專利名稱：靶向pdcd5抗流感病毒寡核苷酸的結構和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程藥物領域，具體地說是一種靶向程序細胞死亡因子5 (PD⑶5， Programmed cell death protein 5)夕臺？(IV, influenza virus)胃|白勺H胃 核苷酸(ASODN，antisense oligodexynucleotide)的序列、結構及其治療藥物。
背景技術：
流感病毒感染可引起急性呼吸道傳染病。該病潛伏期短，傳染性強，傳播迅速。甲 型流感威脅最大，且易發(fā)生變異，易引起暴發(fā)流行。1918年至1920年，著名的"西班牙流 感〃在全球范圍內(nèi)造成了 2000萬-4000萬人死亡。此后，1957甲型流感病毒(H2N2)所致 的〃亞洲流感"、1968由甲型流感病毒(H3N2)所致的"香港流感"、1977年由甲型流感 病毒(H1N1)所致的"俄羅斯流感"、1997年以來出現(xiàn)的高致病性禽流感病毒(AIV，avian influenza virus)，以及2009年出現(xiàn)的甲型流感病毒(H1N1)感染，都嚴重威脅了人們健康 和正常生活。流感作為急性呼吸道傳染病嚴重威脅著人們的健康，對于兒童、老年人、其它 慢性病患者等高危人群尤其嚴重，而且也已成為社會勞動力損失、醫(yī)療負擔加重乃至社會 不安定的主要原因之一。由于流感病毒變異，常規(guī)疫苗不能有效預防流感的發(fā)生和流行。過去用于治療流 感的兩種較低廉的抗病毒藥物三環(huán)癸胺(amantadine)和金剛乙胺(remantadine)對人體 內(nèi)流感病毒幾乎不起作用，且耐藥較為普遍。新近上市的神經(jīng)氨酸酶抑制劑(例如達菲和 帕納米韋)雖效果較好，但隨著臨床廣泛應用，耐藥毒株分離的報道也相繼出現(xiàn)。目前仍缺 乏可靠的方法對流感的發(fā)生和流行進行有效的控制，有效的預防和控制流感病毒方法的已 成當務之急。因此研究特異性高、毒副作用小的新型抗流感病毒藥物對治療與預防具有重 要現(xiàn)實意義。病毒是一種嚴格的細胞內(nèi)寄生物。病毒感染致病涉及病毒與機體兩個復雜生物系 統(tǒng)及其二者間的相互作用。一方面，宿主表現(xiàn)出對病毒感染的主動限制；另一方面，病毒會 主動地通過對宿主細胞的生物大分子進行修飾，以使宿主細胞為它的復制、轉錄等提供必 需的細胞機器。在短時間內(nèi)不影響細胞存活且能為宿主細胞所能容忍的前提下，增強抗病 毒信號或者阻斷病毒復制所需的宿主細胞因子可以有效的抗病毒以及降低耐藥毒株產(chǎn)生 的頻率。PD⑶5是我國科學家發(fā)現(xiàn)的一種凋亡效應分子。PD⑶5表達廣泛，進化保守，具有 促進凋亡和促進Parapotosis的效應，其編碼區(qū)全長559bp，編碼的PDCD5蛋白由125個氨 基酸組成，具有促進多種腫瘤細胞凋亡和抑制增殖的效應。流感病毒感染引起細胞病變凋 亡，因此，抑制PD⑶5可能保護細胞免受病毒傷害。核酸藥物是一類全新的基因靶向創(chuàng)新藥物，長期以來一直是國際研究的熱點，特 別是近幾年小核酸的發(fā)現(xiàn)進一步將核酸藥物的研究推向一個前所未有的發(fā)展高潮。目前幾 乎所有大的國際制藥公司均投入巨資進行核酸藥物的研發(fā)，如諾華和輝瑞公司分別與ISIS 和Eyetech公司共同開發(fā)的核酸藥物Vitravene和Macugen已批準上市，另有幾十個正在進行臨床研究。反義寡核苷酸是一類經(jīng)過人工合成的寡核苷酸片段，長度多為15 30個核苷酸。 通過堿基互補的原理，干擾相關基因的轉錄和翻譯，或者整個基因組的復制，其優(yōu)點在于其 理論上的高度靶特異性，是一種理想的具有精確選擇性的基因靶向治療藥物。由于反義寡 核苷酸作用的高度特異性，因此被認為是極具潛力的抗腫瘤和抗病毒新藥。國外已有一些 著名制藥企業(yè)已將反義藥物作為其新藥研究開發(fā)的重點方向之一
