專利名稱：一種預防豬生殖與呼吸綜合征的疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種預防豬生殖與呼吸綜合征的疫苗。
背景技術：
豬生殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS) 是20世紀80年代末發(fā)現(xiàn)的一種接觸性傳染病，能引起妊娠母豬的流產、死胎、木乃伊胎等 繁殖障礙，以及各種年齡豬(特別是仔豬)的呼吸道疾病。1987年美國首先報道了該病 的發(fā)生，隨后迅速遍及全球各養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達的國家和地區(qū)(北美洲，1987 ；歐洲，1990 ；亞洲， 1991)。荷蘭中央獸醫(yī)研究所(Lelystad et, 1991)用豬肺泡巨噬細胞首次分離到病原，并 命名為Lelystad病毒。1992年美國研究人員用CL2621細胞也分離到PRRSV美洲型代表 株(VR2332)，同年歐共體將該病統(tǒng)一命名為“豬生殖與呼吸綜合征”或“豬繁殖與呼吸綜合 征(PRRS) ”。1996年，哈爾濱獸醫(yī)研究所首次從國內疑似PRRS病例中分離到PRRSV，從而證 實了本病在我國的存在。但隨著毒株的毒力變異，1997年美國又出現(xiàn)了 PRRS新的流行形 式，即急性和非典型性PRRS，引起母豬發(fā)生更高的流產率和死亡率，而目前商品化的弱毒苗 等傳統(tǒng)疫苗不能對這些新出現(xiàn)的PRRSV強毒株的感染進行全面保護，在2006年我國南方地 區(qū)爆發(fā)的該病中，有研究表明其Nsp2序列中483位和535 563位氨基酸發(fā)生缺失。隨后 很多應用研究學者關注著豬生殖與呼吸綜合征的基因重組疫苗、亞單位疫苗等新型疫苗的 應用研究，2007年沈國順等進行了 PRRSV、PCV2基因工程疫苗的構建及臨床試驗研究，隨后 2009年韓松等進行了二聯(lián)苗的探索研究，結果表明新型疫苗對試驗豬有一定的免疫保護作 用。PRRSV的基因組全長約15kb，具有5，端帽子和3，poly(A)尾結構。含有9個部 分重疊的開放閱讀框，由5，端至3，端依次為ORFla、ORFlb、0RF2a、0RF2b、0RF3 7，其中 ORFla和ORFlb編碼非結構蛋白。GP2分子量為29kD 30kD，在病毒粒子中以單體形式出 現(xiàn)；GP3為高度糖基化蛋白，該蛋白是PRRSV各毒株間保守性最差的蛋白之一 ；GP5是糖基 化的囊膜蛋白，其二聚體可能與宿主細胞表面的唾液酸粘附素受體相結合，從而介導病毒 的吸附，可以誘導產生更強烈的T淋巴細胞增殖反應。在免疫豬的臨床試驗中，研究人員已經將預防該病的重點落在疫苗的研發(fā)中。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種預防豬生殖與呼吸綜合征的疫苗。本發(fā)明提供的預防豬生殖與呼吸綜合征的疫苗(PRRS多肽亞單位疫苗)，它的活 性成分由NSP多肽和SP多肽組成；所述SP多肽的氨基酸序列如序列表的序列1所示；所述 NSP多肽的氨基酸序列如序列表的序列3所示。所述活性成分中，NSP多肽和SP多肽的物質的量的比值具體可為1 1。所述疫苗具體可由所述活性成分和佐劑組成。常規(guī)佐劑均可采用，如弗氏佐劑。所述NSP多肽可通過如下方法制備(1)在pET32a的BamHI和Xhol酶切位點之間插入序列表的序列4所示的DNA片段，得到NSP/pET32a質粒；(2)將NSP/pET32a質粒導入 大腸桿菌BL21，得到重組菌BL21-NSP/pET32a ； (3)將重組菌BL21_NSP/pET32a誘導表達， 得到所述NSP多肽。