專利名稱：一種中國(guó)陸生常見(jiàn)蝰科蛇毒多價(jià)抗血清的制備方法及用法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗蛇毒血清，特別是涉及多價(jià)抗血清的制備及多價(jià)抗血清的使用方 法。
背景技術(shù)：
毒蛇屬種具有很大的地區(qū)差異性，同一種類的毒蛇由于地區(qū)差異所產(chǎn)生的蛇毒毒 性成分不同。中國(guó)陸生常見(jiàn)蝰科蛇以中國(guó)南方地區(qū)蝰蛇、烙鐵頭蛇、蝮蛇、五步蛇、竹葉青 的蝰科蝮亞科和蝰亞科毒蛇為主。在毒蛇咬傷后如果能夠鑒別毒蛇種類，首先應(yīng)考慮使用 單價(jià)抗蛇毒血清，然而，資料表明在某一地區(qū)被不同種類蛇傷的全身癥狀相似，蛇傷患者中 能夠鑒定出咬傷蛇種類的僅占20%，臨床上很難或者不可能有針對(duì)性地使用單價(jià)抗蛇毒血 清，反而由于免疫性疾病造成的損害，導(dǎo)致治療失敗和昂貴的抗蛇毒血清浪費(fèi)。目前我國(guó)生 產(chǎn)的抗蛇毒血清均為單價(jià)，相關(guān)技術(shù)包括由申請(qǐng)人此前提出的“抗蝰蛇蛇毒凍干血清及制 備方法”(發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)?1010141970. 5)，該方法的結(jié)果表明按所選劑量誘導(dǎo)馬免疫應(yīng)答 收集的IgG血漿，通過(guò)酶解并疏水層析能夠獲得純化的F (ab)，2片段，當(dāng)滿足一定比例時(shí)， F(ab)，2能夠與小鼠體內(nèi)蛇毒特異性結(jié)合，從而中和溶解蛇毒。但是，該申請(qǐng)仍然為單價(jià)抗 蛇毒血清。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)我國(guó)常見(jiàn)蝰科毒蛇品種和特點(diǎn)，本發(fā)明目的是提供一種能夠有效中和我國(guó)常 見(jiàn)蝰科毒蛇平均排毒量的多價(jià)抗蛇毒血清制劑的制備方法，并提供相應(yīng)的使用方法。本發(fā)明通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)從免疫馬血漿獲得純化的F (ab) ’ 2片段，并且用小鼠中和法分別測(cè)定抗五步蛇、抗蝰蛇和抗蝮蛇毒F(ab) ’ 2凍干品效價(jià)，即五步蛇蛇毒的LD5tl為3. ZSygq-1，抗五步蛇毒血清F(ab' )2凍干品與五步蛇蛇 蛇毒質(zhì)量比為10 Kmg mg)；蝰蛇蛇毒的LD5tl為1. 75μ g巧―1，抗蝰蛇毒血清F(ab' )2凍干品與蝰蛇毒質(zhì)量比 為 15 1 (mg mg)；蝮蛇蛇毒的LD5tl為3. Oyg .g—1，抗蝮蛇毒血清F (ab' )2凍干品與蝮蛇毒質(zhì)量比 為 20 1 (mg mg)；稱取抗五步蛇蛇毒血清600-870mg、抗蝰蛇毒血清400_550mg及抗蝮蛇血清 500-650mg，用305ml注射用水復(fù)溶，經(jīng)0. 22um膜過(guò)濾后灌裝成IOml/瓶注射劑，凍干。所述的所制備的多價(jià)抗血清F(ab)，2分子量為95-110Kda，F(xiàn)(ab)，2含量大于85%， IgG含量小于5%，F(xiàn)c片段含量小于10%。所制備的多價(jià)抗血清用法及劑量為靜脈注射，成人1500-2070mg/次，兒童與成
