專(zhuān)利名稱(chēng)：IL-1Ra的用途及其藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及IL-IRa的用途及其藥物組合物。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，腫瘤治療有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。一些治療腫瘤新藥層出不窮，腫瘤患者的預(yù)后也有了明顯的改善。但同時(shí)化療藥物帶來(lái)的各種副作用也是影響化療進(jìn)行的主要因素?？鼓[瘤藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致對(duì)人體正常組織、器官的損傷，特別是對(duì)心臟的毒性反應(yīng)，常常導(dǎo)致腫瘤病人不是死于腫瘤而是死于心臟并發(fā)癥[Yeh ET, Tong AT, Lenihan DJ, et al. Circulation. 2004,109 (25) :3122-3131]?；熕幬镄呐K毒性首推蒽環(huán)類(lèi)抗癌抗生素藥物[Ferreira AL, Matsubara LS, Matsubara BB. CardiovascHematol Agents Med Chem. 2008,6(4) :278-28]。蒽環(huán)類(lèi)藥物是一類(lèi)對(duì)造血系統(tǒng)腫瘤和實(shí)體腫瘤具有高效作用的抗癌藥物，包括阿霉素、表柔比星、阿克拉霉素、柔紅霉素、米托蒽醌等。其臨床療效得到了一定的認(rèn)可，但其副作用尤其是心臟毒性限制了在臨床上的應(yīng)用。阿霉素(Doxorubi cin, D0X)屬蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥，臨床上用于白血病、淋巴瘤、硬癌等的治療，效果顯著，因此是目前常用的抗腫瘤藥物之一 [Young RC, Ozols RF,Myers CE. N Engl J Med. 1981,305(3) : 139-153]。其除具有骨髓抑制、胃腸道發(fā)應(yīng)、禿發(fā)等毒性外，長(zhǎng)期應(yīng)用還可以發(fā)生劑量依賴(lài)性心臟毒性效應(yīng)[Torti FM, Bristow MR, Lum BL, etal. Cancer Res.1986,46(7) :3722-3727 ；Horan PG，McMull in MF, McKeown PP.EurHeart J.2006, 27(10) :1137-1138],最終導(dǎo)致心力衰竭[Singal PK, Iliskovic N. N EnglJ Med. 1998， 339(13) :900-905 ；Steinherz LJ, Steinherz PG, Tan CT, et al. JAMA. 1991,266(12) 672-677]，從而使其臨床應(yīng)用受到限制。阿霉素心臟毒性由于是遲發(fā)性反應(yīng)，故對(duì)其做到早期診斷難度較大。治療期間及治療后需定期檢測(cè)心臟功能，以便做到及早發(fā)現(xiàn)、盡早停藥。阿霉素所致心肌病的特征在于治療完成后心肌功能基本恢復(fù)正常，但在隨訪(fǎng)后多年的潛伏期后發(fā)生心肌病，所以阿霉素治療患者需終身監(jiān)測(cè)心功能。目前檢測(cè)阿霉素心臟毒性反應(yīng)的方法有①ECG:呈多樣化改變，但缺乏特異性；②同位素心臟血池顯象；③生化指標(biāo)(如心肌酶譜)檢測(cè)；④心肌及心內(nèi)膜活檢最可靠；⑤血漿中的腦鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP)和血清中的肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)，尤其是cTnT的濃度更能較早反映DOX的心臟毒性[Koh E, Nakamura T, Takahashi H. Circ J. 2004,68(2) :163_167·]。目前，治療阿霉素心臟毒性手段包括①減少累積劑量，使用阿霉素類(lèi)似物如表阿霉素、柔紅霉素等，與其它抗腫瘤藥物如順鉬等聯(lián)合應(yīng)用治療不同類(lèi)型腫瘤或者控制阿霉素累積量在^Omg/m2以下；②選擇最佳給藥方式，如應(yīng)用脂質(zhì)體阿霉素，脂質(zhì)體在體內(nèi)主要被吞噬細(xì)胞攝取，減輕對(duì)正常功能細(xì)胞直接損害，由于心肌細(xì)胞的吞噬能力較弱，故阿霉素較少進(jìn)入心肌，減少心肌病發(fā)生，脂質(zhì)體載藥后可降低阿霉素的毒性并保留藥物的抗腫瘤活性；③長(zhǎng)期隨訪(fǎng)，以便早期發(fā)現(xiàn)DOX心臟毒性發(fā)生患者；④藥物治療。