專利名稱：破傷風(fēng)外毒素c片段的b細(xì)胞表位肽的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及破傷風(fēng)外毒素C片段的B表位肽的應(yīng)用。
技術(shù)背景 破傷風(fēng)外毒素(tetanus toxin,TT)是破傷風(fēng)梭菌感染傷口后，在缺氧的條件下分 泌產(chǎn)生的一種神經(jīng)毒素，可導(dǎo)致患者因喉痙攣或繼發(fā)嚴(yán)重的肺部感染而死亡，死亡率可高 達(dá)20 % 50 %。全世界每年約有5萬(wàn)人死于破傷風(fēng)，我國(guó)的破傷風(fēng)死亡率高于世界平均水 平。抗生素不能清除破傷風(fēng)外毒素的毒性作用，具有中和毒素作用的抗破傷風(fēng)毒素的抗體 和疫苗是首選治療藥物。破傷風(fēng)外毒素蛋白分子量為150kDa。毒素經(jīng)菌體釋放后，在蛋白水解酶的作用下， 被“裂解”成一條輕鏈(50kDa)和一條重鏈(IOOkDa)，但輕鏈和重鏈之間仍有二硫鍵相連。 輕鏈?zhǔn)卿\依賴蛋白酶，通過(guò)水解突觸囊泡蛋白_2來(lái)阻斷神經(jīng)抑制性介質(zhì)的釋放。C蛋白是 重鏈的一部分，分子質(zhì)量為50kDa，不具備神經(jīng)毒素的活性，卻保留了完整毒素與神經(jīng)節(jié)苷 脂結(jié)合等許多性質(zhì)，是毒素的保護(hù)性抗原。C蛋白還能將小分子蛋白靶向傳遞到運(yùn)動(dòng)神經(jīng) 元，所以也可作為蛋白載體促進(jìn)低免疫原性抗原的免疫反應(yīng)。由于C蛋白是破傷風(fēng)毒素的 非毒性片段，且有較高的免疫原性，因此是制備破傷風(fēng)疫苗和篩選抗破傷風(fēng)中和性單克隆 抗體的一個(gè)理想靶標(biāo)。鑒于以上研究背景本發(fā)明預(yù)測(cè)并合成了破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位，并對(duì) 預(yù)測(cè)的B細(xì)胞表位的免疫原性和免疫保護(hù)性進(jìn)行了鑒定，本發(fā)明的B細(xì)胞表位肽可用于破 傷風(fēng)梭菌感染的肽疫苗研究和利用B細(xì)胞表位肽制備特異的單克隆抗體診斷、預(yù)防和治療 破傷風(fēng)梭菌的感染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來(lái)自破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽的應(yīng)用，其 中之一為來(lái)自破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽在制備預(yù)防、診斷或治療破傷風(fēng)梭菌感 染的藥物中的應(yīng)用，其中所述破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 1-4所示(其核苷酸序列分別如SEQ IDNO :5_8所示)。上述的來(lái)自破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽還可以用于制備抗破傷風(fēng)毒素單 克隆抗體。本發(fā)明的另一目的是提供用于制備預(yù)防、診斷或治療破傷風(fēng)梭菌感染的藥物，其 包含至少一個(gè)來(lái)自破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽，和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述 破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽的氨基酸序列如SEQID NO :1_4所示。所述藥學(xué)上可接受的載體包含稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、 吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體中的至少一種。本發(fā)明還提供一種預(yù)防、診斷或治療破傷風(fēng)梭菌感染的疫苗，其包含至少一個(gè)來(lái) 自破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽，其中所述破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:l-4所示。本發(fā)明的思路如下首先基于破傷風(fēng)外毒素與配體相互作用的晶體結(jié)構(gòu)，按B細(xì) 胞表位的預(yù)測(cè)原則，對(duì)破傷風(fēng)外毒素C片段的氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)毒素片段的B細(xì)胞 表位，并采用DNAStar軟件分析評(píng)價(jià)，人工合成B表位肽，用合成的B細(xì)胞表位肽偶聯(lián)載體 蛋白鑰孔戚血藍(lán)素(keyhole limpet hemocyanin,KLH)后免疫Balb/c小鼠，檢測(cè)抗體效價(jià) 鑒定其免疫原性；Western blot鑒定鼠抗血清的特異性，并以天然破傷風(fēng)外毒素攻毒，鑒定 B細(xì)胞表位肽的免疫保護(hù)性，結(jié)果顯示P4B細(xì)胞表位肽能刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的抗破傷風(fēng)外 毒素的中和抗體，該肽段位于破傷風(fēng)外毒素C片段N端第312 326位氨基酸。本發(fā)明的B 表位肽可以用來(lái)研制人或小鼠用的破傷風(fēng)肽疫苗，可以用來(lái)開(kāi)發(fā)預(yù)防或治療破傷風(fēng)梭菌感 染的多肽藥物。 