專利名稱：狗棗獼猴桃葉總黃酮在制備預防與治療血管性癡呆藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于天然藥物化學研究領(lǐng)域，更確切地說涉及利用從狗棗獼猴桃葉中提取 分離的總黃酮制備預防與治療血管性癡呆藥物組合物。
背景技術(shù)：
隨著人口老齡化，老年期癡呆的患病率逐年上升。血管性癡呆(Vascular Dementia VD)和阿爾茨海默病是癡呆最常見的兩大病因。血管性癡呆是在多次反復發(fā)作的 腦血管病變基礎(chǔ)上形成的以智能障礙為主的臨床癥候群。據(jù)流行病學調(diào)查，在歐美VD占老 年期癡呆的15% 20%，而在我國高達60%。臨床常見的血管性癡呆類型有(1)多發(fā)性 梗死性癡呆；(2)單發(fā)性梗死性癡呆；(3)小血管疾病引起的癡呆；(4)缺血和缺氧性低灌 注引起的癡呆。其中多發(fā)性梗死性癡呆是血管性癡呆的主要類型，病理表現(xiàn)為大腦雙側(cè)多 發(fā)性梗死。實驗研究表明血管性癡呆大鼠腦組織乙酰膽堿酯酶活性明顯升高 ’海馬CAi區(qū) 膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶免疫反應陽性，神經(jīng)元和纖維數(shù)量明顯減少；而乙酰膽堿酯酶活性升高及 海馬CAi區(qū)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶免疫反應陽性，神經(jīng)元和纖維數(shù)量減少與大鼠的學習記憶障礙 程度呈正相關(guān)。大鼠腦缺血再灌后腦組織乙酰膽堿含量降低，給予擬膽堿能藥物可改善學 習記憶功能。許多研究證明記憶突觸即為膽堿能突觸，膽堿能神經(jīng)通路參與構(gòu)成記憶痕 跡。海馬-邊緣系統(tǒng)的傳導通路與空間識別、工作記憶有關(guān)，基底核-大腦皮質(zhì)的傳導通路 與學習過程的調(diào)制、參照記憶有關(guān)，這些部位的損傷可導致皮質(zhì)、海馬及基底核細胞萎縮， 膽堿能傳導通路受損，從而引起膽堿能缺陷和學習記憶功能障礙。因此，血管性癡呆的記憶 功能障礙與中樞膽堿能系統(tǒng)有著密切的聯(lián)系。近年來，神經(jīng)元間突觸的改變在血管性癡呆發(fā)病中的作用愈來愈受到重視，研究 表明突觸損傷是血管性癡呆等神經(jīng)功能障礙退化性疾病早期的、共同的病理改變，與認知 損害有著密切聯(lián)系。突觸是神經(jīng)元之間結(jié)構(gòu)和功能的接觸點，突觸的可塑性是學習記憶的 神經(jīng)生物學基礎(chǔ)，突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的可塑性和傳遞效能的可塑性的物質(zhì)基礎(chǔ)都涉及神經(jīng)元和 突觸部位的某些蛋白質(zhì)、受體、神經(jīng)遞質(zhì)、離子及信使分子的物理化學變化。狗棗獼猴桃[Actinidiakollomikta(Rupr. et Maxim.)Planch.]是獼猴桃科 (Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)落葉藤本植物，野生資源豐富。狗棗獼猴桃葉和果 實均可入藥，果實成熟時采摘，鮮用，具有滋養(yǎng)強壯之功效，葉鮮用或曬干備用(長白山植 物藥志，吉林人民出版社，1982，983頁)。