專(zhuān)利名稱(chēng)：：南瓜蛋白在制備治療胃癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物領(lǐng)域，尤其涉及南瓜蛋白在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康的疾病，目前臨床常用的化療藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也很大地?fù)p傷了正常組織和細(xì)胞，這就限制了它的應(yīng)用。尋找高效、低毒的治療腫瘤的藥物已成為當(dāng)前抗癌藥物研究的方向和迫切任務(wù)。從天然物質(zhì)中尋找抗腫瘤藥物已被認(rèn)為是一種有效的途徑，對(duì)天然活性物質(zhì)進(jìn)行抗腫瘤作用的研究，尤其在抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡和分化方面進(jìn)行探索，將有助于獲得理想的抗腫瘤藥物。核糖體失活蛋白(ribosome-inactivatingprotein,RIP)廣泛存在于高等植物中，迄今分離到的植物RIP約80余種。植物RIP通常按結(jié)構(gòu)不同分為兩型1型RIP為單鏈蛋白，如天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)，在植物RIP中占多數(shù)；II型RIP是通過(guò)二硫鍵連接的雙鏈蛋白，如蓖麻毒素(ricin)。它們是一類(lèi)RNAN-糖苷酶或多核苷酸腺苷糖苷酶，具有抗生育、抗病毒和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性。植物RIP抗腫瘤方面的研究早就引起人們的興趣RIP對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用遠(yuǎn)比對(duì)正常細(xì)胞的強(qiáng)，尤其是與單克隆抗體交聯(lián)成的免疫毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞具有靶向性和高殺傷效應(yīng)。而有關(guān)RIP抗腫瘤的機(jī)制，最初認(rèn)為在于RIP的細(xì)胞毒作用所致的腫瘤細(xì)胞壞死，后來(lái)發(fā)現(xiàn)是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的。CN1263107A提供了從南瓜中分離出的類(lèi)型1RIP-南瓜蛋白(Cucurmosin)，并公開(kāi)了它的制備方法。SDS-PAGE顯示它的分子量為27kDa，等電點(diǎn)pi>9，具有強(qiáng)烈抑制細(xì)胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)合成的活性。南瓜蛋白已長(zhǎng)出可供X-射線(xiàn)衍射用的單晶，晶體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果指出，南瓜蛋白與天花粉蛋白具有結(jié)構(gòu)同源性[Chenetal.ActaCryst.D562000,665-666；ShietalChineseJ.struct,chem.2003，22(2)，165-168]。CN1603340A提供了南瓜蛋白具有RNAN糖苷酶活性和體外抑制白血病細(xì)胞增殖的抗腫瘤活性。本發(fā)明是基于上述現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了南瓜蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的實(shí)體瘤細(xì)胞(胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和黑色素瘤等)及小鼠移植瘤(黑色素瘤、宮頸癌和肺癌等)具有顯著的抑制作用，而對(duì)人正常肝細(xì)胞株L02及外周血淋巴細(xì)胞的影響小，表現(xiàn)出明顯的選擇性。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察、細(xì)胞增殖周期分析及瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定等研究發(fā)現(xiàn)，南瓜蛋白對(duì)胃癌、肝癌和黑色素瘤等實(shí)體瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用。此外，以黑色素瘤B16細(xì)胞為模型，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察、流式細(xì)胞儀分析及黑色素含量測(cè)定等研究發(fā)現(xiàn)，南瓜蛋白對(duì)黑色素瘤細(xì)胞尚具有誘導(dǎo)分化的作用；對(duì)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡和誘導(dǎo)分化作用同時(shí)存在，但低濃度時(shí)以誘導(dǎo)分化為主，而高濃度時(shí)則具有顯著的誘導(dǎo)凋亡的作用。我們首次發(fā)現(xiàn)南瓜蛋白能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，誘導(dǎo)分化是其抗腫瘤的新機(jī)制。