專利名稱：醋炙黃連炮制品的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醋炙黃連的新用途，具體地，是在制備胰島素增敏劑及PPAR Y激 動(dòng)劑的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
據(jù)世界衛(wèi)生組織《2008年世界衛(wèi)生報(bào)告》城市化、老齡化和全球性的生活方式變 化三者結(jié)合，使糖尿病等慢性非傳染性疾病成為越來(lái)越主要的疾病和死亡原因。據(jù)中華醫(yī) 學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)《中國(guó)2型糖尿病防治指南(2007版)》:中國(guó)糖尿病患病人群中，以2型 糖尿病為主(占93. 7% )，2025年預(yù)計(jì)將達(dá)到5500萬(wàn)人。糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”病范疇， 中醫(yī)藥理論認(rèn)為“消渴”的病機(jī)因恣食肥甘，或情志過(guò)極、房事不節(jié)、熱病之后等，郁熱內(nèi) 蘊(yùn)，氣化失常，津液精微不能正常輸布而下泄，陰虛燥熱(GB/T 16751. 1-1997中醫(yī)臨床診 療術(shù)語(yǔ)疾病部分)?！胺卜e久飲酒，未有不成消渴?！?唐代《千金方》)黃連為常用中藥，中醫(yī)很早就認(rèn)識(shí)到“治消渴”的用途，歷代本草及名醫(yī)驗(yàn)案多有 記載，梁代《名醫(yī)別錄》記載“止消渴”；唐代《新修本草》記載“黃連，療渴為最”；清代《本草 備要》記載“單用能治消渴”。中藥黃連也為治療消渴病(糖尿病)的中成藥處方中常用藥味，2006年國(guó)內(nèi) 醫(yī)院糖尿病用藥分析結(jié)果表明，在排名前十位的產(chǎn)品中，糖脈康顆粒(含黃連，市場(chǎng)分額 22. 1 %，約1億元)、金芪降糖片(含黃連，市場(chǎng)分額11. 6%，約5000萬(wàn)元)，分列第2、4位， 在中醫(yī)臨床中廣泛應(yīng)用。但在中醫(yī)臨床實(shí)踐中甚至提出“黃連不是治療消渴病(糖尿病) 的主藥”。目前黃連治療消渴病(糖尿病)的研究主要集中在生品黃連及單一有效成分(小 檗堿)及生品黃連中提取的黃連總堿上，[黃笑夏，歐陽(yáng)欽.黃連免煎顆粒治療肝原性糖 尿病臨床觀察.天津藥學(xué).2008，20 (3) 41-42]等報(bào)道，在臨床單獨(dú)使用胰島素及黃連素 免煎顆粒與胰島素聯(lián)合應(yīng)用均能有效降低血糖，但黃連素免煎顆粒與胰島素聯(lián)合應(yīng)用效 果更好，且黃連素免煎顆粒與胰島素聯(lián)合應(yīng)用組血糖值控制得更為穩(wěn)定。[Li-Qin Tang, Wei Wei，Li—MingChen，et al. Effects of berberine on diabetes induced by alloxan anda high-fat/high-cholesterol diet in rats. Journal ofEthnopharmacology. 2006, 108 (1) : 109 115]報(bào)道，對(duì)飲食誘導(dǎo)的糖尿病高脂血癥大鼠模型(高脂/高膽固醇/四氧 嘧啶)，小檗堿抑制了糖尿病進(jìn)程，作用機(jī)制可能與降血糖、調(diào)節(jié)血脂代謝等作用相關(guān)。[朱 紅衛(wèi)，唐禮可.黃連總堿對(duì)小鼠降糖作用研究.云南中醫(yī)中藥雜志.2008，29 (7) :59 60] 報(bào)道，黃連總堿具有顯著降血糖作用，對(duì)正常小鼠的血糖水平?jīng)]有影響。小檗堿對(duì)改善2型 糖尿病患者胰島素抵抗方面有明確作用，而黃連各種飲片規(guī)格都含有小檗堿成分，不同的 黃連炮制品的功效也有不同，而且含有小檗堿成分的黃柏、三顆針等中藥臨床效用也有不 同，為中醫(yī)臨床處方用藥所困惑，早在清代《修事指南》就指出“炮制不明，藥性不確，則湯方 無(wú)準(zhǔn)而病癥不驗(yàn)也”，因此本發(fā)明發(fā)掘本草經(jīng)驗(yàn)，系統(tǒng)研究了醋炙黃連“治消渴”用途，對(duì)防 治與胰島素抵抗相關(guān)的代謝綜合征、糖尿病或并發(fā)癥具有一定的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種醋炙黃連炮制品的新用途。本發(fā)明還提供了一種 含有醋炙黃連為原料藥的藥物組合物。本發(fā)明提供了醋炙黃連在制備胰島素增敏劑及PPARY激動(dòng)劑的藥物中的用途。 所述的醋炙黃連可由下列文獻(xiàn)方法制備冉懋雄，郭建民.現(xiàn)代中藥炮制手冊(cè).北京中國(guó) 中醫(yī)藥出版社出版，2002:424，結(jié)合《中國(guó)藥典》2005年版藥材炮制通則(醋炙法)項(xiàng)下方 法醋炙，取凈藥材，加醋拌勻，悶透，置鍋內(nèi)，炒至規(guī)定的程度時(shí)，取出，放涼。