專利名稱：一種家蠶生物反應(yīng)器制備人白介素28a的方法及其制藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種利用家蠶生物反應(yīng)器制備人白介素28A 的方法及其制藥用途。
背景技術(shù)：
人白細(xì)胞介素(interleukin)28A(hIL-28A)是一種新型的干擾素λ (IFN-λ )，與 I類干擾素(IFN)的功能類似，具有抗病毒、抗增殖及免疫調(diào)節(jié)等活性。人自然白介素是通 過分別刺激淋巴母細(xì)胞和人體白細(xì)胞，然后提純制備而得。目前市場供應(yīng)的只有由類淋巴 母細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素，是天然的多亞型的混合物。臨床用的主要是重組制劑，劑型主要有粉 劑和水劑，無口服劑型，使用均為注射給藥。家香桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(Bombyx mori baculovirus expressionvector system)是真核表達(dá)系統(tǒng)，已有許多基因在該系統(tǒng)中成功表達(dá)。用該系統(tǒng)在家蠶中表達(dá)外源 基因，表達(dá)水平高、產(chǎn)物生物活性好。目前，未見利用家蠶桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)表達(dá)人白細(xì)胞介素(interleukin)28A 的報道，以及關(guān)于人白細(xì)胞介素(interleUkin)28A 口服制劑的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種利用家蠶生物反應(yīng)器制備人白介素28A的方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種利用家蠶生物反應(yīng)器制備人白 介素28A的方法，通過基因工程方法獲得重組的帶有人白介素28A(hIL-28A)基因的家蠶 Bombyx mori桿狀病毒，并用該病毒接種家蠶幼蟲或蛹，使人白介素28A在家蠶幼蟲或蛹中 獲得高效表達(dá)。將高效表達(dá)人白介素28A的幼蟲或蠶蛹制備成口服制劑，經(jīng)動物試驗表明 具有顯著的抗腫瘤作用。上述技術(shù)方案中，所述重組的帶有人白介素28A(hIL_28A)基因的家蠶Bombyx mori重組桿狀病毒的制備方法為(1)根據(jù) GenBank 已公開的 hIL_28A 的 cDNA 序列(GenBank 登錄號BC113583)， 合成hIL-28A基因的編碼序列，克隆進(jìn)T-載體，獲pUC-hIL-28A質(zhì)粒；(2)用BamH I/EcoR I雙酶切消化pUC_hIL_28A質(zhì)?；厥説IL_28A基因片段， 用BamH I/EcoR I雙酶切消化供體質(zhì)粒pFastBac-Dual回收pFastBac-Dual片段，將 hIL-28A基因片段插入到pFastBac-Dual的BamH I和EcoR I之間，將hIL_28A克隆進(jìn) pFastBac-Dual載體中的桿狀病毒多角體基因啟動子下游獲得pFastBac-Dual-hIL_28A重 組質(zhì)粒；其中，質(zhì)粒PFastBac-Dual是美國Invitrogen公司的產(chǎn)品，其產(chǎn)品名為 PFASTBAC-DUAL EXP VECTOR ；pFastBac-Dual 載體屬于 Bac-to-Bac(Bacteria to Baculovirus)表達(dá)系統(tǒng)，