本發(fā)明經(jīng)過(guò)深入而廣泛的研究，基于破傷風(fēng)外毒素蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，輔以DNAStar 軟件分析，選擇性的合成了 4條可能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答的B細(xì)胞表位肽，并對(duì)其免 疫特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)此4條表位肽能夠在Balb/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)特異性的體液免疫應(yīng)答， 產(chǎn)生的抗血清均能與破傷風(fēng)外毒素蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。因此，此四條多肽可以用于破傷 風(fēng)梭菌的多表位肽疫苗的設(shè)計(jì)；本發(fā)明的4條多肽可以用于人及動(dòng)物用的疫苗及抗體藥物 的開(kāi)發(fā)。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例， 并配合附圖，作詳細(xì)說(shuō)明如下。


圖1表示免疫印跡鑒定鼠抗血清的特異性，其中1表示PlB表位肽鼠抗血清的免疫印跡2表示P2B表位肽鼠抗血清的免疫印跡3表示P3B表位肽鼠抗血清的免疫印跡4表示P4B表位肽鼠抗血清的免疫印跡。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解的是，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對(duì)本發(fā)明制備方法的簡(jiǎn)單改進(jìn)，及對(duì) 本發(fā)明表位肽及其核苷酸序列的利用都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例IB表位的篩選鑒定1.表位肽的預(yù)測(cè)及合成在NCBI的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索破傷風(fēng)外毒素與配體神經(jīng)節(jié)苷脂晶體結(jié)構(gòu)解析圖 (MMDB ID 75338)，網(wǎng)址:http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/mmdb/mmdbsrv. cgi ？ Uid = 75338)?；赟tx2與配體神經(jīng)節(jié)苷脂相互作用的立體結(jié)構(gòu)，依據(jù)暴露在蛋白質(zhì)表面、 含伸展區(qū)和無(wú)規(guī)則卷曲或β轉(zhuǎn)角、以及肽段長(zhǎng)度約10 20個(gè)氨基酸等B表位肽的預(yù)測(cè)原 貝1J，選取破傷風(fēng)外毒素毒性片段上的氨基酸肽段，采用DNAStar軟件對(duì)預(yù)測(cè)的氨基酸肽段 進(jìn)行親水(Kyte-Doolittle方案)、表面可及性(Emini方案)、可塑性(Karplus-Schulz方 案)、二級(jí)結(jié)構(gòu)(Garnier和Chou-Fasman方案)及抗原性(Jameson-Wolf方案)等參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，如果某肽段中，抗原指數(shù)> 1、親水性指數(shù)> O、氨基酸的表面可能性指數(shù)> 1，同時(shí) 其內(nèi)部或附近又具有柔性結(jié)構(gòu)，則這一區(qū)段為抗原表位的可能性較大。通過(guò)BLAST檢索比 較預(yù)測(cè)的B細(xì)胞表位肽與人、兔、鼠的同源性后，最終確定本研究所用的4條可能的B細(xì)胞 表位肽序列，人工合成4條可能的B表位多肽(由北京中科亞光公司協(xié)助合成，4條B細(xì)胞 表位肽的基本信息見(jiàn)表1)，并分別偶聯(lián)載體蛋白KLH。表1預(yù)測(cè)合成后的破傷風(fēng)外毒素C片段的B表位的基本信息 (其核苷酸序列分別如SEQID NO :5_8所示)2.破傷風(fēng)外毒素B細(xì)胞表位肽的鑒定2. 1 免疫 Balb/c 小鼠8周齡Balb/c小鼠，，隨機(jī)分成5組，每組10只，雌雄各半，分別用偶聯(lián)KLH的4條 B細(xì)胞表位肽(Pl-KLH、P2-KLH、P3-KLH、P4-KLH)加完全福氏佐劑皮下多點(diǎn)注射免疫，每只 注射0. 5ml，含抗原肽100 μ g，免疫時(shí)間為0、2、4、6、8周，共5次，第1次加入福氏完全佐劑 第2 4次加福氏不完全佐劑，最后一次不加佐劑同樣劑量腹腔注射免疫一次，第2、3、4、5 次免疫后7d取尾血，采用間接ELISA法檢測(cè)免疫Balb/c小鼠血清效價(jià)，對(duì)照組PBS替代多 肽進(jìn)行免疫，免疫方法及程序相同。2. 2ELISA檢測(cè)血清效價(jià)間接ELISA的包被抗原分別為未偶聯(lián)KLH的4條多肽和破傷風(fēng)外毒素C片段。具 體方法如下包被用包被液將抗原稀釋為2 μ g/ml，加入酶標(biāo)板，100 μ 1/孔，4°C過(guò)夜，PBS洗 滌5遍，空干；封閉加BSA封閉液300 μ 1/孔，4°C過(guò)夜，洗滌5遍，空干，密封4°C保存
備用；鼠血清稀釋按1 100，1 200,1 400......進(jìn)行系列倍比稀釋至第10管；取