每100kg凈藥 材，用醋20kg，必要時(shí)可加適量水稀釋。所述的藥物是胰島素增敏劑及PPARY激動(dòng)劑的藥物中的用途。與生品黃連、小檗 堿比較，顯著增加PPAR y表達(dá)量，可以顯著改善胰島素抵抗，是具有開發(fā)前景的胰島素增 敏劑。其中，所述的藥物是具有抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化、提高3T3-L1前脂肪細(xì)胞葡 萄糖利用率的藥物或胰島素增敏劑。其中，所述的藥物是降低血脂功能、改善胰島素抵抗的藥物。所述的藥物是治療糖 尿病及其并發(fā)癥的藥物。所述的醋炙黃連的主要指標(biāo)成分包括藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴 馬汀、小檗堿及其以上生物堿成分的鹽酸鹽，其中，所述的藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、 黃連堿、巴馬汀、小檗堿的重量配比為4-7 5-10 14-15 29-33 24-27 100。進(jìn)一步地優(yōu)選地，所述的藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿 的重量配比為4. 71-6. 81 5.62-9.09 14. 22-14. 94 29. 14-32. 58 24.50_26.il 10 0o更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿 的重量配比為 5. 76,7. 36,14. 58,30. 86,25. 30、100。本發(fā)明還提供了一種具有抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化、提高3T3-L1前脂肪細(xì)胞 葡萄糖利用率的藥物組合物，它是由下述方法制備而成取凈醋炙黃連，加水煎煮1 3次， 每次0. 5 3小時(shí)，每次加水量為6 10倍量，濾過(guò)，合并提取液，濃縮，備用，加入藥學(xué)上 可接受的輔料或輔助性成分制備成藥學(xué)上常用的制劑。進(jìn)一步優(yōu)選地，它是由下述方法制備而成取凈醋炙黃連，加水煎煮3次，每次3小 時(shí)，每次加水量為10倍量，濾過(guò)，合并提取液，濃縮，備用。其中，所述的制劑是口服制劑。本發(fā)明涉及的醋炙黃連及其提取浸膏，具有抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化功能的 藥物，可用于改善胰島素抵抗及治療糖尿病及其并發(fā)癥，具有明確的藥效，且藥效優(yōu)于鹽酸 小檗堿和生品黃連及其提取浸膏。以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。


圖1醋炙黃連提取浸膏對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞模型增殖影響
圖2顯微鏡下的3T3-L1前脂肪細(xì)胞及3T3-L1脂肪細(xì)胞(X200)(其中圖2A 3T3-L1前脂肪細(xì)胞；圖2B :3T3-L1脂肪細(xì)胞；圖2C :3T3_L1脂肪細(xì)胞(油紅0染色)圖3醋炙黃連提取浸膏對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞株分化的影響圖4醋炙黃連提取浸膏對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型葡萄糖利用的影響圖5醋炙黃連對(duì)PPAR y表達(dá)的影響(Western blot法)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明醋炙黃連炮制品的制備取凈黃連，照醋炙法(附錄II D)炒干，每100kg黃連，用醋20kg。實(shí)驗(yàn)例2本發(fā)明醋炙黃連炮制品提取浸膏的制備取醋炙黃連，加水煎煮3次，每次3小時(shí)，每次加水量為10倍量，濾過(guò)，合并提取 液，濃縮，備用。根據(jù)上述工藝，提取制備了醋炙黃連、生品黃連的提取浸膏，在總生物堿測(cè)定的基 礎(chǔ)上還測(cè)定了總多糖的含量?？偵飰A的測(cè)定方法精密稱取浸膏0. 4g，至25mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖 勻，照柱色譜法試驗(yàn)。精密量取5mL，置已處理好的氧化鋁柱(內(nèi)徑約0. 9cm,中性氧化鋁 5g，濕法裝柱，用乙醇30mL預(yù)洗)上，用乙醇35mL洗脫，收集洗脫液置50mL量瓶中，用乙醇 稀釋至刻度，搖勻。精密量取2mL轉(zhuǎn)置50mL量瓶中，用0.05mol/l H2S04溶液，稀釋至刻度， 搖勻。按照紫外分光光度法，在345nm波長(zhǎng)處，測(cè)定吸收度，按鹽酸小檗堿的吸收系數(shù)為728 計(jì)算，即得?？偠嗵堑臏y(cè)定方法精密稱取已經(jīng)提取好的黃炮制品品提取浸膏，置離心管中，加 無(wú)水乙醇至80%，離心lOmin (3000r/min)，棄去上清液，用80%乙醇多次洗滌沉淀，至離心 上清液無(wú)色，沉淀用沸水分次使溶解，離心，上清液轉(zhuǎn)移置100mL量瓶中，精密吸取5mL轉(zhuǎn)移 置25mL量瓶中，加水稀釋至刻度，作為供試品。分別吸取供試品溶液、葡萄糖對(duì)照品溶液 (0. 06mg/mL) 2mL至具塞試管中，加入蒽酮試劑8mL，渦旋30s，沸水lOmin，冷卻至室溫，在 620nm處測(cè)定其吸光度，計(jì)算以葡萄糖計(jì)算的黃連總多糖的含量。表1不同黃連炮制品提取浸膏總生物堿/總多糖測(cè)定結(jié)果
