng)24h后加藥。實(shí)驗(yàn)組分南瓜蛋白(⑶S)組、吉西他濱(GEM)組及⑶S+GEM 組，每孔加藥量為40 yL，設(shè)4個(gè)復(fù)孔。兩藥合用時(shí)體積比例為1 1，每種單藥濃縮1倍各 加 20 iil，CUS 的終濃度為 0. 3125,0. 625、1. 25,2. 5、5 和 10 u g/mL, GEM 的終濃度為 6. 25、 12. 5、25、50、100和200nmol/L。陰性對(duì)照組每孔加等量溶劑，設(shè)8個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照孔加營(yíng) 養(yǎng)液200 u L，用于儀器調(diào)零。置5% C02、37°C培養(yǎng)72h，每孔加5mg/mL的MTT20 u L，繼續(xù)培 養(yǎng)4h，甩去上清，每孔加二甲亞砜150 ii L。用酶標(biāo)儀(BI0-RAD產(chǎn)品)測(cè)定570nm各孔的吸 光度值(A5TO)。計(jì)算聯(lián)合用藥指數(shù)(CDI)。CDI = SA+B/(SAXSB)，SA+B表示藥物聯(lián)合作用組細(xì) 胞的存活部分與陰性對(duì)照的比值，SA和SB分別代表A藥和B藥單獨(dú)使用組細(xì)胞的存活部分 與陰性對(duì)照的比值；⑶I < 1、⑶I = 1和⑶I > 1分別表示兩藥有協(xié)同、相加和拮抗作用， 當(dāng)⑶I < 0. 75時(shí)，表示兩藥協(xié)同作用非常顯著。結(jié)果見(jiàn)表6和表7表6不同濃度的CUS和GEM合用時(shí)對(duì)PANC-1細(xì)胞的增殖抑制率(％ ) 表7不同濃度的CUS和GEM聯(lián)合抗PANC-1細(xì)胞的CD I 上述結(jié)果表明，不同濃度的南瓜蛋白與不同濃度的吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)人胰 腺癌PANC-1細(xì)胞的增殖抑制作用均明顯增強(qiáng)，兩者聯(lián)合抗胰腺癌具有顯著的協(xié)同作用。
權(quán)利要求
南瓜蛋白在制備治療胰腺癌藥物中的應(yīng)用，南瓜蛋白為南瓜瓜瓤中提取的I型核糖體失活蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的南瓜蛋白在制備治療胰腺癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于南瓜蛋 白單用時(shí)在制備治療胰腺癌藥物中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求1所述的南瓜蛋白在制備治療胰腺癌藥物中的應(yīng)用，其特征在于南瓜蛋 白與吉西他濱聯(lián)合在制備治療胰腺癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了南瓜蛋白在制備治療胰腺癌藥物中的應(yīng)用。南瓜蛋白單用時(shí)對(duì)體外培養(yǎng)的多株胰腺癌細(xì)胞均具有顯著的增殖抑制作用，對(duì)人胰腺癌小鼠皮下移植瘤及胰腺原位移植瘤均具有明顯的抑制作用，說(shuō)明南瓜蛋白在體外及體內(nèi)均具有抗胰腺癌作用；南瓜蛋白與吉西他濱聯(lián)用時(shí)，對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，具有協(xié)同作用。因而，南瓜蛋白可單用及與吉西他濱聯(lián)合用于治療胰腺癌。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101850106SQ201010155008
公開(kāi)日2010年10月6日 申請(qǐng)日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日
發(fā)明者吳正財(cái), 許春森, 謝捷明, 陳明晃, 黃鶴光 申請(qǐng)人:福建醫(yī)科大學(xué);中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所