專利名稱：一種吳茱萸總生物堿新的醫(yī)藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取的植物中草藥中活性成分的藥物用途，具體地說是一種吳茱萸總生物堿新的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
吳茱萸系蕓香科植物吳茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.、疏毛吳茱萸Evodiarutarecarpa(Juss.)Benth.vat.bodinieri(Dode)Huang、石虎Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalia(Dode)Huang的干燥近成熟果實。味辛、苦，性熱，有小毒。歸肝、脾、胃、腎經(jīng)。具有溫肝暖胃、散寒止痛、降逆、燥濕等功效。分布于安徽、浙江、福建、湖南、湖北、廣東、廣西、云南、貴州等省區(qū)。
目前，從吳茱萸果實中已經(jīng)分離出100余種化合物，包括生物堿、苦味素、揮發(fā)油、氨基酸等。(1)生物堿為吳茱萸主要的活性成分，根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為吲哚喹啉類生物堿和喹諾酮類生物堿，前者主要有吳茱萸堿、吳茱萸次堿、吳茱萸因堿、羥基吳茱萸堿、二氫吳茱萸次堿、去甲吳茱萸酰胺、14-甲酰二氫吳茱萸次堿等；后者有吳茱萸卡品堿、二氫吳茱萸卡品堿、1-甲基-2-十五烷基-4-喹諾酮等，吳茱萸總生物堿具有重要的藥用價值，有些已在臨床得到廣泛的應(yīng)用。(2)苦味素類主要包括吳茱萸苦素、吳茱萸內(nèi)酯醇、黃柏酮、檸檬苦素、吳茱萸苦素乙酸酯、格羅苦素甲等，苦味素類化合物能減少胃酸分泌、改善局部血液循環(huán)等功能。(3)揮發(fā)油類通過氣相色譜從吳茱萸中分離出月桂烯、檸檬烯、石竹烯、別香橙烯等。(4)氨基酸天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等18種氨基酸。此外，吳茱萸中還含有少量的黃酮類化合物、甾體類、脂肪酸及微量元素。
吳茱萸具有多種藥理學(xué)活性，具有較高的藥用價值和應(yīng)用前景。資料顯示吳茱萸生物堿能增強晶體停博液對離體豚鼠心臟的保護(hù)作用，并具有強效降壓和舒張血管效應(yīng)；吳茱萸提取物、吳茱萸堿、吳茱萸內(nèi)酯對家兔有很好的鎮(zhèn)痛作用；吳茱萸煎劑及水浸劑對霍亂弧菌、絮狀表皮癬菌及致病皮膚真菌等具有抑制作用；吳茱萸次堿有抗血小板活性、抑制血栓素的形成、抑制激動劑引起的血小板聚集時細(xì)胞內(nèi)鈣的運動；吳茱萸水提物對大鼠離體子宮由5-羥色胺引起的收縮有拮抗作用，其興奮子宮成分為去氫吳茱萸堿、吳茱萸次堿及蕓香胺；吳茱萸堿還具有支氣管收縮作用；此外實驗還顯示吳茱萸生物堿對多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒活性。
肝纖維化是多種慢性肝病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，表現(xiàn)為肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生，同時也是肝硬化的早期及向肝硬化轉(zhuǎn)變的必經(jīng)階段。病因?qū)W上認(rèn)為肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展是許多不同因素作用的結(jié)果，其中包括化學(xué)品和藥物(如乙醇、氨甲蝶呤、砷化物異煙肼、羥苯吲哚、甲基多巴、聚氯乙烯和二氧化釷等)，肝臟的各種感染(如病毒、細(xì)菌、螺旋體及寄生蟲感染)等均可誘導(dǎo)肝內(nèi)外源性及內(nèi)源性物質(zhì)的非正常沉積。我國現(xiàn)有各類型肝病患者已達(dá)2億人之多，而肝炎、脂肪肝、酒精肝等在內(nèi)的大部分肝病都可能導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生，不僅給無數(shù)患者和家庭帶來了巨大的痛苦，也對社會造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