抗氧化劑VitE是目前最好的心肌保護(hù)藥物，它可增加心肌抗氧化作用，也可使蒽環(huán)類(lèi)抗生素引起的脂質(zhì)過(guò)氧化減輕。相同的這類(lèi)藥物還有β胡蘿卜素、丙丁酚(結(jié)構(gòu)與VitE相似)等鐵離子的螯合劑右旋丙二胺(deXraZOXan，ICRF2187)能置換鐵-蒽環(huán)類(lèi)復(fù)合物中的鐵，并與鐵絡(luò)和抑制自由基的產(chǎn)生，減弱心臟毒性免疫效應(yīng)細(xì)胞的作用，阻斷鐵-蒽環(huán)類(lèi)復(fù)合物對(duì)呼吸酶的滅活。三苯氧氨(TAM)在細(xì)胞水平影響阿霉素的藥代動(dòng)力學(xué)，抑制毒性代謝產(chǎn)物的生成， 而且可以協(xié)同阿霉素的抗腫瘤作用[Bielack SS,Erttmann R，Kempf-Bielack B,etal.Eur J Cancer. 1996，32A(10) :1652-1660 ；Wahab ΜΗ, Akoul ES, Abdel-Aziz AA. Tumori. 2000, 86(2) :157-162 ；Chakrabarti KB, Hopewell Jff, Wilding D, et al. EurJ Cancer. 2001, 37(11) :1435-1442 ；Sromova Τ, Strnadova V, Hrstkova H. Vnitr LeL 2002，48 (7) 649-656 ；Yeh KH, Lu YS, Hsiao CH,et al.Anticancer Res.2003，23(6D) :5133-5137]。目前對(duì)阿霉素心臟毒性反應(yīng)的研究還不成熟，還未發(fā)現(xiàn)有效的治療方法，隨著細(xì)胞水平和基因研究的不斷深入，亟需更多更有效的細(xì)胞保護(hù)劑進(jìn)入臨床，最終服務(wù)于化療藥物心臟毒性病人?！鞍准?xì)胞介素-1 受體拮抗劑”(interleukin-lrec印tor antagonist, IL-lRa)，與 IL-Ia ,IL-I β三者共同屬于IL-I家族成員。IL-IRa是IL_1 a、IL-1 β共同的拮抗劑，它的蛋白序列與IL-la、IL-li3在受體結(jié)合部位即C-末端區(qū)顯著相似。IL-IRa可競(jìng)爭(zhēng)性的抑制IL-I與其受體結(jié)合，阻滯在多個(gè)組織和器官中表達(dá)IL-I的生物活性，臨床上用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、敗血癥等疾病。人和小鼠的IL-IRa有77%的同源性，IL-IRa的生物學(xué)作用沒(méi)有種屬特異性。不同細(xì)胞產(chǎn)生的IL-IRa分子量的差異主要由糖基化程度不同所致。已證實(shí)，糖基化對(duì) IL-IRa 生物學(xué)活性無(wú)影響(R Daig, G Rogler, E Aschenbrenner, et al. Gut 2000 (46) :350-358)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供治療或預(yù)防化療藥物導(dǎo)致的心臟毒性反應(yīng)。為此，本發(fā)明公開(kāi)了一種如下(a)或(b)的蛋白在制備用于治療或預(yù)防化療藥物導(dǎo)致的心臟毒性反應(yīng)的藥物中的用途(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述的蛋白；(b)至少與(a)中的氨基酸序列 70%同源性且具有治療或預(yù)防化療藥物導(dǎo)致的心臟毒性反應(yīng)活性的蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述化療藥物蒽環(huán)類(lèi)藥物。蒽環(huán)類(lèi)藥物可為阿霉素、表柔比星、阿克拉霉素、柔紅霉素、米托蒽醌中之一或任何組合，其中最優(yōu)選為阿霉素。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了一種藥物組合物，其含有作為活性成分的上述蛋白和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。在一些實(shí)施方式中，所述藥物的制劑為腸外給藥制劑，所述腸外給藥制劑可為注射劑或注射用無(wú)菌粉末。另一方面，本發(fā)明還公開(kāi)了一種腫瘤治療藥物盒，其特征在于其包括蒽環(huán)類(lèi)藥物和權(quán)利要求1所述蛋白為活性成分的藥物組合物。另一方面，本發(fā)明公開(kāi)了上述蛋白作為活性成分可治療或預(yù)防化療藥物導(dǎo)致的心臟毒性反應(yīng)的方法，該方法包括給予個(gè)體有效劑量的上述蛋白。另一方面，本發(fā)明還公開(kāi)了一種治療腫瘤的方法，該方法包括給予個(gè)體有效劑量的上述蛋白和化療藥物。本發(fā)明所述蛋白可有效地排除或降低化療藥物導(dǎo)致的心臟毒性反應(yīng)，將可能為今后臨床腫瘤的治療提供新的選擇。


