專利名稱：一種血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體在顳頜關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂中的應(yīng)用的制作方法
一種血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體在顳頜關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體在顳頌 關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
聶頁(yè)下頜關(guān)節(jié)(temporomandibular joint，TMJ)結(jié)構(gòu)紊舌L (internal derangement， ID)是常見病、多發(fā)病，據(jù)統(tǒng)計(jì)在人群中發(fā)病率高達(dá)28% 88%，臨床表現(xiàn)主要為疼 痛、張口受限、關(guān)節(jié)雜音及下頌功能障礙等，嚴(yán)重影響患者的咀嚼、語(yǔ)言等功能，甚至對(duì) 患者的心理造成極大的影響。顳下頌關(guān)節(jié)(temporomandibularjoint，TMJ)囊內(nèi)黏連 (intra-articular adhesion, ΙΑ)是TMJ 結(jié)構(gòu)紊舌L (internalderangement, ID)最常見的伴 發(fā)病癥，約占55% 93%，它使關(guān)節(jié)功能障礙更加嚴(yán)重，多見于ID的III V期。2003年有 文獻(xiàn)報(bào)道血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)在滑膜組織中 的表達(dá)與關(guān)節(jié)液的多少存在重要的關(guān)聯(lián)。2004年有文獻(xiàn)報(bào)道VEGF在骨關(guān)節(jié)炎及滑膜炎的 發(fā)生中起重要作用。2006年有文獻(xiàn)報(bào)道黏連形成與滑膜炎之間存在明確的關(guān)聯(lián)。關(guān)于VEGF 哪種受體在滑膜炎的發(fā)病中起作用，哪種受體與黏連的形成相關(guān)目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種與顳頌關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂有關(guān)的血 管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種檢測(cè)顳頌關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂疾病的試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種VEGFR-2在制備早期檢測(cè)和/或治療顳頌關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂疾病藥中的應(yīng)用。所述的顳頌關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂疾病是顳下頌關(guān)節(jié)囊內(nèi)黏連疾病。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種檢測(cè)顳頌關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂 疾病的試劑盒，其包括擴(kuò)增引物，dNTP，用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶及其緩沖液的一種或多 種，所述擴(kuò)增引物選自VEGFR-2擴(kuò)增引物，上游引物5，-CACGGAACATCCTCTTGTCG-3，，下游引物5，-TGTAGTCTTTGCCACCCTGCT-3，。 所述的顳頌關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂疾病是顳下頌關(guān)節(jié)囊內(nèi)黏連疾病。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明提供了 VEGFR-2在制備早期檢測(cè)和/或治療顳頌關(guān)節(jié) 結(jié)構(gòu)紊亂疾病藥中的應(yīng)用和檢測(cè)顳頌關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂疾病的試劑盒。