專利名稱：腸道病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株腸道病毒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
手足口病(Hand-Foot-mouth disease, HFMD)是由多種腸道病毒引起的常見傳染 病，近年來多爆發(fā)與亞太地區(qū)的熱帶區(qū)域，以嬰幼兒發(fā)病為主。引起手足口病的腸道病毒 包括腸道病毒EV71型(腸道病毒71，Enterovirus 71，簡(jiǎn)稱EV-71)和A組的柯薩奇病毒 (CoxA)、?？瞬《?Echo)等。其中EV-71是引起手足口病的主要病原，常導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng) 系統(tǒng)綜合癥。EV-71是單股正鏈RNA病毒，分為A、B、C3個(gè)基因型，B1-B4及C1-C4共8個(gè) 亞型。該病以前雖有報(bào)道但多以散發(fā)病例出現(xiàn)，而09年在我國(guó)的安徽、河南和河北多個(gè) 地區(qū)呈爆發(fā)流行，對(duì)嬰幼兒健康造成了嚴(yán)重的危害。因此，了解該病毒的特性對(duì)該疾病的預(yù) 防和治療具有重要的指導(dǎo)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株腸道病毒及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的腸道病毒，是腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2， 它是20-30nm，圓形無囊膜的RNA病毒。腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2已于2010年4月2日保藏于 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰 西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCC No 3675。腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2，通過增殖得到大量的病毒液， 經(jīng)滅活濃縮后免疫小鼠制備單克隆抗體，為檢測(cè)試劑的研制提供了材料；同時(shí)經(jīng)滅活純化 后制備的濃縮苗進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，通過檢測(cè)中和抗體的產(chǎn)生和CD4、CD8、干擾素的水平等各項(xiàng) 指標(biāo)可為防治疫苗的研制奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。該腸道病毒具有較強(qiáng)的致病性，可以用于建立 手足口病動(dòng)物模型。


圖1為腸道病毒EV71型河南分離株2感染Vero細(xì)胞的電鏡結(jié)果(30000倍)圖2為腸道病毒EV71型河南分離株2感染Vero細(xì)胞的電鏡結(jié)果(39000倍)圖3為腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2抗原片與手足口病患者 血清1 10的稀釋液間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果圖4為腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2抗原片與手足口病患者 血清1 40的稀釋液間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法.實(shí)施例1、腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2的獲得1、腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2的分離本發(fā)明的發(fā)明人采集經(jīng)過臨床鑒定為手足口病患者血清樣品，然后進(jìn)行病毒分 離，病毒分離的方法樣品直接接種于Vero細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到95%時(shí)，收集病毒培養(yǎng)上 清液，經(jīng)過三輪的蝕斑純化后挑取單斑，感染Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒的增殖收集細(xì)胞懸液，得 到病毒液，最終，發(fā)明人從河南省采集的樣品中分離得到一株腸道病毒EV71型病毒，將該 腸道病毒EV71型病毒命名為腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2。隨后進(jìn)行 了病毒特性及致病性的研究。腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2，已于2010年4月2日保藏于 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰 西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCC No . 3675。2、形態(tài)學(xué)特征將步驟1獲得的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2感染Vero細(xì) 胞(Invitrogen公司)，具體增殖方法為待Vero細(xì)胞長(zhǎng)滿單層25cm2方瓶培養(yǎng)瓶瓶底時(shí)，先 用移液管吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，取2ml已經(jīng)凍融3次的病毒增殖懸液，IOOOrpm離心5-lOmin取 上清加入到培養(yǎng)瓶中，封口后放入37°C、5% CO2孵育2h，中間每個(gè)30min輕輕搖晃一次，2h 后吸出吸附液，補(bǔ)加8ml新鮮的含有2% FBS的DMEM維持液(向500ml DMEM液體中加入 IOml 胎牛血清、100X Antibiotic-AntimycoticUOOX NEAAUOOul HEPES，之后用實(shí)驗(yàn)室配 制的經(jīng)過0. 