所述SP多肽可通過如下方法制備(1)在pET32a的BamHI和Xhol酶切位點之間 插入序列表的序列2所示的DNA片段，得到SP/pET32a質粒；(2)將SP/pET32a質粒導入大 腸桿菌BL21，得到重組菌BL21-SP/pET32a ； (3)將重組菌BL21_SP/pET32a誘導表達，得到 所述SP多肽。本發(fā)明還保護NSP多肽和SP多肽組成的混合物；所述NSP多肽的氨基酸序列如序 列表的序列3所示；所述SP多肽的氨基酸序列如序列表的序列1所示。本發(fā)明還保護序列表的序列3所示的NSP多肽和/或序列表的序列1所示的SP 多肽。本發(fā)明還保護所述NSP多肽的編碼基因和/或所述SP多肽的編碼基因；所述NSP 多肽的編碼基因的核苷酸序列如序列表的序列4所示；所述SP多肽的編碼基因的核苷酸序 列如序列表的序列2所示。含有所述NSP多肽的編碼基因的重組表達載體或重組菌也屬于本發(fā)明的保護范 圍。所述重組表達載體具體可為NSP/pET32a質粒。所述重組菌具體可為重組菌BL21-NSP/ pET32a。所述NSP/pET32a質粒為在pET32a的多克隆位點插入序列表的序列4所示的DNA 片段得到的重組質粒，優(yōu)選為在pET32a的BamHI和Xhol酶切位點之間插入序列表的序列4 所示的DNA片段得到的重組質粒。所述重組菌BL21-NSP/pET32a為將NSP/pET32a質粒導 入大腸桿菌BL21得到的重組菌。含有所述SP多肽的編碼基因的重組表達載體或重組菌也屬于本發(fā)明的保護范 圍。所述重組表達載體具體可為SP/pET32a質粒。所述重組菌具體可為重組菌BL21-SP/ pET32a。所述NSP/pET32a質粒為在pET32a的多克隆位點插入序列表的序列2所示的DNA 片段得到的重組質粒，優(yōu)選為在pET32a的BamHI和Xhol酶切位點之間插入序列表的序列2 所示的DNA片段得到的重組質粒。所述重組菌BL21-SD/pET32a為將SP/pET32a質粒導入 大腸桿菌BL21得到的重組菌。如下物質均可應用于制備預防豬生殖與呼吸綜合征的疫苗所述混合物、所述 NSP多肽和所述SP多肽、所述NSP多肽的編碼基因和所述SP多肽的編碼基因、所述重組表 達載體或重組菌。NSP多肽和SP多肽來自PRRSV序列中的非結構蛋白和結構蛋白，參與宿主細胞結 合、病毒的吸附、誘導T淋巴細胞增殖反應等，具有促進免疫活性的功能。本發(fā)明的疫苗特備適用于豬。將NSP、SP多肽與弗氏佐劑均勻乳化后，得到的疫苗 非常適用于豬生殖與呼吸綜合征等病毒病的預防，安全、有效、成本低廉，易于大范圍推廣 應用。


圖1為NSP和SP基因的PCR檢測結果；1 :NSP基因；2 :SP基因；M :Marker。圖2為BL21-SP/pET32a誘導前后的SDS-PAGE檢測結果；M 分子量蛋白Marker ； 1 誘導前；2 誘導后。
圖3為BL21-NSP/pET32a誘導前后的SDS-PAGE檢測結果；M 分子量蛋白Marker ； 1 誘導前；2 誘導后。圖 4 為 BL21-NSP/pET32a、BL21_SP/pET32a 的 western blot 檢測結果；M 分子量 蛋白 Marker ；1 :BL21_NSP/pET32a ；2 :BL21_SP/pET32a。圖 5 為 BL21-NSP/pET32a、BL21-SP/pET32a 純化后 SDS-PAGE 檢測圖；M 分子量蛋 白 Markero
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。所有引物合成及測序工作均由上海生工公司完成。實施例1、預防豬生殖與呼吸綜合征的疫苗的制備一、NSP基因、SP基因的設計1、NSP基因的設計選取PRRSV非結構蛋白Nsp2的B細胞表位中的4個相對保守的表位(BCE1 4)； 選取一個PRRSV中和性B細胞表位即結構蛋白Gp5的B表位(BCE5)；再加上一個通用型T 細胞表位PADRE (TCE)；通過三氨基酸連接序列GGS將這6個表位連接起來組成多表位亞單 位疫苗NSP的蛋白序列(各個表位的氨基酸序列見表1)。