欧美在线观看视频网站,亚洲熟妇色自偷自拍另类,啪啪伊人网,中文字幕第13亚洲另类,中文成人久久久久影院免费观看 ,精品人妻人人做人人爽,亚洲a视频

一種新城疫病毒感染免疫復合物疫苗的制備方法和應用的制作方法

文檔序號:1183612閱讀:246來源:國知局
專利名稱:一種新城疫病毒感染免疫復合物疫苗的制備方法和應用的制作方法
技術領域
本發(fā)明涉及DNA疫苗的制備和應用,具體涉及一種新城疫病毒感染免疫復合物疫苗的制備方法和應用。
背景技術
新城疫(Newcastle Disease,ND),又稱亞洲雞瘟,偽雞瘟等,是由新城疫病毒 (Newcastle disease virus,NDV)引起的一種急性高度接觸性傳染病。典型新城疫特征為體溫升高,食欲減退,垂頭縮頸或翅膀下垂,病雞咳嗽,呼吸困難,嗉囊內充滿液體內容物, 常有酸臭液體從口內流出,有的病雞還出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,下痢,泄殖腔出血、壞死,腺胃乳頭、 腺胃和肌胃交界處以及十二指腸出血,慢性病例常有呼吸道癥狀或神經(jīng)癥狀。雖然現(xiàn)在廣泛接種疫苗用于預防該病,但仍不時在養(yǎng)禽業(yè)中造成慘重的經(jīng)濟損失,當前仍是最主要和最危險的禽病之一。目前,控制該病的主要措施還是通過接種疫苗,但不論是滅活苗還是活疫苗都各有優(yōu)缺點,面對新城疫常規(guī)疫苗的缺陷,許多研究者都致力于新型疫苗的研制工作。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種新城疫病毒感染免疫復合物疫苗的制備方法和應用,通過被動免疫(疫苗)與主動免疫(特異性抗體)措施結合,及時而長久地使動物對病原微生物的感染起保護作用,在免疫措施、方法、劑量等方面進行研究,探討其可行性,并通過動物攻毒試驗評價被動與主動聯(lián)合免疫的保護效果。本發(fā)明的新城疫病毒感染免疫復合物疫苗的制備方法,具體包括以下步驟1)以新城疫病毒上海株為種毒制備抗原及滅活苗;2)由雞血清中的抗體轉移至蛋黃中形成蛋黃抗體IgY ;3)將上述制備的滅活苗和蛋黃抗體IgY等體積混合,孵育,即制得本發(fā)明的免疫復合物疫苗。所述抗原的血凝價大于1 28的尿囊液,所述抗原加入0.2% (ν/ν)的甲醛,經(jīng) 42°C水浴12h,即制得所述滅活苗。所述蛋黃抗體IgY的血凝抑制價大于1 21(1。本發(fā)明由雞血清中的抗體轉移至蛋黃中形成蛋黃抗體IgY,它與血清中的抗體具有相同的特異性和靈敏度,因而從雞蛋中提取抗體不需要采血而且抗體的量較大。本發(fā)明所制得的免疫復合物疫苗可用于抑制新城疫病毒感染。


圖1為免疫后雞體內抗體水平圖,其中+為抗原抗體復合物疫苗,_■一為滅活疫苗,+為陰性對照。圖2為RT-PCR檢測結果,其中M、1 4為接種Lasota滅活疫苗RT-PCR的檢測結果,5 8為接種sh09NDV免疫復合物疫苗RT-PCR的檢測結果。
具體實施例方式以下結合具體實施例進一步詳細描述本發(fā)明的技術方案。新城疫病毒上海株、Lasota滅活苗、sh09和F48E9病毒均由上海農(nóng)科院畜牧所病
毒實驗室保存。PEG、PEG_8000購自上海捷倍思基因技術有限公司,硫酸銨購自上海實驗試劑有限公司。Trizol-A+總RNA提取試劑購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司。實施例1抗原及滅活苗的制備以新城疫病毒上海株為種毒,經(jīng)尿囊腔接種,具體方法是取9 10日齡SPF雞胚(購自北京SPF雞場),用檢卵燈照視畫出氣室和胚胎位置后,將卵橫放在卵座上,胚胎位置向下。在卵長徑的1Λ處用碘酊和酒精消毒。用鋼錐打一小孔,將針頭刺入約1. 5cm,注入病毒液0. 1 0. 