22um濾膜過濾除菌的7. 5% (質(zhì)量百分比)NaHCO3調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 0-7. 2， 上述液體均為GIBCO公司產(chǎn)品)，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)常觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)95% 的病變時(shí)收獲細(xì)胞。感染Vero細(xì)胞(Invitrogen公司)后，37°C培養(yǎng)48小時(shí)后離心收集 細(xì)胞沉淀做超薄片進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果表明在細(xì)胞胞漿內(nèi)可見20-30nm的圓形的病毒顆粒 (圖1和圖2)。3、理化性質(zhì)核型實(shí)驗(yàn)將步驟1分離得到的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株 2病毒液(用腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2感染Vero細(xì)胞，當(dāng)Vero 細(xì)胞出現(xiàn)95%左右的病變時(shí)，先吸出原有的細(xì)胞培養(yǎng)液，用一次性細(xì)胞刮刮起瓶底的細(xì)胞， 之后用原有的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后，2000rpm離心5-lOmin，收集上清后分裝 即為病毒液)分為加藥組和無藥組兩組，加藥組的細(xì)胞維持液加入5溴-2脫尿苷，使其終 溶度為50ug/ml，無藥組不做任何處理，之后用含有2% (體積百分比)胎牛血清的細(xì)胞 維持液(向 500mlDMEM 液體中加入 IOml 胎牛血清、100XAntibiotic-Antimycotic、100X NEAA、IOOul HEPES (上述液體均為GIBCO公司產(chǎn)品)，之后用實(shí)驗(yàn)室配置的經(jīng)過過濾除菌 的7. 5% NaHCO3(質(zhì)量百分比)調(diào)節(jié)溶液的pH值為7. 0-7. 2)進(jìn)行10倍系列稀釋(分別 IO-1UO-2UOA 10_4、10_5、10_6、10人10_8倍稀釋)，最后將各稀釋液接種于鋪滿單層Vero細(xì)胞 (Invitrogen公司)的96孔板中，每個(gè)稀釋度接種4孔，0. 2ml/孔，37°C培養(yǎng)24-72小時(shí)連 續(xù)觀察并記錄細(xì)胞生長(zhǎng)情況。結(jié)果加藥組和無藥組均出現(xiàn)細(xì)胞病變，并且滴度均為10_5，證 明步驟1分離得到的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2為RNA病毒。
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耐乙醚實(shí)驗(yàn)將步驟1分離得到的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離 株2病毒液(用腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2感染Vero細(xì)胞，當(dāng)Vero 細(xì)胞出現(xiàn)95%左右的病變時(shí)，先吸出原有的細(xì)胞培養(yǎng)液，用一次性細(xì)胞刮刮起瓶底的細(xì)胞， 之后用原有的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后，2000rpm離心5-lOmin，收集上清后分裝即 為病毒液)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組兩份，實(shí)驗(yàn)組用終濃度為20% (體積濃度)的乙醚溶液處 理，對(duì)照組不做任何處理，封口后都放入4°C放置過夜后，次日放入生物安全柜中使乙醚完 全揮發(fā)，用含有2% (體積濃度)胎牛血清的細(xì)胞維持液進(jìn)行10倍系列(分別10人10_2、 10_3、10_4、10_5、10_6、10_7、10_8、10_9、10,倍稀釋)稀釋，分別接種于鋪滿單層Vero細(xì)胞的96 孔板中，每個(gè)稀釋度分別接種個(gè)4孔，0. 2ml/孔，24-72小時(shí)連續(xù)觀察記錄細(xì)胞生長(zhǎng)情況。 結(jié)果兩組均出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，滴度均為10-4，證明步驟1分離得到的腸道病毒EV71型 (Enterovirus 71)河南分離株2為無囊膜病毒。4、血清學(xué)特征用步驟1分離得到的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2感染Vero 細(xì)胞制備抗原片，抗原片制備的方法如下所述實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備把抗原片擺放在抗原架上，每個(gè)架上排放2排，1排4個(gè)，完畢后用罩 子蓋上防止灰塵的進(jìn)入。