例如，由于本發(fā)明證實(shí) VEGFR-2是顳頌關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂(顳下頌關(guān)節(jié)囊內(nèi)黏連)相關(guān)基因中的一個(gè)，從而將VEGFR-2 與顳頌關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂(顳下頌關(guān)節(jié)囊內(nèi)黏連)患者的藥物治療聯(lián)系起來，可以發(fā)明作用于 這些靶點(diǎn)的藥物來治療顳頌關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂(顳下頌關(guān)節(jié)囊內(nèi)黏連)患者，為顳頌關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu) 紊亂(顳下頌關(guān)節(jié)囊內(nèi)黏連)患者的新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

圖1 關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物的情況，圖中A為X線片顯示注射針在關(guān)節(jié)腔內(nèi)，圖中B為 兔麻醉后向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射VEGFR-2抗體的情況。圖2 兔TMJ黏連模型的MRI、內(nèi)鏡評(píng)價(jià)。圖中A示MRI評(píng)價(jià)顯示關(guān)節(jié)液中有低信 號(hào)影，診斷為黏連；圖中B示內(nèi)鏡下證實(shí)有黏連存在，滑膜有充血.圖3A 兔TMJ ID模型建立的手術(shù)示意圖，圖中為牽弓丨后關(guān)節(jié)盤的移位和牽弓I部位 以及雙板區(qū)的滑膜充血。圖中標(biāo)號(hào)分別為1、示雙板區(qū)血管增生，滑膜充血，2、關(guān)節(jié)腔黏連， 3、前移位的關(guān)節(jié)盤，4、牽引關(guān)節(jié)盤的部位。圖3B 兔TMJ黏連模型大體標(biāo)本(箭頭示關(guān)節(jié)盤前附著被牽引部位)。圖3C 模型建立后注射生理鹽水側(cè)關(guān)節(jié)的組織學(xué)評(píng)價(jià)，關(guān)節(jié)腔上內(nèi)可見盤移位和 黏連形成(箭頭示)(X2)。圖3D 關(guān)節(jié)腔內(nèi)的黏連帶倍數(shù)增大后(X 10)。圖4 兔動(dòng)物模型建立后的組織學(xué)評(píng)價(jià)。圖中A兔動(dòng)物模型建立后的實(shí)驗(yàn)側(cè)關(guān)節(jié) 可見盤移位和黏連形成(箭頭示)；圖中B對(duì)照側(cè)(未做處理側(cè))關(guān)節(jié)盤無移位，關(guān)節(jié)腔內(nèi) 表面光滑、無黏連。
具體實(shí)施方式下面對(duì)本發(fā)明提供的一種血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體在顳頌關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂中的應(yīng)用 的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明。實(shí)施例11材料和方法1. 1 材料1. 1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康成年日本大耳白兔32只，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)前由上海第九人民醫(yī)院動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物納入標(biāo)準(zhǔn) 為6月齡，體重2. 5 3kg，無缺失牙、咬合異常，營(yíng)養(yǎng)狀況良好，無全身系統(tǒng)性疾病，動(dòng)作敏 捷者。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為4組，每組8只；右側(cè)關(guān)節(jié)作為建模側(cè)，左側(cè)為對(duì)照側(cè)；分別于術(shù) 后1、2、3和4周進(jìn)行MRI和內(nèi)鏡評(píng)價(jià)模型建立是否成功，檢測(cè)關(guān)節(jié)盤移位程度和有無IA形 成，之后在全麻下獲取兔關(guān)節(jié)滑膜組織標(biāo)本放于液氮中保存，留待集中進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢 測(cè)。1. 1. 