近幾年來，本發(fā)明者對狗棗獼猴桃葉的化學成分及其生物活性進行了大量的研 究。至今為止，已從狗棗獼猴桃葉中分得了 18個黃酮類化合物(圖1，化合物1-18)，其 中7個為新化合物，分別是山柰甲黃素-3-0-蕓香糖苷，山柰甲黃素-7-0-(4〃 -0-乙酰 基-鼠李糖基)-3_0-i3-D-吡喃葡萄糖苷，山柰甲黃素-7-0-(4〃 -0-乙酰基-鼠李糖 基)-3-0_蕓香糖苷(簡稱A-F-B)，山柰甲黃素-7-0-(4〃 _0_乙酰基)-鼠李糖苷，4'-甲氧基-槲皮素-7-0-(4〃 -0-乙?；?鼠李糖基)-3-0-i3_D-吡喃葡萄糖苷，山柰甲黃 素-7-0-(3〃 -0-乙?；?鼠李糖基)-3-0_蕓香糖苷、山柰酚-7-0-(4〃 -0-乙?；?鼠 李糖基)-3-0-蕓香糖苷(高等學?；瘜W學報，2007年，第28卷第11期，2060-2064頁；高 等學?；瘜W學報，2009年，第30卷第3期，468-473頁)。本發(fā)明者還利用HPLC法對狗棗 獼猴桃葉中含量最高的黃酮類成分A-F-B的含量進行了測定(藥物分析雜志，2007年.第 27卷第1期，120-122頁)同時還測定了不同生長期狗棗獼猴桃葉中A-F-B的含量變化情 況(中國中藥雜志，2007年，第32卷第18期，1989-1990頁)，同時以A-F-B為指標性成分 建立了狗棗獼猴桃葉總黃酮的制備工藝及質(zhì)量標準(陸娟.狗棗獼猴桃葉化學成分研究， 吉林大學博士學位論文，2009)。本發(fā)明者還對狗棗獼猴桃葉總黃酮的生物活性進行了研究。研究結(jié)果表明，狗棗 獼猴桃葉總黃酮對高脂血癥大鼠的血脂代謝紊亂具有改善作用(陸娟.狗棗獼猴桃葉化學 成分研究[D]，吉林大學博士學位論文，2009)，對大鼠實驗性缺血性心肌細胞具有保護作用 (金永日.狗棗獼猴桃葉黃酮類成分與生物活性研究，吉林大學博士學位論文，2007.)，同 時對發(fā)生缺血改變的神經(jīng)細胞具有保護作用，其機制可能與抑制神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)(中國 卒中雜志，2006年，第1卷第12期，842-845)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是要提供一種對血管性癡呆具有預防與治療作用的藥物組合物。本發(fā)明者在前期研究(中國專利ZL03145194. 2)的基礎(chǔ)上通過進一步的深入研 究，發(fā)現(xiàn)了狗棗獼猴桃葉總黃酮對血管性癡呆具有明顯的預防與治療作用，進而完成了本 發(fā)明。本發(fā)明的狗棗獼猴桃葉總黃酮是指從狗棗獼猴桃葉中提取分離的黃酮類化合物 的混合物，屬于天然藥物有效部位。本發(fā)明所用狗棗獼猴桃葉總黃酮是利用在中國專利 ZL03145194. 2的基礎(chǔ)上經(jīng)過篩選得到的最佳制備工藝提取純化得到。首先使用的狗棗獼猴桃葉是6月份采集的葉子。狗棗獼猴桃葉中山柰甲黃 素-7-0-(4〃 -0-乙?；?鼠李糖基)-3-0_蕓香糖苷(簡稱A-F-B)不僅是含量最高的成 分，而且也是最主要的活性成分。我們發(fā)現(xiàn)6月份中旬采集的狗棗獼猴桃葉中A-F-B含量 較高，故使用6月份采集的葉子，而且最好是6月中旬采集的葉子，也最是說最好是6月10 日至20之間采集的葉子。另外對中國專利ZL03145194. 