之后按照下面步驟進(jìn)行1)待25cm2方瓶的Vero細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右的時(shí)候，用實(shí)驗(yàn)病毒株2ml感染細(xì) 胞1小時(shí)后，吸出吸附液，補(bǔ)加新鮮的細(xì)胞維持液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2)當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變的時(shí)候(約25%-50%)，按照細(xì)胞傳代的方法消化細(xì)胞， 用適量體積的培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞生長(zhǎng)液，具體配方向500mlDMEM液 體中加入 50ml 胎牛血清、100X Antibiotic-AntimycoticUOOX NEAA、lOOulHEPES，之后用 實(shí)驗(yàn)室配制的經(jīng)過0. 22um濾膜過濾除菌的7. 5% (質(zhì)量百分比)NaHCO3調(diào)節(jié)溶液的pH值 至7. 0-7. 2，上述液體均為GIBCO公司產(chǎn)品)；3ml)懸浮細(xì)胞，每個(gè)抗原孔加入40ul細(xì)胞懸 液，蓋上蓋子后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)；3)取一燒杯內(nèi)盛PBS溶液(0. 01mol/L pH = 7. 2)，將吸附后的抗原片緩緩放入溶 液中，浸泡Imin左右，取出放在工作臺(tái)內(nèi)晾干，約需30min ；4)將抗原片放入盛有丙酮(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純濃度99. 5% )的 燒杯中，-20 0C 30min或者過夜；5)取出晾干后保存于低溫(-40°C以下)冰箱中備用。間接免疫熒光法用山東臨床鑒定為手足口病恢復(fù)期患者的血清稀釋液以及熒光 標(biāo)記的IgG抗體分別進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，于顯微鏡下觀察并照相。血清制備方法經(jīng)過山東省成武縣醫(yī)院臨床鑒定為手足口病患者，采集其恢復(fù)期 患者血液放置于37°C培養(yǎng)箱孵育30min，經(jīng)800rpm離心15min后吸取上清得到。用0.00511 !1值為7.2的？85配制2% (質(zhì)量百分比)BSA(牛血清白蛋白)作為 血清稀釋液，血清在使用前56°C水浴滅活30min，之后將血清按照實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行稀釋后進(jìn) 行間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下1)從冰箱中取出抗原片，肉眼觀察上面的細(xì)胞是否脫落，如果有脫落孔，放棄不用；2)在抗原片上用蠟筆在吸附有抗原的畫圈周圍劃一圈，防止所加樣品溢流；3)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要稀釋所檢測(cè)的血清后加樣，每孔20-25ul，一般需要做復(fù)孔，故需要50ul，根據(jù)需要做倍比稀釋；例首濃度按照1 10，故需要加入IOul血清+90ul抗體稀釋液，在漩渦混合器 上充分混勻后取出50ul 1 10稀釋液+50ul血清稀釋液(1 20)，依此稀釋下去，一般稀 釋至1 160 ；4)把已經(jīng)加樣的抗原片放入鋪有塑料板的飯盒中，放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵 育 30min ；5)取出抗原片，放入洗板槽內(nèi)，向里面加入洗滌液(0. 005M PBS+0. 02% 分比) Tween 20)，在水平振蕩器上洗滌5min，重復(fù)3次；6)待抗原片完全風(fēng)干后，加入1 50稀釋的熒光抗體25ul/孔，放入飯盒后在 37°C>5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30min ；熒光抗體的稀釋取出針對(duì)所加入血清來源的適量熒光抗體，用0.02% (質(zhì)量 百分比)伊文斯蘭溶液按照1 50稀釋抗體，該實(shí)驗(yàn)所使用的抗體為FITC conjugate GoatAnti-Human IgG 購(gòu)自 Sigma 公司。7)重復(fù)步驟5);8)風(fēng)干后，滴加無菌水在熒光顯微鏡下觀察熒光情況并記錄結(jié)果。結(jié)果見圖3和圖4，根據(jù)間接免疫熒光檢測(cè)的原理，圖中的綠色點(diǎn)表明了所檢測(cè)人 血清中的抗體可以與抗原片上吸附固定的病毒抗原發(fā)生特異性的反應(yīng)，而且血清的效價(jià)可 以達(dá)到1 40。5、病毒全基因組序列測(cè)定和同源性分析按照步驟2的方法將步驟1分離得到的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南 分離株2感染Vero細(xì)胞后收集細(xì)胞以及培養(yǎng)上清，用試劑盒提取總的RNA，按照反轉(zhuǎn)錄酶的 說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。合成8對(duì)引物(F表示上游引物，R表示下游引物，引物序列均為5’-3’ 方向)具體如下Fl TTAAAACAGCTGTGGGTTG ；Rl :ACTTCCAGTACCATCCCTTG。F2 :ATGGTCGGCTATGGTGAGTG ；R2 :AGTGAGTGTTGCTGATCCATGGT。F3 TGTTCACTGGGTCCTTTATGGC ； R3 :ACCAGCATAATTTGGGTTGGCT。F4 :ACCATTCATGTCACCTGCGA ；R4 :CTAGATACGACACATTCCCAAA。