專利名稱：一株腸道病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及 一株腸道病毒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
手足口病(Hand-Foot-mouth disease, HFMD)是由多種腸道病毒引起的常見傳染 病，近年來多爆發(fā)與亞太地區(qū)的熱帶區(qū)域，以嬰幼兒發(fā)病為主。引起手足口病的腸道病毒 包括腸道病毒EV71型(腸道病毒71，Enterovirus 71，簡稱EV-71)和A組的柯薩奇病毒 (CoxA)、?？瞬《?Echo)等。其中EV-71是引起手足口病的主要病原，常導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng) 系統(tǒng)綜合癥。EV-71是單股正鏈RNA病毒，分為A、B、C3個基因型，B1-B4及C1-C4共8個 亞型。該病以前雖有報道但多以散發(fā)病例出現(xiàn)，而09年在我國的安徽、河南和河北多個 地區(qū)呈爆發(fā)流行，對嬰幼兒健康造成了嚴(yán)重的危害。因此，了解該病毒的特性對該疾病的預(yù) 防和治療具有重要的指導(dǎo)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株腸道病毒及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的腸道病毒，是腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1， 它是20-30nm，圓形無囊膜的RNA病毒。腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1已于2010年4月2日保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC No 3674。將分離得到的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1在Vero細(xì) 胞上增殖并測得病毒的滴度后進行動物實驗，實驗證明，本發(fā)明的腸道病毒EV71型 (Enterovirus71)重慶分離株1為弱致病性毒株，為以后減毒疫苗的制備奠定了基礎(chǔ)。


圖1為腸道病毒EV71型重慶分離株1感染Vero細(xì)胞的電鏡結(jié)果(30000倍)圖2為腸道病毒EV71型重慶分離株1感染Vero細(xì)胞的電鏡結(jié)果(39000倍)圖3為腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1抗原片與手足口病患者 血清1 10的稀釋液間接免疫熒光檢測結(jié)果圖4為腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1抗原片與手足口病患者 血清1 40的稀釋液間接免疫熒光檢測結(jié)果
具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法.實施例1、腸道病毒 EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1的獲得
1、腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1的分離 本發(fā)明的發(fā)明人采集經(jīng)過臨床鑒定為手足口病患者血清樣品，然后進行病毒分 離，病毒分離的方法是將樣品直接接種于Vero細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到95%時，收集病毒培 養(yǎng)上清液，經(jīng)過三輪的蝕斑純化后挑取單斑，感染Vero細(xì)胞進行病毒的增殖收集細(xì)胞懸 液，得到病毒液，最終，發(fā)明人從重慶采集的樣品中分離得到一株EV-71型病毒命名為腸道 病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1。隨后進行了病毒特性及致病性的研究。腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1，已于2010年4月2日保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC No . 3674。2、形態(tài)學(xué)特征將步驟1獲得的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1感染Vero細(xì) 胞(Invitrogen公司)，具體增殖方法為待Vero細(xì)胞長滿單層25cm2方瓶培養(yǎng)瓶瓶底時，先 用移液管吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，取2ml已經(jīng)凍融3次的細(xì)胞懸液，IOOOrpm離心5-lOmin取上清 加入到培養(yǎng)瓶中，封口后放入37°C、5% CO2孵育2h，中間每個30min輕輕搖晃一次，2h后吸 出吸附液，補加8ml新鮮的含有2% FBS的DMEM維持液(向500mlDMEM液體中加入IOm胎 牛血清、IOOX Antibiotic-AntimycoticUOOX NEAA, lOOulHEPES,之后用實驗室配制的經(jīng) 過0. 