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗流感病毒藥物設計的宿主靶標PD⑶5，以及一種靶 向PDCD5阻斷流感病毒復制、抑制流感病毒致病的寡核苷酸序列、結構及其藥物。本發(fā)明的主要內(nèi)容是利用亞細胞蛋白質(zhì)組學方法篩選到小分子蛋白PDCD5，根據(jù) 已公開的PDCD5基因mRNA序列(NM_004708. 2)，對其進行RNA 二級結構的計算機模擬，設計 了 5條針對PDCD5的反義寡核苷酸，初步篩選結果顯示PDCD5-5抑制病毒所致細胞病變作 用最佳，PDCD5-1和-2次之。進而進行了長度優(yōu)化，針對PDCD5總共設計了 29條反義寡核 苷酸。篩選結果顯示14個堿基以上的序列絕大部分具有抗流感活性，其中序列PDCD5-1、 PDCD5-2、PDCD5-5、21L、19A、18B、16A在各個長度的序列中抗流感活性較高，綜合考慮其中 PD⑶5-5抑制病毒所致細胞病變作用最佳。在A549細胞及MDCK細胞中以PD⑶5_5為代表 進一步評價了金剛乙胺修飾及與金剛乙胺聯(lián)合用藥抑制流感病毒致細胞病變效果。結果表 明修飾后PDCD5-5對病毒致細胞病變的抑制效果明顯提高，對流感病毒Hmi所致細胞病 變抑制率提高了 10%左右，對金剛乙胺耐藥H3N2型流感病毒引起的細胞病變的IC50降低 了 30%左右。表1反義寡核苷酸的分子設計 總之，根據(jù)本發(fā)明，與人PDCD5基因的mRNA互補結合的寡核苷酸均能有效的抑制 流感病毒和保護細胞使其免于流感病毒所致細胞病變，是一種特異性高、毒副作用小的新 型抗流感病毒的潛在藥物。根據(jù)本發(fā)明，針對PDCD5 mRNA的反義寡核苷酸能特異性抑制流感病毒的致細胞病 變和復制，有可能成為治療及預防流感相關疾病的新型生物工程藥物。根據(jù)本發(fā)明，反義寡核苷酸的長度與其細胞通透性，與靶序列結合親和性及作用 特異性等因素相關，PDCD5-5的長度根據(jù)實驗確定，本發(fā)明包含了與PDCD5-5具有60%及其 以上連續(xù)相同序列的任何長度寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，為增強反義寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及組織靶向性等，本 發(fā)明包含了 PD⑶5-5硫代修飾、甲基修飾或金剛乙胺修飾。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的寡核苷酸及其修飾物可按本領域已知方法配成非腸道給藥 的制劑。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的寡核苷酸及其修飾物治療組成可應用單獨的有效成分或組 合物形式包括聯(lián)合其他反義寡核苷酸及其衍生物形式，還可以含有治療上可以接受的載體 材料，如脂質(zhì)體、融合肽或病毒載體等。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的治療組成，依不同情況包括特定藥物的藥物動力學、藥代動 力學、給藥模式、給藥途徑、受者的年齡、體重、肝腎功能狀態(tài)、疾病的性質(zhì)、程度及治療時限等，以適宜的劑量給藥。本發(fā)明的實施對嚴重危害人類健康的流感病毒感染的治療具有重要的社會效益和經(jīng)濟效益。