人同劑量，一次/日，病情緩解較慢時(shí)可適當(dāng)增加劑量。本發(fā)明通過(guò)選擇達(dá)到一定效價(jià)水平的幾種蝰科毒蛇的特異性單價(jià)抗蛇毒血清F(ab) ’ 2，按照選擇的劑量范圍裝量成注射劑，提供一種能夠中和蝰科不同種類的蛇毒的多 價(jià)抗蝰科蛇毒血清。經(jīng)小鼠中和法檢測(cè)該血清能有效中和我國(guó)常見(jiàn)五種蝰科毒蛇的平均一 次排毒量，包括尖吻蝮蛇毒80-110mg、或蝰蛇毒30-55mg、或烙鐵頭蛇毒55_75mg、或竹葉青 蛇毒20-35mg、或蝮蛇毒20-35mg，可以直接應(yīng)用于蛇傷重?；颊?，而不需要鑒定咬傷蛇的 種類，從而降低蛇傷重患率和死亡率。本發(fā)明制備的多價(jià)抗蝰科蛇毒血清本發(fā)明制備工藝 穩(wěn)定、高效，產(chǎn)品純度高于《中國(guó)藥典》2010年版中單價(jià)抗蛇毒血清的標(biāo)準(zhǔn)，其它項(xiàng)目符合 《中國(guó)藥典》2010年版中單價(jià)抗蛇毒血清的標(biāo)準(zhǔn)。


圖1為本發(fā)明多價(jià)抗蝰科蛇毒血清非還原性SDS-PAGE電泳圖譜。圖中，1.穿透 峰；2. 80-65ms/cm 洗脫峰；3. 65_55ms/cm 洗脫峰；4. 55_30ms/cm 洗脫峰；5. 30_5ms/cm 洗脫 峰；6.標(biāo)準(zhǔn)MK。圖2為抗五步蛇毒免疫血漿ELISA分析結(jié)果圖。圖3為抗蝮蛇毒免疫血漿ELISA分析結(jié)果圖。圖4為抗蝰蛇蛇毒免疫血漿ELISA分析結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式( 一 )本發(fā)明制備方法及對(duì)蝰科蛇毒中和試驗(yàn)效果實(shí)施例1 取五步蛇毒加佐劑乳化混勻?qū)︸R匹進(jìn)行兩次免疫，血漿抗體效價(jià)IO5采血，離心分 離血漿，鹽析、滅菌、酶解后疏水層析收集蛋白峰F(ab)’ 2純化片段，用8000-10000膜超濾 脫鹽后0. 22um膜過(guò)濾除菌冷凍干燥，獲得抗五步蛇血清凍干品。取蝰蛇毒、蝮蛇毒按相同 工藝獲得對(duì)應(yīng)抗血清凍干品。分別稱取抗五步蛇血清13g、抗蝰蛇血清9g、抗蝮蛇血清llg， 經(jīng)200ml注射用水復(fù)溶后0. 22um膜過(guò)濾后分裝，IOml/瓶，凍干，成為20人份用量。所制備的凍干抗血清每瓶經(jīng)小鼠中和法檢測(cè)能有效中和尖吻蝮蛇毒109mg、蝰蛇 毒50mg、烙鐵頭蛇毒62mg、竹葉青蛇毒24mg及蝮蛇毒26mg。所制備的多價(jià)抗血清F(ab)，2分子量為102Kda, F(ab)，2含量92. 7%，IgG含量 5%，F(xiàn)c片段含量小于10%。實(shí)施例2 取五步蛇毒加佐劑乳化混勻?qū)︸R匹進(jìn)行兩次免疫，血漿抗體效價(jià)IO5采血，離心 分離血漿鹽析后，滅菌、酶解、疏水層析收集蛋白峰F(ab)，2純化片段，用8000-10000膜超 濾脫鹽后0. 22um膜過(guò)濾除菌冷凍干燥，獲得凍干抗五步蛇血清。取蝰蛇毒、蝮蛇毒按相同 工藝獲得對(duì)應(yīng)凍干抗血清。分別稱取凍干抗蝮蛇血清6. 3g，抗蝰蛇血清5g，抗五步蛇血清 8. 9g凍干品，IOOml注射用水復(fù)溶后0. 22um膜過(guò)濾后分裝，IOml/瓶，凍干。所制備的凍干抗血清經(jīng)小鼠中和法檢測(cè)能有效中和尖吻蝮蛇毒llOmg、蝰蛇毒 50mg、烙鐵頭蛇毒67mg、竹葉青蛇毒26mg及蝮蛇毒26mg。所制備的多價(jià)抗血清F(ab)，2分子量為108Kda，F(xiàn)(ab)，2含量92. 6%，IgG含量 4%，F(xiàn)c片段含量小于10%。實(shí)施例3