表1 亞單位疫苗NSP的蛋白序列 注BCE為B細胞表位，TCE為T細胞表位根據(jù)大腸桿菌堿基密碼子偏好性，利用DNAstar軟件生成NSP核酸序列，設計引物 如下表2 (在其N端引入BamHI酶切位點，C端引入Xhol酶切位點)，送交上海生物工程有 限公司合成。表2 NSP核酸序列的設計引物(5’ 一 3’ ) 根據(jù)上述引物利用重疊PCR技術擴增得到NSP基因PCR反應條件如下94°C 4分 鐘；94°C 50秒，55°C 50秒，72°C 1分鐘；共30循環(huán)；72°C 10分鐘。得到約為300bp的PCR 產物(見圖1)。NSP多肽的氨基酸序列如序列表的序列3所示，其編碼基因(NSP基因)的核苷酸 序列如序列表的序列4所示。2、SP基因的設計選取PRRSV結構蛋白Gp2、Gp3、Gp5和N蛋白的B細胞表位中的4個相對保守的表 位(BCE6 9)；選取一個已知的PRRSV中和性B細胞表位即結構蛋白Gp5的B表位(BCE5)； 再加上一個通用型T細胞表位PADRE (TCE)；通過三氨基酸連接序列GGS將這6個表位連接 起來組成多表位亞單位疫苗SP的蛋白序列(各個表位的氨基酸序列見表3)。表3亞單位疫苗SP的蛋白序列 注BCE為B細胞表位，TCE為T細胞表位根據(jù)大腸桿菌堿基密碼子偏好性，利用DNAstar軟件生成SP核酸序列，設計引物 如下表4(在其N端引入BamHI酶切位點，C端引入Xhol酶切位點)，送交上海生物工程有 限公司合成。表4 SP核酸序列的設計引物(5’ 一 3’ ) 根據(jù)上述引物利用重疊PCR技術擴增得到SP基因PCR反應條件如下94°C 4分 鐘；94°C 50秒，55°C 50秒，72°C 1分鐘；共30循環(huán)；72°C 10分鐘。結果得到約為350bp的 PCR產物(見圖1)。SP的氨基酸序列如序列表的序列1所示，其編碼基因(SP基因)的核苷酸序列如 序列表的序列2所示。二、NSP多肽和SP多肽的制備1、重組表達載體和重組菌的構建(1)大腸桿菌表達載體NSP/pET_32a和重組菌BL21_NSP/pET32a的構建由上海生工公司合成序列4所示的NSP基因，然后用如下引物對進行PCR擴增，引 入BamHI和Xhol酶切識別位點NSP-1-B :5’ -CATGGATCCACCCTTCCCGAAAGAGTGAGACCTCCAGATGACTGGGCTAC-3'；NSP-8-X 5’ -CATCTCGAGTTAAGCGGCAGCCTTCAGGGTCCAGGCAGCCACG-3’。將PCR擴增產物用限制性內切酶BamHI和Xhol雙酶切后克隆至載體pMD18_T (購 自寶生物工程有限公司，D102A)，轉化大腸桿菌DH5ci (購自北京康為世紀生物科技有限公 司，CW0808)。進行PCR和酶切鑒定后獲得陽性重組菌，將陽性重組菌提取質粒進行測序， 結果表明得到的目的質粒NSP/pMD18 (在pMD18-T中插入了序列表的序列4所示的DNA片 段)。將NSP/pMD18用限制性內切酶BamHI和Xhol雙酶切后插入載體pET32a(購自 Novagen公司，69015-3)的BamHI和Xhol酶切位點之間，轉化大腸桿菌BL21 (北京康為世 紀生物科技有限公司，CW0809)。進行PCR和酶切鑒定后獲得陽性重組菌，將陽性重組菌提 取質粒進行測序，結果表明得到了目的質粒NSP/pET32a(在pET32a的BamHI和Xhol酶切
