專利名稱：核酸酶激活型熒光納米探針及其制備方法
核酸酶激活型熒光納米探針及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及納米藥物領域，尤其涉及一種核酸酶激活型熒光納米探針及其制備方法。
背景技術：
癌癥已成為威脅人類生命的最大殺手之一。研究無創(chuàng)、無害且有效的癌癥治療方 法已成為當務之急。而納米技術的納米藥物載體的出現，為癌癥的治療帶來了新的曙光。納 米載體通過精確的靶向治療將藥物高劑量地集中傳遞到腫瘤部位而減少其對正常細胞的 損傷；納米藥物載體不但可以提高藥物的溶解度，增強藥物的穩(wěn)定性，避免藥物在到達病灶 前被降解，而且還可以同時對多種藥物進行共定位靶向傳遞和控制釋放，從而達到減少給 藥劑量，降低藥物毒副作用，增加藥物的有效吸收，提高藥物生物利用度。盡管納米藥物載體為腫瘤的治療提供了新的方法和思路，為腫瘤藥物制劑的開發(fā) 帶來了新的機遇，而且體外實驗效果也非常顯著，但是在臨床應用中研究者卻發(fā)現，腫瘤納 米藥物載體的療效并不理想，納米藥物載體的靶向治療很難名副其實。這種體內外療效的 差異表明，在采用納米藥物載體進行臨床治療的過程中一些關乎藥物載體體內轉運過程、 作用原理和藥物動力學的關鍵問題沒有得到解決，而研究這些問題的主要手段就是進行藥 物載體的體內分析。但目前常規(guī)的體內藥物分析方法如免疫分析、光譜分析、放射同位素分析、色 譜-質譜聯用等分析方法對于藥物載體的體內分析并不適用，這里的“藥物載體”不單指 載體材料，它指一個完整的納米顆粒，包括藥物、載體材料及修飾在載體上的生物配體分子 等。這些微量分離分析技術并不能實時、原位、動態(tài)地監(jiān)測藥物載體在活體動物內的傳遞和 代謝情況，而且無法檢測藥物進入細胞的情況。

發(fā)明內容基于此，有必要提供一種能實時動態(tài)的監(jiān)測納米藥物載體在體內的傳遞和代謝的 核酸酶激活型熒光納米探針。同時，還有必要提供一種能實時動態(tài)的監(jiān)測納米藥物載體在體內的傳遞和代謝的 核酸酶激活型熒光納米探針的制備方法。—種核酸酶激活型熒光納米探針，包括殼層和核層，所述殼層包裹所述核層，所述 核層包括藥物和雙鏈DNA探針分子，所述雙鏈DNA探針分子包括雙鏈DNA、熒光基團和淬滅 基團；所述熒光基團位于雙鏈DNA —條鏈的5’末端或3’末端，所述淬滅基團位于該鏈的3’ 末端或5’末端或另一條鏈的5’末端或3’末端。優(yōu)選的，所述殼層為有機聚合物、磷脂或無機材料。優(yōu)選的，所述熒光基團為芘、異硫氰酸熒光素、羅丹明、綠色羅丹明、X-羅丹明、多 甲藻黃素葉綠素蛋白、藻紅蛋白、羧基熒光素、花青素系列熒光染料、四甲基羅丹明、德克薩 斯紅、四氯羧基熒光素、亞歷克斯熒光素系列、硝基苯并氧雜惡二唑、六氯熒光素、萘并熒光素、二苯基蒽系列、香豆素系列或吖啶中的一種。優(yōu)選的，所述淬滅基團為黑洞淬滅劑系列、4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸或 蒙蔽淬滅劑中的一種。優(yōu)選的，所述的雙鏈DNA長度為8-30個堿基對。一種核酸酶激活型熒光納米探針的制備方法，包括如下步驟合成雙鏈DNA探針分子，所述雙鏈DNA探針分子包括雙鏈DNA、熒光基團和淬滅基 團，所述熒光基團位于雙鏈DNA —條鏈的5’末端或3’末端，所述淬滅基團位于該鏈的3’ 末端或5’末端或另一條鏈的5’末端或3’末端；用殼層包裹雙鏈DNA探針分子。優(yōu)選的，所述殼層包裹雙鏈DNA探針分子步驟包括首先，量取氯仿和甲醇混合備 用；其次，稱取1，2- 二油?；?3-三甲基氨基內烷和1，2- 二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷 酯溶于上述的氯仿甲醇混合液中，得到1，2-二油?；?3-三甲基氨基內烷的氯仿甲醇溶液 和1，2_ 二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯得氯仿甲醇溶液；再量取該1，2_ 二油?