圖1 心肌組織H&E染色病理學(xué)觀(guān)察(阿霉素注射后第14天，X 400)；圖2 心肌組織H&E染色病理學(xué)評(píng)分；
圖3 心肌組織MDA含量檢測(cè)；圖4 血清肌鈣蛋白I檢測(cè)；圖5 (A-C) =M型超聲心動(dòng)圖檢測(cè)射血分?jǐn)?shù)及短軸收縮率。
具體實(shí)施例方式在本文，術(shù)語(yǔ)所述“白細(xì)胞介素-I受體拮抗劑” (interleukin-1 儀。印忉『3壯38011丨8仏11^-11^1)，與比-10、IL-I β三者共同屬于IL-1家族成員。IL-IRa是 IL-I a、IL-I β共同的拮抗劑，它的蛋白序列與IL-I α、IL-I β在受體結(jié)合部位即C-末端區(qū)顯著相似。hIL-IRa的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述，人和小鼠的IL-IRa有77%的同源性，IL-IRa的生物學(xué)作用沒(méi)有種屬特異性。不同細(xì)胞產(chǎn)生的IL-IRa分子量的差異主要由糖基化程度不同所致。已證實(shí)，糖基化對(duì)IL-IRa生物學(xué)活性無(wú)影響(R Daig,G Rogler, E Aschenbrenner, et al. Gut 2000 (46) :350-358)。本發(fā)明的所述蛋白質(zhì)優(yōu)選該物質(zhì)是hIL-IRa蛋白質(zhì)及其突變體；其功能性活性片段或其類(lèi)似物；具有高度同源性的同系物以及編碼包含SEQ ID NO. 1描述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的載體例如DNA載體(質(zhì)?；虿《?。功能性活性片段或類(lèi)似物可通過(guò)添加、插入、 修飾、取代或缺失以上所列的氨基酸序列中的一或多個(gè)氨基酸殘基而形成。術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”也包括嵌合蛋白質(zhì)、融合蛋白、抗獨(dú)特型抗體、上述化合物的前體和其它功能等效物或模擬物。也包括模擬IL-IRa結(jié)合蛋白活性的合成體。術(shù)語(yǔ)“突變體”是指氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述hIL_lRa的突變體。相比于天然的IL-IRa蛋白，該突變體與它們野生型相比，具有增強(qiáng)的活性和/或改變了的立體專(zhuān)一性。天然蛋白的氨基酸序列突變體可通過(guò)向本發(fā)明的核苷酸中引入適當(dāng)?shù)暮塑账嶙兓?或通過(guò)體外合成所需多肽來(lái)制備。這些突變體包括，例如缺失、插入或替換該氨基酸序列中的殘基?？梢酝ㄟ^(guò)缺失、插入和替換的組合以得到最終的構(gòu)建體，提供最終的蛋白產(chǎn)品。蛋白的同源性百分比由GAP(Needleman和mmsh，1970)分析(GCG程序)確定，其 rPgap creation penalty = 5, gap extension penalty = 0. 30 ^^Ι/τWii^1JixiS 至少為15個(gè)氨基酸時(shí)，GAP分析就在參與測(cè)試的兩個(gè)序列的至少為15個(gè)氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測(cè)試。更優(yōu)選地，被分析的序列長(zhǎng)度至少為50個(gè)氨基酸時(shí)，GAP分析就在參與測(cè)試的兩個(gè)序列的至少為50個(gè)氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測(cè)試。更優(yōu)選地，被分析的序列長(zhǎng)度至少為100個(gè)氨基酸時(shí)，GAP分析就在參與測(cè)試的兩個(gè)序列的至少為100個(gè)氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測(cè)試。更優(yōu)選地，被分析的序列長(zhǎng)度至少為250個(gè)氨基酸時(shí)，GAP分析就在參與測(cè)試的兩個(gè)序列的至少為250個(gè)氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測(cè)試。