(3)將pFastBac-Dual-hIL-28A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BmDHlOBac感受態(tài)細(xì)胞， 涂布于含四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、IPTG、X-gal的LB瓊脂培養(yǎng)平板上，挑取白色菌落培 養(yǎng)，提取重組 Bacmid 基因組 Bacmid-hIL_28A DNA ；(4)將Bacmid-hIL-28A DNA由脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞BmN，培養(yǎng)細(xì)胞后取 上清，獲得重組桿狀病毒BmNPV-hIL-28A。上述技術(shù)方案中，采用所述家蠶Bombyx mori重組桿狀病毒接種家蠶幼蟲或蛹的 方法為將重組桿狀病毒BmNPV-hIL-28A感染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞BmN進(jìn)行擴(kuò)增，采用擴(kuò)增后的重 組桿狀病毒BmNPV-hIL-28A接種至五齡家蠶幼蟲或蛹。進(jìn)一步地，取5天后家蠶或蛹的血 淋巴，分析檢測hIL-28A表達(dá)水平，結(jié)果顯示每毫升血淋巴中重組hIL-28A的量達(dá)33 μ g。本發(fā)明的另一目的為提供一種含有人白介素28A藥物的制備方法，為實現(xiàn)該目 的，采用的技術(shù)方案為，一種含有人白介素28A藥物的制備方法，采用上述技術(shù)方案獲得的 感染重組家蠶桿狀病毒的家蠶幼蟲或蛹經(jīng)冷凍干燥后制成口服藥物制劑；經(jīng)動物試驗表明 具有顯著的抗腫瘤作用。

由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點1.由于本發(fā)明中采用pFastBac-Dual載體進(jìn)行hIL_28A基因的轉(zhuǎn)染，相對于其 他載體而言，大大簡化了篩選過程pFastBac_Dual載體屬于Bac-to-Bac (Bacteria to Baculovirus)表達(dá)系統(tǒng)，與傳統(tǒng)的 BEVS (Baculovirus expressionvector system)相比具 有三個優(yōu)點(1)縮短了重組病毒構(gòu)建所需的時間。傳統(tǒng)重組病毒構(gòu)建，方法技術(shù)嫻熟的人 員也需要6-9周時間甚至更長的時間。而構(gòu)建Bac-to-Bac系統(tǒng)7-9天就可以成功構(gòu)建； (2)可根據(jù)菌斑藍(lán)、白顏色進(jìn)行篩選，不需要空斑分析來純化重組病毒，轉(zhuǎn)座和純化率高，純 化率達(dá)100% ； (3)縮短了重組病毒的鑒定和純化的時間；感染宿主細(xì)胞或幼蟲即可獲得大 量的外源基因表達(dá)產(chǎn)物。2.由于本發(fā)明用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組人白介素28A(hIL_28A)，家蠶可食可 藥，表達(dá)hIL-28A的家蠶幼蟲和蛹可直接冷凍干燥，表達(dá)產(chǎn)物無需純化，可以直接作為口服 藥物使用，因此具有制備工藝簡單、成本低，口服藥物方便使用等優(yōu)點，同時可以減少注射 劑型的一些常有發(fā)熱、疲勞不適、食欲不佳、白細(xì)胞減少及血壓波動等的副作用。3.本發(fā)明所得人白介素28A(hIL_28A) 口服抗腫瘤藥物經(jīng)動物試驗證明具有明確 療效，而且人白介素28A(hIL-28A) 口服抗腫瘤是首創(chuàng)。


圖1為實施例一中重組病毒Bacmid-EGFP-hIL_28A的PCR鑒定圖，其中，M.標(biāo)準(zhǔn) DNA分子質(zhì)量；1.重組病毒的PCR產(chǎn)物(pUC/M13引物)；2.重組病毒的PCR產(chǎn)物(M13-1和 IL-28A2引物)；3.重組病毒的PCR產(chǎn)物(M13-2和IL-28A1引物)；4.野生病毒的PCR產(chǎn) 物(pUC/M13 引物)；圖2為實施例一中蠶蛹血淋巴的ELISA分析圖，其中1_6分別為感染重組桿狀病 毒1-6天的家蠶蛹； 圖3為實施例四中口服含有hIL-28A的蠶蛹粉對A549移植瘤PCNA和VEGF表達(dá)水 平的影響結(jié)果圖，其中ABC分別為A549的陰性對照組、藥物組和陽性對照組的PCNA表達(dá)； DEF分別為A549的陰性對照組、藥物組和陽性對照組的VEGF表達(dá)；
圖4為實施例五中口服含有hIL-28A的蠶蛹粉對HL60移植瘤PCNA和VEGF表達(dá)水 平的影響結(jié)果圖，其中ABC分別為HL60的陰性對照組、藥物組和陽性對照組的PCNA表達(dá)； DEF分別為HL60的陰性對照組、藥物組和陽性對照組的VEGF表達(dá)。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述