5mL,用熔化的石賭封孔,置孵卵箱內繼續(xù)孵育。24h時取出照蛋,將死亡的雞胚棄掉,其余放入孵育箱,在48 60h內再次照蛋,將活的雞胚放入4°C冰箱,24h后取出收獲其尿囊液,用血凝試驗(HA試驗)測定其血凝價,血凝價大于1 28的尿囊液經(jīng)檢驗合格后保存?zhèn)溆?。以上制備的抗原加?.2% (ν/ν)的甲醛,經(jīng)42°C水浴12h,獲得滅活苗。實施例2蛋黃抗體IgY的制備用實施例1制備的滅活苗免疫SPF產(chǎn)蛋雞四次后,收集產(chǎn)下的雞蛋,用PEG和硫酸銨沉淀來制備蛋黃抗體(IgY)。具體過程如下從雞蛋中小心分離蛋黃,將IOml蛋黃液、40ml 0. lmol/LpH7. 4的磷酸鹽緩沖液 (PBS),混勻,以4500r/min離心30min,取上清液加入PEG-8000,使?jié)舛葹?wt%,在室溫下攪拌溶解,4°C 12000r/min離心15分鐘,得到的蛋黃抗體IgY溶解于IOmL PBS中,再緩慢加入PEG-8000使?jié)舛葹?5wt%,沉淀后離心以純化IgYjf IgY溶于50mL PBS中,緩慢加入飽和硫酸銨使終濃度達到50 % (ν/ν),40C 12000r/min離心15分鐘,沉淀溶于PBS中,再在PBS中透析過夜以除去飽和硫酸銨。用血凝抑制試驗(HI試驗)測定血凝抑制價,血凝抑制價大于1 21°的抗體經(jīng)檢驗合格后保存?zhèn)溆?。實施?免疫復合物疫苗的制備將實施例1制備的滅活苗和實施例2制備的抗體等體積混合,20°C孵育1小時,即得本發(fā)明的免疫復合物疫苗。實施例4免疫試驗取45只SPF雞,隨即分三組。第一組每只注射生理鹽水0. 2mL/只做為陰性對照。第二組每只注射NDV滅活苗0. 2mL/只。第三組每只注射免疫復合物疫苗0. 2mL/只,在接種后十五天按相同劑量加強免疫一次。每隔一周隨即取上述雞只,測其血清HI效價。對測得的血清HI效價,取各組的平均值,繪圖,參見圖1。結果表明注射免疫復合物疫苗的雞體內抗體HI效價上升較顯著, 明顯高于只注射滅活疫苗組。實施例5攻毒試驗取80只SPF雞,隨即分4組,前三組接種的劑量和方法同實施例4。第四組每只注射Lasota滅活苗0. 2mL/只在免疫后35天攻毒,注射106LD50的sh09和F48E9病毒各0. ImL,比較各組的免
疫保護率。對各組的抗體效價和存活率進行相互比較,結果參見表1??梢钥吹絊h09品系 Lasota接種組存活率為0,Sh09組在攻毒實驗后存活率顯著地高于陰性對照組。免疫復合物疫苗可以很好的應對sh09,即使在接種低效價的疫苗時,死亡率也為零,而陰性對照組為 100%死亡率。最低劑量l(fEID50的疫苗完全具有保護性,其血清中和反應效價同那些被免疫100倍量的病毒的小雞具有一樣高的的水平。表1免疫復合物疫苗應對sh09和F48E9病毒的免疫保護效果
組別疫苗效價 (EID50)HI titer at 34 DPI (Iog2)接種病毒存活率(%)sh090/15 (0)陰性對照00F48E90/15 (0)
,sh092/15 (13.3)
IO76.5 土 0.6 -
F48E95/15 (33.3)
ssh093/15 (20)
Sh09IO87.3 土 0.9 -
F48E97/15 (46.8)
。sh0915/15(100)
IO911.8 士 0.3 -
F48E915/15 (100)
,sh0915/15(100)
IO712.5 土 0.6 -
F48E915/15 (100)
Sh09 免疫ssh0915/15 (100)
IO813.3 士 0.5 -
復合物F48E915/15 (100)
。sh0915/15 (100)
IO913.8 土 0.4 -
____F48E9__15/15 (100)
sh090/15 (0)
10811.6 士 0.8 -^―
Lasota __14/15 (93.