2提到的制備工藝也進行了改進，在 對提取溶劑乙醇的濃度、使用量、回流次數(shù)、回流時間、大孔吸附樹脂的種類、吸附條件、解 析條件、硅膠柱層析流動相組成、硅膠用量等參數(shù)進行篩選的基礎(chǔ)上確定了最佳制備工藝 條件。在此基礎(chǔ)上對狗棗獼猴桃葉進行提取分離純化，得到了總黃酮含量大于80%，A-F-B 含量大于40%的狗棗獼猴桃葉總黃酮。取狗棗獼猴桃葉粉末3份，每份12kg，分別用6倍量90%乙醇回流提取4次，時間 分別為2h、l. 5h、lh、0. 5h，濾過，合并濾液，減壓濃縮，加水稀釋，得到生藥量為200mg · mL—1 的藥液，將藥液過AB-8大孔吸附樹脂吸附，上樣液PH值為6，藥液流速為6BV -^10吸附完 畢后先用水沖洗至流出液接近無色，然后用90%乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，干燥，即得狗 棗獼猴桃葉總黃酮粗提物。狗棗獼猴桃葉總黃酮粗提物中拌入2倍量硅膠，以乙酸乙酯-乙 醇-水=10 1 0.3為流動相，濕法上柱，干法上樣，進行硅膠(10倍樣品量)柱層析分離純化，收集A-F-B前后含黃酮類化合物部分，減壓回收溶劑，干燥得到三批樣品，批號分 別為 20090511，20090615，20090718。三批狗棗獼猴桃葉總黃酮中A-F-B及總黃酮的含量的測定結(jié)果如下。三批狗棗獼猴桃葉總黃酮中A-F-B及總黃酮的含量
"￥￥狗棗獼猴桃葉總A-F-B含量(％)總黃酮含量
黃酮重量(g)--HPLC法 (％)--紫外分光
光度法
2009051132640.989.12009061531842.388.32009071830842.488.6由上表可知，無論是用HPLC法測定的單體化合物A-F-B的含量，還是用紫外分光 光度法測定的總黃酮含量都比原方法(中國專利ZL03145194. 2)得到的狗棗獼猴桃葉總黃 酮有了很大提高，尤其是A-F-B的含量。將三批樣品混合均勻后用做活性實驗用樣品(批 號20090806)，混合后A-F-B的含量為41. 2%，總黃酮含量為88. 2%。


圖1是從狗棗獼猴桃葉中分離得到的18個黃酮類化合物的化學結(jié)構(gòu)。
具體實施例方式實驗實施例1狗棗獼猴桃葉總黃酮抗血管性癡呆作用實驗1狗棗獼猴桃葉總黃酮對大鼠腦原代神經(jīng)細胞的保護作用1-1藥物狗棗獼猴桃葉總黃酮(批號20090806)1-2動物Wistar大鼠，體重220 240g，由吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院實驗動物中心提 供，合格證號SYXK-(吉)2003-0001。將大鼠雌雄合籠飼養(yǎng)。1-3材料剪刀，鑷子兩套，75 %酒精，碘棉球，平皿，離心管(玻璃或塑料)，吸管 (帽)，200目篩，燒杯，96孔培養(yǎng)板，馬血清，DMEM培養(yǎng)基，F(xiàn)12，青霉素G，鏈霉素，0. 01%多 聚賴氨酸，阿糖胞苷(終濃度為3 5 μ mol/L或4 μ g/ml)，胰蛋白酶0. 125 % 0. 25 %， D-Hanks 液。1-4試驗方法預先在96孔培養(yǎng)板中加入0. 01 %多聚賴氨酸，孵育過夜后吸棄，用 D-Hanks液清洗幾遍備用。取出生24小時內(nèi)的同窩Wistar大鼠大腦，進行神經(jīng)細胞原代培 養(yǎng)。步驟如下(1)新生大鼠75%酒精消毒，剪去頭皮顱骨暴露出全腦，將全腦取出，放入裝有冰 冷D-Hank’ s液的培養(yǎng)皿內(nèi)，清洗3次。(2)切取大腦皮層，用眼科鑷剔除腦膜和血管，將大腦皮層剪碎，切成 0. 5mm X0. 5mm X0. 5mm 的小塊。(3)加入約五倍體積的0. 125%胰蛋白酶，37°C水浴，消化15 20分鐘，每隔4分