2試劑IOObp ladder鼎國(guó)生物技術(shù)公司產(chǎn)品；TRIzol和PCR引物為 invitrogen 公司產(chǎn)品；dNTP、Oligo (dT) 15、Taq 酶、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、SYBR PremixEx Taq 試劑盒均為Takara公司產(chǎn)品；Safranin 0、EDTA-Na2、多聚甲醛、乙酸、乙酸鈉、石蠟、酒精、 二甲苯、過氧化氫為北京化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。1. 2 方法1. 2. 1動(dòng)物模型制作及獲取標(biāo)本按照文獻(xiàn)(張善勇，楊馳，魏魁杰，等.兔TMJ囊 內(nèi)黏連動(dòng)物模型的建立[J]·中國(guó)口腔頌面外科雜志，2009，7(1) 50-53)制作兔TMJ ID模 型的方法，將20只兔的右側(cè)關(guān)節(jié)建立模型，左側(cè)作為對(duì)照側(cè)；術(shù)后第1，2，3，4周分別獲取標(biāo) 本放于液氮中保存，待全部標(biāo)本收齊后集中進(jìn)行VEGFR三種亞型的Real time-PCR檢測(cè)。1. 2. 2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)VEGFR的表達(dá)取關(guān)節(jié)前隱窩及后上隱窩的滑膜組織，利用Real time-PCR檢測(cè)VEGFR各種亞型的表達(dá)情況。抽提滑膜組織RNA步驟組織在 液氮內(nèi)研磨成勻漿后在超凈工作臺(tái)內(nèi)，加入Iml Trizol，室溫孵育5分鐘，將之移入1. 5ml RNA-free EP管內(nèi)，加入200 μ 1氯仿，輕輕顛倒均勻，劇烈震蕩2min，室溫孵育lOmin，在4°C 離心機(jī)按12000rpm/min離心速度，離心15min，可見分層，小心吸取上清液約400 500 μ 1 移入1.5ml RNA-free EP管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖勻，室溫沉淀lOmin，在 4°C離心機(jī)按12000rpm/min離心速度，離心15min，傾倒異丙醇，加入75 μ 1無水乙醇，再加 入250 μ 1 DEPC水，在4°C離心機(jī)按12000rpm/min離心速度，離心15min，棄上清，打開管蓋， 室溫干燥5 IOmin至無色透明，在冰上加入DEPC水20 μ 1，溶解RNA，分光光度計(jì)測(cè)RNA濃 度。按下列組分配制RT反應(yīng)液(冰上進(jìn)行)5*PrimeScript BufTer4y l,PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μ 1, Oligo dT Primer(50Um)1 μ 1, Random 6mers(IOOUm)1 μ 1, Total RNA 1 μ g (按濃度計(jì)算)，加無RNA酶的雙蒸水至總體積為20 μ 1.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件 370C 15min，85°C 5s。離心后置 _80°C冰箱備用。Real-time PCR(按 TaKaRa SYBR Premix Ex Taq 試劑盒要求共計(jì)15 μ 1體系)(1) cDNA模板稀釋模板用滅菌的雙蒸水H2O 1 1 稀釋；(2)按下列組分配制Real-time PCR反應(yīng)液(冰上進(jìn)行)SYBR Premix Ex Taq 試齊U盒 7· 5μ 1，PCRForward/Reverse primer (10 μ Μ) 0. 6 μ 1 cDNA 模板(滅菌的雙蒸水 H2O稀釋)1.5 μ 1，滅菌的雙蒸水H2O加至15 μ 1，每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)反應(yīng)體積相同復(fù)孔； (3)VEGFR-I 上游引物5，-TAGCATCACAAGGGCAGCTTTA-3，；下游引物 5，-CATCTACTATCTTGC ACTAAGCCTCT-3，；擴(kuò)增產(chǎn)物為 lOlbp。VEGFR-2 上游引物 5，-CACGGAACATCCTCTTGTCG-3，， 下游引物5，-TGTAGTCTTTGCCACCCTGCT-3，；擴(kuò)增產(chǎn)物為435bp。VEGFR-3上游引物序列 5，-GGTACAAAGATGAGAGGCTGCTG-3，；下游引物序列 5，-AGGTATTCACATTGCTCCTCCA-3，；擴(kuò)增 產(chǎn)物為36Ibp。