；?3-三 甲基氨基內烷的氯仿甲醇溶液和1，2- 二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯得氯仿甲醇溶液混 合，在氮氣裝置中吹至成膜，干燥過夜后除去過量的氯仿和甲醇；然后加入合成的雙鏈DNA 探針分子，水化，再在超聲儀中超聲，過聚碳酸酯膜，反復擠壓即可得到脂質體殼層包載的 雙鏈DNA探針分子。優(yōu)選的，所述氯仿和甲醇混合是按照體積比2 1混合。優(yōu)選的，所述1，2-二油?；?3-三甲基氨基內烷的氯仿甲醇溶液濃度為6. 986mg/ ml，所述1，2- 二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯氯仿甲醇溶液的濃度為7. 582mg/ml。優(yōu)選的，所述1，2-二油?；?3-三甲基氨基內烷的氯仿甲醇溶液與所述1，2-二 油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯氯仿甲醇溶液混合是按照體積比為1 4混合。優(yōu)選的，所述聚碳酸酯膜的孔徑為200nm。核酸酶激活型熒光納米探針通過將熒光基團和淬滅基團耦合于同一雙鏈DNA分 子中，在未被核酸酶分解激活的情況下，由于淬滅基團的存在，雙鏈DNA探針分子不發(fā)光， 但當攜帶該雙鏈DNA探針分子的藥物載體進入相應的組織細胞，在胞內核酸酶的酶解作用 下，雙鏈DNA探針分子解離，熒光基團和淬滅基團分離而發(fā)出熒光，因此可以準確的記錄和 檢測藥物載體在體內的傳遞和代謝情況，而且可以最大限度的降低背景熒光對藥物載體分 析的干擾。同時，該核酸酶激活型熒光納米探針制備方法簡單，原料相對便宜，不需要使用 過多有毒的有機試劑，減少了反應步驟，提供了制備效率，便于推廣應用。

圖1是實施例采用的雙鏈DNA探針分子的結構示意圖；圖2是實施例采用的雙鏈DNA探針分子的酶切前后的熒光強度具體實施方式核酸酶激活型熒光納米探針，巧妙的利用了細胞內源性的DNA酶來激發(fā)其中的探 針分子熒光以探測藥物載體與細胞的相互作用，核酸酶激活型探針分子最初是沒有熒光 的，只有進入細胞，被細胞內的DNA酶降解才能發(fā)出熒光，因此在對動物進行活體成像分析時，就能最大限度地降低背景熒光對藥物載體分析的干擾。由于該核酸酶激活型探針分子 可以作為藥物載體的一部分，因此可以用來研究藥物在體內的分級控釋性能、藥物載體和 藥物在腫瘤組織和體內各臟器的分布情況等。核酸酶激活型熒光納米探針，包括殼層和核層，其中核層包括雙鏈DNA探針分子 和藥物，所述殼層為有機聚合物、磷脂或無機材料等。雙鏈DNA探針分子包括DNA分子、熒光基團和淬滅基團。DNA分子為一段由A、T、 C、G核苷酸組成的雙鏈的隨意序列，序列長度太短無法商品化構建，太長則構建成本較高， 所以一般選用8-30個堿基對的雙鏈DNA分子；熒光基團標記于雙鏈DNA分子一條鏈的5’ 末端或3’末端，而該鏈的3’末端或5’末端或者相對應的另一條鏈的5’末端或者3’末端 標記有可以淬滅該熒光基團的淬滅基團，如圖1所示為一段具有24個堿基對的標記有熒光 基團和淬滅基團的雙鏈DNA探針分子。其中熒光基團為芘(pyrene)、異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明(Rhodamine)、綠色 羅丹明(Rhodamine Green)、X_羅丹明(X-Rhodamine)、多甲藻黃素葉綠素蛋白(PerCP)、藻 紅蛋白(ΡΕ)、羧基熒光素(FAM)、花青素系列熒光染料(Cy系列，Cy3、Cy5、Cy5.5等)、四甲 基羅丹明(Tetramethylrhodamine)、德克薩斯紅(Texas Red)、四氯羧基熒光素(ΤΕΤ)、亞 歷克斯熒光素系列(Alexa Fluor系列熒光染料)、硝基苯并氧雜惡二唑(NBD)、六氯熒光素 (HEX)、萘并熒光素(Naphthofluorescein)、二苯基蒽系列(D2-PA、D3_PA、D4_PA)香豆素系 列(coumarin系列)、吖啶(Acridine)等，優(yōu)選為羅丹明、X-羅丹明、羧基熒光素、Cy3、Cy5、 D2-PA、D3-PA、D4-PA。淬滅基團為黑洞淬滅劑系列(BlackHole Quencher 系列，BHQ-1、BHQ-2、BHQ_3)、 4-(4-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)、蒙蔽淬滅劑(ECLIPSE)等，優(yōu)選為BHQ-1、 BHQ-2、BHQ-3、4- (4- 二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸。核酸酶激活性熒光納米探針的具體制備流程包括首先，商品化合成8-30個堿基對的雙鏈DNA探針分子。所述雙鏈DNA探針分子包括雙鏈DNA、熒光基團和淬滅基團，熒光基團標記于雙鏈 DNA分子一條鏈的5’末端或3’末端，而淬滅基團標記于該鏈的3’末端或5’末端或者相對 應的另一條鏈的5’末端或者3’末端。其次，用脂質體殼層包載雙鏈DNA探針分子。量取一定體積的氯仿和甲醇按體積比2 1混合備用；稱取一定量的1，2_ 二油 ?；?3-三甲基氨基內烷(DOTAP)和1，2- 二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯(DOPC)分別 溶于上述的氯仿甲醇混合液中，其中DOTAP濃度為6. 986mg/ml, DOPC濃度為7. 582mg/ml ； 再量取一定體積的DOTAP氯仿甲醇溶液和DOPC氯仿甲醇溶液按體積比1 4混合，放置在 一定的容器中，在氮氣裝置中吹至成膜，干燥過夜后除去過量的氯仿和甲醇；然后加入商品 化合成的雙鏈DNA探針分子，水化，再在超聲儀中超聲10分鐘，過孔徑為200nm的聚碳酸酯 膜，反復擠壓即可得到脂質體殼層包載的雙鏈DNA探針分子。具體檢測實施例如下首先，商品化合成一段具有24個堿基對的雙鏈DNA探針分子，其結構如圖1所示。 然后，向準備好的Iml的離心管中加入15ml 26mM/ml的上述雙鏈DNA探針分子的磷酸溶解 液；再加入60 μ 1的IOX脫氧核糖核酸酶I (DNase I)緩沖液。在熒光儀上檢測這種混合溶液的熒光強度；檢測完畢后再加入200單位的脫氧核糖核酸酶I，在37°C水浴孵化30分 鐘，再檢測其熒光強度。通過對商品化合成的雙鏈DNA探針分子進行熒光激活實驗分析，如圖2所示，可以 發(fā)現激活前雙鏈DNA探針分子熒光強度為0，即雙鏈DNA探針分子不發(fā)熒光，在進行DNase I酶解激活后，雙鏈DNA探針分子中DNA雙鏈解離，淬滅基團與熒光基團分離，探針發(fā)出熒光。對脂質體包載的雙鏈DNA探針分子可以通過測量其粒徑和zeta電位來檢測分別 量取IOml的氯仿，5ml的甲醇，混勻放置；精密稱取34. 93mg的D0TAP、37. 9Img的DOPC分 別溶于5ml的氯仿甲醇溶液。將20 μ 1 DOTAP氯仿甲醇溶液和80ul的DOPC氯仿甲醇溶 液混合，放置在小瓶中；氮氣裝置吹至成膜。干燥過夜，除去過量的氯仿和甲醇；然后加入 0. 5ml的商品化合成的雙鏈DNA探針分子，水化；水化的懸液置于水浴超聲儀中超聲IOmin ； 過200nm的聚碳酸酯膜，反復擠壓，檢測探針的粒徑、zeta電位。核酸酶激活型熒光納米探針通過將熒光基團和淬滅基團耦合于同一雙鏈DNA分 子中，在未被核酸酶分解激活的情況下，由于淬滅基團的存在，雙鏈DNA探針分子不發(fā)光， 但當攜帶該雙鏈DNA探針分子的藥物載體進入相應的組織細胞，在胞內核酸酶的酶解作用 下，雙鏈DNA探針分子解離，熒光基團和淬滅基團分離而發(fā)出熒光，因此可以比較準確的記 錄和檢測藥物載體在體內的傳遞和代謝情況，而且可以最大限度的降低背景熒光對藥物載 體分析的干擾。同時，該核酸酶激活型熒光納米探針制備方法簡單，原料相對便宜，不需要 使用過多有毒的有機試劑，減少了反應步驟，提供了制備效率，便于推廣應用。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并 不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員 來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保 護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
權利要求
一種核酸酶激活型熒光納米探針，其特征在于，包括殼層和核層，所述殼層包裹所述核層，所述核層包括藥物和雙鏈DNA探針分子，所述雙鏈DNA探針分子包括雙鏈DNA、熒光基團和淬滅基團，所述熒光基團位于雙鏈DNA一條鏈的5’末端或3’末端，所述淬滅基團位于該鏈的3’末端或5’末端或另一條鏈的5’末端或3’末端。