取五步蛇毒加佐劑乳化混勻?qū)︸R匹進(jìn)行兩次免疫，血漿抗體效價(jià)IO5采血，離心分離血漿，鹽析、滅菌、酶解后疏水層析收集蛋白峰F(ab)，2純化片段，用8000-10000膜超 濾脫鹽后0. 22um膜過(guò)濾除菌冷凍干燥，獲得凍干抗五步蛇血清。取蝰蛇毒、蝮蛇毒按相同 工藝獲得對(duì)應(yīng)凍干抗血清。分別稱取抗蝮蛇血清10. 5g，抗蝰蛇血清8. 7g，抗五步蛇血清 12. 5g凍干品，200ml注射用水復(fù)溶后0. 22um膜過(guò)濾后分裝，IOml/瓶，凍干。所制備的多價(jià)抗血清F(ab)，2分子量為97Kda，F(xiàn)(ab)，2含量94. 2%，IgG含量小 于3%，F(xiàn)c片段含量小于10%。( 二)本發(fā)明免疫擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果及小鼠中和能力測(cè)定(1)免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果純化后的F(ab' )2凍干品與蝰蛇毒在8 1時(shí)出現(xiàn)明顯免疫沉淀線。純化后的F(ab' )2凍干品與五步蛇毒在4 1時(shí)出現(xiàn)明顯免疫沉淀線。純化后的F(ab' )2凍干品與蝮蛇毒在4 1時(shí)出現(xiàn)明顯免疫沉淀線。(2)抗蝰蛇毒血清成品小鼠中和法測(cè)定抗體效價(jià)采用Blliss簡(jiǎn)化機(jī)率單位法分 別測(cè)得蝰蛇蛇毒LD5tl 為 1. 75 μ g/g ；五步蛇蛇毒的LD50為3. 25 μ g · g-1 ；蝮蛇蛇毒的LD5tl 為 3. 0 μ g · g-1。小鼠體外中和實(shí)驗(yàn)小鼠分為抗蝰蛇、抗五步蛇、抗蝮蛇、對(duì)照組四個(gè)組，每組 6只小鼠，雌雄各半。以硼酸鹽緩沖溶液溶解抗血清與蛇毒，蛇毒量均為2LD5(I，注射液 為抗蝰科蛇毒血清F(ab' )2凍干品與蛇毒按質(zhì)量比5 UlO 1、15 1,20 1、 25 1,30 1混合搖勻后置37°C結(jié)合45min后注射小鼠腹腔，每個(gè)稀釋度注射6只，腹 腔注射，每只0. 4ml ；對(duì)照組為硼酸鹽緩沖液與2LD5(i蝰蛇毒、五步蛇毒、蝮蛇毒腹腔注射 0.4ml/只，觀察72h并記錄小鼠死亡情況。結(jié)果本發(fā)明抗血清F(ab' )2凍干品與蝰蛇 毒質(zhì)量比為15 Kmg mg)；本發(fā)明抗血清F(ab' )2凍干品與五步蛇蛇蛇毒質(zhì)量比為 10 Kmg mg)；本發(fā)明抗血清F(ab' )2凍干品與蝮蛇毒質(zhì)量比為20 l(mg mg)，可 保護(hù)小鼠100%存活，而對(duì)照組小鼠全部死亡。(三)免疫血漿抗體滴度測(cè)定以包被液稀釋濃度為10 μ g/mL的蝰蛇毒、五步蛇毒、蝮蛇毒(1 20)包被酶標(biāo) 板，每孔100μ L，4°C過(guò)夜，洗板3次，將免疫馬血漿按10-1-10-6稀釋作為檢測(cè)抗體加入酶 標(biāo)板，并以健康馬血清稀釋相同倍數(shù)作為陰性對(duì)照，37°C結(jié)合2h后，洗板3次，再加入酶標(biāo) 記二抗(兔抗馬HRP)，370C結(jié)合2h，洗板后加入顯色液，置暗處顯色30-45min后加入2mol/ L H2SO4中止反應(yīng)，用酶標(biāo)分析儀測(cè)定A492nm值?？