5鐘輕輕振蕩一次，使組織充分接觸胰酶。(4)小心吸棄胰蛋白酶，加入含有10%馬血清的DMEM/F12中止消化。(或者加入 10%馬血清的DMEM/F12中止消化后離心，去上清。再加入含有10%馬血清的DMEM/F12混 懸細胞)(5)用吹打管反復吹打，直到組織塊基本消散為止，成為細胞懸液。(6)過篩網(wǎng)(200目)，收集濾液至尖底離心管中，lOOOr/min離心5min，棄上清。(7)將細胞團塊加入含有體積分數(shù)10%馬血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，用細口吸管反 復輕輕吹打成細胞懸液，臺盼藍染色鏡下計數(shù)活細胞數(shù)，調(diào)整細胞濃度至2 X 106/ml。(8)接種入預先用0.01%多聚賴氨酸包被過的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板(皿)內(nèi)，置37°C、 5% C02、飽和濕度條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第2天待細胞貼壁后換液，去除死細胞，以后每2 3 天換液1次。細胞培養(yǎng)至3 4天后，加入阿糖胞苷(終濃度為3 5ym0l./L)培養(yǎng)24h， 以抑制非神經(jīng)細胞過度增殖。繼續(xù)培養(yǎng)至7 8天后開始實驗。1-4-1過氧化氫(H2O2)損傷模型取培養(yǎng)7 8d的神經(jīng)細胞，分為①正常對照 組，不加H2O2，其余同模型組；②H2O2模型組，吸去原培養(yǎng)液，加入終濃度為100 μ mol/L H2O2IOO μ L的DMEM培養(yǎng)基在37°C、5% CO2孵箱37°C條件，作用4h后進行實驗；③藥物處理 組，在H2O2處理前2h分別加入各濃度梯度的藥物；④培養(yǎng)液對照組。MTT法檢測細胞活力 每孔內(nèi)加入MTT液10 μ 1 (5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去上清液后，每孔加入DMSO 100 μ L，室 溫振蕩lOmin。待孔內(nèi)顆粒完全溶解后，于570nm處測定吸光度值，各組吸光度值-培養(yǎng)液對 照組吸光度值后由公式計算存活率。細胞存活率(％ )=各組OD值/對照組OD值X 100 %。1-4-2氯化鉀(KCl)損傷模型取培養(yǎng)7 8d的神經(jīng)細胞，分為①正常對照組，不 加KCl，其余同模型組；②KCl模型組，吸去原培養(yǎng)液，加入終濃度為30mmol/L KCL 100 μ L 的DMEM培養(yǎng)基在37°C、5% CO2孵箱37°C條件，作用4h后進行實驗；③藥物處理組，在KCL 處理前2h分別加入各濃度梯度的藥物；④培養(yǎng)液對照組。MTT法檢測細胞活力每孔內(nèi)加 入MTT液10 μ L(5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去上清液后，每孔加入DMSO 100 μ L，室溫振蕩 IOmin0待孔內(nèi)顆粒完全溶解后，于570nm處測定吸光度值，各組吸光度值-培養(yǎng)液對照組 吸光度值后由公式計算存活率。