專(zhuān)利名稱(chēng)：異葒草苷作為制備抗呼吸道合胞病毒的藥物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及異葒草苷(isoorientin)作為制備抗呼吸道 合胞病毒的藥物的用途。
背景技術(shù)：
異葒草苷(isoorientin)是一個(gè)天然來(lái)源的黃酮6位碳苷類(lèi)化合物，不少藥用 植物中都含有該化合物。在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局、中國(guó)期刊網(wǎng)和Scifinder Scholar的檢索 結(jié)果顯示，有關(guān)異葒草苷的公開(kāi)發(fā)明專(zhuān)利有三個(gè)①白花敗醬草中幾種高純度藥用物質(zhì) 的快速制備方法(專(zhuān)利號(hào)200410068016. 2)；②藏茵陳提取物及其制備方法、藥物組合物 和用途(專(zhuān)利號(hào)200710163097. 8)；③從含羞草中分離純化黃酮苷單體的方法(專(zhuān)利號(hào) 200910096967. 3)。分別為異葒草苷從白花敗醬草、藏茵陳和含羞草中分離、純化的制備方 法。有關(guān)異葒草苷的研究論文大致可分為三類(lèi)①異葒草苷的分離和結(jié)構(gòu)鑒定從淡竹葉、 竹葉、含羞草、白花敗醬草、金蓮花、廣金錢(qián)草、大青葉、鴨跖草、某些龍膽屬植物等中都曾分 離得到異葒草苷；②異葒草苷在植物中的含量分析淡竹葉、竹葉、金蓮花、線(xiàn)葉龍膽中的 異葒草苷含量測(cè)定研究；③異葒草苷的生物活性研究只有異葒草苷的抗菌活性研究，結(jié) 果顯示，該化合物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和黃曲霉有一定的抑制活性。未發(fā)現(xiàn)從植物 中分離得到的異葒草苷或其它來(lái)源的異葒草苷在抗呼吸道合胞病毒方面的專(zhuān)利和文獻(xiàn)。本發(fā)明中的異葒草苷從中藥淡竹葉中分離得到。中藥淡竹葉為禾本科淡竹葉屬植 物淡竹葉(Lophatherum gracile Brongn.)的干燥莖葉，1977年以來(lái)的歷版《中華人民共 和國(guó)藥典》對(duì)淡竹葉均有收載。淡竹葉性寒，味甘、淡，具清熱、除煩、利尿的功效，民間多用 于熱病心煩、口渴、口舌生瘡、牙齦腫痛、尿路炎癥、小便熱痛等癥的治療?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究 表明，淡竹葉具解熱利尿、抗菌、抗腫瘤、升高血糖等作用。有資料提及淡竹葉有抗病毒作 用，但卻沒(méi)見(jiàn)任何活性成分和抗病毒活性研究數(shù)據(jù)。呼吸道病毒感染是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的傳染性疾病之一。呼吸道合胞病毒 (respiratory syncytial virus,RSV)屬副粘病毒科肺病毒屬，它所引起的呼吸道感染、喉 炎、氣管炎、支氣管炎和肺炎等是臨床上的常見(jiàn)病與多發(fā)病，易感人群為小孩和老人。血清 學(xué)統(tǒng)計(jì)表明，100%的兒童成年以前都感染過(guò)RSV。迄今為止，對(duì)RSV感染尚無(wú)有效的特異性 防治措施，核苷類(lèi)藥物病毒唑(ribavirin)是唯一被FDA批準(zhǔn)治療RSV感染的化學(xué)藥物，但 由于其療效有限、毒副作用大，臨床應(yīng)用效果并不理想。另外，RSV抗體類(lèi)藥物(如RSV單 克隆抗體Synagis)雖然療效較好，但使用周期長(zhǎng)、費(fèi)用高，尚未廣泛應(yīng)用于臨床。因此，亟 需尋找和開(kāi)發(fā)使用安全、特異性強(qiáng)的高效抗RSV感染藥物。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供異葒草苷 (isoorientin)作為制備抗呼吸道合胞病毒的藥物的用途。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)異葒草苷作為制備抗呼吸道合胞病毒的藥物的用途。