22um濾膜過濾除菌的7. 5% (質(zhì)量百分比)NaHCO3調(diào)節(jié)溶液的pH值至7. 0-7. 2，上述 液體均為GIBCO公司產(chǎn)品)，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)95%的病變時 收獲細(xì)胞。感染Vero細(xì)胞(Invitrogen公司)后，37°C培養(yǎng)48小時后離心收集細(xì)胞沉淀 做超薄切片進行電鏡觀察，結(jié)果表明在細(xì)胞胞漿內(nèi)可見20-30nm的圓形的病毒顆粒(圖1 和圖2)。3、理化性質(zhì)核型實驗將步驟1分離得到的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株 1病毒液(用腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1感染Vero細(xì)胞，當(dāng)感染后 的Vero細(xì)胞出現(xiàn)95%左右的病變時，先吸出原有的細(xì)胞培養(yǎng)液，用一次性細(xì)胞刮刮起瓶底 的細(xì)胞，之后用原有的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后，2000rpm離心5-lOmin，收集上清 后分裝即為病毒液)分為加藥組和無藥組兩組，加藥組的細(xì)胞維持液加入5溴-2脫尿苷， 使其終溶度為50ug/ml，無藥組不做任何處理，之后用含有2% (體積百分比)胎牛血清的 細(xì)胞維持液(向 500mlDMEM液體中加入 IOml 胎牛血清、lOOXAntibiotic-Antimycotic、IOOX NEAA、IOOul HEPES,之后用實驗室配置的經(jīng)過過濾除菌的7. 5% NaHC03(5!M^tfc)調(diào)節(jié)溶液的 PH值為7. 0-7. 2。上述液體均為GIBCO公司產(chǎn)品)進行10倍系列稀釋(分別10—1、10_2、10_3、 10_4、10_5、10_6、ΙΟ"7, ΙΟ"8倍稀釋)。最后將各稀釋液接種于鋪滿單層Vero細(xì)胞(Invitrogen 公司)的96孔板中，每個稀釋度接種4孔，0. 2ml/孔，37°C培養(yǎng)24-72小時連續(xù)觀察記錄細(xì) 胞生長情況。結(jié)果加藥組和無藥組均出現(xiàn)細(xì)胞病變，并且滴度均為10_5，證明步驟1分離得 到的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1為RNA病毒。耐乙醚實驗將步驟1分離得到的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離 株1病毒液(用腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1感染Vero細(xì)胞，當(dāng)感染 后的Vero細(xì)胞出現(xiàn)95%左右的病變時，先吸出原有的細(xì)胞培養(yǎng)液，用一次性細(xì)胞刮刮起瓶 底的細(xì)胞，之后用原有的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后，2000rpm離心5-lOmin，收集上清后分裝即為病毒液)分為實驗組和對照組兩份，實驗組用終濃度為20% (體積百分比) 的乙醚溶液處理，對照組不做任何處理，封口后都放入4°C放置過夜后，次日放入生物安全 柜中使乙醚完全揮發(fā)，用含有2% (體積百分比)胎牛血清的細(xì)胞維持液進行10倍系列 (分別 10-\10-2,10_3、10_4、10_5、10_6、10_7、10_8、10_9、10_10 倍稀釋)稀釋，分別接種于鋪滿單 層Vero細(xì)胞的96孔板中，每個稀釋度分別接種個4孔，0. 2ml/孔，24-72小時連續(xù)觀察記 錄細(xì)胞生長情況。結(jié)果兩組均出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，滴度均為10_4，證明步驟1分離得到的 腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1為無囊膜病毒。4、血清學(xué)特征用步驟1分離得到的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1感染Vero 細(xì)胞制備抗原片，抗原片制備的方法如下所述實驗前準(zhǔn)備把抗原片擺放在抗原架上，每個架上排放2排，1排4個，完畢后用罩 子蓋上防止灰塵的進入。