甚至更優(yōu)選地，被分析的序列長(zhǎng)度至少為500個(gè)氨基酸時(shí)，GAP分析就在參與測(cè)試的兩個(gè)序列的至少為500個(gè)氨基酸的區(qū)域進(jìn)行測(cè)試。本發(fā)明涉及的方面還包括IL-IRa蛋白類(lèi)似物，在它們合成期間或合成后進(jìn)行了不同的修飾，例如，通過(guò)生物素化、芐基化、糖基化、乙?；⒘姿峄?、由已知保護(hù)/封閉基團(tuán)的衍生作用、蛋白水解的切割作用、連接到抗體分子或其它細(xì)胞配體上等。這些修飾可以用來(lái)增加本發(fā)明IL-IRA蛋白的穩(wěn)定性和/或生物活性。蛋白的表達(dá)本發(fā)明包括編碼本發(fā)明的IL-IRa蛋白的DNA以及含有這些DNA的載體、轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明中，使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化體”(transformant)，即帶有異源DNA分子的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還包括通過(guò)合成和重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明所述蛋白的方法。通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法可以分離和純化多核苷酸(DNA或RNA)、載體、轉(zhuǎn)化體和生物體。用于本發(fā)明的載體可以是如噬菌體、質(zhì)粒、粘粒、微型染色體、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體?？捎糜诳寺『?或表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸的載體是能在需復(fù)制和/或表達(dá)多核苷酸的宿主細(xì)胞中復(fù)制和/或表達(dá)多核苷酸的載體。一般說(shuō)來(lái)，多核苷酸和/或載體可用于任何真核或原核細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如人(如HeLa)、猴(如Cos)、兔(如兔網(wǎng)織紅細(xì)胞)、大鼠、倉(cāng)鼠(如CHO、NSO和幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)或小鼠細(xì)胞(如L細(xì)胞))、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)。有關(guān)適用于多種類(lèi)型宿主細(xì)胞的適當(dāng)載體的例子可參見(jiàn)例如 F. Ausubel et al. , Current Protocols inMolecular Biology. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1992)禾口 Sambrook et al. (1989)?？梢允褂煤羞@些多核苷酸的宿主細(xì)胞來(lái)大量表達(dá)可用于例如藥物、診斷試劑、疫苗和治療劑的蛋白質(zhì)。已開(kāi)發(fā)出多種方法用于經(jīng)由互補(bǔ)的粘性末端使多核苷酸與載體可操作相連。例如，可在欲插入載體DNA內(nèi)的DNA區(qū)段添加互補(bǔ)的同聚體序列片段。然后通過(guò)互補(bǔ)同聚體尾之間的氫鍵連接載體和DNA區(qū)段以形成重組DNA分子。含有一或多種限制性位點(diǎn)的合成接頭提供了另一種連接DNA區(qū)段與載體的方法。 用噬菌體T4DNA聚合酶或大腸桿菌DNA聚合酶I處理通過(guò)內(nèi)切核酸酶限制性消化產(chǎn)生的 DNA區(qū)段，所述的兩種聚合酶用其3’，5’ -核酸外切活性除去突出的Y-單鏈末端，并用其聚合活性補(bǔ)平3’-凹端。因此，這些活性的聯(lián)合產(chǎn)生了平端DNA區(qū)段。然后在能催化平端 DNA分子連接的酶，如噬菌體T4 DNA連接酶的存在下將平端區(qū)段與摩爾過(guò)量的接頭分子一起保溫。因此，反應(yīng)產(chǎn)物是末端攜有聚合接頭序列的DNA區(qū)段。然后用適當(dāng)?shù)南拗菩悦噶呀膺@些DNA區(qū)段，并連接至已用酶裂解的表達(dá)載體中，所述酶能產(chǎn)生與所述DNA區(qū)段相容的末端。從多個(gè)商家可以買(mǎi)到含有多個(gè)限制性?xún)?nèi)切核酸酶位點(diǎn)的合成接頭。多核苷酸插入物應(yīng)該可操作地連接于同表達(dá)多核苷酸的宿主細(xì)胞相容的適當(dāng)啟動(dòng)子上。