MMnrrnnT-^-^^-iimMljrr............||…丨丨mmiMitmramtmmMimTgf.Twiaiwiiiii丨III ................................................................................MWW'iiirqTi............................:! i”TiOTffr_iiifmiiiir"TjW(mM:iMHrJUMjjlK'irmiiniiinTj—HaiganwmrMinmiini'iiMiiiWilKa
樣品名稱總生物堿含量(g/100g浸膏)總多糖含量(g/100g浸膏)總生物堿/總多糖比率(倍)
'I…..........................ii 11in ii iii.i_mr"iriiiiiii.T...i wMwwi.uiiii—T......_i, n__ ijurijfiwr.iwtiHiitiiOTiwrnriiiiiiiiTirtfMimr.nwi—nim"!....".””!^!^'-!---'--!.!.!'-'!]，”...........................................................................................
醋炙黃連1.080.79868.86
生品黃連7.600.704410.81
vmmmmmmmm-nt-iir^K^imimm hhi i ................ ■ ii__i iiiiirr___Mi hiimi iiiwir i ijiiii ■■!ii'riiiiiiiiiiiiiiiriiitfff<iii'imiii ii i)ii<riiir1 'ii<ii i iiiiiiir"Mn _丨丨廠'1丨廠廠'丨'丨1盯丨|_丨 m'" ir iiT"W"iiiii""iiiiiii 'i_iiiii……imi …niiiniTnv-f........wrr.......由上數(shù)據(jù)可知，生品黃連中總生物堿含量和總多糖含量高于醋炙黃連。實(shí)施例3醋炙黃連的質(zhì)量控制方法(1)薄層色譜鑒別取本品粉末0. lg，加甲醇50ml，超聲處理30min，濾液作為供試品溶液。取鹽酸藥 根堿照品、非洲防己堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀及鹽酸小檗堿加甲醇制成 每1ml含0. lmg的溶液，作為對(duì)照品溶液。精密量取各對(duì)照品溶液1. 5ml加入同一 10ml量 瓶中，以甲醇稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2005年版一部 附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10 yl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-氨水-三乙胺(3 3.5 1 1.5 0.5 1)并以氨水預(yù)飽和 20min后，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相 應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。(2)含量測(cè)定方法采用XtimateTM C18(4. 6mmX 250mm, 5 u m)色譜柱，以 0. 三乙胺(碳酸 氫銨，氨水調(diào)PH為10)為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫；流速lmL.min-l，柱溫 30 °C，檢測(cè)波長(zhǎng) 270nm。結(jié)果鹽酸藥根堿在 0. 848 u g. ml/1 16. 96 u g. ml/1 (r = 0. 9997)、 非洲防己堿在 1. 248 u g. ml/1 24. 96 u g. ml/1 (r = 0. 9999)、表小檗堿在 2. 048 u g. ml/1 40. 96 u g. mL_1 (r = 0. 9999)、黃連堿在 3. 648 ii g. mL_1 72. 96 u g. mL_1 (r = 0. 9999)、 巴馬汀在 2. 88 u g. mL-1 57.6iig. mL-1 (r = 0. 9998)、鹽酸小檗堿在 13. 248 u g. mL-1 264. 96 ug. mL—1，(r = 0. 9996)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。