南瓜蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡和誘導(dǎo)分化作用是其抗腫瘤活性的重要機(jī)制。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是通過(guò)研究南瓜蛋白在體內(nèi)外的抗腫瘤活性，提供南瓜蛋白在抗腫瘤制藥中的應(yīng)用采用溫和的分離純化方法，包括鹽溶液抽提、DEAE-纖維素過(guò)濾、CM-纖維素或SP-瓊脂糖等強(qiáng)或弱的陽(yáng)離子凝膠介質(zhì)二次離子交換層析分離，可以從南瓜果肉中分離到南瓜蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)分子量為27kDa。層析純的南瓜蛋白(純度>97%)經(jīng)過(guò)濾除菌后用于實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明提供了南瓜蛋白作為制備治療肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌、黑色素瘤藥物的應(yīng)用。具體實(shí)施例方式下面用具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明南瓜蛋白的藥效作用和有益效果實(shí)施例1南瓜蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用及對(duì)人正常細(xì)胞的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞(胃癌細(xì)胞SGC■，肝癌細(xì)胞IfepG2、Bel74(14，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549，乳腺癌細(xì)胞MCF-7及黑色素瘤細(xì)胞B16)和人正常肝細(xì)胞L02接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔接種量分別為30004000個(gè)/100iiL和6000個(gè)/100uL；無(wú)菌采集健康獻(xiàn)血者靜脈血15mL，肝素抗凝，用Ficoll密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640配制單個(gè)細(xì)胞懸夜，調(diào)細(xì)胞濃度為2X105個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100PL。上述各培養(yǎng)板細(xì)胞培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組加不同濃度的南瓜蛋白lOOiiL，每個(gè)濃度做三個(gè)復(fù)孔；陰性對(duì)照組加營(yíng)養(yǎng)液100yl，空白對(duì)照孔加營(yíng)養(yǎng)液100yL，用于儀器調(diào)零。作用不同時(shí)間(48h和72h)后，每孔加5mg/mL的MTT20uL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，甩去上清，每孔加二甲亞砜150iiL。用酶標(biāo)儀(BI0-RAD產(chǎn)品)測(cè)定570nm各孔的吸光度值(A57C1)，各組取平均值，計(jì)算抑制率抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組A57Q/對(duì)照組A57Q)X100%。用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并計(jì)算IC5(I。結(jié)果南瓜蛋白對(duì)上述胃癌、肝癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌及黑色素瘤細(xì)胞均具有明顯的增殖抑制作用，并呈劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性，其48h的IC5(I從9.77到36.91ug/mL,72h的IC5(1從1.94ug/mL到13.54ug/mL；而南瓜蛋白對(duì)人正常肝細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞抑制作用較小，其48h的IC50分別>80ug/mL和>40yg/mL,72h的IC50分別為27.30ii40yg/mL(表1)。可見(jiàn)南瓜蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞具有明顯的選擇性抑制作用。表1南瓜蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實(shí)施例2南瓜蛋白對(duì)SGC79Q1、IfepG2、Bel74(14、A549、MCF-7及B16細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用(1)南瓜蛋白對(duì)上述腫瘤細(xì)胞形態(tài)的影響①熒光顯微鏡觀(guān)察上述腫瘤細(xì)胞分別接種于多個(gè)蓋玻片上，12h后加入不同濃度的南瓜蛋白處理24、48和72h，用吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)混合熒光染料染色后，倒扣于載玻片上，在熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變。