啟動(dòng)子可以是強(qiáng)啟動(dòng)子和/或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。列舉的一些啟動(dòng)子的例子包括噬菌體λ PL啟動(dòng)子、大腸桿菌lac、trP、phoA、tac啟動(dòng)子、SV40早期和晚期啟動(dòng)子以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動(dòng)子。其它適當(dāng)啟動(dòng)子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。表達(dá)重組載體進(jìn)一步含有轉(zhuǎn)錄起始、終止位點(diǎn)，并在轉(zhuǎn)錄區(qū)含有用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。重組載體表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物的編碼部分可包括位于起點(diǎn)處的翻譯起始密碼子和適當(dāng)?shù)匚挥诒环g多肽的末端的終止密碼子(UAA，UGA 或 UAG)。如上所述，表達(dá)載體可包括至少一個(gè)選擇標(biāo)記。所述標(biāo)記包括對(duì)真核細(xì)胞培養(yǎng)物而言的二氫葉酸還原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大腸桿菌和其它細(xì)菌培養(yǎng)的四環(huán)素、卡那霉素或氨芐青霉素抗性基因。適當(dāng)宿主的代表性例子包括但不限于細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌、鏈霉菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞，如酵母細(xì)胞(如釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母)；昆蟲(chóng)細(xì)胞，如果蠅S2和夜蛾SF9細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞，如CH0，C0S，NS0，293 和Bowes黑素瘤細(xì)胞；和植物細(xì)胞。上述宿主細(xì)胞的適當(dāng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域已知的。為了有效地分離純化或分泌目標(biāo)蛋白，常常還可利用便于分離純化的標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽(Tag)。常用的有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transf erase, GST)、六聚組氨酸肽(圯&！“叫^蛋白質(zhì)八⑦偽切土!! Α)和纖維素結(jié)合位點(diǎn)(cellulose bindingdomain)等。通過(guò)特殊性蛋白或多肽與目標(biāo)蛋白構(gòu)成融合蛋白的形式，表達(dá)后利用所述的標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽的特殊性質(zhì)可對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行分離和純化。如His. Tag與 Ni-Chelating kpharose柱特異性結(jié)合。所述的標(biāo)簽蛋白或標(biāo)簽多肽可以在純化后用位點(diǎn)特異性蛋白酶消化去除融合序列，如可用凝血酶、腸激酶和)(a因子等，以獲得目標(biāo)蛋白。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的核苷酸序列的宿主細(xì)胞，所述核苷酸序列經(jīng)本領(lǐng)域已知的技術(shù)與一或多種異源控制區(qū)(如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)可操作相連。可以選擇能調(diào)節(jié)插入的基因序列的表達(dá)，或能按照所需的特殊方式修飾和加工基因產(chǎn)物的宿主菌株。在某些誘導(dǎo)物的存在下，某些啟動(dòng)子啟動(dòng)的表達(dá)會(huì)升高；因此，可以控制經(jīng)基因改造的多肽的表達(dá)。另外，不同宿主細(xì)胞具有特征性的和特殊的翻譯、翻譯后加工和修飾(如磷酸化、裂解) 蛋白質(zhì)的機(jī)制?？梢赃x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系以確保對(duì)表達(dá)的外源蛋白質(zhì)進(jìn)行合乎需要的修飾和加工。