加樣回收率及其RSD分別為102.4% (RSD 為 1. 17 % )、101. 8 % (RSD 為 1. 30 % )、100. 3 % (RSD 為 1. 76 % )、100. 7 % (RSD 為 1. 75% )U01. 2% (RSD 為 1.53% )和 97.9% (RSD 為 1. 97% ) 樣品重復(fù)性良好，在 12h 內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)論方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好，可用于醋炙黃連中6種生物堿的含量測(cè) 定。表醋炙黃連的含量測(cè)定結(jié)果 對(duì)以上含量測(cè)定數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行進(jìn)行兩樣本均數(shù)的比較分析 (Independent-Samples T Test)，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明與生品飲片比較，醋炙黃連中非洲防 己堿含量有顯著性變化(P = 0. 043)，非洲防己堿可能是醋炙黃連中與藥效生物效應(yīng)相關(guān) 的重要成分之一。表醋炙黃連含量測(cè)定結(jié)果(比例含量，以鹽酸小檗堿含量為100計(jì)算) 按統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的99%置信區(qū)間(下限值，上限值)，1/2 = 2.56(0 =0.01)下 限值=平均值-Ua/2x標(biāo)準(zhǔn)偏差，上限值=平均值+Ua/2X標(biāo)準(zhǔn)偏差綜上所述，醋炙黃連中，藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿的 重量配比為4. 71-6. 81,5. 62-9. 09,14. 22-14. 94,29. 14-32. 58,24. 50-26. 11,100 或 4-7、 5-10、14-15、29-33、24-27、100。以下通過(guò)藥效學(xué)試驗(yàn)證明本發(fā)明的有益效果。試驗(yàn)例1醋炙黃連提取浸膏對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增值的影響3T3-L1前脂肪細(xì)胞株是小鼠胚胎來(lái)源、具有纖維母細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞株，在經(jīng)典的 激素雞尾酒，即胰島素、地塞米松和1-甲基-3-異丁基黃嘌呤的刺激下，具有分化為成熟脂 肪細(xì)胞的能力，是目前國(guó)際上研究肥胖及體外脂肪細(xì)胞增殖和分化的細(xì)胞模型。通過(guò)干預(yù) 小鼠前脂肪細(xì)胞觀察其對(duì)該細(xì)胞增殖和分化的影響，為肥胖的2型糖尿病的治療提供可能 的途徑。方法將3T3-L1前脂肪細(xì)胞懸液按5X 105/ml的密度接種到48孔培養(yǎng)板，于含 10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37°C、5% C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)，2d換液1次。 待3T3-L1前脂肪細(xì)胞貼壁后，按設(shè)計(jì)劑量分別加入不同濃度的受試藥物干預(yù)，空白對(duì)照組 培養(yǎng)液中加入等體積藥物溶劑PBS，每濃度組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。在37°C、體積分?jǐn)?shù)5% C02中 培養(yǎng)2d。48h后，PBS漂洗，加入DMEM高糖培養(yǎng)液400 yl及5mg/ml MTT 40 u 1，孵育4h。 吸去培養(yǎng)液，并加入溶媒DMSO 300ia，490nm測(cè)定各組的0D值。計(jì)算3T3-L1前脂肪細(xì)胞 增殖變化率。相對(duì)變化率(％ )=(實(shí)驗(yàn)組平均0D值/空白對(duì)照組平均0D值-1) X 100%表2醋炙黃連提取浸膏對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響 增殖率1 各劑量組相對(duì)空白組的增殖變化率；增殖率2 醋炙組相對(duì)于同劑量組生品的增殖變化率。注與正常組比較，*P< 0. 05，**P < 0. 01 ；由表2、圖1可知，醋炙黃連促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖作用優(yōu)于黃連生品。