近年來，隨著對肝纖維化發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識不斷深入特別是對細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解的調(diào)控有了更多的了解。人們逐漸認(rèn)識到由于肝纖維化的發(fā)生機(jī)理非常復(fù)雜，很難用單一作用靶點的藥物來達(dá)到抑制肝纖維化的目的。目前，臨床上使用的抗肝纖維化化學(xué)藥物及生物制劑主要有以下幾類 1、抑制肝臟炎癥主要有秋水仙堿、干擾素、糖皮質(zhì)激素、拉米夫定、馬洛替酯、PGE、IL-10、特異性受體拮抗藥(如IL-受體拮抗藥、可溶性TNF-α受體)等。
2、抑制肝星狀細(xì)胞活化與增殖肝星狀細(xì)胞活化是肝纖維化發(fā)生的重要因素，激活的肝星狀細(xì)胞具有增殖、纖維生成、致炎和收縮等功能，因此，抑制該種細(xì)胞的活化與增殖就成為抑制肝纖維化的重要策略。目前，水飛薊賓、磷脂酰膽堿、維生素E和S-腺苷蛋氨酸等，在動物實驗中均顯示出對肝星狀細(xì)胞的活化及膠原合成有抑制作用。
3、抗纖維化細(xì)胞因子白細(xì)胞介素10能促進(jìn)胸腺細(xì)胞和B細(xì)胞增殖，在四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化實驗中，白細(xì)胞介素10能阻斷炎癥反應(yīng)，促進(jìn)膠原的溶解，使得肝纖維化發(fā)生逆轉(zhuǎn)。肝細(xì)胞生長因子能刺激肝細(xì)胞DNA合成，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，減少肝細(xì)胞的壞死與損傷，減輕炎癥刺激，抑制甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)展。
4、誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡資料顯示曲霉菌素和膠毒霉素能不同程度的誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞凋亡，減少膠原的合成，從而起到阻斷或延緩肝纖維化的作用。
5、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解研究較為成熟的有不飽和卵磷脂和松弛素，體外實驗證實其不飽和卵磷脂能抑制肝星形細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維母細(xì)胞，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)分泌，促使已經(jīng)形成的膠原分解。松弛素在體內(nèi)外實驗中均可促使膠原合成減少，細(xì)胞外基質(zhì)降解增加。
盡管研究人員對肝纖維化的形成機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，但到目前為止，臨床上還缺乏療效確切、副反應(yīng)小、毒性低的抗肝纖維化西藥。由于化學(xué)藥物及生物制劑在抗肝纖維化治療中的種種不足，近幾十年來國內(nèi)外研究人員也致力于抗肝纖維化的中醫(yī)藥研究。傳統(tǒng)中藥的有效部位、單味制劑及復(fù)方成分復(fù)雜，對肝纖維化能進(jìn)行多方位、多靶點治療，較其他藥物顯示出明顯的優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種抗肝纖維化的藥物，所要解決的技術(shù)問題是自植物中草藥中遴選療效確切、毒性低、副反應(yīng)小的活性成分。
齊賀彬等基于傳統(tǒng)中醫(yī)理論，認(rèn)為肝纖維化的主要病因是濕熱疫毒入侵和正氣不足；肝血瘀阻是其病理基礎(chǔ)，該病屬本虛標(biāo)實之證，病位在肝，表現(xiàn)為濕、熱、毒、瘀、虛。申請人結(jié)合長期的中草藥基礎(chǔ)研究，利用吳茱萸所具有的溫肝、散寒、止痛、降逆、燥濕等屬性，對防治肝纖維化進(jìn)行了深入的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吳茱萸有很好的預(yù)防和治療作用，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
本發(fā)明所稱的吳茱萸總生物堿新的醫(yī)藥用途就是吳茱萸總生物堿在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
所述的吳茱萸總生物堿是自吳茱萸中提取、分離得到的吲哚喹啉類和喹諾酮類等生物堿的總稱，以生物堿計，總生物堿含量20～60％。