結(jié)果上述細(xì)胞均可觀(guān)察到早、中期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有濃染致密的顆粒狀黃綠色熒光，核染色質(zhì)濃縮，核破裂，凋亡小體釋放等典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；同時(shí)凋亡有時(shí)間及劑量依賴(lài)關(guān)系。②電子顯微鏡觀(guān)察上述腫瘤細(xì)胞分別用20yg/mL南瓜蛋白作用48h為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)以正常培養(yǎng)的上述細(xì)胞為對(duì)照組，各組細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，離心收集細(xì)胞沉淀，用4°C預(yù)冷的2.5%戊二醛-1%多聚甲醛混合液固定，鋨酸后固定，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬鉛染色，透射電子顯微鏡(HITACHIHu-12A型)觀(guān)察并拍照。結(jié)果上述腫瘤細(xì)胞經(jīng)南瓜蛋白作用后均出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核仁消失，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)邊聚于核膜下，可見(jiàn)核固縮、核碎裂和凋亡小體；凋亡細(xì)胞約占15-20%0(2)流式細(xì)胞儀分析以2X105/mL接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)12h后，加入不同濃度南瓜蛋白溶液繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72h，收集細(xì)胞，2000r/min離心5分鐘，PBS洗1次后，傾去上清。以70%乙醇在4°C固定30min以上，離心除去固定液，PBS洗1次后用碘化丙啶(PI)溶液(含0.005%PI、0.TritonX_100、0.lmmol/LEDTA和0.01%RNaseA)在室溫避光染色30min，上機(jī)分析。結(jié)果上述腫瘤細(xì)胞經(jīng)不同濃度南瓜蛋白處理24、48和72h后，在h/A峰的前面，都有高度不同的亞二倍體峰，且呈明顯的時(shí)間和劑量依賴(lài)性。(3)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞DNA分別收集經(jīng)20ug/mL南瓜蛋白處理的上述腫瘤細(xì)胞12X106個(gè)，同時(shí)以正常培養(yǎng)的上述細(xì)胞為對(duì)照。用PBS重懸浮一遍，加入200iiL裂解液(含10mmol/LTris、50mmol/LEDTA、0.5%SDS)，同時(shí)加入1ii1蛋白酶K溶液(20mg/mL)，于55°C消化4小時(shí)，經(jīng)酚氯仿異戊醇(25241)和氯仿異戊醇(241)各抽提一次，用無(wú)水乙醇沉淀、TE溶解，加入RNase,37°C30分鐘，加入上樣緩沖液后，于90V、1.2%瓊脂糖凝膠電泳2h。電泳完畢，于紫外觀(guān)察儀上觀(guān)察并拍照。結(jié)果上述腫瘤細(xì)胞經(jīng)20iig/mL南瓜蛋白處理72h，均可見(jiàn)明顯的DNALadder條帶。而對(duì)照組僅見(jiàn)一基因組DNA條帶。結(jié)果表明，南瓜蛋白對(duì)胃癌，肝癌和黑色素瘤細(xì)胞均具有顯著的誘導(dǎo)凋亡作用。實(shí)施例3南瓜蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用(以黑色素瘤B16細(xì)胞為模型)(1)細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察將對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組B16細(xì)胞培養(yǎng)72h后，分別用相差顯微鏡和透射電子顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)并拍照。結(jié)果如下①光學(xué)顯微鏡觀(guān)察對(duì)照組B16細(xì)胞呈多層不規(guī)則生長(zhǎng)，具有重疊的圓形細(xì)胞；南瓜蛋白作用后，細(xì)胞呈一定的極性生長(zhǎng)，平行排列，不重疊；3d后，南瓜蛋白濃度在2.5yg/mL以上者，細(xì)胞極性明顯，多數(shù)細(xì)胞體積變大，具有樹(shù)突狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間連成網(wǎng)狀，生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞數(shù)變少。