7位點之間插入序列表的序列4所示的DNA片段)。將含有NSP/pET32a的大腸桿菌BL21命 名為 BL21-NSP/pET32a。(2)大腸桿菌表達載體SP/pET_32a和重組菌BL21_SP/pET32a的構建由上海生工公司合成序列2所示的SP基因，然后用如下引物對進行PCR擴增，引 入BamHI和Xhol酶切識別位點SP-1-B :5’ -CATGGATCCAAAGCAGGACAGGCTGCCTGGAAACAGGTGGTGAGCGAGGC-3，；SP-10-X 5’ -CATCTCGAGTTAAGCGGCAGCCTTCAGGGTCCA-3’。將PCR擴增產物用限制性內切酶BamHI和Xhol雙酶切后克隆至載體pMD18_T，轉 化大腸桿菌DH5ci。進行PCR和酶切鑒定后獲得陽性重組菌，將陽性重組菌提取質粒進行測 序，結果表明得到的目的質粒SP/pMD18 (在pMD18-T中插入了序列表的序列2所示的DNA 片段)。將SP/pMD18用限制性內切酶BamHI和Xhol雙酶切后插入載體pET32a的BamHI和 Xhol酶切位點之間，轉化至大腸桿菌BL21。進行PCR和酶切鑒定后獲得陽性重組菌，將陽 性重組菌提取質粒進行測序，結果表明得到了目的質粒SP/pET32a (在pET32a的BamHI和 Xhol酶切位點之間插入序列表的序列2所示的DNA片段)。將含有SP/pET32a的大腸桿菌 BL21 命名為 BL21-SP/pET32a。(3)對照菌的獲得用pET32a轉化大腸桿菌BL21，得到重組菌BL21_pET32a (對照)。2、NSP和SP的表達和純化(1)誘導表達將BL21-NSP/pET32a (或 BL21_SP/pET32a 或 BL21_pET32a)，37°C、200 轉 / 分(旋 轉半徑為13mm)振搖培養(yǎng)(菌液0D_至1. 0)，加入IPTG(使其終濃度為0. 5M)，在37°C下 誘導3小時。分別將誘導前和誘導后的菌液10000g離心1分鐘收集菌體，加入lOOuL PBS重懸 后與 2XLoading Buffer 混合，沸水煮 10 分鐘，SDS-PAGE 電泳檢測。BL21_NSP/pET32a 的 檢測結果如圖3所示(泳道M為分子量蛋白Marker，泳道1為誘導前，泳道2為誘導后)。 BL21-NSP/pET32a的菌液誘導前沒有蛋白條帶，誘導后出現(xiàn)28KD左右的目的蛋白條帶。 BL21-pET32a的菌液誘導前后都沒有NSP相應的目的蛋白條帶。BL21_SP/pET32a的檢測結 果如圖2所示(泳道M為分子量蛋白Marker，泳道1為誘導前，泳道2為誘導后)。BL21-SP/ pET32a的菌液誘導前沒有蛋白條帶，誘導后出現(xiàn)30KD左右的目的蛋白條帶。BL21_pET32a 的菌液誘導前后都沒有SP相應的目的蛋白條帶。將誘導后的菌液10000g離心10分鐘，收集菌體經PBS重懸，超聲破菌，12000轉/ 分離心15分鐘，取上清進行SDS-PAGE電泳檢測，以每平方厘米膜面積X0. 65mA的恒流轉 膜1. 5 2小時，放入用TBST配置的5%的脫脂牛奶中，脫色后棄去封閉液(5g脫脂牛奶 溶于 100ml)，加入 TBST(NaCl 25mM、Tris 100Mm、Tween-200. 2%定容至 1000ml)，加入用封 閉液配制的一抗，室溫下孵育3小時，回收一抗后保存。將膜放入TBST溶液中脫色，加入用 封閉液配制的HRP標記二抗后脫色，加入TBST洗膜3次后脫色，進行顯影、定影洗片、壓片。 結果如圖4所示。BL21-NSP/pET32a具有28KD的NSP目的蛋白信號，BL21_SP/pET32a具有 30KD的SP蛋白信號，BL21-pET32a既沒有NSP的信號又沒有SP的信號。結果表明NSP基因和SP基因均可在大腸桿菌中正確表達。(2)NSP 的純化①將BL21-NSP/pET32a，37°C、200轉/分(旋轉半徑為13mm)振搖培養(yǎng)(菌液0D_ 至1. 0)，加入IPTG(使其終濃度為0. 5M)，在37°C下誘導3小時。②培養(yǎng)結束后，進行如下處理10000g、離心10分鐘收集菌體經Binding Buffer (50mM Na2HP04,150mM NaCl，20mM 咪唑，pH7. 9)重懸，超聲破菌，12000 轉 / 分離心 15 分鐘，得到含NSP蛋白的上清。 ③將步驟②的上清進行NTA-Ni親和純化。