圖1硫代PDCD5反義寡核苷酸序列抑制Hmi型病毒所致細胞病變圖2 PDCD5-1、PDCD5-2、PDCD5-5劑量依賴抑制Hmi型流感病毒致細胞病變作用圖3 PD⑶5-5劑量依賴性地抑制H3N2型流感病毒引起的細胞病變圖4 22個堿基長度的PD⑶5-5劑量依賴性地抑制Hmi型流感病毒所致細胞病變圖5 18個堿基長度的PD⑶5-5劑量依賴性地抑制Hmi型流感病毒所致細胞病變圖6 16個堿基長度的PD⑶5-5劑量依賴性地抑制Hmi型流感病毒所致細胞病變圖7 14個堿基長度的PD⑶5-5劑量依賴性地抑制Hmi型流感病毒所致細胞病變圖8對Hmi型流感病毒所致細胞病變抑制率較高的不同長度PDCD5-5序列效果 的驗證圖9 PD⑶5-5抑制Hmi型流感病毒序列長度的再優(yōu)化圖10金剛乙胺與PD⑶5-5的偶聯(lián)過程示意11金剛乙胺修飾后的PD⑶5-5劑量依賴地抑制Hmi型流感病毒所致細胞病變圖12金剛乙胺修飾后的PD⑶5-5劑量依賴地抑制金剛乙胺耐藥H3N2型流感病毒 所致細胞病變
具體實施例方式實施例一本實施例主要說明靶向人PDCD5基因抗流感病毒反義寡核苷酸的設計、合成和篩 選。材料與方法1.反義寡核苷酸PD⑶5-5的設計和合成檢索GeneBank中的核酸序列數(shù)據(jù)庫，選擇NCBI公布的PD⑶5 mRNA參考序列 NM_004708. 2，對其進行RNA 二級結構的計算機模擬，選擇了 5個不穩(wěn)定的莖環(huán)結構作為反 義寡核苷酸的作用靶點。通過與GeneBank聯(lián)機blast序列比對，所選擇的靶序列均具有很 好的特異性，不會干擾人類其它正常基因的表達(見表1)。所有寡核苷酸均采用8909型自 動DNA合成儀合成全硫代修飾的反義寡核苷酸。合成完畢濃氨水55°C切割并脫保護15小 時后，經(jīng)Micro Pure II反相純化柱(Oligo Prep 0P120，SAVANT)純化，紫外定量后真空干 燥，-20°C保存?zhèn)溆谩?. A549細胞、病毒和對照藥物病毒在10日齡SPF雞胚傳代，收集尿囊液，測定其血凝(Hemagglutination，HA) 效價，取HA價>1 26者，混勻、分裝、保存于-70°C備用。使用的病毒毒株為A/京防 /86-1 (HlNl)、A/ 魯防 /9/93 (H3N2)。A549 細胞培養(yǎng)液為含 10%胎牛血清(Gibco)的 1640 培養(yǎng)液，病毒感染和細胞病變測定時使用含胎牛血清和5mg/ml胰蛋白酶的維持液。陽 性對照藥物為金剛乙胺。
3.反義寡核苷酸的篩選A549細胞在含10%胎牛血清(Gibco)的1640培養(yǎng)基中，于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，以8000 10000個細胞/孔將細胞接 種至96孔細胞培養(yǎng)板中，次日60 80%長滿。用含胎牛血清的1640稀釋PD⑶5-1 5至ii M。用PBS (pH7. 5)沖洗細胞一次，將PDCD5-1 5以100 yl/孔的量加入各孔。同 時設立鹽酸金剛乙胺陽性對照藥物組、病毒感染陽性對照組和A549細胞陰性對照組，作用 60min。用 PBS (pH7. 5)沖洗細胞一次，每孔加入 100TCID50/0. lml 的 A/ 京防 /86-1 (H1N1) 病毒稀釋液50 u 1，37°C感染作用60min，用PBS (pH7. 5)沖洗細胞，將PDCD5-1 5及陽性對 照藥物鹽酸金剛乙胺以lOOiU/孔的量加入各孔。37°C培養(yǎng)2d。利用CellTiter96 Aqueous One Solution試劑盒(Promega產(chǎn)品)測定細胞病變程度(以0D490表示)，并以如下公式 計算藥物的病毒抑制率[(0D試驗-0D病毒)/ (0D細胞-0D病毒)]X 100。重復試驗二次， 計算平均值以篩選出最佳的反義寡核苷酸以進一步評價。4. PDCD5-1、PDCD5-2、PDCD5-5抑制流感病毒致細胞病變劑量依賴作用參照實施例一將A549細胞鋪板96孔細胞培養(yǎng)板，次日60 80%長滿。用含1 % FBS 的 1640 稀釋 PDCD5-l、PDCD5-2、PDCD5-5 至 0. 25,0. 5,1. 0、2. Oy M。以 PBS(pH7. 5)沖 洗細胞一次，將PDCD5-1、PDCD5-2、PDCD5-5以100 yl/孔的量加入各孔。同時設立鹽酸 金剛乙胺陽性對照藥物組、病毒感染陽性對照組和A549細胞陰性對照組，作用60min。