GAPDH (內(nèi)參照)上游引物序列為5，-CATCATCCCTGCCTCCACT-3，，下游引物 序列 5，-GCCTGCTTCACCACCTTCTT-3，；擴(kuò)增產(chǎn)物為 180bpReal_timePCR 反應(yīng)條件預(yù)變性 950C 30s, Real-time PCR 反應(yīng)95°C 5s, 60°C 30s (40 個(gè)循環(huán))，溶解曲線分析95°C 15s, 60°C lmin,95°C 15s ； (4)數(shù)據(jù)分析反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real-time PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲 線，擴(kuò)增和溶解曲線良好的CT值進(jìn)行以下分析Δ CT = CT (目的基因)-CT (內(nèi)參)，2_Δ CT 代表目的基因在不同組織的相對(duì)表達(dá)值，2_ΔΔα代表在不同組織中變化倍數(shù)。1. 3統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用t檢驗(yàn)比較VEGFR各種亞型的相對(duì)表達(dá)值，在模型建立后的不同階段與對(duì)照 組之間的差異。2 結(jié)果不同階段VEGFR三種亞型在建模組與對(duì)照組滑膜組織中的相對(duì)表達(dá)值比較結(jié)果 如下術(shù)后第1周(表1)和第4周(表4)建模組VEGFR-2亞型的相對(duì)表達(dá)值高，與對(duì)照組 比較有顯著性差異(P < 0. 01)，而VEGFR-I和VEGFR-3亞型的表達(dá)與對(duì)照組比較無顯著差 異(P > 0. 05)；術(shù)后第2周(表2)，第3周(表3)建模組的VEGFR-I、VEGFR-2和VEGFR-3 三種亞型的表達(dá)與對(duì)照組相比均無顯著差異(P > 0. 05)。表1. VEGFRs在建模組和對(duì)照組相對(duì)表達(dá)值比較(1周) *P < 0. 01表2. VEGFRs在建模組和對(duì)照組相對(duì)表達(dá)值比較(2周) 表3. VEGFRs在建模組和對(duì)照組相對(duì)表達(dá)值比較(3周) 表4. VEGFRs在建模組和對(duì)照組相對(duì)表達(dá)值比較(4周) *P0. 013 討論 在TMJID滑膜炎的關(guān)節(jié)，血管充血和滲出很顯著，其主要的分子機(jī)制包括VEGF及 其受體。VEGF家族主要有3個(gè)特異性受體。VEGFR-1，又叫flt_l，即fms樣酪氨酸激酶 (macrophage colony stimulating factor receptor-like tyrosinekinase)，是巨UM細(xì)胞 集落刺激因子受體樣酪氨酸激酶。VEGFR-2又叫KDR/flk-1 (Kinase-insert-domain-conta ining-rec印tor含酪氨酸激酶插入?yún)^(qū)受體/fetal liver kinase胎肝激酶)。它們?cè)谑荏w 結(jié)合區(qū)有7個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)，與FMS/PIGF家族結(jié)構(gòu)類似。在成年哺乳動(dòng)物，VEGFR-I和VEGFR-2 均僅表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞上。在靜止的和增殖的血管內(nèi)皮細(xì)胞上均有VEGFR-I表達(dá)，提示 它在血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈組成性表達(dá)，有維持血管內(nèi)皮穩(wěn)定的作用。VEGFR-2在靜止血管內(nèi) 皮細(xì)胞表達(dá)很弱，但是在激活的血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)顯著上調(diào)。VEGFR-I和VEGF的親和力 是最高的(Kdl-IOpM)，但它促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、趨化的作用很弱。而VEGFR-2雖然和VEGF親和力相對(duì)于VEGFR-I很弱(Kd 200pmulf/L)，但它的酪氨酸激酶活性很高，參與血管 內(nèi)皮細(xì)胞VEGF激活后的有絲分裂、趨化等多種功能。有學(xué)者認(rèn)為VEGFR-I是血管內(nèi)皮細(xì)胞 上的VEGF結(jié)合受體，可能負(fù)性調(diào)控VEGFR-2介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞激活。我們的實(shí)驗(yàn)表明 VEGFR-2在建模第1周的兔關(guān)節(jié)滑膜組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在對(duì)照組的關(guān)節(jié)滑膜組織中表 達(dá)很弱，提示其與模型建立以后，關(guān)節(jié)腔內(nèi)的急性滑膜炎有關(guān)，可能是介導(dǎo)滑膜炎血管通透 性增加的重要分子。