之后按照下面步驟進行1)待25cm2方瓶的Vero細(xì)胞生長至80%左右的時候，用實驗病毒株2ml感染細(xì) 胞1小時后，吸出吸附液，補加新鮮的細(xì)胞維持液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；2)當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變的時候(約25%-50%)，按照細(xì)胞傳代的方法消化細(xì)胞， 用適量體積的培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞生長液，具體配方向500mlDMEM液 體中加入 50ml 胎牛血清、100X Antibiotic-AntimycoticUOOX NEAA、lOOulHEPES，之后用 實驗室配制的經(jīng)過0. 22um濾膜過濾除菌的7. 5% (質(zhì)量百分比)NaHCO3調(diào)節(jié)溶液的pH值 至7. 0-7. 2，上述液體均為GIBCO公司產(chǎn)品)；3ml)懸浮細(xì)胞，每個抗原孔加入40ul細(xì)胞懸 液，蓋上蓋子后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)8小時；3)取一燒杯內(nèi)盛PBS溶液(0. 01mol/L pH = 7. 2)，將吸附后的抗原片緩緩放入溶液中，浸泡Imin左右，取出放在工作臺內(nèi)晾干，約需30min ；4)將抗原片放入盛有丙酮(國藥集團化學(xué)試劑有限公司分析純濃度彡99. 5% ) 的燒杯中，-20 0C 30min或者過夜；5)取出晾干后保存于低溫(-40°C以下)冰箱中備用。間接免疫熒光法用山東臨床鑒定為手足口病恢復(fù)期患者的血清稀釋液以及熒光 標(biāo)記的IgG抗體分別進行間接免疫熒光檢測，于顯微鏡下觀察并照相。血清制備方法經(jīng)過山東省成武縣醫(yī)院臨床鑒定為手足口病患者，采集其恢復(fù)期 患者血液放置于37°C培養(yǎng)箱孵育30min，經(jīng)800rpm離心15min后吸取上清得到。用0.005厘？!1值為7.2的？85配制2% (質(zhì)量百分比)BSA(牛血清白蛋白)作為 血清稀釋液，血清在使用前56°C水浴滅活30min，之后將血清按照實驗要求進行稀釋后進 行間接免疫熒光實驗，具體實驗步驟如下1)從冰箱中取出抗原片，肉眼觀察上面的細(xì)胞是否脫落，如果有脫落孔，放棄不 用；2)在抗原片上用蠟筆在吸附有抗原的畫圈周圍劃一圈，防止所加樣品溢流；3)根據(jù)實驗的需要稀釋所檢測的血清后加樣，每孔20-25ul，一般需要做復(fù)孔，故 需要50ul，根據(jù)需要做倍比稀釋；例首濃度按照1 10，故需要加入IOul血清+90ul抗體稀釋液，在漩渦混合器 上充分混勻后取出50ul 1 10稀釋液+50ul血清稀釋液(1 20)，依此稀釋下去，一般稀釋至1 160 ；
4)把已經(jīng)加樣的抗原片放入鋪有塑料板的飯盒中，放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中孵 育 30min ；5)取出抗原片，放入洗板槽內(nèi)，向里面加入洗滌液(0. 005M PBS+0. 02% (體積百分比) Tween 20)，在水平振蕩器上洗滌5min，重復(fù)3次；6)待抗原片完全風(fēng)干后，加入1 50稀釋的熒光抗體25ul/孔，放入飯盒后在 37°C>5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30min ；熒光抗體的稀釋取出針對所加入血清來源的適量熒光抗體，用0.02% (質(zhì)量 百分比)伊文斯蘭溶液按照1 50稀釋抗體，該實驗所使用的抗體為FITC conjugate GoatAnti-Human IgG 購自 Sigma 公司。7)重復(fù)步驟5);8)風(fēng)干后，滴加無菌水在熒光顯微鏡下觀察熒光情況并記錄結(jié)果。結(jié)果見圖3和圖4，根據(jù)間接免疫熒光檢測的原理，圖中的綠色點表明了所檢測人 血清中的抗體可以與抗原片上吸附固定的病毒抗原發(fā)生特異性的反應(yīng)，而且血清的效價可 以達(dá)到1 40。5、病毒全基因組序列測定和同源性分析按照步驟2的方法將步驟1分離得到的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶 分離株1感染Vero細(xì)胞后收集細(xì)胞以及培養(yǎng)上清，用試劑盒提取總的RNA，按照反轉(zhuǎn)錄酶的 說明書進行反轉(zhuǎn)錄。合成8對引物(F表示上游引物，R表示下游引物，引物序列均為5’-3’ 方向)，具體如下Fl TTAAAACAGCTGTGGGTTG ；Rl :ACTTCCAGTACCATCCCTTG。F2 :ATGGTCGGCTATGGTGAGTG ；R2 :AGTGAGTGTTGCTGATCCATGGT。F3 TGTTCACTGGGTCCTTTATGGC ； R3 :ACCAGCATAATTTGGGTTGGCT。F4 :ACCATTCATGTCACCTGCGA ；R4 :CTAGATACGACACATTCCCAAA。F5 :ATCAGCAAATTCATGGATTGGCT ；R5 ATGACATACACTAGCGATACAAC F6 TGCTTGTCATGCAATCCATCGC ； R6 :TAGCAGGCTTCCTCCATACTCAT。