F5 :ATCAGCAAATTCATGGATTGGCT ；R5 ATGACATACACTAGCGATACAAC F6 TGCTTGTCATGCAATCCATCGC ； R6 :TAGCAGGCTTCCTCCATACTCAT。F7 :ACTAAGCTAGAGCCCAGTGT ；R7 :TCACGACCAGATTTCTGGTG。F8 GAAAAATTTGTGAGCACAAT ； R8 :GCTATTCTGGTTATAACAAAT。之后按照上述合成的引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，用凝膠純 化試劑盒回收，之后送往上海英俊公司測(cè)序，經(jīng)DNAstar Seqman軟件拼接為全序列。采用 Blast、DNAstar、Meg Aligen 程序、Clustal W 軟件以及 MEGA 4. 0 軟件，對(duì)腸道病毒 EV71 型(Enterovirus 71)河南分離株2病毒株進(jìn)行同源性比對(duì)和核苷酸序列進(jìn)化進(jìn)行分析。 結(jié)果表明8個(gè)片段經(jīng)過拼接后組成基因組全長(zhǎng)約為7419個(gè)堿基(不包含poly (A)尾，序 列如序列表中序列1所示)?；蚪M編碼區(qū)起于自序列表中序列1的5’端第742位核苷 酸2，止于自序列表中序列1的5’端第7324位，共6582個(gè)堿基。5’和3’端各有一段非編 碼區(qū)，長(zhǎng)度分別為741nt和96nt。堿基統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，A含量最高，G含量最低，G+C含量為
648%。將測(cè)得的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2的VPl的全序列(序 列如序列表中序列1的5'第2437-3327位核苷酸)與不同流行區(qū)和不同時(shí)間分離的多株 腸道病毒EV71型病毒相對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明其與首都兒科研究所2007年 分離的BJ4211株(編碼VP1蛋白的序列如序列表中序列2 (GenBank :EU024958. 1))同源性 高達(dá)97. 4%，與EV-71標(biāo)準(zhǔn)株BrCr (序列表中序列3，編碼VP1蛋白的序列如序列表中序列 3的5'第2439-3329位核苷酸(GenBank :U22521. 1))在核苷酸和氨基酸的同源性分別為 82. 7%和95%，而與CoxA16則分另Ij (編碼VP1蛋白的序列如序列4(GenBank :AF177911. 1)) 為64. 2%和72%。用MegAligen程序進(jìn)行分析表明所分離的H2病毒株在進(jìn)化上屬于C4基 因亞型。二、腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2的致病性鑒定
將步驟1分離的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2在Vero細(xì)胞 上大量增殖后，并在其上測(cè)定病毒的TCID5tl，結(jié)果表明該病毒的滴度為2X 107。從北京軍 事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心領(lǐng)取2日齡Balb/c乳鼠進(jìn)行該分離株致病性研究。實(shí)驗(yàn)采用 IOOOTCID5ci攻擊乳鼠，腹腔接種和腦內(nèi)注射兩種不同的接種方式，而同時(shí)設(shè)立對(duì)照組接種 PBS溶液，共4組(每組接種乳鼠1窩，平均8只，雌雄均有，各個(gè)劑量組腹腔注射lOOul、腦 內(nèi)注射20ul)。連續(xù)觀察小鼠。結(jié)果表明，腦內(nèi)實(shí)驗(yàn)組乳鼠在接種病毒后3-6天出現(xiàn)體重 減輕、后肢偏癱、抽搐等癥狀，在接種后第3-5天乳鼠出現(xiàn)陸續(xù)死亡，未死亡的小鼠隨后癥 狀消失；而腹腔接種實(shí)驗(yàn)組癥狀同上，但是時(shí)間較腦內(nèi)接種的晚2-3天，小鼠陸續(xù)在接種第 5-8天出現(xiàn)死亡，未死亡的乳鼠隨后癥狀消失；而對(duì)照組小鼠未出現(xiàn)任何癥狀和死亡。21天 后根據(jù)小鼠的死亡數(shù)計(jì)數(shù)出LD5tl，為以后動(dòng)物模型的建立提供了依據(jù)。利用上述方法可以快速建立手足口病小鼠模型，為手足口病致病性和藥物篩選研 究提供材料。
權(quán)利要求
一株腸道病毒，其名稱為腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2，保藏登記號(hào)為CGMCC №.3675。
2.權(quán)利要求1所述的腸道病毒EV71型(Enterovirus71)河南分離株2在建立手足口 病動(dòng)物模型中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的腸道病毒EV71型(Enterovirus71)河南分離株2在制備手足口 病疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株腸道病毒及其應(yīng)用。該腸道病毒，其名稱為腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2，保藏登記號(hào)為CGMCC №.3675。該腸道病毒具有較強(qiáng)的致病性，可以用于手足口病動(dòng)物模型的建立和疫苗的開發(fā)。
文檔編號(hào)A61K39/125GK101906403SQ201010172178
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月7日
發(fā)明者吳曉燕, 常國(guó)輝, 林磊, 祝慶余, 羅彥軍 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所