用 PBS(pH7. 5)沖洗細胞一次，每孔加入100TCID50/0. lml的A/京防/86-1 (Hmi)病毒稀釋 液 50iil，37°C 感染作用 60min，用 PBS(pH7. 5)沖洗細胞，將 PDCD5-1、PDCD5-2、PDCD5-5 及 陽性對照藥物鹽酸金剛乙胺以100 ill/孔的量加入各孔。37°C培養(yǎng)2d。利用CellTiter96 Aqueous One Solution試劑盒(Promega產(chǎn)品)測定細胞病變程度(以0D490表示)，計算 藥物的細胞病變抑制率和IC5Q。5. PDCD5-5抑制H3N2型流感病毒(A/魯防/9/93 (H3N2))致細胞病變劑量依賴作 用參照實施例一將A549細胞鋪板96孔細胞培養(yǎng)板，次日60 80%長滿。用 含 1 % FBS 的 1640 稀釋 PDCD5-5 至 0. 25,0. 5,1. 0、2. OyM。以 PBS(pH7. 5)沖洗細胞一 次，以100 yl/孔的量加入不同濃度的PD⑶5-5，同時設立陽性藥物對照組、病毒感染陽 性對照組和A549細胞陰性對照組，作用60min。用PBS(pH7. 5)沖洗細胞一次，每孔加入 100TCID50/0. lml的H3N2型病毒稀釋液50iU，37°C感染作用60min。再以PBS(pH7. 5)沖洗 細胞一次，每孔加入100 u 1不同濃度的PDCD5-5。37°C培養(yǎng)2d。利用CellTiter96 Aqueous One Solution試劑盒(Promega產(chǎn)品)測定細胞病變程度(以0D49(1表示)，計算藥物的細 胞病變抑制率和IC5(1。結果從所設計的5條反義寡核苷酸中進行初步篩選，以選出效果最佳的反義寡核苷 酸，以便于進一步的評價。結果顯示在濃度為2 y M時以PDCD5-2抑制病毒所致細胞病變 作用最佳，平均抑制率為94. 299%, PDCD5-1和-5次之，平均抑制率為88. 23%和89. 13% (見圖1)。1. PDCD5-1、PDCD5-2、PDCD5-5抑制Hmi型流感病毒致細胞病變作用的劑量依賴
作用
7
不同濃度PDCD5-1、PDCD5-2、PDCD5-5抑制Hmi型流感病毒致細胞病變抑制率見圖2。三種反義序列能較好地抑制Hmi型流感病毒致細胞病變，三種反義核酸 PDCD5-l、PDCD5-2和PDCD5-5抑制流感病毒致細胞病變作用，IC5tl分別為0. 34μΜ、0. 79 μ M 和 0. 25 μ Μ。三種反義序列均能較好地抑制Hmi型流感病毒致細胞病變，PD⑶5-1在高濃度對 HlNl型流感病毒致細胞病變抑制率較高，PDCD5-2，在低濃度對Hmi型流感病毒致細胞病 變抑制率最低，PDCD5-5對Hmi型流感病毒致細胞病變抑制IC5tl最低。選擇PDCD5-5進行 下步實驗。2. PD⑶5-5抑制Η3Ν2型流感病毒致細胞病變劑量依賴作用各個劑量PDCD5-5對Η3Ν2型流感病毒引起的細胞病變抑制率見圖3，由試驗結果 可知PD⑶5-5抑制Η3Ν2型流感病毒致細胞病變存在劑量依賴作用，IC5tl約為0. 16 μ Μ,陽性 藥鹽酸金剛乙胺對Η3Ν2型流感病毒引起的細胞病變抑制的IC5tl約為0. 16 μ M0由結果可 推測PDCD5-5對甲型流感病毒的抑制存在普遍性。結論PDCD5可以作為抗甲型流感病毒宿主靶標，靶向PDCD5的反義寡核苷酸藥物具有 體外抗甲型流感病毒引起的細胞病變和抑制流感病毒的復制作用。實施例二 本實施例主要說明不同長度反義寡核苷酸PDCD5-5抗流感病毒效果。1.PDCD5-5序列長度的優(yōu)化一參考人PD⑶5基因的mRNA序列，將PD⑶5_5序列進行兩端增加或減少堿基，使序 列為22、18、16、14個堿基。通過與GeneBank聯(lián)機blast序列比對，所選擇的靶序列均具有 很好的特異性，不會干擾人類其它正?；虻谋磉_。參照實施例一進行寡核苷酸合成、硫代 修飾、純化、干燥和存儲。參照實施例一將A549細胞鋪板96孔細胞培養(yǎng)板，次日60 80%長滿。