VEGFR-I則在建模組和對(duì)照組的滑膜組織中其表達(dá)均較穩(wěn)定。VEGFR-3， 又叫flt-4，是另外一個(gè)巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體樣酪氨酸激酶，它結(jié)構(gòu)上和VEGFR-I類 似，在胚胎形成中有重要作用。但它在成年動(dòng)物體內(nèi)只表達(dá)在淋巴內(nèi)皮上，其功能與淋巴管 及血管增生有關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示VEGFR-3的相對(duì)表達(dá)值雖然較對(duì)照組稍高，但統(tǒng)計(jì) 學(xué)處理顯示建模組與對(duì)照組之間無顯著性差異，提示VEGFR-3可能是介導(dǎo)TMJ ID滑膜淋巴 管增生的重要分子，而與滑膜炎的形成沒有直接的聯(lián)系。我們的研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后第1周建模組VEGFR-2亞型的相對(duì)表達(dá)值高，與對(duì)照組比較 有顯著性差異(P < 0. 01)，而VEGFR-I和VEGFR-3亞型的表達(dá)與對(duì)照組比較無顯著差異(P >0.05)，提示VEGFR-2可能與TMJ ID的急性創(chuàng)傷性滑膜炎的形成有關(guān)。術(shù)后第2，3周 建模組的VEGFR-I、VEGFR-2和VEGFR-3三種亞型的表達(dá)與對(duì)照組相比均無顯著差異(P > 0. 05)，提示急性滑膜炎消退后，早期高表達(dá)的VEGFR-2亦趨于正常，這一點(diǎn)從MRI及關(guān)節(jié)鏡 的評(píng)價(jià)中也能得到證實(shí)。術(shù)后第4周的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VEGFR-2又呈現(xiàn)高表達(dá)，提示此時(shí)ID 的形成，導(dǎo)致關(guān)節(jié)前上隱窩及盤后區(qū)的滑膜受到擠壓或牽拉，產(chǎn)生慢性滑膜炎，并激活血管 內(nèi)皮細(xì)胞，這就為阻斷VEGFR-2進(jìn)而抑制TMJID及黏連的形成提供了思路。由于VEGF是促 進(jìn)血管通透性的唯一因子，是影響?zhàn)みB形成的重要因素，因此早期特異性阻斷VEGFR-2可 望達(dá)到抑制黏連形成之目的。實(shí)施例21材料與方法1. 1 材料1. 1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康成年日本大耳白兔20只，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)2周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物納入和排除標(biāo)準(zhǔn)模型建立(見實(shí)施例 1)，建立好實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，右?cè)為模型側(cè)，左側(cè)為對(duì)照側(cè)。1. 1. 2試劑VEGFR-2抗體(4. 662mg/ml)購(gòu)于南京金思特生物試劑公司的試劑，抗 體2-8°C下可以保存1月，-20°C及以下可以長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)冷凍和復(fù)蘇。1.2方法(請(qǐng)參見圖1，圖2，圖3六，38，3(，30，圖4)1. 2. 1模型建立和關(guān)節(jié)腔注射藥物將20只兔的右側(cè)關(guān)節(jié)建立TMJ模型，關(guān)節(jié)腔內(nèi) 注射VEGFR-2抗體作為實(shí)驗(yàn)組；左側(cè)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射0. 9%的生理鹽水，作為對(duì)照組1 ；前期 實(shí)驗(yàn)的52只兔(日本大耳白兔)的左側(cè)關(guān)節(jié)因未進(jìn)行任何處理，在本實(shí)驗(yàn)中作為對(duì)照組 2。實(shí)驗(yàn)組兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)，分別于第l，2，4，8周注射含有VEGFR-2抗體的(MAB3757，CHEMIC0N， INTERNATIONAL)配比液體，注射量為0. 06ml，濃度為150萬U/ml ；對(duì)照組1則注射等量的 0.9%生理鹽水。