所述的吳茱萸總生物堿的提取、分離如下 取吳茱萸生藥，酸性乙醇回流提取，提取液合并，回收部分乙醇后調(diào)整pH值上樹脂柱，水洗后收集40-95％乙醇洗脫部分，回收乙醇，減壓濃縮，干燥后得到的提取物即是吳茱萸總生物堿。其主要成分總生物堿含量以生物堿計20～60％。
總生物堿可加入藥學(xué)上允許的相應(yīng)輔料，制成片劑、膠囊、緩釋片、滴丸、沖劑、微粒劑，并進(jìn)一步純化制成針劑。
根據(jù)動物實驗的結(jié)果，吳茱萸總生物堿臨床推薦劑量300～1200mg/天，口服，一日三次。
本發(fā)明有以下的優(yōu)點和效果 1、本發(fā)明發(fā)掘了吳茱萸總生物堿新的藥用前景，開拓了一個新的藥用領(lǐng)域； 2、本發(fā)明的吳茱萸總生物堿采用口服給藥，服用方便，毒副作用小，長期服藥無危害； 3、本發(fā)明吳茱萸總生物堿的原藥資源非常豐富，具有良好的社會和經(jīng)濟(jì)效益； 4、本發(fā)明的吳茱萸總生物堿對肝纖維化的療效確切； 5、本發(fā)明為將吳茱萸總生物堿進(jìn)一步開發(fā)成新藥提供了強有力的基礎(chǔ)。
四

附圖所示是受試大鼠肝組織切片光鏡圖，其中 圖1是對照組(正常組)HE染色10×10倍。
圖2是模型組HE染色10×10倍。
圖3是吳茱萸總生物堿100mg·kg-1HE染色10×10倍。
圖4是吳茱萸總生物堿50mg·kg-1HE染色10×10倍。
圖5是陽性藥組HE染色10×10倍。
五具體實施例方式 以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地描述。
(一)吳茱萸總生物堿的制備 取吳茱萸生藥6kg，用酸性乙醇回流提取4次，每次1.5h，提取液合并，回收部分乙醇后調(diào)整pH至2上陽離子樹脂柱，水洗后收集80％乙醇洗脫部分，回收乙醇，減壓濃縮，干燥即得吳茱萸總生物堿。以總生物堿計，生物堿含量為20～60％。
(二)動物實驗 實驗結(jié)果如下 1、實驗?zāi)康? 采用體積分?jǐn)?shù)比為40％CCl4色拉油溶液給予大鼠背部或四肢下注射制備肝纖維化模型，測試吳茱萸總堿對肝纖維化的治療作用。
2、受試藥物 名稱吳茱萸總堿 來源安徽省藥物研究所 純度總生物堿含量＞50％ 批號20090121 溶液用5‰CMC-Na溶液混懸溶解。
3、陽性對照藥 名稱復(fù)方鱉甲軟肝片 來源內(nèi)蒙古福瑞蒙藥科技股份有限公司 批號20080604 規(guī)格0.5g/粒 4、實驗動物 品系SD大鼠 體重180±20g 性別雌性 來源安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心 動物合格證號皖醫(yī)實動準(zhǔn)第01號 每組動物數(shù)12只 5、實驗試劑 CCl4溶液分析純，純度≥99.5％，廣東汕頭西隴化工廠有限公司 AST、ALT試劑盒長春匯力生物技術(shù)有限公司 LN、HA和、PCIII放免試劑盒北京華英生物技術(shù)研究所 6、實驗方法 實驗設(shè)吳茱萸總生物堿大、小劑量組(100、50mg·kg-1)，模型組，復(fù)方鱉甲軟肝片組(600mg顆?！g-1)和對照組。
采用體積分?jǐn)?shù)比為40％CCl4色拉油溶液給予大鼠背部或四肢下注射制備肝纖維化模型，3ml·kg-1(首次劑量加倍)，一周2次，連續(xù)12周；正常組，皮下注射等量色拉油；陽性藥和受試藥均用5‰CMC-Na溶液混懸溶解，每天灌胃給藥1次，連續(xù)10周。正常組和模型組給予等量5‰CMC-Na溶液。
實驗12周末(給藥10周)，3.2％水合氯醛(1ml·100g-1)腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血，以3500r·min-1離心10min，取上清液按試劑盒說明測定血清肝功能生化指標(biāo)AST和ALT活性(賴氏法)；肝纖維化指標(biāo)HA、LN、PC-III放免法測定。處死大鼠，稱肝、脾濕重，計算肝、脾重指數(shù)。肉眼觀察大鼠肝臟情況并評分，取部分右葉肝臟以福爾馬林浸泡，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察。
7、實驗結(jié)果 (1)吳茱萸總生物堿對CCl4致肝纖維化大鼠肝重、脾重指數(shù)的影 給藥12周模型組大鼠體重明顯低于正常組，肝重指數(shù)顯著高于正常組，脾重指數(shù)與正常組無統(tǒng)計學(xué)差異；吳茱萸總生物堿100mg·kg-1組大鼠體重增長略快于模型組，肝重指數(shù)明顯低于模型組(見表1)。
表1吳茱萸總生物堿對CCl4致肝纖維化大鼠肝重、脾重指數(shù)的影響