細胞存活率(％)=各組OD值/對照組OD值X 100%。1-5試驗結(jié)果大鼠腦原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)的實驗結(jié)果表明，狗棗獼猴桃葉總黃酮對過氧化氫 (H2O2)及氯化鉀(KCl)所致大鼠腦神經(jīng)細胞的損傷均具有保護作用，見表1。表1.狗棗獼猴桃葉總黃酮對H2O2及KCl所致大鼠腦神經(jīng)細胞損傷的保護作用細胞存活率(％)
組別
藥物濃度
(Hg/ml)
H2O2損傷模型
KCL損傷模型
實驗2狗棗獼猴桃葉總黃酮對頸內(nèi)動脈注射微小栓子致血管性癡呆的治療作用 2-1藥物狗棗獼猴桃葉總黃酮(批號20090806)
2-2動物雄性Wistar大鼠120只，體重360 440g，由吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院實
驗動 物中心提供，合格證號SYXK-(吉)2003-0001。2-3試驗方法參考文獻(血管性癡呆現(xiàn)代中醫(yī)臨床與研究，人民衛(wèi)生出版社，2003年10月，第 一版，214頁；試驗性血管性癡呆大鼠動物模型研究進展，山西醫(yī)藥雜志，2000年，第29卷 第5期，402-403頁；多發(fā)性腦梗塞癡呆動物模型的制作，青海醫(yī)藥雜志，2000年，第30卷 第7期，53-54頁)制作栓塞液，Wistar大鼠無菌自然干燥的血凝塊研碎分級過篩，選直徑 100 200目的微粒溶于生理鹽水中，制成2mg/ml的懸濁液即栓塞液，制作大鼠老年性癡 呆模型。用20%的烏拉糖腹腔注射麻醉大鼠，頸中切開皮膚，暴露左側(cè)頸總動脈及頸內(nèi)、頸 外動脈，用動脈夾暫時夾閉頸總動脈，從頸外動脈處逆行穿刺插管注入0. 3mL栓塞液(正常 對照組給同容積的生理鹽水)，結(jié)扎頸外動脈，放開頸總動脈夾，使栓子通過頸內(nèi)動脈進入 顱內(nèi)至大腦各動脈，造成多灶性腦梗塞。術(shù)后3天分組給藥。第①組為正常組，第②組為模 型組，均灌胃給蒸餾水0. 5mL/100g，第③組灌胃狗棗獼猴桃葉總黃酮25mg/kg，第④組灌胃 狗棗獼猴桃葉總黃酮50mg/kg，第⑤組灌胃狗棗獼猴桃葉總黃酮100mg/kg。連續(xù)給藥20天 后進行水迷宮試驗，試驗期間繼續(xù)給藥。采用Morris水迷宮實驗觀測動物學習記憶行為學 功能。Morris水迷宮為不銹鋼的圓形水池，直徑200cm，高50cm，水深30cm，水溫25士 1°C， 池壁標明4個入水點，由此將水池分為4個象限，任選其中1個象限，正中放置1個直徑為 11cm，高29cm的平臺。迷宮上方裝有攝像機及錄像機以及顯示器連接，自動錄入大鼠游泳 軌跡進行分析。水迷宮試驗連續(xù)7天，前6天，在1、2、3、4象限四個不同的入水點，測定大 鼠到達平臺的時間及游程，第7天撤掉平臺，測定大鼠在2min內(nèi)穿越平臺的次數(shù)，在平臺區(qū)