NTA-Ni (購自 GE Healthcare 公司，10033267)親和純化的參數(shù)Wash Buffer :50mM NaH2P04, 300mM NaCl,20mM 咪唑，pH8. 0 ；Elute Buffer :50mM NaH2P04, 300mM NaCl,500mM 咪唑，pH8. 0。柱長為10cm、柱子的內徑為0. 77cm。目的蛋白結合在Ni柱上后，先用30個柱體積Wash Buffer沖洗柱子(洗掉非特 異性結合的雜蛋白)，再用1個柱體積Elute Buffer沖洗柱子5分鐘，收集該1個柱體積的 洗脫液(NSP溶液)。將NSP溶液進行SDS-PAGE電泳檢測，見圖5。在28KD左右處出現(xiàn)目的蛋白條帶， 與預測大小相符，表明NSP基因在大腸桿菌中正確表達。檢測NSP溶液的蛋白含量。用BL21_pET32a代替BL21_NSP/pET32a，重復步驟⑵的操作，得到的溶液作為溶 液I。(3) SP 的純化①將BL21-SP/pET32a，37°C、200轉/分(旋轉半徑為13mm)振搖培養(yǎng)(菌液0D_ 至1. 0)，加入IPTG(使其終濃度為0. 5M)，在37°C下誘導3小時。②培養(yǎng)結束后，進行如下處理10000g、離心10分鐘收集菌體經Binding Buffer (50mM Na2HP04,150mM NaCl，20mM 咪唑，pH7. 9)重懸，超聲破菌，12000 轉 / 分離心 15 分鐘，得到含SP蛋白的上清。③將步驟②的上清進行NTA-Ni親和純化。NTA-Ni (購自 GE Healthcare 公司，10033267)親和純化的參數(shù)Wash Buffer :50mM NaH2P04, 300mM NaCl,20mM 咪唑，pH8. 0 ；Elute Buffer :50mM NaH2P04, 300mM NaCl,500mM 咪唑，pH8. 0。柱長為10cm、柱子的內徑為0. 77cm。目的蛋白結合在Ni柱上后，先用30個柱體積Wash Buffer沖洗柱子(洗掉非特 異性結合的雜蛋白)，再用1個柱體積Elute Buffer沖洗柱子5分鐘，收集該1個柱體積的 洗脫液(SP溶液)。將SP溶液進行SDS-PAGE電泳檢測，見圖5。在30KD左右處出現(xiàn)目的蛋白條帶，與 預測大小相符，表明SP基因在大腸桿菌中正確表達。檢測SP溶液的蛋白含量。用BL21_pET32a代替BL21_SP/pET32a，重復步驟(3)的操作，得到的溶液作為溶液 II。三、預防豬生殖與呼吸綜合征的疫苗的制備1、預防豬生殖與呼吸綜合征的疫苗的制備
(l)PRRS多肽溶液的制備將步驟二的2的(2)純化得到的NSP溶液和步驟二的2的(3)純化得到的SP溶 液等體積混合，得到PRRS多肽溶液(溶液中，NSP和SP的物質的量的比值為1 1)。(2)乳化油相弗氏佐劑(購自上海博蘊生物科技有限公司代理sigma產品，貨號 BY12096)。水相步驟(1)的PRRS多肽溶液。乳化取1體積份油相放于乳化缸內，開動電機慢速轉動攪拌，同時緩慢加入1體 積份水相，加完后再以10000轉/分鐘，攪拌2 5分鐘；得到預防豬生殖與呼吸綜合征的 疫苗(批號為0912001)。(3)分裝將步驟(2)的疫苗定量分裝，加蓋密封，2 8°C。2、陰性對照的制備(1)對照溶液的制備將步驟二的2的(2)得到的溶液I和步驟二的2的(3)得到的溶液II等體積混 合，得到對照溶液。(2)乳化采用步驟⑴的對照溶液作為水相，其它同步驟1的(2)，得到陰性對照。(3)分裝將步驟(2)的陰性對照定量分裝，加蓋密封，2 8°C。實施例2、預防豬生殖與呼吸綜合征的疫苗的制備再次采用實施例1的步驟二和步驟三的方法制備疫苗，得到預防豬生殖與呼吸綜 合征的疫苗(批號為0912002)。實施例3、預防豬生殖與呼吸綜合征的疫苗的制備再次采用實施例1的步驟二和步驟三的方法制備疫苗，得到預防豬生殖與呼吸綜 合征的疫苗(批號為0912003)。實施例4、PRRS多表位亞單位疫苗的成品檢驗用實施例1、實施例2和實施例3制備的三個批號的疫苗進行如下檢測1、物理性狀外觀3個不同批號的疫苗均為乳白色乳狀液。