用含1 % FBS 的 1640 稀釋 PDCD5-5 至 0. 25、0. 5、1.0、2. ΟμΜ。以 PBS(pH7. 5)沖洗細胞一次，加入不 同濃度的22、20、18、16、14個堿基長度的PD⑶5_5。同時設立鹽酸金剛乙胺陽性對照藥物 組、病毒感染陽性對照組和A549細胞陰性對照組。加入100TCID50/0. Iml的病毒稀釋液 50μ 1，37°C感染作用60min。再用PBS(pH7. 5)沖洗細胞，加入不同濃度的22、20、18、16、14 個堿基長度的 PDCD5-5。37°C培養(yǎng) 2d。利用 CellTiter96 Aqueous One Solution 試劑盒 (Promega產(chǎn)品)測定細胞病變程度(以OD49tl表示)，計算藥物的細胞病變抑制率和IC5。。2.PDCD5-5序列長度的優(yōu)化二參考人PDCD5基因的mRNA序列，將實施例二步驟1篩選出的序列進行兩端增加或 減少堿基。通過與GeneBank聯(lián)機blast序列比對，所選擇的靶序列均具有很好的特異性， 不會干擾人類其它正?；虻谋磉_。所有寡核苷酸均參照實施例一進行寡核苷酸合成、硫 代修飾、純化、干燥和存儲。參照實施例一將A549細胞鋪板96孔細胞培養(yǎng)板，次日60 80%長滿。用含1 % FBS 的 1640 稀釋 PDCD5-5 至 0. 25、0. 5、1.0、2. ΟμΜ。以 PBS(pH7. 5)沖洗細胞一次，加入不 同濃度的23、22、21、20、19、18個堿基長度的PD⑶5_5。同時設立鹽酸金剛乙胺陽性對照藥物組、病毒感染陽性對照組和A549細胞陰性對照組。加入100TCID50/0. Iml的病毒稀釋液 50μ 1，37°C感染作用60min。再用PBS(pH7. 5)沖洗細胞，加入不同濃度的22、20、18、16、14 個堿基長度的 PDCD5-5。37°C培養(yǎng) 2d。利用 CellTiter96 Aqueous One Solution 試劑盒 (Promega產(chǎn)品)測定細胞病變程度(以OD49tl表示)，計算藥物的細胞病變抑制率和IC5。。結果 1.PDCD5-5序列長度的優(yōu)化一不同堿基長度的PDCD5-5序列對細胞病變劑量依賴抑制效果如圖4、圖5、圖6、圖 7，其中22々、228、22(、？00)5-5、188和16A均表現(xiàn)出較好的抑制流感病毒致細胞病變作用和 劑量依賴性，IC5tl 分別為3. 873μΜ、0· 442μΜ、3· 903μΜ、0· 507μΜ、0· 838 μ M和 0. 573 μ Μ。 選出這6個序列，再次合成重復試驗，對細胞病變的抑制率如圖8，22A、22B、22C、PD⑶5_5、 18B和16A抑制流感病毒致細胞病變均表現(xiàn)出較好的劑量依賴作用，IC5tl分別為0. 884 μ Μ、 0. 879 μ Μ、0· 958 μ Μ、0· 864 μ Μ、3· 245 μ M 和 0· 882 μ Μ。2.PDCD5-5序列長度的優(yōu)化二長度再次優(yōu)化的PDCD5-5序列抑制Hmi型流感病毒所致細胞病變效果如圖 9，PDCD5-5、18B、19A、19B、21L、21R、22A、23L、和23R均表現(xiàn)出較好的抑制流感病毒致細 胞病變作用和劑量依賴性，IC50分別為0. 271 μ Μ、1. 212 μ Μ、0· 454,0. 715,0. 302 μ Μ、 0. 295 μ Μ、0· 413 μ Μ、0· 537 μ M和0· 831 μ Μ。確定PDCD5-5為抑制流感病毒致細胞病變效 果和長度最佳序列。結論考慮合成及抑制效果確定PD⑶5-5為最佳抗流感序列。實施例三本實施例主要說明經(jīng)過金剛乙胺修飾的PD⑶5-5在體外Α549細胞水平抑制Hmi 致細胞病變活性的研究。材料與方法1.金剛乙胺與PD⑶5-5的偶聯(lián)鹽酸金剛乙胺去鹽酸后暴露氨基，與6-馬來酰亞胺己酸N琥珀酰亞胺酯進行親核 取代反應，取代琥珀酰亞胺酯，形成新的化合物。