②電鏡觀(guān)察對(duì)照組B16細(xì)胞表面可見(jiàn)較多微絨毛，細(xì)胞核多數(shù)較大且為橢圓形，核內(nèi)以常染色質(zhì)為主，胞漿內(nèi)細(xì)胞器較少，黑色素顆粒少見(jiàn)；20ug/mL南瓜蛋白處理3d后，B16細(xì)胞體積多數(shù)變大，表面較光滑，微絨毛減少，細(xì)胞核減小且不規(guī)則，核內(nèi)異染色質(zhì)增多，胞漿內(nèi)細(xì)胞器豐富，可見(jiàn)大量不同成熟期的黑色素小體，部分細(xì)胞大量黑色素小體聚集成團(tuán)。(2)南瓜蛋白對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖周期的影響收集經(jīng)10yg/mL南瓜蛋白處理24小時(shí)的B16細(xì)胞，1500r/min離心lOmin，沉淀經(jīng)70%乙醇固定12小時(shí)，PBS洗滌2遍后重懸，用300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，以碘化丙啶(PI)溶液在室溫避光染色30min，流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果B16細(xì)胞經(jīng)10iig/mL南瓜蛋白處理24h后，G2/M期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞明顯減少，而G/h期細(xì)胞增多。提示南瓜蛋白可阻止B16細(xì)胞由&期向S期過(guò)渡從而停滯于&期。(3)南瓜蛋白對(duì)黑色素瘤細(xì)胞黑色素含量的影響接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16細(xì)胞至6孔板，每孔1.5X105，每組3孔，d2加入南瓜蛋白，終濃度分別為1.25,2.5、5和10yg/mL，作用72h后用PBS洗滌3次，0.25%胰酶消化、計(jì)數(shù)，1000r/min離心lOmin，細(xì)胞沉淀溶于1MNa0H-10%DMS0溶液lmL中，室溫放置30min，于400nm波長(zhǎng)測(cè)定吸收度值(A4J，將結(jié)果換算成106細(xì)胞的吸收度。結(jié)果對(duì)照組B16細(xì)胞黑色素含量為0.040士0.002(A4(K1/106細(xì)胞)，而1.25、2.5、5和10iig/mL南瓜蛋白組黑色素含量分別為0.088士0.007,0.165士0.003、0.225士0.006和0.309士0.008(A400/106細(xì)胞)?？梢?jiàn)，經(jīng)南瓜蛋白處理后B16細(xì)胞黑色素含量明顯增加。結(jié)果表明，南瓜蛋白對(duì)黑色素瘤細(xì)胞具有明顯的誘導(dǎo)分化作用。實(shí)施例4南瓜蛋白對(duì)動(dòng)物移植瘤的抑制作用(1)南瓜蛋白對(duì)宮頸癌U14的抑制作用選擇腫瘤生長(zhǎng)良好、全身狀態(tài)較好的荷瘤小鼠，頸椎脫白處死，固定后碘酒酒精消毒，無(wú)菌條件下取出瘤塊，將腫瘤(g)和生理鹽水(mL)以14比例勻漿后，于皮下接種ICR小鼠(合格證號(hào)SCXK(閩)2004-0002)，每只0.2mL。將動(dòng)物隨機(jī)分組并于接種24h后腹腔注射給藥，設(shè)0.25、0.5和lmg/kg三個(gè)劑量組，同時(shí)設(shè)環(huán)磷酰胺組和生理鹽水對(duì)照組，每2天給藥1次，共5次后，頸椎脫白處死，分別稱(chēng)取體重和瘤重。計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率(％)腫瘤生長(zhǎng)抑制率％=(1-給藥組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)X100；并將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果南瓜蛋白0.25,0.5和lmg/kg對(duì)宮頸癌U14均具有明顯的抑制作用，抑制率分別為22.57%、41.17%和58.26%(表2)。(2)南瓜蛋白對(duì)黑色素瘤B16的抑制作用將黑色素瘤B16于皮下接種純系小鼠C57(合格證號(hào)SCXK(滬)2003-0003)按上述方法測(cè)定南瓜蛋白對(duì)黑色素瘤B16的抑制作用。結(jié)果南瓜蛋白0.25、0.5和lmg/kg對(duì)黑色素瘤B16均具有明顯的抑制作用，抑制率分別為22.26%,36.55%和52.21%(表3)。(3)南瓜蛋白對(duì)肺癌Lewis的抑制作用將肺癌Lewis于皮下接種純系小鼠C57(合格證號(hào)SCXK(滬)2003-0003)按上述方法測(cè)定南瓜蛋白對(duì)肺癌Lewis的抑制作用。