試驗(yàn)例2醋炙黃連提取浸膏對(duì)對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響方法將3T3-L1前脂肪細(xì)胞懸液按5X 105/ml的密度接種到48孔培養(yǎng)板，于含 10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37°C、5% C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)，2d換液1次。 待3T3-L1前脂肪細(xì)胞達(dá)到接觸抑制后，用含1 P mol/L的Dex、0. 5mmol/L IBMX及5mg/L胰 島素的DMEM完全培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，48h后撤去Dex和IBMX，用10mg/L胰島素再繼續(xù)作用 48h，換正常完全培養(yǎng)液培養(yǎng)8 12天，隔天換液，直至3T3-L1細(xì)胞90 %多呈脂肪細(xì)胞表型 時(shí)。在誘導(dǎo)分化的同時(shí)，按表2設(shè)計(jì)劑量分別加入不同濃度的受試藥物干預(yù)，空白對(duì)照組培 養(yǎng)液中加入等體積藥物溶劑PBS，每濃度組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。藥物與分化培養(yǎng)液同步更換至分 化結(jié)束。誘導(dǎo)分化結(jié)束后，吸去培養(yǎng)液，細(xì)胞經(jīng)PBS清洗3次后，用4%多聚甲醛溶液固定 細(xì)胞lOmin，吸去固定液，PBS漂洗，加入油紅0染液室溫染色15min。棄去油紅0染液，PBS 漂洗3次除去多余染液；置顯微鏡下觀察，拍片；加入異丙醇，抽提脂肪細(xì)胞中油紅0，510nm 測(cè)定0D值，計(jì)算細(xì)胞分化相對(duì)變化率。分化相對(duì)變化率(％ )=(實(shí)驗(yàn)組平均0D值/空白對(duì)照組平均0D值-1) X 100%由圖2可知，未分化的3T3-L1前脂肪細(xì)胞呈梭形，胞漿中無(wú)脂滴存在，形態(tài)與成纖 維細(xì)胞相似(圖2-A)。3T3-L1前脂肪細(xì)胞在地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和胰島 素的共同作用下，逐漸誘導(dǎo)分化成為成熟的脂肪細(xì)胞，胞漿內(nèi)出現(xiàn)脂滴，并隨著分化程度的 加深而積聚增多(圖2-B)。油紅0為脂肪特征性染色劑，染色后胞漿中的脂滴呈紅色(圖 2-C)。表3醋炙黃連提取浸膏對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞株分化的影響(^敘，n=6) 注與正常組比較，*P<0.05，**P < 0. 01 ；分化率1 各劑量組相對(duì)空白組的分化變化率；分化率2 醋炙組相對(duì)于同劑量組生品的分化變化率。由表3，圖3可知，與正常組比較，醋炙黃連炮制品在一定劑量下能明顯或部分抑 制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化(P < 0. 01)，這與陽(yáng)性藥馬來(lái)酸羅格列酮作用恰好相反，其中 尤以醋炙黃連H組的濃度下抑制作用最為明顯，抑制率達(dá)到32% ；同時(shí)，與黃連生品相比 較，醋炙黃連最高抑制分化率明顯高于黃連生品。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，醋炙黃連在一定劑量下抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化，提示 醋炙黃連炮制品可能不會(huì)引起脂肪的聚集而造成體重增加，這對(duì)防治與胰島素抵抗相關(guān)的 代謝綜合征或并發(fā)癥具有一定的意義。綜上試驗(yàn)結(jié)果，醋炙黃連對(duì)上述改善作用優(yōu)于黃連生品。試驗(yàn)例3醋炙黃連提取浸膏對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞胰島素抵抗(IR)模型葡萄糖利 用的影響方法細(xì)胞分化完全后，除空白組加入正常培養(yǎng)基，其余各組均加入1 P mol/L的 地塞米松、lymol/L的胰島素進(jìn)行脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗，作用3d。待脂肪細(xì)胞胰島素抵 抗成立后，換用無(wú)酚紅DMEM高糖培養(yǎng)基，按設(shè)計(jì)劑量分別加入不同濃度的受試藥物干預(yù) 3d，空白對(duì)照組培養(yǎng)液中加入等體積藥物溶劑PBS，每濃度組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，觀察藥物對(duì)胰 島素抵抗的改善作用。72h后取細(xì)胞培養(yǎng)上清液505nm比色測(cè)定葡萄糖的含量，計(jì)算細(xì)胞葡 萄糖利用相對(duì)變化率。 表4醋炙黃連提取浸膏對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型葡萄糖利用的影響(^如，