2.如權利要求1所述的核酸酶激活型熒光納米探針，其特征在于，所述殼層為有機聚 合物、磷脂或無機材料。
3.如權利要求1所述的核酸酶激活型熒光納米探針，其特征在于，所述熒光基團為芘、 異硫氰酸熒光素、羅丹明、綠色羅丹明、X-羅丹明、多甲藻黃素葉綠素蛋白、藻紅蛋白、羧基 熒光素、花青素系列熒光染料、四甲基羅丹明、德克薩斯紅、四氯羧基熒光素、亞歷克斯熒光 素系列、硝基苯并氧雜惡二唑、六氯熒光素、萘并熒光素、二苯基蒽系列、香豆素系列或吖啶 中的一種。
4.如權利要求1所述的核酸酶激活型熒光納米探針，其特征在于，所述淬滅基團為黑 洞淬滅劑系列、4- (4- 二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸或蒙蔽淬滅劑中的一種。
5.如權利要求1所述的核酸酶激活型熒光納米探針，其特征在于，所述的雙鏈DNA長度 為8-30個堿基對。
6.一種核酸酶激活型熒光納米探針的制備方法，其特征在于，包括如下步驟合成雙鏈DNA探針分子，所述雙鏈DNA探針分子包括雙鏈DNA、熒光基團和淬滅基團，所 述熒光基團位于雙鏈DNA —條鏈的5’末端或3’末端，所述淬滅基團位于該鏈的3’末端或 5’末端或另一條鏈的5’末端或3’末端；殼層包裹雙鏈DNA探針分子。
7.如權利要求6所述的核酸酶激活型熒光納米探針的制備方法，其特征在于，所述殼 層包裹雙鏈DNA探針分子步驟包括首先，量取氯仿和甲醇混合備用；其次，稱取1，2_ 二油 ?；?3-三甲基氨基內烷和1，2- 二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯溶于上述的氯仿甲醇混 合液中，得到1，2- 二油?；?3-三甲基氨基內烷的氯仿甲醇溶液和1，2- 二油酰-sn-甘 油-3-磷酸卵磷酯得氯仿甲醇溶液；再量取該1，2-二油酰基-3-三甲基氨基內烷的氯仿甲 醇溶液和1，2_ 二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯得氯仿甲醇溶液混合，在氮氣裝置中吹至 成膜，干燥過夜后除去過量的氯仿和甲醇；然后加入合成的雙鏈DNA探針分子，水化，再在 超聲儀中超聲，過聚碳酸酯膜，反復擠壓即可得到脂質體殼層包載的雙鏈DNA探針分子。
8.如權利要求7所述的核酸酶激活型熒光納米探針的制備方法，其特征在于，所述氯 仿和甲醇混合是按照體積比為21混合。
9.如權利要求7所述的核酸酶激活型熒光納米探針的制備方法，其特征在于，所述 1，2-二油?；?3-三甲基氨基內烷的氯仿甲醇溶液濃度為6. 986mg/ml，所述1，2_ 二油 酰-sn-甘油-3-磷酸卵磷酯氯仿甲醇溶液的濃度為7. 582mg/ml。
10.如權利要求7所述的核酸酶激活型熒光納米探針的制備方法，其特征在于，所述1， 2- 二油?；?3-三甲基氨基內烷的氯仿甲醇溶液與所述1，2- 二油酰-sn-甘油-3-磷酸卵 磷酯氯仿甲醇溶液混合是按照體積比為14混合。
11.如權利要求7所述的核酸酶激活型熒光納米探針的制備方法，其特征在于，所述聚 碳酸酯膜的孔徑為200nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種核酸酶激活型熒光納米探針及其制備方法，該探針包括殼層和核層，其中核層包括藥物和雙鏈DNA探針分子，雙鏈DNA探針分子包括雙鏈DNA、熒光基團和淬滅基團；殼層包裹核層，熒光基團位于雙鏈DNA一條鏈的5’末端或3’末端，淬滅基團位于該鏈的3’末端或5’末端或另一條鏈的5’末端或3’末端。核酸酶激活型熒光納米探針通過將熒光基團和淬滅基團耦合于同一雙鏈DNA分子中，只有在被胞內核酸酶激活的情況下才能發(fā)出熒光，因此可以準確的記錄和檢測藥物載體在體內的傳遞和代謝情況，而且可以降低背景熒光對藥物載體分析的干擾。同時，探針制備方法簡單，原料相對便宜，使用有毒有機試劑少，減少了反應步驟，提供了制備效率，便于推廣應用。
文檔編號A61K49/00GK101884795SQ20101019626
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月9日 優(yōu)先權日2010年6月9日
發(fā)明者胡德紅, 蔡林濤, 鄭明彬, 龔萍 申請人:中國科學院深圳先進技術研究院