的逗留時間及在平臺象限內(nèi)的逗留時間。試驗結(jié)束后快速取腦固定，進行病理檢查。2-4試驗結(jié)果與正常對照組比，模型組大鼠第2天至第6天到達平臺的潛伏期及 到達平臺的游程均明顯延長(P < 0. 05或P < 0. 01)，第7天大鼠在2min內(nèi)的穿越平臺 的次數(shù)，在平臺象限的逗留時間及平臺區(qū)象限內(nèi)的游程占總游程的百分比均明顯降低(P < 0. 05或P < 0. 01)；與模型組比較，狗棗獼猴桃葉總黃酮3個劑量組第2天至第6天達 到平臺的潛伏期及游程均不同程度地縮短(P < 0. 05或P < 0. 01)，第7天大鼠在2min內(nèi) 的穿越平臺的次數(shù)及在平臺區(qū)的逗留時間均明顯增加(P <0.05)見表2、3、4。表2.狗棗獼猴桃葉總黃酮對頸內(nèi)動脈注射微小栓子致血管性癡呆大鼠到達平臺 潛伏期(s)的影響(η = 10，χ士s) 與模型組比較:*Ρ< 0. 05，**Ρ < 0.01表3.狗棗獼猴桃葉總黃酮對頸內(nèi)動脈注射微小栓子致血管性癡呆大鼠到達平臺 游程(cm)的影響(η = 10，χ士s) 與模型組比較:*P< 0. 05，**P < 0.01表4.狗棗獼猴桃葉總黃酮對頸內(nèi)動脈注射微小栓子致血管性癡呆大鼠第7天水 迷宮的影響(η = 10，χ士s) 與模型組比較:*Ρ< 0. 05，**Ρ < 0.01病理顯示①正常組可見腦膜為正常結(jié)構(gòu)，無明顯擴張。大腦皮層神經(jīng)細胞數(shù)多， 細胞胞體大，核大，染色淡，核膜、核仁清楚。海馬神經(jīng)細胞數(shù)多，排列整齊，層次清楚，胞體 大、核大，核仁清楚。皮層、海馬無軟化灶及膠質(zhì)小結(jié)；②模型組可見部分腦膜血管擴張、充 血，大腦皮質(zhì)及基底節(jié)多發(fā)、散在灶狀壞死，壞死神經(jīng)細胞核固縮，染色深，核仁不清，局部 區(qū)域有較多的膠質(zhì)細胞增生，膠質(zhì)小結(jié)形成。海馬神經(jīng)細胞數(shù)明顯減少，噬神經(jīng)細胞現(xiàn)象明 顯增加，局部區(qū)域神經(jīng)細胞節(jié)段性壞死，壞死細胞深染，細胞核消失；③狗棗獼猴桃葉總黃酮中、大劑量組均可見腦膜血管不同程度的擴張，大腦皮質(zhì)及基底節(jié)可見少許散在壞死灶， 但比模型組輕，狗棗獼猴桃葉總黃酮小劑量組與模型組無明顯差異，病理結(jié)果表明狗棗獼 猴桃葉總黃酮對頸內(nèi)動脈注射微小栓子所致大鼠癡呆的病理改變有減輕作用。實驗3 狗棗獼猴桃葉總黃酮對大腦中動脈梗塞(MCAO)擬血管性癡呆的治療作 用3-1藥物狗棗獼猴桃葉總黃酮(批號20090806)3-2動物雄性Wistar大鼠120只，體重280 320g，由吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院實 驗動物中心提供，合格證號SYXK-(吉)2003-0001。3-3試驗方法按文獻(中國病理生理雜志，2003年，第19卷第8期，1144-1147 頁)方法制作大鼠MCAO擬血管性癡呆模型，此方法是在線栓法所致腦缺血再灌注損傷的基 礎(chǔ)上改良的。用10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔注射麻醉禁食，仰位固定，頸部備毛，用強 力碘消毒后，手術(shù)剪剪開皮膚，用蚊氏鉗小心鈍性分離粘膜及肌層，找到并分離右側(cè)頸總動 脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈，穿線(0號絲線)備用。結(jié)扎頸總動脈及頸外動脈，在頸總動脈分 叉處2mm處剪一小切口，將一端加熱成球形的尼龍絲線插入，在入口處用絲線將頸內(nèi)動脈 及尼龍絲線輕輕結(jié)扎固定，然后繼續(xù)插入尼龍絲線，至劃線處(20mm)處時可感覺到有一落 空感，此時再將尼龍絲線稍稍撤回至刻度(18mm)處，即完成大腦中動脈栓塞(MCAO)。