n=6) 注與模型組比較，*P< 0. 05，**P < 0. 01 ；由表4，圖4可知，與空白組比較，3T3-L1脂肪細(xì)胞在地塞米松和胰島素作用下，模 型組對(duì)胰島素的敏感性明顯降低，培養(yǎng)液中葡萄糖的攝取明顯減少，表明脂肪細(xì)胞胰島素 抵抗模型造模成功(P<0.01)。與模型組比較，醋炙黃連能明顯或部分降低培養(yǎng)液中葡萄 糖的含量(P< 0.01)，提高脂肪細(xì)胞葡萄糖的利用率，改善胰島素抵抗，作用與陽(yáng)性藥馬來(lái) 酸羅格列酮相似。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，醋炙黃連具有改善3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗，增強(qiáng)脂肪細(xì) 胞對(duì)葡萄糖攝取和利用的能力，從體外細(xì)胞水平上具有改善胰島素抵抗的作用；同時(shí)，醋炙 黃連在一定劑量下抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化，提示醋炙黃連在增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝 取的同時(shí)不會(huì)引起脂肪的聚集而造成體重增加，這對(duì)防治與胰島素抵抗相關(guān)的代謝綜合征 或并發(fā)癥具有一定的意義。試驗(yàn)例4醋炙黃連提取浸膏對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞PPAR y的影響曾歹L夕舌(Peroxisome Proliferator ActivatedReceptors, PPARs)，PPARs包括PAR a .PPAR y和PPAR 6等三種亞型。PPAR y則主要在肝臟及脂肪、肌 肉組織表達(dá)，促進(jìn)脂肪組織的分化、脂肪酸合成和儲(chǔ)存，是脂肪形成的關(guān)鍵物質(zhì)。PPARy與 配體或激活物結(jié)合后，可進(jìn)一步激活脂肪細(xì)胞分化過(guò)程，參與調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞特異基因的表 達(dá)、脂質(zhì)貯存和代謝。目前PPAR Y激動(dòng)劑中的典型藥物是羅格列酮，它是人工合成的PPAR 配體，它有胰島素增敏及降血糖作用，可通過(guò)激活靶組織中的PPAR Y發(fā)揮改善胰島素抵抗 (IR)、降低血糖、抑制血管平滑肌的增殖和遷移、改善內(nèi)皮功能等多種生物學(xué)效應(yīng)。對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞模型，按設(shè)計(jì)劑量分別加入不同濃度的受試藥物干預(yù)， Western blot檢測(cè)PPAR Y表達(dá)量，結(jié)果表明與生品比較，醋炙黃連使PPAR Y的蛋白表達(dá) 量顯著上升，見圖5。體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞經(jīng)小檗堿干預(yù)，在3T3-L1脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中，小 檗堿組脂肪細(xì)胞的PPAR YmRNA較對(duì)照組低48 %，蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果也顯示小檗堿抑制 PPARY的表達(dá)[周麗斌，楊穎，唐金鳳，等.小檗堿對(duì)脂肪細(xì)胞糖代謝的影響.上海第二 醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).2002，22 (5) :412-414]。而PPAR Y表達(dá)的增加，可以促進(jìn)葡萄糖的利用以 及胰島素的增敏[成峰，蔣華良，陳凱先，等.PPARy激動(dòng)劑的研究進(jìn)展.中國(guó)藥物化學(xué)雜志2003，13(2) 110-118,124]劉毅，婁少穎，何燕銘，等.小檗堿對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增 殖及分化相關(guān)基因PPARy、C/EBPamRNA何蛋白表達(dá)的影響.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志.2008， 28(11) 10051009，小檗堿使PPARy表達(dá)量減少82%。按BandScan5. 0，默認(rèn)值 經(jīng)內(nèi)參校正后結(jié)果表明，與生品黃連比較，醋炙黃連使PPARY表達(dá)量增加8. 74倍。以上文獻(xiàn)與試驗(yàn)的結(jié)果表明與生品黃連、小檗堿不同，醋炙黃連明顯增加 PPAR y的表達(dá)，可以促進(jìn)葡萄糖的利用以及胰島素的增敏，有希望成為一類2型糖尿病治 療藥物。該試驗(yàn)說(shuō)明，本發(fā)明萸炙黃連可作為胰島素增敏劑使用，胰島素增敏劑是指噻唑 烷二酮(TZDs)衍生物，又稱羅格列酮。