包被好的酶標(biāo)板，加入依次稀釋血清100 μ 1/孔，37°C水浴30分鐘，洗滌5遍，空干；加辣根 過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠gG抗體工作液(1 20000稀釋)100 μ 1/孔，37°C水浴30分鐘， 洗滌4遍，空干；加底物顯色液100 μ 1/孔，室溫避光反應(yīng)5 10分鐘；加終止液100 μ 1/ 孔，立即在酶標(biāo)儀上以492nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值；結(jié)果判斷0D值大于或等于陰性對(duì)照(小鼠 免疫前血清1 100倍稀釋)的2.1倍為抗體陽(yáng)性。呈抗體陽(yáng)性的最大稀釋倍數(shù)即為抗體 效價(jià)。表2B細(xì)胞表位肽免疫鼠血清效價(jià) 抗破傷風(fēng)外毒素C片段B表位肽血清的特異性取已處理的破傷風(fēng)外毒素C片段，并設(shè)定蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，在5%濃縮膠，12% 分離膠上進(jìn)行垂直SDS-PAGE，80V，30分鐘，調(diào)整電壓為150V，約1. 5小時(shí)。電泳結(jié)束后，取 下凝膠，一塊用考馬斯亮藍(lán)R-250染液快速染色，另一塊置于硝酸纖維素膜上，15V恒壓電 轉(zhuǎn)移過(guò)夜。轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜在麗春紅S中染色1分鐘，標(biāo)記蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)，再用蒸 餾水脫去紅色。將轉(zhuǎn)移膜置于封閉液(TTBS)中，37°C，150rpm，輕輕振搖封閉60分鐘棄去 封閉液，用洗滌液(TTBS)漂洗膜4次，每次10 15分鐘。加入以洗滌液1 1000稀釋 的鼠抗破傷風(fēng)外毒素C片段B表位肽抗血清，370C，150rpm,輕輕振搖反應(yīng)60分鐘。TBS漂 洗膜4次，每次10 15分鐘。加入以TBS稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(l 10000), 150rpm,輕輕振搖反應(yīng)60分鐘。TBS漂洗4次，每次10 15分鐘。加入DAB顯色液，輕搖 至顯色，蒸餾水漂洗終止反應(yīng)。結(jié)果間接ELISA結(jié)果顯示4條合成多肽均能分別刺激Balb/c小鼠產(chǎn)生抗特異多 肽和破傷風(fēng)外毒素C片段的抗體，鼠血清抗體與多肽和破傷風(fēng)外毒素C片段反應(yīng)的效價(jià)如 表2所示，而免疫前的鼠血清與PBS免疫對(duì)照組血清檢測(cè)為陰性，此結(jié)果表明本發(fā)明的4條 多肽具有較好的免疫原性和反應(yīng)原性，為B細(xì)胞表位肽。免疫印跡結(jié)果如圖1所示4條B 細(xì)胞表位肽刺激Balb/c小鼠產(chǎn)生的抗體均有很好的特異性，均能與破傷風(fēng)外毒素C片段特 異反應(yīng)。實(shí)施例2免疫小鼠攻毒試驗(yàn)初步篩選保護(hù)性B細(xì)胞表位肽上述免疫小鼠末次免疫10天后每只小鼠腹腔注射致死劑量(LDltltl, 1 μ g/kg)的天 然破傷風(fēng)外毒素，觀察5天內(nèi)各組小鼠的存活率。對(duì)照組PBS替代多肽進(jìn)行免疫和攻毒，方 法及程序相同。天然破傷風(fēng)外毒素攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示小鼠腹腔注入1 μ g/kg(LD100)劑量天 然破傷風(fēng)外毒素后，各組小鼠均先后出現(xiàn)了較重的中毒癥狀，表現(xiàn)為皮毛蓬松皺摺、攝食減 少、全身痙攣。尤其以對(duì)照組、P1、P2、P3的小鼠中毒癥狀出現(xiàn)快(24h 72h)，且呈進(jìn)行性 加重直至死亡，而P4組的小鼠中毒癥狀出現(xiàn)相對(duì)較慢(96h)，癥狀出現(xiàn)后有部分小鼠能夠 逐漸恢復(fù)。各組小鼠具體的存活與死亡情況表3所示表3小鼠免疫后攻毒的保護(hù)效果觀察 P < 0. Olvs PBS ；P > 0. 05vs PBS由表3可見(jiàn)，PBS對(duì)照組小鼠攻毒后48h內(nèi)全部死亡，而P1、P2、P3、P4抗原免疫組 的小鼠能夠不同程度的耐受LDltltl的天然破傷風(fēng)外毒素攻擊而得以存活，5天后的存活率分 別為、20%、10%、10%、70%，經(jīng)χ 2檢驗(yàn)分析P4組與PBS對(duì)照組有顯著性差異(P < 0. 01)， PU P2、P3免疫組和PBS對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P > 0. 05)，說(shuō)明單一的P4B細(xì)胞表位肽能 夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和破傷風(fēng)毒素的抗體，具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用，而單一的P2、P3、P4B 細(xì)胞表位肽保護(hù)效率差，但不能排除P2、P3、P4B細(xì)胞表位肽聯(lián)合應(yīng)用時(shí)會(huì)產(chǎn)生免疫保護(hù)作 用。此結(jié)果為利用B細(xì)胞表位肽制備破傷風(fēng)外毒素中和性單克隆抗體和破傷風(fēng)外毒素肽疫 苗的候選組分提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。序列表<110>中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)<120>破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽的應(yīng)用<130>10P99065-CN<160>8<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>16<212>PRT<213>破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽的氨基酸序列<400>1lie Asn Asn Asp lie lie Ser Asp lie Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val151015<210>2<211>12<212>PRT<213>破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽的氨基酸序列<400>2Asp Ser Ala Gly Glu Val Arg Gln lie Thr Phe Arg1510<210>3<211>10<212>PRT
