專利名稱：一種用作基因載體的殼聚糖衍生物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殼聚糖衍生物及其制備方法和用途，具體涉及一種用作非病毒型基因載體的新型殼聚糖衍生物及其制備方法和用途，還涉及由該殼聚糖衍生物與核酸所構(gòu)成的納米復(fù)合物及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)越來(lái)越多的生物大分子藥物(如蛋白質(zhì)、多肽和核酸等)都應(yīng)用于臨床。該類藥物生物活性強(qiáng)，劑量小，治療指數(shù)高，已經(jīng)成為臨床上十分重要的一類藥物。特別是用于基因治療的核酸類藥物，不僅具有高效、長(zhǎng)療、副作用少的特點(diǎn)，而且能使治療基因在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)治療蛋白。目前，基因藥物載體可分為病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體(如各種逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、痘病毒、皰疹病毒、腺相關(guān)病毒等)，雖然轉(zhuǎn)染效率高，但存在著對(duì)外源基因的容納量少(約4. 5-30kbp)、穩(wěn)定性差、會(huì)引起安全性問(wèn)題等諸多缺點(diǎn)。而非病毒載體因其安全可靠、穩(wěn)定、對(duì)外源基因的容納量大、不會(huì)引起免疫系統(tǒng)反應(yīng)及易于生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注。遺憾的是，非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率比病毒載體的低得多，而且基因表達(dá)時(shí)間短。因此，尋找新型的高轉(zhuǎn)染效率的基因非病毒載體已成為基因治療研究領(lǐng)域最為迫切并具挑戰(zhàn)性的課題之一。殼聚糖(化學(xué)名β _(1，4)-2-氨基-2-脫氧氨基-D-葡萄糖)是甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種天然堿性多糖。它既可生物合成，又可生物降解，與動(dòng)物的器官組織及細(xì)胞有良好的生物相容性，無(wú)毒，降解過(guò)程中產(chǎn)生的低分子寡聚糖在體內(nèi)不積累，幾乎無(wú)免疫原性。近十多年來(lái)，研究表明，殼聚糖具有多種生物活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，如其能在粘膜表面打開(kāi)細(xì)胞間緊密連接的接口 ；并且由于其本身帶有正電，能和帶負(fù)電的細(xì)胞膜發(fā)生靜電作用，從而增強(qiáng)藥物對(duì)小腸上皮細(xì)胞的滲透性，進(jìn)而用作多肽和蛋白類藥物鼻腔或粘膜給藥的滲透促進(jìn)劑；殼聚糖分子中的氨基、羥基還可與粘液中的糖蛋白形成氫鍵而產(chǎn)生粘附作用，從而延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)特定區(qū)域的滯留時(shí)間，提高藥物的生物利用度，因此可用作疫苗給藥的粘附劑；此外，殼聚糖還可制備成微粒制劑、混合膠體和包衣制劑或形成自身聚集體，這些形式都能在一定程度上避免胃腸道PH環(huán)境和酶對(duì)生物大分子藥物的降解，提高生物利用度，用作蛋白多肽類藥物的載體；特別是由于腫瘤細(xì)胞表面帶負(fù)電，帶正電的殼聚糖納米粒能吸附到腫瘤細(xì)胞表面使電荷中和，作為抗腫瘤藥物載體則更利于抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。隨著對(duì)殼聚糖應(yīng)用研究的不斷深入和發(fā)展，殼聚糖作為基因載體的有效性逐漸得到了肯定，殼聚糖與DNA形成納米復(fù)合物后容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，且對(duì)DNA有保護(hù)作用。但用沒(méi)有任何修飾的殼聚糖，轉(zhuǎn)染效率非常低，而且高分子量的殼聚糖水溶性差，不利于提高轉(zhuǎn)染效率，所以要對(duì)其進(jìn)行一定的化學(xué)修飾。在殼聚糖結(jié)構(gòu)的2位上有活潑的氨基，易于化學(xué)修飾，因此目前絕大多數(shù)文獻(xiàn)均采用在殼聚糖2位氨基上引入多功能基團(tuán)的辦法來(lái)提高殼聚糖的水溶性，增加其轉(zhuǎn)染效果。但殼聚糖的2位氨基在基因輸送過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用，因此需要既能保留殼聚糖的2位氨基，又能對(duì)殼聚糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，提高殼聚糖轉(zhuǎn)染效果。 