通過(guò)磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、 轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染或其它方法，即可將本發(fā)明的核酸和核酸重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。所述方法描述于多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中，如Davis et al.，Basic Methods In Molecular Biology (1986)。編碼本發(fā)明的所述蛋白的多核苷酸可以與含有選擇標(biāo)記的載體連接以在宿主中增殖。一般說(shuō)來(lái)，可在沉淀物，如磷酸鈣沉淀物或其與帶電脂質(zhì)的復(fù)合物中導(dǎo)入質(zhì)粒載體。 如果載體是病毒，可使用適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系在體外對(duì)其進(jìn)行包裝，再轉(zhuǎn)導(dǎo)至宿主細(xì)胞。通過(guò)眾所周知的技術(shù)可以鑒定出被成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即含有本發(fā)明的DNA重組載體的細(xì)胞。例如，可培養(yǎng)導(dǎo)入表達(dá)重組載體所得的細(xì)胞以產(chǎn)生所需多肽。收集并裂解細(xì)胞， 使用如 Southern(1975) J. Mol. Biol. 95，503 或 Berent et al (1985) Biotech. 3，208 所述的方法，檢測(cè)其DNA內(nèi)容物中DNA的存在。或者，使用抗體檢測(cè)上清液中蛋白質(zhì)的存在。通過(guò)眾所周知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化本發(fā)明的所述蛋白較為有利，所述方法包括硫酸按或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、 疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析、疏水電荷作用層析和凝集素層析。在一些實(shí)施方案中，可使用高效液相層析(HPLC)進(jìn)行純化。在一些實(shí)施方案中，可使用上述的一種或多種層析方法純化本發(fā)明的所述蛋白。 在其它實(shí)施方案中，可使用下述的一種或多種層析柱純化本發(fā)明的所述融合蛋白，所述層析柱有:Q sepharose FF柱、SP sepharose FF柱、Q sepharose High Performance 柱、Blue sepharose FF 柱、Blue 柱、Phenyl Sepharose FF 柱、DEAE Sepharose FF、Ni-Chelating Sepharose FF 柱或 Methyl 柱等。
另外，可使用國(guó)際公開(kāi)號(hào)W000/44772(全文列入本文作為參考)中描述的方法純化本發(fā)明的蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地改動(dòng)其中所述的方法以用于純化本發(fā)明的蛋白?？梢詮陌ɡ缂?xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的原核或真核宿主經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生的產(chǎn)物中回收本發(fā)明的蛋白。藥物組合物用于本發(fā)明或者含有本發(fā)明所述蛋白的藥物組合物。通常，當(dāng)本發(fā)明藥物組合物用于上述用途時(shí)，所述蛋白可與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合制成不同給藥途徑的藥物劑型，如片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、口服液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無(wú)菌粉末、栓劑等?！八帉W(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)?！八帉W(xué)上可接受的載體”是用于將本發(fā)明的融合體蛋白傳送給動(dòng)物或人的藥學(xué)上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或固體。