實施例一表達(dá)hIL_28A家蠶幼蟲的制備1.根據(jù) GenBank 已公開的 hIL_28A 的 cDNA 序列(GenBank 登錄號BC113583)，合 成hIL-28A基因的編碼序列，克隆進(jìn)T-載體，獲pUC-hIL-28A質(zhì)粒。2.設(shè)計并合成引物對 IL-28A-1 (TAGGATCCATGAAACTAGACATGAC,下劃線為 BamH I 位點)和 IL-28A-2 (TTGAATTCAGACACACAGGTCCCCACTG,下劃線為 EcoR I 位點)。以 pUC-hIL-28A質(zhì)粒為模板，用BamH I/EcoR I雙酶切，回收hIL_28A片段，與用相同酶切的供 體質(zhì)粒 pFastBac-Dual (invitrogen 公司)連接獲得 pFastBac-Dual_hIL28A 質(zhì)粒，該質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BmDHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含四環(huán)素(10 μ g/ml)、卡那霉素(50 μ g/ml)、 慶大霉素O μ g/ml)、IPTG (40 μ g/ml)、X_gal (100 μ g/ml)的LB瓊脂培養(yǎng)平板上。挑取白色 菌落培養(yǎng)，提取重組Bacmid基因組DNA，分別用pUC/M13引物(M13-1 :GTTTTCCCAGTCACGAC ； M13-2 :CAGGAAACAGCTATGAC)和 IL-28A 引物(IL-28A-1 和 IL-28A-2)對重組 Bacmid 進(jìn)行 組合PCR鑒定。鑒定結(jié)果參見圖1 用M13引物可從重組Bacmid DNA中擴(kuò)增出3. 92kb的目的條 帶；IL-28A-1和pUC/M13-2引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物的大小約為1150bp ；M13-1和IL-28A-2 引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物的大小約為2776bp，各特異性產(chǎn)物的分子量與預(yù)計的大小相符，說 明IL-28A基因已按要求重組進(jìn)Bacmid DNA，所獲得的重組Bacmid命名為Bacmid-hIL_28A。3. Bacmid-hIL-28A DNA (2 μ g)加入到 98 μ 1TC-100 (無胎牛血清)中混勻，另取 10 μ 1脂質(zhì)體加入到90 μ 1 TC-100 (無胎牛血清)中混勻，再將前者滴加到后者中混勻放置 30分鐘后滴加到800 μ 1的TC-100 (無胎牛血清，GIBC0BRL公司)中混勻，轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞。 27°C培養(yǎng)3 4天，收取病毒感染的培養(yǎng)細(xì)胞上清，獲重組病毒BmNPV-hIL-28A。4.用昆蟲針醮取BmNPV-hIL-28A感染BmN培養(yǎng)細(xì)胞4天的培養(yǎng)上清，接種5齡 起蠶，25°C左右正常飼養(yǎng)，5天后，取少量蠶血。用IL-28A ELISA試劑盒(USCN and LIFE TECHNOLOGY公司)測定hIL_28A表達(dá)水平，結(jié)果參見圖2每毫升血淋巴中重組hIL_28A的 量達(dá)33 μ g。收集接種病毒5天后的家蠶，-20°C保存。實施例二 表達(dá)hIL_28A家蠶蛹的制備1.采用實施例一步驟3獲得的重組病毒BmNPV-hIL-28A，感染BmN培養(yǎng)細(xì)胞，4天 后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。2.用昆蟲針醮取步驟1的細(xì)胞培養(yǎng)上清，穿刺接種復(fù)眼著色前的家蠶蛹，25°C左 右保護(hù)5天后，取少量蠶血。用IL-28A ELISA試劑盒(USCN and LIFETECHN0L0GY公司) 測定hIL-28A表達(dá)水平，每毫升血淋巴中重組hIL-28A的量達(dá)33 μ g。