2001年，諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者Siarpless提出“Click”化學(xué)反應(yīng)。其中最為典型的反應(yīng)之一就是將末端帶有炔基和疊氮基團(tuán)的單體通過(guò)高選擇性環(huán)合耦聯(lián)后形成帶有三唑環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物。該反應(yīng)快速、高效且具有高選擇性，已被廣泛用于合成各種材料?；谏鲜鲅芯勘尘?，本發(fā)明人利用“Click”反應(yīng)將N，N, N-三甲基-(1，2，3_三唑-4-)甲基溴化銨基團(tuán)選擇性地引入到殼聚糖(Chitosan，Cs)的6位上，合成N，N, N-三甲基三唑殼聚糖(TCs)。本發(fā)明的殼聚糖衍生物既能保留Cs的2位氨基的功能，又能增加 Cs的溶解性，提高Cs的正電性，從而增加Cs的DNA壓縮功能，提高Cs轉(zhuǎn)染效率。此外，由 Click反應(yīng)產(chǎn)生的三唑基團(tuán)跟DNA具有強(qiáng)結(jié)合能力，可提高殼聚糖衍生物/DNA納米復(fù)合物的穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明的目的在于提供一種高效低毒的用作非病毒基因載體的新型殼聚糖衍生物及其制備方法和用途。本發(fā)明的另一目的在于提供由該殼聚糖衍生物與DNA所構(gòu)成的納米復(fù)合物及其制備方法和用途。本發(fā)明提供了一種用作非病毒型基因載體的新型殼聚糖衍生物，其結(jié)構(gòu)式如下
權(quán)利要求
1. 一種殼聚糖衍生物，其結(jié)構(gòu)式如下
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖衍生物，其中，所述殼聚糖衍生物的重均分子量為 5-1000千道爾頓。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖衍生物，其中，所述N，N，N-三甲基-(1，2，3-三唑_4_)甲基溴化銨基團(tuán)的取代度為10% 100%。
4.權(quán)利要求1所述的殼聚糖衍生物的制備方法，該方法包括以下步驟
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其中，所述殼聚糖1的重均分子量為10-1000千道爾頓。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖衍生物/核酸的納米復(fù)合物。
7.權(quán)利要求6所述的納米復(fù)合物的制備方法，其包括以下步驟將權(quán)利要求1中所述的殼聚糖衍生物和質(zhì)粒DNA分別用去離子水溶解，混合，室溫靜置，殼聚糖衍生物和質(zhì)粒 DNA通過(guò)靜電自組裝成納米復(fù)合物。
8.權(quán)利要求6所述的納米復(fù)合物用于將核酸遞送到細(xì)胞中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中，所述核酸為含有編碼遺傳標(biāo)記的質(zhì)粒DNA序列， 所述遺傳標(biāo)記為綠色熒光蛋白基因。
10.權(quán)利要求1所述的殼聚糖衍生物用于非病毒型基因載體的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用作非病毒型基因載體的新型殼聚糖衍生物及其制備方法和用途。所述殼聚糖衍生物是通過(guò)將N，N，N-三甲基-(1，2，3-三唑-4-)甲基溴化銨基團(tuán)引入到殼聚糖的6位上而合成，其結(jié)構(gòu)式如下。其中，n為殼聚糖衍生物重復(fù)單元的個(gè)數(shù)。本發(fā)明的殼聚糖衍生物既保留了2位氨基在基因輸送過(guò)程中的功效，保留了殼聚糖無(wú)毒、生物相容性高的特性，又大大提高殼聚糖的水溶性，提高殼聚糖的基因轉(zhuǎn)染效率，用該殼聚糖衍生物制備的基因非病毒載體具有生物相容性高、毒性低、轉(zhuǎn)染效率高等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102260356SQ201010183769
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2010年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月24日
發(fā)明者張志文, 李亞平, 顧王文, 高瑜 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所