(2)吳茱萸總生物堿對CCl4致肝纖維化大鼠肝功能的影響 CCl4造模期間，模型組大鼠血清ALT和AST顯著高于正常組(P＜0.01)，提示造模成功；給藥2～10周期間，吳茱萸總生物堿高劑量組ALT呈進(jìn)行性下降(P＜0.05～0.01)，吳茱萸低劑量組和陽性藥組于給藥10周后ALT和AST均明顯下降(見表2、3)。
表2吳茱萸總生物堿對CCl4致肝纖維化大鼠血清ALT的影響
表3吳茱萸總生物堿對CCl4致肝纖維化大鼠血清AST的影響
(3)吳茱萸總生物堿對CCl4致肝纖維化大鼠血清中LN、HA和PCIII的影響 采用CCl4造模12周后，模型組大鼠血清PCIII、HA和LN均顯著高于正常組(p＜0.01)，提示肝組織中ECM大量沉積，TAE 50、100mg·kg-1組和陽性藥組上述三指標(biāo)均明顯下降(見表4)。
表4吳茱萸總生物堿對CCl4致肝纖維化大鼠血清中LN、HA和PCIII的影響

(4)吳茱萸總生物堿對CCl4致肝纖維化大鼠病理組織學(xué)的影響 肉眼觀察到正常組大鼠肝臟表面光滑，色澤鮮紅；模型組大鼠肝臟顏色暗淡、偏黃，甚至肝臟表面呈顆粒狀或細(xì)小結(jié)節(jié)狀，肉眼觀察平均分為2.8分，吳茱萸總生物堿高劑量組大鼠肝臟肉眼觀察病變情況輕于模型組，平均分為1.8分，各組大鼠肝臟肉眼觀察評分見表5。
表5吳茱萸總生物堿對CCl4致肝纖維化大鼠病理組織學(xué)的影響
評分標(biāo)準(zhǔn)0分表面光滑，色澤鮮紅；1分肝臟表面光滑，色澤淡紅； 2分肝臟表面光滑，黃色； 3分肝臟表面尚光滑，觀之呈顆粒狀，色澤黃； 4分肝臟表面不光滑，有細(xì)小結(jié)節(jié)，色澤黃。
光鏡觀察顯示正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常，肝竇明顯，肝細(xì)胞呈索狀分布，排列整齊，體積正常，無脂肪變性壞死，無炎癥細(xì)胞浸潤。如圖1所示。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞呈腫脹空泡樣脂肪變性，匯管區(qū)有炎癥細(xì)胞浸潤，膠原纖維沿匯管區(qū)及中央靜脈周圍向肝小葉內(nèi)延伸，交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，部分大鼠形成完整的假小葉。如圖2所示。吳茱萸高劑量組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)明顯改善，膠原纖維間隔減少，肝細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤少見，匯管區(qū)結(jié)締組織增生減輕。如圖3所示。吳茱萸低劑量組和陽性藥組肝組織灶性破壞，肝細(xì)胞變性、肝纖維化較模型組也減輕。如圖4所示。說明吳茱萸總生物堿能有效的緩解CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化?？傮w效果優(yōu)于陽性藥組。
(三)吳茱萸總生物堿制劑加工 吳茱萸總堿片劑的制備 實施例一 吳茱萸總堿100mg 淀粉100mg 淀粉漿(10％)適量 硬脂酸鎂1％ 工藝 將主藥和輔料混勻，以10％淀粉漿制粒、干燥、整粒，加入硬脂酸鎂混勻，壓片即得。
實施例二1000片 吳茱萸總堿100g 淀粉100g 淀粉漿(10％)適量 硬脂酸鎂1％ 工藝同上。
權(quán)利要求
1.一種吳茱萸總生物堿新的醫(yī)藥用途，其特征在于吳茱萸總生物堿在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種吳茱萸總生物堿新的醫(yī)藥用途，即吳茱萸總生物堿在制備預(yù)防和治療肝纖維化藥物中的應(yīng)用。吳茱萸總生物堿是自吳茱萸中提取、分離得到的吲哚喹啉類和喹諾酮類生物堿的總稱，總生物堿含量20～60％。本發(fā)明在大鼠四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化的治療作用實驗中顯示出一定的治療作用，有較好的臨床應(yīng)用前景。說明吳茱萸總生物堿具有確切的抗肝纖維化作用，可與輔料結(jié)合制備抗肝纖維化藥物。
文檔編號A61K36/754GK101829218SQ201010171738
公開日2010年9月15日 申請日期2010年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月6日
發(fā)明者張毅, 楊冬梅, 李莉, 陳師農(nóng), 馬玲, 錢利武 申請人:安徽省藥物研究所