F7 :ACTAAGCTAGAGCCCAGTGT ；R7 :TCACGACCAGATTTCTGGTG。F8 GAAAAATTTGTGAGCACAAT ； R8 :GCTATTCTGGTTATAACAAAT。之后按照上述合成的引物進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，用凝膠純 化試劑盒回收，之后送往上海英俊公司測序，經(jīng)DNAstar Seqman軟件拼接為全序列。采用 Blast、DNAstar、Meg Aligen 程序、Clustal W 軟件以及 MEGA 4. 0 軟件，對 EV-71 病毒株進 行同源性比對和核苷酸序列進化進行分析。結(jié)果表明8個片段經(jīng)過拼接后組成基因組全 長，約7422個堿基(不包含poly (A)尾，序列如序列表中序列1所示)。基因組編碼區(qū)起 于自序列表中序列1的5’端第744位核苷酸，止于自序列表中序列1的5’端第7326位， 共6582個堿基。5’和3’端各有一段非編碼區(qū)，長度分別為743nt和97nt。堿基統(tǒng)計結(jié)果 表明，A含量最高，G含量最低，G+C含量為48%。將測得的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1的VPl的全序列(序列如序列表中序列1的5'第2439-3329位核苷酸) 與不同流行區(qū)和不同時間分離的多株EV-71型病毒相對應(yīng)序列進行同源性比對，結(jié)果表明 其與本實驗室分離腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)河南分離株2同源性高達(dá)95. 3%，與首都兒科研究所2007年分離的BJ4211株同源性高達(dá)95. 4% (編碼VPl蛋白的序列如序 列表中序列2 (GenBank :EU024958. 1))，與EV-71標(biāo)準(zhǔn)株BrCr (序列表中序列3，編碼VP1蛋 白的序列如序列表中序列3的5'第2439-3329位核苷酸(GenBank :U22521. 1))在核苷酸 和氨基酸的同源性分別為83. 4%和95. 3%，而與CoxAie (編碼VP1蛋白的序列如序列表中 序列4(GenBank :AF177911. 1))則分別為59. 5%和64. 2%。用Meg Aligen程序進行分析 表明所分離的C1V1病毒株在進化上屬于C4基因亞型。二、腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1的致病性鑒定將步驟1分離的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1在Vero細(xì)胞 上大量增殖后，并在其上測定病毒的TCID5tl，結(jié)果表明該病毒的滴度為1X107。從北京軍事 醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心領(lǐng)取2日齡Balb/c乳鼠進行該分離株致病性研究。實驗采取腹 腔接種和腦內(nèi)注射兩種不同的接種方式，病毒的接種量為IOOOTCID5ci，同時設(shè)立對照組接種 PBS溶液，共4組(每組接種乳鼠1窩，平均8只，雌雄均有，各個劑量組腹腔注射lOOul、腦 內(nèi)注射20ul)。連續(xù)觀察小鼠結(jié)果表明，實驗組 小鼠在接種后第3-7天內(nèi)出現(xiàn)體重稍微減 輕、精神狀態(tài)不佳外，與對照組小鼠無任何差異，連續(xù)觀察21天，實驗組小鼠無死亡。結(jié)果 表明，分離得到的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1為弱致病性毒株，為以 后減毒疫苗的制備提供了依據(jù)。
權(quán)利要求
一株腸道病毒，其名稱為腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1，保藏登記號為CGMCC №.3674。
2.權(quán)利要求1所述的腸道病毒EV71型(Enterovirus71)重慶分離株1在制備手足口 病減毒疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株腸道病毒及其應(yīng)用。該腸道病毒，其名稱為腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1，保藏登記號為CGMCC №.3674。實驗證明，本發(fā)明的腸道病毒EV71型(Enterovirus 71)重慶分離株1為弱致病性毒株，為以后減毒疫苗的制備奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號A61K39/125GK101864399SQ20101017225
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月7日
發(fā)明者吳曉燕, 常國輝, 林磊, 祝慶余, 羅彥軍 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所