本發(fā)明的蛋白可經(jīng)過(guò)口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥。上述劑型中可經(jīng)口服給藥的劑型為片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、醑劑。固態(tài)載體包括淀粉、乳糖、磷酸氫鈣、微晶纖維素、蔗糖、白陶土、微粉硅膠、滑石粉、低取代羥丙基纖維素、羧甲基淀粉鈉、聚乙烯吡咯烷酮。而液態(tài)載體包括無(wú)菌水、乙醇、聚乙二醇、非離子型表面活性劑和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。在制備藥物組合物的過(guò)程中通常使用的佐劑包括調(diào)味劑、著色劑、防腐劑(如羥苯烷基丁酯、苯甲酸鈉、山梨酸)和抗氧化劑(如維生素E、維生素C、焦亞硫酸鈉和二丁基羥基甲苯)。上述劑型中可用于注射途徑給藥的劑型包括注射劑、注射用無(wú)菌粉末，它們是將藥物與一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑混合制成以供注射給藥的形式。溶劑包括無(wú)菌水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇。此外，還需加入抑菌劑(如苯甲醇、羥苯丁酯、硫柳汞)、 等滲調(diào)節(jié)劑(如氯化鈉、葡萄糖)、助懸劑(如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素)、增溶劑(吐溫-80、卵磷酯)、抗氧化劑(如維生素E、維生素C、焦亞硫酸鈉)和填充劑(如乳糖、甘露醇)。從易于制備和給藥的立場(chǎng)看，優(yōu)選的藥物組合物是固態(tài)組合物，尤其是凍干粉針劑。本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)熟知的及公認(rèn)的制藥生產(chǎn)要求的方法制備。藥用組合物適宜包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)以及藥學(xué)上可接受的載體，并適宜為單位劑量形式。本發(fā)明的藥用組合物可包含前藥形式的本發(fā)明的蛋白質(zhì)，該前藥可在接受者宿主體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化成本發(fā)明物的活性形式。本發(fā)明的藥物組合物還可與其它療法聯(lián)合應(yīng)用，如同時(shí)、序貫或分別應(yīng)用。本發(fā)明的藥用組合物可包含有其它活性作用物。用途公開(kāi)了所述蛋白作為活性成分可以預(yù)防或治療化療藥物導(dǎo)致心臟毒性反應(yīng)的方法，該方法包括給予患者有效劑量的上述(a)或(b)所述的蛋白。在一些實(shí)施方式中，所述方法可通過(guò)化療藥物給藥前、化療藥物給藥后、化療藥物給藥前和化療藥物給藥后方式，給予患者有效劑量的上述(a)或(b)所述的蛋白。
“有效劑量”或“治療量”均是指足以產(chǎn)生療效的量。有效量可分一或多次給藥。通常，有效量足以緩和、改善、穩(wěn)定、減慢或延遲疾病的進(jìn)一步發(fā)展。所用的活性成分的有效劑量可隨給藥模式和待治療疾病的嚴(yán)重程度而變化。對(duì)大部分大型哺乳動(dòng)物而言，每天施以有效成分的總劑量約為0. Ol-IOOOmgo通常，成人臨床給藥量的范圍為0. 01-200mg/日，優(yōu)選為0. 05-100mg/日?；熕幬锝o藥劑量按照公知有效劑量給藥，如阿霉素臨床一般為靜脈注射，每次 40 60mg/m2，3周1次；或每日20mg/m2，連續(xù)3日，間隔3周再給藥。目前認(rèn)為總量不宜超過(guò) 450 550mg/m2。以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠(chǎng)商所建議的條件。動(dòng)物給藥小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，兩組小鼠均予以腹腔一次性注射18mg/kg阿霉素 (DOX)。實(shí)驗(yàn)組小鼠在給藥后4小時(shí)開(kāi)始皮下注射lmg/kg rhIL-IRa，連續(xù)5天；對(duì)照組則以皮下注射同體積生理鹽水作對(duì)照。于給藥前(day 0)及給藥后第7、14天收集小鼠血清及心肌組織標(biāo)本，完成各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)(表1)。表1動(dòng)物給藥方法