然后 及時結(jié)扎入口處頸內(nèi)動脈的絲線以固定插入的尼龍線。在手術(shù)視野內(nèi)灑青霉素少許，縫合 皮膚，將尼龍線留在體外約1cm。2小時后，輕輕提拉留在體外的尼龍絲線至有阻力，此時實 現(xiàn)大腦中動脈再灌注。假手術(shù)大鼠僅結(jié)扎頸總、頸內(nèi)及頸外動脈。造模成功后，可見動物出 現(xiàn)對側(cè)前肢倦曲或行走轉(zhuǎn)圈或行走向?qū)?cè)倒的體征。術(shù)后每日給予青霉素抗感染，80萬單 位/kg。大鼠正常飲食飲水。術(shù)后第10日開始給藥。第①組為正常組，第②組為模型組，均 灌胃給蒸餾水0. 5mL/100g，第③組灌胃狗棗獼猴桃葉總黃酮25mg/kg，第④組灌胃狗棗獼 猴桃葉總黃酮50mg/kg，第⑤組灌胃狗棗獼猴桃葉總黃酮100mg/kg。術(shù)后第30天，進行水 迷宮練習及測試，期間一直給藥。學習記憶行為學與神經(jīng)功能觀測具體方法各組動物在從MCAO造模后第30天， 采用Morris水迷宮實驗觀測動物學習記憶行為學功能。Morris水迷宮為不銹鋼的圓形水 池，直徑200cm，高50cm，水深30cm，水溫25士 1 °C，池壁標明4個入水點，由此將水池分為4 個象限，任選其中1個象限，正中放置1個直徑為11cm，高29cm的平臺。迷宮上方裝有攝 像機及錄像機以及顯示器連接，自動錄入大鼠游泳軌跡進行分析。水迷宮試驗連續(xù)7天，前 6天進行定位航行試驗將大鼠面向池壁放入水中，上下午各一次，記錄其在2min內(nèi)尋找平 臺的時間及游泳路徑。若其在2min內(nèi)未找到平臺，則潛伏期為120s，并由實驗者用手牽引 其至平臺上，讓大鼠停留10s，再放回籠內(nèi)。第7天進行空間探索試驗將大鼠從前6天訓 練的入水點放入水中，記錄其在2min內(nèi)的游泳軌跡及時間，若其在2min內(nèi)未找到平臺，則 潛伏期為120。并分析大鼠在原平臺象限游泳的時間(tP)和路徑(dP)與總游泳時間(tT) 和總游泳路徑(dT)之比。分析大鼠的空間學習、記憶能力的變化。 水迷宮后，斷頭取腦，于4 %甲醛溶液中固定，送病理檢測。
3-4試驗結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組大鼠第2天至第6天到達平臺的潛伏期明 顯延長(P < 0. 05或P < 0. 01)，第3天至第6天到達平臺的游程明顯延長(P < 0. 05)，第 7天大鼠空間探索的tP/tT及dP/dT均明顯降低(P <0.05或P <0.01)；與模型組比較，狗棗獼猴桃葉總黃酮中、大劑量組第3天至第6天達到平臺的潛伏期明顯縮短(P < 0. 05 或P < 0. 01)，第4天至第6天到達平臺的游程明顯縮短(P < 0. 05)，第7天大鼠空間探索 的 tP/tT 及 dP/dT 均明顯增加(P < 0. 05 或 P < 0. 01)，見表 5、6、7。表5.狗棗獼猴桃葉總黃酮對MCAO擬血管性癡呆大鼠到達平臺潛伏期(s)的影響 (η = 10，χ 士 s) 與模型組比較:*Ρ< 0. 05，**Ρ < 0.01表6.狗棗獼猴桃葉總黃酮對MCAO擬血管性癡呆大鼠到達平臺游程(cm)的影響 (η = 10，χ 士 s) 與模型組比較*P < 0. 05表7.狗棗獼猴桃葉總黃酮對MCAO擬血管性癡呆大鼠tP/tT及dP/dT的影響(η =10，χ 士 s) 與模型組比較:*Ρ< 0. 