關(guān)節(jié)腔注射方法為在兔子外眥后下方可觸及兩個(gè)小結(jié)節(jié)，分別為眶下緣 和髁突后極，作TMJ腔內(nèi)穿刺時(shí)，先固定兔子的四肢，PVP-I消毒局部皮膚，在兩小結(jié)節(jié)之間 進(jìn)針，針尖指向前、內(nèi)、下，約與眶下緣平行，進(jìn)針0. 5cm后可有脫空感，回吸無血，偶爾少許 黏稠的淡黃色液體即關(guān)節(jié)液，注射藥物后可回抽，此時(shí)表明針尖位于關(guān)節(jié)腔內(nèi)，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組注射VEGFR-2抗體和對(duì)照組1注射等量的0. 9%生理鹽水，退出針頭，壓迫止血。留待進(jìn) 行MRI、內(nèi)鏡評(píng)價(jià)以及組織學(xué)的觀察，統(tǒng)計(jì)各組之間黏連的形成有無顯著性差異。1. 2. 2術(shù)后評(píng)價(jià)方法包括MRI評(píng)價(jià)，內(nèi)鏡評(píng)價(jià)和組織學(xué)的評(píng)價(jià)。其具體方法如下 (I)MRI評(píng)價(jià)(圖2)是在模型建立后第1、2、4、8周，采用MRI確定有無關(guān)節(jié)盤的移位和T2 序列上是否存在關(guān)節(jié)液的積聚；根據(jù)關(guān)節(jié)液中是否有低信號(hào)影像、或關(guān)節(jié)液的連續(xù)性中斷， 確定模型建立是否成功，并據(jù)此進(jìn)行分組，探討關(guān)節(jié)液的積聚與黏連形成之間的關(guān)系。MRI 檢查的儀器和順序?yàn)樗脙x器為美國(guó)GE公司生產(chǎn)的1.5-T MRI (其規(guī)格型號(hào)SIGNA TWIN SPEED)；表面線圈為直徑3in的TMJ MRI檢查專用線圈；采用快速自旋回波成像技術(shù)按照特 定的MRI參數(shù)和檢查程序，對(duì)兔TMJ進(jìn)行掃描。(2)關(guān)節(jié)鏡檢查具體穿刺技術(shù)見前面的關(guān)節(jié) 腔注射方法。關(guān)節(jié)鏡為美國(guó)產(chǎn)Stryker關(guān)節(jié)鏡系統(tǒng)、Sony視頻監(jiān)視系統(tǒng)。MRI評(píng)價(jià)兔黏連模 型后，經(jīng)內(nèi)鏡進(jìn)一步證實(shí)有無黏連的產(chǎn)生(圖2)，同時(shí)評(píng)價(jià)滑膜血管充血、增生的級(jí)別，黏 連的類型、部位和分級(jí)。(3)組織學(xué)評(píng)價(jià)分別取實(shí)驗(yàn)側(cè)和對(duì)照側(cè)的全關(guān)節(jié)進(jìn)行固定，立即放 入4%的福爾馬林固定；酒精梯度脫水；二甲苯透明2次，各15 30分鐘；浸蠟2次，各1 2小時(shí)；將組織用石蠟包埋；切片、厚度為5微米、置60°C過夜；消化酶適當(dāng)消化；0. Olmol/ L，PH7. 4PBS沖洗15分鐘；HE染色，置濕盒，室溫，60mins ；0. 01mol/L, PH7. 4PBS沖洗三次， 每次5 IOmins ；蒸餾水洗Imin ；50%的甘油(0. 5mol/L, PH9. 0碳酸鹽緩沖液配置)封 片，光鏡下觀察比較兩組之間滑膜組織中毛細(xì)血管分布、增生的情況以及黏連的有無；同時(shí) 評(píng)價(jià)滑膜細(xì)胞的光鏡和電鏡下的變化。電鏡觀察是在內(nèi)鏡評(píng)價(jià)動(dòng)物模型的同時(shí)，留取滑膜 組織標(biāo)本立即放入2%戊二醛緩沖液中4°C條件下固定；0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖 液)沖洗2次，每次IOmin ； 1 %鋨酸后固定2h，再次用0. 2mol/L PBS緩沖液沖洗2次，每次 IOmin ；然后，依次放入30%、50%、70%乙醇逐級(jí)脫水、每次IOmin (70%乙醇含3%醋酸雙 氧鈾)4°C塊染，80%、95%、100%乙醇逐級(jí)脫水、每次lOmin，使組織中的水分充分去除。經(jīng) 過環(huán)氧丙烷置換2次，每次IOmin ；618包埋液與環(huán)氧丙烷1 1浸透處理2h ；在60°C烘箱 內(nèi)包埋48h;LKB V型超薄切片機(jī)切片；甲苯胺藍(lán)染色后光鏡下定位，枸櫞酸鉛進(jìn)行電子染 色；HITACHI-500透射電鏡(日本日立公司)下觀察。2 結(jié)果術(shù)后MRI評(píng)價(jià)20只兔的右側(cè)實(shí)驗(yàn)側(cè)關(guān)節(jié)術(shù)后均見關(guān)節(jié)液的積聚；左側(cè)對(duì)照組1 關(guān)節(jié)內(nèi)亦同樣均見關(guān)節(jié)的積聚；而在未做任何處理的對(duì)照組2中，則未見關(guān)節(jié)液的積聚。