收集接種病毒5天后 的家蠶蛹，_20°C保存。實施例三表達(dá)hIL_28A家蠶蛹凍干粉的制備1.取實施例二步驟2的蠶蛹5kg，冰浴勻漿，加0. 7%的生理鹽水20kg，混勻，用紗布過濾去除粗雜質(zhì)。2.濾液冷凍干燥成粉劑原料，ELISA測定表明每克冷凍干燥粉中含 8. 5mghIL-28A。實施例四裸鼠口服含有人白介素28A家蠶蛹粉對A549移植瘤的抑制能力1. RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)A549細(xì)胞至生長狀態(tài)良好，取0. 2ml細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度 為5X106/ml)，皮 下接種于BALB/C-nu 6_8周齡裸鼠(體重20士2g，蘇州貝爾達(dá)生物醫(yī)藥 科技有限公司)的右腋下，按照《腫瘤治療增敏藥》(上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2002)建立 裸鼠皮下移植瘤模型。共接種18只裸鼠。2.接種3天后，裸鼠隨機(jī)分為3組，每組6只即正常對照組(模型組)，含 hIL-28A蛹粉組和環(huán)磷酰胺(購自中國江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；批準(zhǔn)文號國家醫(yī)藥準(zhǔn) 確H32020857)陽性對照組。3.正常對照組每天給裸鼠灌胃正常蛹粉量為1500mg/kg;含hIL_28A蛹粉用 1XPBS(PH7. 4)溶解，每天給裸鼠灌胃相當(dāng)于IL-28A 12. 7mg/kg ；環(huán)磷酰胺每天給裸鼠灌 胃量為25mg/kg ；連續(xù)灌胃30天后檢測抗腫瘤相關(guān)的指標(biāo)，結(jié)果參見圖3 含有人白介素 28A家蠶蛹粉口服對A549移植瘤的抑制率為40. 98%，腫瘤組織中的PCNA (增殖細(xì)胞核抗 原)和VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)的陽性細(xì)胞率分別為27. 6%和17.4%，而環(huán)磷酰胺組分 別為38. 4%和42. 6%，正常對照組分別為44. 6%和59. 3%?？诜腥税捉樗?8A家蠶 蛹粉組、環(huán)磷酰胺組和正常對照組的細(xì)胞凋亡程度分別為35%、27%，17%，表明口服含有 人白介素28A家蠶蛹粉對A549移植瘤的增殖有明確的抑制作用。實施例五裸鼠口服含有人白介素28A家蠶蛹粉對HL60移植瘤的抑制能力1. RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)HL60細(xì)胞至生長狀態(tài)良好，取0. 2ml細(xì)胞懸液(細(xì)胞濃度 為5X106/ml)，皮下接種于BALB/C-nu 6_8周齡裸鼠(體重20士2g，蘇州貝爾達(dá)生物醫(yī)藥 科技有限公司)的右腋下，按照《腫瘤治療增敏藥》(上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2002)建立 裸鼠皮下移植瘤模型。共接種18只裸鼠。2.接種3天后，裸鼠隨機(jī)分為3組，每組6只即正常對照組(模型組)，含 hIL-28A蛹粉組和環(huán)磷酰胺(購自中國江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；批準(zhǔn)文號國家醫(yī)藥準(zhǔn) 確H32020857)陽性對照組。3.正常對照組每天給裸鼠灌胃正常蛹粉量為1500mg/kg;含hIL_28A蛹粉用 1XPBS(PH7. 4)溶解，每天給裸鼠灌胃相當(dāng)于IL-28A 12. 7mg/kg ；環(huán)磷酰胺每天給裸鼠灌 胃量為25mg/kg ；連續(xù)灌胃30天后檢測抗腫瘤相關(guān)的指標(biāo)，結(jié)果參見圖4 含有人白介素 28A家蠶蛹粉口服對HL60移植瘤的抑制率為44. 6 %，腫瘤組織中的PCNA (增殖細(xì)胞核抗 原)和VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)的陽性細(xì)胞率分別為42. 8%和39.2%，而環(huán)磷酰胺組分 別為51. 4%和68. 4%，正常對照組分別為67%和70. 3%; 口服含有人白介素28A家蠶蛹粉 組、環(huán)磷酰胺組和正常對照組的細(xì)胞凋亡程度分別為58%、46%，23%，表明口服含有人白 介素28A家蠶蛹粉對HL60移植瘤的增殖有明確的抑制作用。