結(jié)果南瓜蛋白0.25、0.5和lmg/kg對(duì)肺癌Lewis均具有明顯的抑制作用，抑制率分別為30.80%、50.76%和65.54%(表4)表2南瓜蛋白對(duì)小鼠U14瘤重的影響(x+s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與對(duì)照組比較，<0.01表3南瓜蛋白對(duì)小鼠B16瘤重的影響(x+s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與對(duì)照組比較，**ρ<0.01廣ρ<0.001表4南瓜蛋白對(duì)小鼠Lewis瘤重的影響(x+s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注與對(duì)照組比較，**p<0.01廣ρ<0.001從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出，本發(fā)明的南瓜蛋白的有益效果在于南瓜蛋白顯著抑制體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞SGC79tll，肝癌細(xì)胞!fepG2、Bel7404,非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549，乳腺癌細(xì)胞MCF-7及黑色素瘤細(xì)胞B16的增殖，而對(duì)人正常肝細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞抑制作用較小，表現(xiàn)出明顯的選擇性，南瓜蛋白亦能在體內(nèi)明顯抑制宮頸癌U14、黑色素瘤B16和肺癌Lewis等動(dòng)物移植瘤。因此，本發(fā)明證實(shí)南瓜蛋白具良好的體內(nèi)外抗實(shí)體瘤作用。過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察、細(xì)胞增殖周期分析及瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定等研究發(fā)現(xiàn)，南瓜蛋白對(duì)胃癌、肝癌和黑色素瘤等實(shí)體瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用；此外，以黑色素瘤B16細(xì)胞為模型，通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察、流式細(xì)胞儀分析及黑色素含量測(cè)定等研究發(fā)現(xiàn)，南瓜蛋白對(duì)黑色素瘤細(xì)胞尚具有誘導(dǎo)分化的作用。對(duì)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡和誘導(dǎo)分化作用同時(shí)存在，但低濃度時(shí)以誘導(dǎo)分化為主，而高濃度時(shí)則具有顯著的誘導(dǎo)凋亡的作用。因此，本發(fā)明證實(shí)南瓜蛋白具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化和凋亡的作用機(jī)制。實(shí)施例5南瓜蛋白和天花粉蛋白對(duì)胃癌、肝癌及黑色素瘤細(xì)胞的增殖抑制作用的比較分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌SGC79m、肝癌Bel74tl4和黑色素瘤B16細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔接種量30004000個(gè)/100μ1。培養(yǎng)隔夜后，實(shí)驗(yàn)組加不同濃度的南瓜蛋白或天花粉蛋白100μ1，每個(gè)濃度做三個(gè)復(fù)孔；陰性對(duì)照組加營(yíng)養(yǎng)液100μ1，空白對(duì)照孔加營(yíng)養(yǎng)液100μ1，用于儀器調(diào)零。作用不同時(shí)間(24、48、72小時(shí))后，每孔加5mg/ml的ΜΤΤ20μ1，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，甩去上清，每孔加二甲亞砜150μ1。用酶標(biāo)儀(BI0-RAD產(chǎn)品)測(cè)定570nm各孔的吸光度值，各組取平均值，并計(jì)算抑制率。抑制率=(1_實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)XlOO%結(jié)果見(jiàn)表5:表5<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求南瓜蛋白作為制備治療胃癌藥物的應(yīng)用。全文摘要南瓜蛋白在制藥中的應(yīng)用，能夠從南瓜果肉中分離出一種核糖體失活蛋白——南瓜蛋白，該蛋白顯示了良好的抗腫瘤活性，可用于制備抗腫瘤藥物。南瓜蛋白能顯著抑制體外培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞SGC7901，肝癌細(xì)胞HepG2、Bel7404，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549，乳腺癌細(xì)胞MCF-7及黑色素瘤細(xì)胞B16，而對(duì)人正常肝細(xì)胞和外周血淋巴細(xì)胞的抑制作用較小，表現(xiàn)出明顯的選擇性；南瓜蛋白亦能在小鼠體內(nèi)明顯抑制宮頸癌U14、黑色素瘤B16和肺癌Lewis等動(dòng)物移植瘤。此外，本發(fā)明也證實(shí)了南瓜蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡和誘導(dǎo)分化作用是其抗腫瘤活性的重要機(jī)制。文檔編號(hào)A61P35/00GK101822819SQ201010166688公開(kāi)日2010年9月8日申請(qǐng)日期2005年11月3日優(yōu)先權(quán)日2004年11月5日發(fā)明者謝捷明,陳明晃申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所;福建醫(yī)科大學(xué)