1982年研究其降脂作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)還有減肥降低血 糖作用。其主要通過(guò)結(jié)合和活化過(guò)氧化物酶增殖物激活受體PPARy起作用，PPARy受體 被激活后通過(guò)誘導(dǎo)脂肪生成酶和與糖代謝調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)脂肪細(xì)胞和其他細(xì)胞 的分化，并提高細(xì)胞對(duì)胰島素作用的敏感性，減輕胰島素抵抗，故被稱為胰島素增敏劑。(張 文，治療糖尿病藥物的發(fā)展歷史，《中國(guó)執(zhí)業(yè)藥師》，2008年2期)胰島素增敏劑除了包含胰 島素增敏劑激動(dòng)劑外，還包括維甲酸受體激動(dòng)劑，3 3受體激動(dòng)劑等(蔡小花，等，胰島素增 敏劑類糖尿病藥物研究進(jìn)展，懷化醫(yī)專學(xué)報(bào)，2002，1 (2)。試驗(yàn)例4醋炙黃連提取浸膏對(duì)糖尿病整體動(dòng)物模型的影響(1)醋炙黃連對(duì)正常小鼠空腹血糖的影響方法取ICR小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18 22g。按體質(zhì)量分成隨機(jī)分組，每組10 只，即正常對(duì)照組、二甲雙胍對(duì)照組、鹽酸小檗堿對(duì)照組、黃連生品組、醋炙黃連組。各組小 鼠按表4設(shè)計(jì)劑量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7天。末次給藥后45min(禁食不禁水8h)， 小鼠眼眶取血，3000r/min離心lOmin，分離血清，按試劑盒測(cè)定說(shuō)明書測(cè)定小鼠空腹血糖 (FBG)。表5黃連炮制品提取浸膏對(duì)正常小鼠FBG的影響(I± s )
注與正常組比較，P > 0.05由表5可知，與空白組相比較，不同黃連炮制品對(duì)正常小鼠空腹血糖(FBG)均無(wú)明 顯影響(P > 0. 05)，鹽酸小檗堿對(duì)正常小鼠空腹血糖(FBG)均無(wú)明顯影響(P > 0. 05)。(2)醋炙黃連對(duì)四氧嘧啶致小鼠糖尿病模型的影響取ICR小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18 22g。按體質(zhì)量分層隨機(jī)分組，每組10只，分 組同上。經(jīng)文獻(xiàn)改進(jìn)，試驗(yàn)前小鼠禁食18h。第2日早晨小鼠尾靜脈注射的四氧嘧啶溶液 40mg/kg造模，注射后4h模型小鼠灌胃50 %葡萄糖，0. 4ml/只，24h后小鼠再次尾靜脈注射 四氧嘧啶溶液40mg/kg造模，同時(shí)4h后模型小鼠灌胃50%葡萄糖，0. 4ml/只。造模24h后， 各組小鼠按表4設(shè)計(jì)劑量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7天。第7天末次給藥后45min(禁食 不禁水8h)，小鼠眼眶取血，3000r/min離心lOmin，分離血清，按試劑盒測(cè)定說(shuō)明書分別測(cè) 定小鼠糖化血清蛋白(GSP)和空腹血糖(FBG)的含量。表7醋炙黃連對(duì)四氧嘧啶小鼠糖尿病模型GSP和FBG的影響(x敘) 注與模型組比較，*P< 0. 05，**P < 0.01由表7可知，與空白組比較，模型組小鼠尾靜脈注射四氧嘧啶72h后，均出現(xiàn)多食、 多飲、多尿等癥狀，模型組小鼠糖化血清蛋白含量和空腹血糖含量明顯升高，表明四氧嘧啶 致小鼠糖尿病模型造模成功(P<0.01)。與模型組比較，醋炙黃連能明顯降低小鼠血清糖 化血清蛋白和空腹血糖的含量(p<0.01)，表明各給藥組能通過(guò)減弱四氧嘧啶對(duì)胰島3細(xì) 胞的損傷或改善受損傷的0細(xì)胞的功能來(lái)發(fā)揮降血糖作用。(4)醋炙黃連對(duì)STZ+高脂高糖高鹽乳液復(fù)合2型糖尿病模型的影響取ICR小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18 22g。按體質(zhì)量分層隨機(jī)分組，每組10只，分組 同2. 1. 2。實(shí)驗(yàn)時(shí)小鼠禁食18h，第2日早晨小鼠腹腔注射STZ緩沖液100mg/kg (空白組注射 等量的0. lmol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液)，注射后6h各組小鼠灌胃50%葡萄糖，0. 4ml/ 只，2d后除空白組外，各組小鼠開始灌胃給予高脂高糖高鹽乳液0.4ml/只，連續(xù)14d。每天 給予高脂乳液同時(shí)，各組小鼠按表4設(shè)計(jì)劑量灌胃給藥，末次給藥后40min，小鼠眼眶取血， 3000r/min離心lOmin，分離血清，按試劑盒測(cè)定說(shuō)明書分別測(cè)定小鼠空腹血糖(FBG)、糖化 血清蛋白(GSP)的含量。