劑型3個不同批號的疫苗均為油包水型(W/0)；取清潔吸管，吸取少量疫苗滴于 冷水中，呈油滴狀，不擴散。粘度用1ml吸管(出口內徑為1.2mm)，吸取25°C左右的疫苗，令其垂直自然流 出，記錄流出0. 4ml所需時間，3個不同批號的疫苗均不超過8秒。穩(wěn)定性在37°C左右條件下放置21日或將疫苗5ml加入離心管，經3000轉/分 離心15分鐘，3個不同批號的疫苗均不破乳。2、無菌檢驗按照《中國獸藥典》規(guī)定進行，3個不同批號的疫苗均無菌生長。實施例5、PRRS亞單位疫苗的安全性試驗
用實施例1、實施例2和實施例3制備的三個批號的疫苗進行如下檢測1、用小白鼠檢驗用體重14 18g的健康小白鼠10只，各腹腔免疫(也可皮下免疫)0. 2ml PRRS 多表位亞單位疫苗，觀察28日。在觀察期間，若出現(xiàn)因免疫PRRS多表位亞單位疫苗導致的 抽搐、死亡等不良反應，判該批PRRS亞單位疫苗為不合格；若出現(xiàn)非PRRS亞單位疫苗因素 導致的抽搐、死亡等不良反應，判本次檢驗無效，應重檢，若不進行重檢，則判該批PRRS亞 單位疫苗不合格。2、用豚鼠檢驗用體重350 400g的健康豚鼠10只，各腹腔免疫(也可皮下注射)1ml PRRS亞單 位疫苗，觀察28日。在觀察期間，若出現(xiàn)因PRRS亞單位疫苗注射導致的抽搐、死亡等不良 反應，判該批PRRS亞單位疫苗為不合格；若出現(xiàn)非PRRS亞單位疫苗因素導致的抽搐、死亡 等不良反應，判本次檢驗無效，應重檢，若不進行重檢，則判該批PRRS亞單位疫苗不合格。3、用豬檢驗用40日齡斷奶仔豬6頭，各肌肉免疫(也可皮下注射)4ml PRRS亞單位疫苗，觀 察28日。在觀察期間，若出現(xiàn)因PRRS亞單位疫苗注射導致的抽搐、死亡等不良反應，判該 批PRRS亞單位疫苗為不合格；若出現(xiàn)非PRRS亞單位疫苗因素導致的抽搐、死亡等不良反 應，判本次檢驗無效，應重檢，若不進行重檢，則判該批PRRS亞單位疫苗不合格。小白鼠、豚鼠和豬的安全性驗證結果表明，3個不同批號的疫苗均是安全的，沒有 引起任何不良反應。實施例6、PRRS亞單位疫苗的效力檢驗用實施例1、實施例2和實施例3制備的三個批號的疫苗和實施例1制備的陰性對 照進行如下檢測將40日齡斷奶仔豬(品種為長白豬，購自中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌 平動物實驗基地)分為11組，每組6頭，分別進行如下處理第一組注射0912001批號的疫苗，每次每頭豬肌肉注射0. 5ml ；第二組注射0912001批號的疫苗，每次每頭豬肌肉注射1ml ；第三組注射0912001批號的疫苗，每次每頭豬肌肉注射2ml ；第四組注射0912002批號的疫苗，每次每頭豬肌肉注射0.5ml ；第五組注射0912002批號的疫苗，每次每頭豬肌肉注射1ml ；第六組注射0912002批號的疫苗，每次每頭豬肌肉注射2ml ；第七組注射0912003批號的疫苗，每次每頭豬肌肉注射0.5ml ；第八組注射0912003批號的疫苗，每次每頭豬肌肉注射1ml ；第九組注射0912003批號的疫苗，每次每頭豬肌肉注射2ml ；第十組(陰性對照組)注射陰性對照，每次每頭豬肌肉注射2ml ；第十一組(空白對照組)注射生理鹽水，每次每頭豬肌肉注射2ml。分別于第1、21、35天分三次免疫豬群。第50天時，各組的豬均肌肉注射PRRSV病毒(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，JXA1 ；攻 毒劑量均為105TCID5(I)，連續(xù)觀察14天。第14天統(tǒng)計攻毒保護數(shù)，結果見表5。表5 PRRS亞單位疫苗效力試驗結果
效力試驗表明以0. 5ml劑量組免疫40日齡斷奶仔豬，攻毒保護率在80%以上； 以1ml劑量組和2ml劑量組進行免疫，攻毒保護率在100% ；陰性對照組和空白對照組的豬 均全部發(fā)病或死亡，保護率為0%。