所述抗呼吸道合胞病毒的藥物含有治療有效量的異葒草苷和藥學(xué)上可接受的載 體。所述抗呼吸道合胞病毒的藥物制成散劑、丸劑、片劑、膠囊劑、口服液、氣霧劑或注 射劑。所述抗呼吸道合胞病毒的藥物可與臨床上應(yīng)用的抗病毒藥物病毒唑組合，制備成 預(yù)防和治療由呼吸道合胞病毒感染引起疾病的藥物。所述異葒草苷分子結(jié)構(gòu)如下 本發(fā)明所述異葒草苷可由淡竹葉或其它植物中分離得到，也可由其它途徑(如從 SIGMA等公司購(gòu)買(mǎi))獲得，純度大于或等于98%時(shí)，活性更好。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果本發(fā)明針對(duì)目前呼吸道病 毒治療領(lǐng)域急需解決的問(wèn)題，尋找出新的高效、低毒的抗呼吸道病毒藥物資源；本發(fā)明提供 的異葒草苷是天然來(lái)源的單體化合物，具有很強(qiáng)的抗呼吸道合胞病毒活性，且對(duì)宿主細(xì)胞 的毒性小。另外，體外抗病毒實(shí)驗(yàn)表明，異葒草苷與臨床上常用的抗病毒藥物病毒唑聯(lián)合應(yīng) 用時(shí)，具協(xié)同增效作用。因此，異葒草苷的抗病毒的活性具有高效、低毒、作用機(jī)理新穎的特 點(diǎn)，有很好的應(yīng)用前景。


圖1是異葒草苷和病毒唑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的抗呼吸道合胞病毒(RSV)活性照片圖，其 中a為正常喉癌Ofep-2)細(xì)胞照片，b為RSV感染的H印-2細(xì)胞照片，c為加入5. 7 μ g/mL 的異葒草苷后的RSV感染的!fep-2細(xì)胞照片，d為加入5. 7 μ g/mL的異葒草苷和2. 9 μ g/mL 病毒唑混合物后的RSV感染的H印-2細(xì)胞照片。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。實(shí)施例1 異葒草苷體外抗呼吸道合胞病毒活性(1)細(xì)胞、病毒和實(shí)驗(yàn)材料呼吸道合胞病毒(RSV，Long strain)，宿主細(xì)胞為喉 癌細(xì)胞(Hep-2細(xì)胞)；陽(yáng)性對(duì)照藥為病毒唑(ribavirin)；細(xì)胞生長(zhǎng)在質(zhì)量百分比濃度為 10 %的小牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)基中；維持液是含有質(zhì)量百分比濃度1 %的FBS的MEM培養(yǎng)基。(2)樣品溶液的配制分別將異葒草苷樣品(購(gòu)買(mǎi)于SIGMA公司)和病毒唑樣品 用二甲基亞砜(DMSO)配成濃度為40mg/mL的溶液，再用維持液分別將樣品配制成400 μ g/ mL和25 μ g/mL的樣品溶液，分別用作細(xì)胞毒性和抗病毒活性實(shí)驗(yàn)。
(3)用四唑鹽(MTT)比色法測(cè)定化合物的細(xì)胞毒性將Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板中，等單層細(xì)胞長(zhǎng)好后，加入用維持液倍半稀釋 的系列濃度(濃度為400 12. 5μ g/mL)樣品溶液，在37°C，5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天； 加入10 μ L MTT溶液(5mg/mL，用緩沖溶液配置)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。吸出樣品溶液，加入二 甲亞砜，室溫下，將96孔板置于微空孔板振蕩器中振蕩10分鐘。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的OD 值，測(cè)量波長(zhǎng)為570nm，參比波長(zhǎng)為630nm，計(jì)算樣品對(duì)細(xì)胞的半數(shù)致死毒性濃度(CC5tl)。每 組設(shè)4個(gè)平衡孔，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算結(jié)果，畫(huà)出曲線(xiàn)，求出半數(shù)毒性濃度(CC5tl)。(4)通過(guò)觀察樣品對(duì)細(xì)胞病變效應(yīng)的抑制程度(cytopathic effect reductionassay) IlJ定抗病毒 舌個(gè)生
將Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板中，等單層細(xì)胞長(zhǎng)好后，加入用維持液稀釋好的 100倍半數(shù)感染量(IOOTCID5ci)的病毒液，再加入用維持液倍半稀釋的系列濃度(濃度為 25 0.8 μ g/mL)樣品溶液，在37°C，5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 4天。每天于倒置顯微鏡 下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的程度，并記錄-表示無(wú)CPE ；+表示0 25%細(xì)胞有CPE ；2+ 表示25 50%細(xì)胞有CPE ；3+表示50 70%細(xì)胞有CPE ；4+表示75 100%細(xì)胞有CPE。 最后估計(jì)出半數(shù)抑制濃度(IC5tl)。選擇性指數(shù)(Si) = CC50/IC50O實(shí)驗(yàn)結(jié)果異葒草苷體外抑制呼吸道合胞病毒的IC5tl = 5. 7 士0. 8 μ g/mL, CC50 = 362. 6 士0. 7 μ g/mL, SI = 63. 6。病毒唑體外抑制呼吸道合胞病毒的IC5tl = 2. 9 士0. 2 μ g/mL, CC50 = 62. 6 + 3. 2 μ g/mL, SI = 21. 6?？梢?jiàn)，異葒草苷抑制RSV的SI值(Si = CC5(1/IC5(1)高于陽(yáng)性對(duì)照藥病毒唑，其抗病 毒的活性具有高效、低毒的特點(diǎn)。實(shí)施例2 異葒草苷與病毒唑聯(lián)合用藥的體外抗呼吸道合胞病毒活性測(cè)定(1)細(xì)胞、病毒和實(shí)驗(yàn)材料呼吸道合胞病毒(RSV，Long strain)，宿主細(xì)胞為喉 癌細(xì)胞(Hep-2細(xì)胞)；陽(yáng)性對(duì)照藥為病毒唑(ribavirin)；細(xì)胞生長(zhǎng)在質(zhì)量百分比濃度為 10%的小牛血清(FBS)的MEM培養(yǎng)基中；維持液是質(zhì)量百分比濃度為1 %的FBS的MEM培養(yǎng)基。(2)樣品溶液的配制分別將異葒草苷樣品(購(gòu)買(mǎi)于SIGMA公司)和病毒唑樣品 用二甲基亞砜(DMSO)配成濃度為40mg/mL的溶液，用維持液分別將異葒草苷和病毒唑配制 成5. 7 μ g/mL和3. 0 μ g/mL的溶液，再將兩者按體積比1 1混合成待測(cè)樣品溶液。(3)采用細(xì)胞病變抑制法(cytopathic effect reduction assay)測(cè)定異葒草苷 和病毒唑聯(lián)合應(yīng)用的抗病毒活性將Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板中，等單層細(xì)胞長(zhǎng)好后，加入用維持液稀釋好的 100倍半數(shù)感染量(IOOTCID5ci)的病毒液，再加入待測(cè)樣品溶液，在37°C，5 % C02培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)3 4天。每天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)的程度，并記錄_表示無(wú) CPE ；+表示0 25%細(xì)胞有CPE ；2+表示25 50%細(xì)胞有CPE ；3+表示50 70%細(xì)胞有 CPE ；4+表示75 100%細(xì)胞有CPE。最后用數(shù)碼相機(jī)照相。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，在異葒草苷和病毒唑的半數(shù)抑制濃度(IC5tl分別為5.7 μ g/ mL和3. 0 μ g/mL)時(shí)，兩者聯(lián)合應(yīng)用能100%抑制由RSV引起的細(xì)胞病變，說(shuō)明兩者具有協(xié)同作用。實(shí)施例3 異葒草苷體內(nèi)抗呼吸道合胞病毒活性(1)動(dòng)物昆明種雄性或雌性小白鼠(18 22g)。