跪裆叨久庖哐獫{稀釋至10_6時(shí)可與蝰蛇蛇毒發(fā)生特異性結(jié)合呈陽(yáng)性，抗五步蛇 毒免疫血漿稀釋至10_5時(shí)可與五步蛇毒發(fā)生特異性結(jié)合呈陽(yáng)性，抗蝮蛇毒免疫血漿稀釋至 10_5時(shí)可與蝮蛇蛇毒發(fā)生特異性結(jié)合呈陽(yáng)性。(四)成品制備及使用方法分別稱取抗蝮蛇血清500_650mg，抗五步蛇蛇毒血清600_870mg，抗蝰蛇毒血清 400-550mg后，用305ml注射用水復(fù)溶，經(jīng)0. 22um膜過(guò)濾后分裝，IOml/瓶，凍干。劑量及用法靜脈注射，成人1500-2070mg/次，兒童與成人同劑量，一次/日，如病情緩解較慢可適當(dāng)增加劑量 。
權(quán)利要求
一種中國(guó)陸生常見(jiàn)蝰科蛇毒多價(jià)抗血清的制備方法，包括從免疫馬血漿獲得純化的F(ab)’2片段，其特征是a.用小鼠中和法分別測(cè)定抗五步蛇、抗蝰蛇和抗蝮蛇毒F(ab)’2凍干品效價(jià)，包括五步蛇蛇毒的LD50為3.25μg·g-1，抗五步蛇毒血清F(ab′)2凍干品與五步蛇蛇蛇毒質(zhì)量比為10∶1(mg∶mg)；蝰蛇蛇毒的LD50為1.75μg·g-1，抗蝰蛇毒血清F(ab′)2凍干品與蝰蛇毒質(zhì)量比為15∶1(mg∶mg)；蝮蛇蛇毒的LD50為3.0μg·g-1，抗蝮蛇毒血清F(ab′)2凍干品與蝮蛇毒質(zhì)量比為20∶1(mg∶mg)；b.稱取符合以上效價(jià)的抗五步蛇蛇毒血清600-870mg、抗蝰蛇毒血清400-550mg及抗蝮蛇血清500-650mg，用305ml注射用水復(fù)溶，經(jīng)0.22um膜過(guò)濾后灌裝成10ml/瓶注射劑，凍干保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中國(guó)陸生常見(jiàn)蝰科蛇毒多價(jià)抗血清的制備方法，其特征是所 制備的多價(jià)抗血清F(ab)，2分子量為95-llOKda，F(xiàn)(ab)，2含量大于85%，IgG含量小于 5%，F(xiàn)c片段含量小于10%。
3.如權(quán)利要求1或2所述的中國(guó)陸生常見(jiàn)蝰科蛇毒多價(jià)抗血清的用法，其特征是該多 價(jià)抗血清用法及劑量為靜脈注射，成人1500-2070mg/次，兒童與成人同劑量，一次/日，病 情緩解較慢時(shí)可適當(dāng)增加劑量。
全文摘要
一種中國(guó)陸生常見(jiàn)蝰科蛇毒多價(jià)抗血清的制備方法及用法，涉及多價(jià)抗血清的制備及用法。本發(fā)明選擇達(dá)到一定效價(jià)水平的幾種蝰科毒蛇的特異性單價(jià)抗蛇毒血清F(ab)’2，裝量成10ml/瓶注射劑。經(jīng)小鼠中和法檢測(cè)該血清能有效中和我國(guó)常見(jiàn)五種蝰科毒蛇的平均一次排毒量，包括尖吻蝮蛇毒80-110mg、或蝰蛇毒30-55mg或烙鐵頭蛇毒55-75mg或竹葉青蛇毒20-35mg或蝮蛇毒20-35mg，可直接應(yīng)用于蛇傷重?；颊?，不需鑒定咬傷蛇種類，降低蝰科毒蛇傷致殘率和死亡率。
文檔編號(hào)A61K35/16GK101843902SQ20101017917
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月21日
發(fā)明者葉峰平, 張富強(qiáng), 張志曉, 范泉水, 邱薇, 鄭穎 申請(qǐng)人:成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心軍事醫(yī)學(xué)研究所