<213>破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽的氨基酸序列<400>3Gly Asn Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr1510<210>4<211>15<212>PRT<213>破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽的氨基酸序列<400>4lie lie Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu lie Asp Ser Phe Val151015<210>5<211>48<212>DNA<213>編碼破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽的核苷酸序列<400>5attaataatg atattatatc agatatatct gggtttaatt catctgta48<210>6<211>36<212>DNA<213>編碼破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽的核苷酸序列<400>6gattccgcgg gagaagttag acaaataact tttagg36<210>7<211>30<212>DNA<213>編碼破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽的核苷酸序列<400>7ggaaaccctt tacgatatga tacagaatal30<210>8<211>45<212>DNA<213>編碼破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽的核苷酸序列<400>8attataaaaa gatatacacc taataatgaa atagattctt ttgtt4權(quán)利要求
一種來(lái)自破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽在制備預(yù)防、診斷或治療破傷風(fēng)梭菌感染的制劑中的應(yīng)用，其中所述破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1-4所示。
2.根據(jù)權(quán)利1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述制劑為抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體。
3.一種預(yù)防、診斷或治療破傷風(fēng)梭菌感染的藥物，其特征在于包含至少一個(gè)來(lái)自破傷 風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽，和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述破傷風(fēng)外毒素C片段的 B細(xì)胞表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 1-4所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的預(yù)防、診斷或治療破傷風(fēng)梭菌感染的藥物，其特征在于，所述 藥學(xué)上可接受的載體包含稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表 面活性劑、吸附載體中的至少一種。
5.一種預(yù)防、診斷或治療破傷風(fēng)梭菌感染的疫苗，其特征在于包含至少一個(gè)來(lái)自破傷 風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽，其中所述破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽的氨基酸 序列如SEQ ID NO 1-4所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及來(lái)自破傷風(fēng)外毒素(Tetanus toxion，TT)C片段的B細(xì)胞表位肽的應(yīng)用，來(lái)自破傷風(fēng)外毒素C片段的B細(xì)胞表位肽的氨基酸序列如SEQ IDNO1-4所示，其可用于制備預(yù)防或治療破傷風(fēng)梭菌感染的藥物，或制備抗破傷風(fēng)毒素單克隆抗體。本發(fā)明還提供預(yù)防或治療破傷風(fēng)梭菌感染的藥物和預(yù)防或治療破傷風(fēng)梭菌感染的疫苗。
文檔編號(hào)A61K38/08GK101837117SQ201010197830
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2010年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月11日
發(fā)明者余抒, 劉唯, 張衛(wèi)軍, 羅萍, 趙 卓, 鄒全明, 陳立, 顧江 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)