表8醋炙黃連提取浸膏對(duì)小鼠STZ復(fù)合模型GSP和FBG的影響(x敘) 注與模型組比較，*P < 0. 05，**P < 0. 01 ；各給藥組與生品組比較，AP < 0. 05， AAP < 0. 01由表8可知，與空白組比較，模型組小鼠糖化血清蛋白含量和空腹血糖含量明顯 升高，血脂TC、TG水平也明顯升高，表明小鼠2型糖尿病糖脂紊亂復(fù)合模型造模成功(P < 0. 01)。與模型組比較，不同黃連炮制品均能明顯降低小鼠血清糖化血清蛋白和空腹血糖 的含量(P < 0. 05 0. 01)，對(duì)糖化血清蛋白(GSP)的影響明顯優(yōu)于生品黃連。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，雖然生品黃連中總生物堿含量和總多糖含量高于醋炙黃連， 但醋炙黃連可以明顯改善糖尿病的癥狀、緩解胰島素抵抗，對(duì)正常血糖水平均無(wú)明顯影響， 藥效明顯優(yōu)于生品黃連。
權(quán)利要求
醋炙黃連在制備PPARγ激動(dòng)劑的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述的藥物是抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化、 提高3T3-L1前脂肪細(xì)胞葡萄糖利用率的藥物或胰島素增敏劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的藥物是降低血脂功能、改善胰 島素抵抗的藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的藥物是治療糖尿病及其并發(fā) 癥的藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于；所述的醋炙黃連的主要指標(biāo) 成分包括藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿及其以上生物堿成分的鹽 酸鹽，其中，所述的藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿的重量配比為 4-7 5-10 14-15 29-33 24-27 100。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述的藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃 連堿、巴馬汀、小檗堿的重量配比為 4. 71-6. 81 5.62-9.09 14. 22-14. 94 29. 14-32. 5824.50-26. 11 100。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于所述的藥根堿、非洲防己堿、表小檗堿、黃 連堿、巴馬汀、小檗堿的重量配比為5. 76,7. 36、14. 58,30. 86,25. 30、100。
8.一種具有抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化、提高3T3-L1前脂肪細(xì)胞葡萄糖利用率的藥 物組合物，其特征在于它是由下述方法制備而成取凈醋炙黃連，加水煎煮1 3次，每次 0. 5 3小時(shí)，每次加水量為6 10倍量，濾過(guò)，合并提取液，濃縮，備用，加入藥學(xué)上可接受 的輔料或輔助性成分制備成藥學(xué)上常用的制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于它是由下述方法制備而成取凈醋 炙黃連，加水煎煮3次，每次3小時(shí)，每次加水量為10倍量，濾過(guò)，合并提取液，濃縮，備用。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的藥物組合物，其特征在于所述的制劑是口服制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了醋炙黃連在制備胰島素增敏劑及PPARγ激動(dòng)劑的藥物中的用途，具有抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化、提高3T3-L1前脂肪細(xì)胞葡萄糖利用率或降低血脂功能及在改善胰島素抵抗或糖尿病藥物中的用途。本發(fā)明還提供了一種具有抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化、提高3T3-L1前脂肪細(xì)胞葡萄糖利用率的藥物組合物，本發(fā)明涉及的醋炙黃連及其提取浸膏，作為PPARγ激動(dòng)劑，具有抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化功能的藥物，可用于改善胰島素抵抗及治療糖尿病及其并發(fā)癥，具有明確的藥效，且藥效優(yōu)于鹽酸小檗堿和生品黃連。
文檔編號(hào)A61P3/10GK101874834SQ20101017492
公開日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日
發(fā)明者孟憲麗, 張藝, 李佳川, 賴先榮, 鄭海杰 申請(qǐng)人:成都中醫(yī)藥大學(xué)