(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用小鼠RSV感染模型，測(cè)定異葒草苷內(nèi)抗呼吸道合胞病毒(抗 RSV)活性。選用BALB/C小鼠60只，雄雌各半，隨機(jī)分成6組，分別為異葒草苷高劑量組 (40. Omg/ (kg ·(!))、中劑量組(20. Omg/ (kg -d))、低劑量組(10. Omg/ (kg -d))、病毒唑 IOmg/ (kg · d)、病毒陽(yáng)性和生理鹽水陰性對(duì)照組，每組10只。灌胃給藥，陽(yáng)性和陰性對(duì)照組灌胃 生理鹽水。三天后，經(jīng)鼻滴入RSV懸液(TCID5tl為I(T66Ail)，繼續(xù)灌胃給藥7天，觀察小鼠 存活情況。最后給藥40min后處死小鼠，無(wú)菌取肺組織，勻漿、用維持液吹打懸浮、離心、稀 釋?zhuān)臃N在Hep-2細(xì)胞上，采用細(xì)胞病變效應(yīng)抑制法測(cè)定病毒滴度，計(jì)算病毒抑制率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，可見(jiàn)異葒草苷在體內(nèi)能抑制抗呼吸道合胞病毒，且具有劑 量依賴(lài)性。表1異葒草苷體內(nèi)抗呼吸道合胞病毒結(jié)果 *χ2檢驗(yàn)，與病毒對(duì)照組比較ρ < 0. 05實(shí)施例4 異葒草苷片劑的制備取異葒草苷Ig與微晶纖維素27g及硬脂酸鎂2g混合，混合物用單沖壓片機(jī)打成 直徑6mm，重量300mg的片。本片劑中每片含異葒草苷10mg。實(shí)施例5 異葒草苷膠囊劑的制備取異葒草苷Ig與乳糖27g、硬脂酸鎂2g混合，以每300mg填充膠囊。本膠囊劑中， 每個(gè)膠囊含異葒草苷10mg。實(shí)施例6 異葒草苷散劑的制備取異葒草苷5g與淀粉25g混合，加水制成軟材，過(guò)12目篩進(jìn)行造粒，干燥后得到 散劑。本散劑中，每300mg中含異葒草苷50mg。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明 的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
異葒草苷作為制備抗呼吸道合胞病毒的藥物的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述抗呼吸道合胞病毒的藥物含有治療 有效量的異葒草苷和藥學(xué)上可接受的載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述抗呼吸道合胞病毒的藥物制成散劑、 丸劑、片劑、膠囊劑、口服液、氣霧劑或注射劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了異葒草苷作為制備抗呼吸道合胞病毒的藥物的用途。所述抗呼吸道合胞病毒的藥物含有治療有效量的異葒草苷和藥學(xué)上可接受的載體。所述抗呼吸道合胞病毒的藥物制成散劑、丸劑、片劑、膠囊劑、口服液、氣霧劑或注射劑。本發(fā)明針對(duì)目前呼吸道病毒治療領(lǐng)域急需解決的問(wèn)題，尋找出新的高效、低毒的抗呼吸道病毒藥物資源；本發(fā)明提供的異葒草苷是天然來(lái)源的單體化合物，具有很強(qiáng)的抗呼吸道合胞病毒活性，且對(duì)宿主細(xì)胞的毒性?。涣硗?，體外抗病毒實(shí)驗(yàn)表明，異葒草苷與臨床上常用的抗病毒藥物病毒唑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，具協(xié)同增效作用。因此，異葒草苷的抗病毒的活性具有高效、低毒、作用機(jī)理新穎的特點(diǎn)，有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P11/00GK101843612SQ201010178799
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者葉文才, 張曉琦, 李藥蘭, 王英, 范春林 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)