0714實(shí)驗(yàn)組(DOX+rhlL-IRa)**對(duì)照組(D0X+生理鹽水)*氺*注*代表取標(biāo)本時(shí)間點(diǎn)，每組3只小鼠實(shí)施例1、小鼠一般情況觀(guān)察在阿霉素注射后密切觀(guān)察兩組小鼠死亡情況，并每天稱(chēng)量小鼠體重。定點(diǎn)收集心肌組織標(biāo)本，同時(shí)稱(chēng)量心臟重，計(jì)算心臟指數(shù)(心臟重/體重)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿霉素的毒性損傷明顯。小鼠在阿霉素注射后出現(xiàn)部分死亡，且體重、心臟指數(shù)等指標(biāo)下降明顯。在皮下注射rhIL-IRa后，上述指標(biāo)得到了不同程度的改善。如表一所示，阿霉素注射后8天，DOX+生理鹽水組小鼠死亡率為53. 3% (16/30)， DOX+rhlL-IRa組則為36. 7% (11/30)，rhIL-IRa能顯著增加DOX作用后小鼠的存活。存活小鼠均表現(xiàn)出不同程度的體重減輕，rhIL-IRa能顯著減輕DOX導(dǎo)致的體重下降(表2)。表2. rhIL-IRa對(duì)阿霉素毒性的一般保護(hù)作用
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權(quán)利要求
1.一種如下(a)或(b)的蛋白在制備用于治療或預(yù)防化療藥物導(dǎo)致的心臟毒性反應(yīng)的藥物中的用途(a)其氨基酸序列如SEQID NO. 1所述的蛋白；(b)至少與(a)中的氨基酸序列70%同源性且具有治療或預(yù)防化療藥物導(dǎo)致的心臟毒性反應(yīng)活性的蛋白。
2.權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述化療藥物為蒽環(huán)類(lèi)藥物。
3.權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述蒽環(huán)類(lèi)藥物可為阿霉素、表柔比星、阿克拉霉素、柔紅霉素或米托蒽醌中之一或任何組合。
4.權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于所述蒽環(huán)類(lèi)藥物可為阿霉素。
5.權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述(b)的蛋白為氨基酸序列如SEQID NO. 2 所述的蛋白。
6.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1所述蛋白和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
7.權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物的制劑為腸外給藥制劑。
8.權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于所述腸外給藥制劑可為注射劑或注射用無(wú)菌粉末。
9.一種腫瘤治療藥物盒，其特征在于其包括蒽環(huán)類(lèi)藥物和權(quán)利要求1所述蛋白為活性成分的藥物組合物。
10.權(quán)利要求9所述的腫瘤治療藥物盒，其特征在于所述蒽環(huán)類(lèi)藥物可為阿霉素、表柔比星、阿克拉霉素、柔紅霉素或米托蒽醌中之一或任何組合。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及IL-1Ra的用途及其藥物組合物。本發(fā)明公開(kāi)了一種如下(a)或(b)的蛋白在制備用于治療或預(yù)防化療藥物導(dǎo)致的心臟毒性反應(yīng)的藥物中的用途(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述的蛋白；(b)至少與(a)中的氨基酸序列70％同源性且具有治療或預(yù)防化療藥物導(dǎo)致的心臟毒性反應(yīng)活性的蛋白。本發(fā)明所述蛋白可有效地排除或降低化療藥物導(dǎo)致的心臟毒性反應(yīng)，將可能為今后臨床腫瘤的治療提供了新的選擇。
文檔編號(hào)A61K31/704GK102240394SQ201010175559
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2010年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者朱勁舟, 韓偉 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué), 上海伍洋生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司