Osh090/15 (0)
10912.4 士 0.3 -^―
____F48E9__15/15 (100)
5
實施例6攻毒后RT-PCR檢測新城疫病毒通過對病毒在雞體內的繁殖情況來測試NDV免疫復合物的效果,在用sh09品系進行攻毒后3天,用RT-PCR檢測病毒的數(shù)量。取攻毒后的雞腦組織樣品0. lg,按Trizol-A+提取總RNA說明書進行RNA提取。根據(jù)NDV-HN基因序列,設計合成一對特異性引物,引物序列如下上游弓丨物AATGCGGCCGCAATGGACCGCGCCGTTAGC下游引物TATTTGAGGATCTCAACTAGTAACGGAAC根據(jù)寶生物提供的PT-PCR反應體系進行擴增,PCR參數(shù)為94°C預變性3min,94°C 變性30s,55°C退火30s,72°C延伸60s,35個循環(huán),最后72°C延伸lOmin,結果參見圖2。可以看出sh09免疫復合物接種組沒有檢測到病毒的存在,但在所有接種Lasota滅活疫苗的雞中都檢測到了 NDV病毒的存在。該實驗進一步證明本發(fā)明的sh09NDV免疫復合物疫苗完全地抑制了病毒在雞體內的繁殖。最后應當說明的是,以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制,盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明,本領域的普通技術人員應當理解,可以對發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換,而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍,其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍中。
權利要求
1.一種新城疫病毒感染免疫復合物疫苗的制備方法,其特征在于,包括以下步驟1)以新城疫病毒上海株為種毒制備抗原及滅活苗;2)由雞血清中的抗體轉移至蛋黃中形成蛋黃抗體IgY;3)將上述制備的滅活苗和蛋黃抗體IgY等體積混合,孵育,即制得本發(fā)明的免疫復合物疫苗。
2.根據(jù)權利要求1所述的制備方法,其特征在于,所述抗原的血凝價大于1 28的尿囊液,所述抗原加入0.2% (ν/ν)的甲醛,經(jīng)水浴,即制得所述滅活苗。
3.根據(jù)權利要求1所述的制備方法,其特征在于,所述蛋黃抗體IgY的血凝抑制價大于 1 210。
4.權利要求1所制備的免疫復合物疫苗在抑制新城疫病毒感染中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新城疫病毒感染免疫復合物疫苗的制備方法和應用。所述制備方法包括以下步驟1)以新城疫病毒上海株為種毒制備抗原及滅活苗;2)將雞血清中的抗體轉移至蛋黃中形成蛋黃抗體IgY;3)將上述制備的滅活苗和蛋黃抗體IgY等體積混合,孵育,即制得本發(fā)明的免疫復合物疫苗。本發(fā)明通過將被動免疫(疫苗)與主動免疫(特異性抗體)措施結合,及時而長久地使動物對病原微生物的感染起保護作用。
文檔編號A61P31/14GK102233133SQ20101016602
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月29日 優(yōu)先權日2010年4月29日
發(fā)明者劉成倩, 易建中 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1
汶川县| 灵武市| 陕西省| 化德县| 聊城市| 成都市| 二连浩特市| 陵川县| 东乌| 安陆市| 平阳县| 咸丰县| 海口市| 南宁市| 富锦市| 涞水县| 金湖县| 柯坪县| 华阴市| 东港市| 贡嘎县| 衡山县| 五家渠市| 普陀区| 达日县| 义乌市| 余江县| 高密市| 永定县| 巴彦县| 游戏| 昭苏县| 仪征市| 盱眙县| 恩施市| 枞阳县| 于田县| 鄂托克旗| 巴彦县| 青铜峡市| 濮阳市|