與5 ‘進行巰基修飾的反義寡核苷酸重新 反應，最終形成目標金剛乙胺-反義寡核苷酸偶聯(lián)化合物，偶聯(lián)過程如圖10。使用優(yōu)化合成 路線及各步反應條件進行合成，合成高純度的金剛乙胺與PDCD5-5的偶聯(lián)的PDCD5-5的金 剛乙胺修飾序列(PJG)并借助各類分析手段確保得到的偶聯(lián)化合物純度好、結構正確。2. Α549細胞、MDCK細胞、病毒和對照藥物參照實施例一病毒在10日齡SPF雞胚傳代，收集尿囊液，測定其血凝 (Hemagglutination，HA)效價，取HA價> 1 26者，混勻、分裝、保存于-70°C備用。使用 的病毒毒株為A/京防/86-1 (HlNl)、金剛乙胺耐藥毒株H3N2。A549細胞培養(yǎng)液為含10% 胎牛血清(Gibco)的1640培養(yǎng)液；MDCK細胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清(Gibco)的DMEM培 養(yǎng)液，病毒感染和細胞病變測定時使用含胎牛血清和5mg/ml胰蛋白酶的維持液。陽性 對照藥物為金剛乙胺。3.偶聯(lián)金剛乙胺后的PD⑶5-5抑制Hmi型流感病毒復制的劑量依賴作用參照實施例一將A549細胞鋪板96孔細胞培養(yǎng)板，次日60 80%長滿。用含1 %FBS 的 1640 培養(yǎng)基稀釋 PDCD5-5 及 PJG 至 0. 125,0. 25,0. 5,1. 0,2. OyM0 以 PBS (pH7. 5) 沖洗一次，加入100TCID50/0. Iml的H3N2型病毒稀釋液50 μ 1，37°C感染作用60min。再 以PBS(pH7. 5)沖洗一次，分別加入不同濃度的PJG和同濃度PD⑶5-5與金剛乙胺聯(lián)合用藥 (PD⑶5-5+JG)，同時設立鹽酸金剛乙胺陽性藥對照、病毒感染陽性對照和A549細胞陰性對 照。37°C培養(yǎng) 2d。利用 CellTiter96 Aqueous One Solution 試劑盒(Promega 產(chǎn)品)測定 細胞病變程度(以OD49tl表示)，計算藥物的細胞病變抑制率和IC5Q。4.偶聯(lián)金剛乙胺后PD⑶5-5抑制金剛乙胺耐藥毒株H3N2型流感病毒復制的劑量 依賴作用參照實施例一將MDCK細胞鋪板96孔細胞培養(yǎng)板，次日60 80%長滿。用含1 % FBS 的DMEM 培養(yǎng)基稀釋 PDCD5-5 及 PJG 至 0. 125、0. 25、0. 5、1. 0、2. 0 μ M。以 PBS(pH7. 5) 沖洗一次，加入100TCID50/0. Iml的H3N2型病毒稀釋液50 μ 1，37°C感染作用60min。再以 PBS(pH7. 5)沖洗一次，分別加入不同濃度的PJG，同時設立鹽酸金剛乙胺對照、病毒感染陽 性對照和MDCK細胞陰性對照。37°C培養(yǎng)2d。利用CellTiter96 Aqueous One Solution試 劑盒(Promega產(chǎn)品)測定細胞病變程度(以OD49tl表示)，計算藥物的細胞病變抑制率和 IC500結果1.合成成出高純度的PJG，經(jīng)分析純度在95%以上。2. PJG抑制Hmi型流感病毒致細胞病變檢測結果得出，PD⑶5_5組抑制Hmi型流 感病毒致細胞病變IC5tl為0. 451 μ Μ,鹽酸金剛乙胺陽性藥對照組抑制Hmi型流感病毒致 細胞病變IC5tl為1. 265 μ Μ, PJG組抑制Hmi型流感病毒致細胞病變IC5tl為0. 235 μ Μ，如圖 11所示，PD⑶5-5+JG組抑制Hmi型流感病毒致細胞病變IC5tl為0. 097 μ Μ,與未修飾相比， 金剛乙胺修飾后PDCD5-5對流感病毒引起的細胞病變的抑制率提高了 10%左右，與金剛乙 胺聯(lián)合用藥結果顯示聯(lián)合用藥對Hmi型流感病毒致細胞病變抑制作用幾乎是兩種藥單 獨效果的疊加。