權(quán)利要求
一種家蠶生物反應(yīng)器制備人白介素28A的方法，其特征在于，通過基因工程方法獲得重組的帶人白介素28A基因的家蠶Bombyx mori重組桿狀病毒，并用該病毒接種家蠶幼蟲或蛹，使人白介素28A在家蠶幼蟲或蛹中獲得到高效表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述重組的帶人白介素28A基因的家 蠶Bombyx mori重組桿狀病毒的制備方法為(1)根據(jù)GenBank已公開的hIL_28A的cDNA序列(GenBank登錄號:BC113583)，合成 hIL-28A基因的編碼序列，克隆進(jìn)T-載體，獲pUC-hIL-28A質(zhì)粒；(2)用BamHI/EcoR I雙酶切消化pUC_hIL_28A質(zhì)?；厥説IL_28A基因片段，用BamH I/EcoR I雙酶切消化供體質(zhì)粒pFastBac-Dual回收pFastBac-Dual片段，將hIL_28A基因 片段插入到 pFastBac-Dual 的 BamH I 和 EcoR I 之間，將 hIL_28A 克隆進(jìn) pFastBac-Dual 載體中的桿狀病毒多角體基因啟動子下游獲得pFastBac-Dual-hIL-28A重組質(zhì)粒；(3)將pFastBac-Dual-hIL-28A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BmDHlOBac感受態(tài)細(xì)胞，涂布于 含四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、IPTG、X-gal的LB瓊脂培養(yǎng)平板上，挑取白色菌落培養(yǎng)，提 取重組 Bacmid 基因組 Bacmid-hIL_28A DNA ；(4)將Bacmid-hIL-28ADNA由脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞BmN，培養(yǎng)細(xì)胞后取上清， 獲得重組桿狀病毒BmNPV-hIL-28A。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，采用所述家蠶Bombyxmori重組桿狀 病毒接種家蠶幼蟲或蛹的方法為將重組桿狀病毒BmNPV-hIL-28A感染家蠶培養(yǎng)細(xì)胞BmN 進(jìn)行擴(kuò)增，采用擴(kuò)增后的重組桿狀病毒BmNPV-hIL-28A接種至五齡家蠶幼蟲或蛹。
4.一種含有人白介素28A的藥物的制備方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1所述制備方 法所得感染重組桿狀病毒的家蠶幼蟲或蛹，經(jīng)冷凍干燥后制成口服藥物制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種家蠶生物反應(yīng)器制備帶有人白介素28A的方法，通過基因工程方法獲得重組的帶人白介素28A(hIL-28A)基因的家蠶Bombyx mori重組桿狀病毒，并用該病毒接種家蠶幼蟲或蛹，使人白介素28A在家蠶幼蟲或蛹中獲得高效表達(dá)。由于本發(fā)明用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組人白介素28A(hIL-28A)，家蠶可食可藥，表達(dá)hIL-28A的家蠶幼蟲和蛹可直接冷凍干燥，表達(dá)產(chǎn)物無需純化，可以直接作為口服藥物使用，因此具有制備工藝簡單、成本低，口服藥物方便使用等優(yōu)點，同時可以減少注射劑型的一些副作用。
文檔編號A61P35/00GK101845442SQ20101016109
公開日2010年9月29日 申請日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者曹廣力, 薛仁宇, 貢成良, 鄭小堅, 陸葉 申請人:蘇州大學(xué)