內(nèi) 鏡評(píng)價(jià)內(nèi)鏡下可見20側(cè)實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)中，只有4側(cè)關(guān)節(jié)有黏連的存在，關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜組織血 管充血明顯減輕，有效率為80% ；而在對(duì)照組1中，則全部可見黏連的產(chǎn)生，并伴有滑膜組 織血管充血；在對(duì)照組2中，52只兔的左側(cè)關(guān)節(jié)則未見明顯的黏連和滑膜血管充血。實(shí)驗(yàn) 組和對(duì)照組1之間的黏連形成有顯著性差異，而在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組2之間黏連的形成則無 顯著性差異。3 結(jié)論該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明①VEGFR-2抗體可以抑制關(guān)節(jié)滑膜血管充血，減輕關(guān)節(jié)液的滲出； ②VEGFR-2抗體通過減輕血管滲出，進(jìn)而在抑制顳下頌關(guān)節(jié)囊內(nèi)黏連方面具有一定的價(jià)值。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種VEGFR-2在制備早期檢測(cè)和/或治療顳頜關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂疾病藥中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的顳頌關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂疾病是顳下頌 關(guān)節(jié)囊內(nèi)黏連疾病。
3.—種檢測(cè)顳頌關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂疾病的試劑盒，其包括擴(kuò)增引物，dNTP，用于PCR反應(yīng) 的DNA聚合酶及其緩沖液的一種或多種，所述擴(kuò)增引物選自VEGFR-2擴(kuò)增引物，上游引物 5’ -CACGGAACATCCTCTTGTCG-3，， 下游引物 5，-TGTAGTCTTTGCCACCCTGCT-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述的顳頌關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂疾病是顳下 頌關(guān)節(jié)囊內(nèi)黏連疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種VEGFR-2在制備早期檢測(cè)和/或治療顳頜關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂疾病藥中的應(yīng)用。還提供了一種檢測(cè)顳頜關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂疾病的試劑盒，所述的試劑盒包括擴(kuò)增引物，dNTP，用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶及其緩沖液的一種或多種，所述擴(kuò)增引物選自VEGFR-2擴(kuò)增引物。本發(fā)明將VEGFR-2與顳頜關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂(顳下頜關(guān)節(jié)囊內(nèi)黏連)患者的藥物治療聯(lián)系起來，可以發(fā)明作用于這些靶點(diǎn)的藥物來治療顳頜關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂(顳下頜關(guān)節(jié)囊內(nèi)黏連)患者，為顳頜關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂(顳下頜關(guān)節(jié)囊內(nèi)黏連)患者的新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。
文檔編號(hào)A61P19/02GK101886123SQ20101018414
公開日2010年11月17日 申請(qǐng)日期2010年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月13日
發(fā)明者劉秀明, 張善勇, 惲白, 曹巍, 楊馳, 魏魁杰, 黃棟 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院