3. PJG抑制金剛乙胺耐藥Η3Ν2型流感病毒致細胞病變檢測結果得出，PD⑶5_5組 抑制金剛乙胺耐藥Η3Ν2型流感病毒所致細胞病變IC50為0. 294 μ Μ,鹽酸金剛乙胺對金剛 乙胺耐藥Η3Ν2型流感病毒所致細胞病變幾乎沒有抑制作用，PJG組抑制金剛乙胺耐藥Η3Ν2 型流感病毒所致細胞病變IC50為0. 215 μ Μ，如圖12所示，與未修飾相比，金剛乙胺修飾后 PD⑶5-5對金剛乙胺耐藥Η3Ν2型流感病毒引起的細胞病變的IC50降低了 30%左右。結論通過偶聯(lián)金剛乙胺PD⑶5-5對流感病毒Hmi所致細胞病變抑制率提高了 10%左 右，對金剛乙胺耐藥Η3Ν2型流感病毒引起的細胞病變的IC50降低了 30%左右。
權利要求
與PDCD5mRNA互補的寡核苷酸，分布在5’非編碼區(qū)、編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)，其長度是10-30個堿基。
2.根據(jù)權利要求1所述寡核苷酸，其特征是所述的選自序列表1 29所示反義寡核苷 酸序列結構。
3.根據(jù)權利要求2所述的寡核苷酸，其特征是所述的反義寡核苷酸序列結構選自下列 之一Dgcttccctgtgctttgcttc ；2)tccctgtgctttgcttcctg；3)ccctgtgctttgcttcctgt；4)ccctgtgctttgcttcctgtt5)ccctgtgctttgcttcctg；6)ccctgtgctttgcttcct；7)ccctgtgctttgcttc。
4.根據(jù)權利要求3所述的寡核苷酸，其特征是所述的反義寡核苷酸序列結構選自下列 之一1)ccctgtgctttgcttcctgt；2)gcttccctgtgctttgcttc。
5.根據(jù)權利要求4所述的寡核苷酸，其特征是所述的反義寡核苷酸序列結構為以下序 列ccctgtgctttgcttcctgt。
6.根據(jù)權利要求5所述的寡核苷酸，其特征為所述的反義寡核苷酸包含了與 ccctgtgctttgcttcctgt具有60%及其以上連續(xù)相同序列的任何長度寡核苷酸。
7.根據(jù)權利要求1所述寡核苷酸，其特征是該反義寡核苷酸經(jīng)過不同化學修飾。
8.根據(jù)權利要求7所述寡核苷酸，其化學修飾為硫代修飾、甲基修飾或金剛乙胺修飾。
9.根據(jù)權利要求1所述寡核苷酸，其特征為活性成分選自權利要求1-8所述任一寡核 苷酸或其組合。
10.權利要求1-9中所述的任一寡核苷酸或其組合在制備治療和預防流感病毒感染的 藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種反義寡核苷酸藥物的結構和用途。具體說是發(fā)現(xiàn)程序死亡蛋白5(PDCD5)可以作為抗病毒的宿主靶標，靶向PDCD5抗流感病毒病毒(IV)反義寡核苷酸的結構和用途。本實驗室通過篩選和驗證發(fā)現(xiàn)病毒感染相互作用宿主蛋白PDCD5，于是設計合成了靶向PDCD5的反義寡核苷酸。在病毒感染的A549細胞上對27條反義寡核苷酸序列進行了活性篩選及評價，首次發(fā)現(xiàn)互補于PDCD5 mRNA特定功能區(qū)域的寡核苷酸PDCD5-5在培養(yǎng)的A549細胞中能有效地抑制IV的復制和H1N1、H3N2型IV所致的細胞病變，具有很好的特異性和可藥性。因此，本發(fā)明涉及到靶向PDCD5 mRNA抗IV感染的反義寡核昔酸的序列與結構及其成為治療IV病毒相關性疾病，減小IV相關性疾病危害性的新型藥物。
文檔編號A61K48/00GK101864421SQ20101017917
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月21日 優(yōu)先權日2010年5月21日
發(fā)明者丁曉然, 伯曉晨, 周喆, 楊靜, 林汝仙, 王升啟, 趙海豹, 鐘芝茵 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所