權利要求
一種預防豬生殖與呼吸綜合征的疫苗，它的活性成分由NSP多肽和SP多肽組成；所述NSP多肽的氨基酸序列如序列表的序列3所示；所述SP多肽的氨基酸序列如序列表的序列1所示。
2.如權利要求1所述的疫苗，其特征在于所述活性成分中中，NSP多肽和SP多肽的物 質的量的比值為1 1。
3.如權利要求1或2所述的疫苗，其特征在于所述疫苗由所述活性成分和佐劑組成； 所述佐劑優(yōu)選為弗氏佐劑。
4.如權利要求1至3中任一所述的疫苗，其特征在于所述NSP多肽通過如下方法制備(1)在pET32a的BamHI和Xhol酶切位點之間插入 序列表的序列4所示的DNA片段，得到NSP/pET32a質粒；(2)將NSP/pET32a質粒導入大腸 桿菌BL21，得到重組菌BL21-NSP/pET32a ； (3)將重組菌BL21_NSP/pET32a誘導表達，得到 所述NSP多肽；所述SP多肽通過如下方法制備(1)在pET32a的BamHI和Xhol酶切位點之間插入序 列表的序列2所示的DNA片段，得到SP/pET32a質粒；(2)將SP/pET32a質粒導入大腸桿菌 BL21，得到重組菌BL21-SP/pET32a ;(3)將重組菌BL21_SP/pET32a誘導表達，得到所述SP多肽。
5.NSP多肽和SP多肽組成的混合物；所述NSP多肽的氨基酸序列如序列表的序列3所 示；所述SP多肽的氨基酸序列如序列表的序列1所示。
6.序列表的序列3所示的NSP多肽或序列表的序列1所示的SP多肽。
7.權利要求6所述NSP多肽的編碼基因或權利要求6所述SP多肽的編碼基因；所述 NSP多肽的編碼基因的核苷酸序列如序列表的序列4所示；所述SP多肽的編碼基因的核苷 酸序列如序列表的序列2所示。
8.含有權利要求6所述基因的重組表達載體或重組菌。
9.如權利要求8所述重組表達載體或重組菌，其特征在于所述重組表達載體為NSP/ pET32a質?；騍P/pET32a質粒；所述重組菌為重組菌BL21_NSP/pET32a或重組菌BL21-SP/ pET32a ；所述NSP/pET32a質粒為在pET32a的多克隆位點之間插入序列表的序列4所示的 DNA片段得到的重組質粒，優(yōu)選為在pET32a的BamHI和Xhol酶切位點之間插入序列表的 序列4所示的DNA片段得到的重組質粒；所述重組菌BL21-NSP/pET32a為將NSP/pET32a質 粒導入大腸桿菌BL21得到的重組菌；所述SP/pET32a質粒為在pET32a的多克隆位點之間 插入序列表的序列2所示的DNA片段得到的重組質粒，優(yōu)選為在pET32a的BamHI和Xhol 酶切位點之間插入序列表的序列2所示的DNA片段得到的重組質粒；所述重組菌BL21-SP/ pET32a為將SP/pET32a質粒導入大腸桿菌BL21得到的重組菌。
10.如下物質中的至少一種在制備預防豬生殖與呼吸綜合征的疫苗中的應用權利要 求5所述混合物、權利要求6所述NSP多肽或SP多肽、權利要求7所述NSP多肽的編碼基 因或SP多肽的編碼基因、權利要求8或9所述重組表達載體或重組菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預防豬生殖與呼吸綜合征的疫苗。本發(fā)明提供的疫苗的活性成分由NSP多肽和SP多肽組成；所述NSP多肽的氨基酸序列如序列表的序列3所示；所述SP多肽的氨基酸序列如序列表的序列1所示。將NSP、SP多肽與弗氏佐劑均勻乳化后，得到的疫苗非常適用于豬生殖與呼吸綜合征的的預防，安全、有效、成本低廉、易于制備，特別適于大范圍推廣應用。
文檔編號A61P31/14GK101850113SQ20101018341
公開日2010年10月6日 申請日期2010年5月19日 優(yōu)先權日2010年5月19日
發(fā)明者劉文軍, 孫蕾, 李晶, 陳才偉 申請人:中國科學院微生物研究所