05，**Ρ < 0.01病理顯示①假手術(shù)組可見腦膜血管正常，無擴張、充血現(xiàn)象。皮質(zhì)神經(jīng)細胞數(shù)多， 排列均勻，神經(jīng)細胞胞體大、核大，染色均勻，核膜、核仁清楚，偶見嗜神經(jīng)現(xiàn)象。海馬神經(jīng) 細胞數(shù)多，胞體大、核大，核仁清楚；②模型組可見皮質(zhì)神經(jīng)細胞數(shù)減少，多數(shù)神經(jīng)細胞呈固 縮、深染的三角形，核膜、核仁不清，多見神經(jīng)細胞空泡變性，嗜神經(jīng)現(xiàn)象較多，可見軟化灶 及膠質(zhì)小結(jié)形成。海馬神經(jīng)細胞明顯減少，層次不清，排列不整，噬神經(jīng)細胞現(xiàn)象較多，多見 深染、固縮的三角形細胞；③狗棗獼猴桃葉總黃酮中、大劑量組均可見皮質(zhì)神經(jīng)細胞數(shù)無明 顯減少，核固縮、深染的三角形神經(jīng)細胞及嗜神經(jīng)細胞現(xiàn)象較模型組減少，未見軟化灶及膠 質(zhì)小結(jié)。海馬神經(jīng)細胞數(shù)無明顯減少，變性、壞死細胞比模型組少，可見嗜神經(jīng)細胞現(xiàn)象。病葉總黃酮可不同程度地減輕大腦中動脈梗塞(MCAO)擬血管性癡 呆大鼠的病理性變化，對血管性癡呆有治療作用。 上述狗棗獼猴桃葉總黃酮對大鼠腦原代神經(jīng)細胞的保護作用以及狗棗獼猴桃葉 總黃酮對頸內(nèi)動脈注射微小栓子致血管性癡呆的治療作用和狗棗獼猴桃葉總黃酮對大腦 中動脈梗塞(MCAO)擬血管性癡呆的治療作用的實驗研究結(jié)果表明狗棗獼猴桃葉總黃酮對 血管性癡呆具有顯著的預防與治療作用。
權(quán)利要求
狗棗獼猴桃葉總黃酮在制備預防與治療血管性癡呆藥物中的應用。
2.權(quán)利要求1所述的狗棗獼猴桃葉總黃酮，其特征在于所述的狗棗獼猴桃葉總黃酮中 山柰甲黃素-7-0-(4〃 -0-乙酰基-鼠李糖基)-3-0-蕓香糖苷的含量大于40%。
3.權(quán)利要求1所述的狗棗獼猴桃葉總黃酮，其特征在于所述的狗棗獼猴桃葉總黃酮 通過如下制備工藝獲得取狗棗獼猴桃葉粉末，用6倍量90%乙醇回流提取4次，時間分 別為2h、1.5h、lh、0. 5h，濾過，合并濾液，減壓濃縮，加水稀釋，將藥液過AB-8大孔吸附樹脂 吸附，90 %乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮，干燥，得到的狗棗獼猴桃葉總黃酮粗提物以乙酸乙 酯-乙醇-水=10 1 0.3為流動相進行硅膠柱層析分離純化，收集含黃酮類化合物部 分，減壓回收溶劑，干燥即得。
4.權(quán)利要求1所述的狗棗獼猴桃葉總黃酮，其特征在于用于制備狗棗獼猴桃葉總黃酮 的狗棗獼猴桃葉是6月份采集的葉子。
全文摘要
本發(fā)明公開了狗棗獼猴桃葉總黃酮的一種新的醫(yī)藥用途。利用本發(fā)明的制備工藝獲得的狗棗獼猴桃葉總黃酮其中山柰甲黃素-7-O-(4″-O-乙?；?鼠李糖基)-3-O-蕓香糖苷的含量大于40％，對血管性癡呆具有顯著的預防與治療作用。
文檔編號A61K36/185GK101897738SQ20101017725
公開日2010年12月1日 申請日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月20日
發(fā)明者于曉風, 李緒文, 桂明玉, 睢大員, 金永日 申請人:長春瑞德醫(yī)藥科技有限公司