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細(xì)胞周期因子y及其用途的制作方法

文檔序號:1185021閱讀:264來源:國知局
專利名稱:細(xì)胞周期因子y及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域;更具體地,本發(fā)明涉及細(xì)胞周期因子Y及其用途。
背景技術(shù)
PFTKl蛋白屬于⑶K蛋白激酶家族成員之一,已有的研究證明,其在肝癌發(fā)生和細(xì) 胞周期調(diào)控中有重要功能作用。近年來,對PFTKl的研究表明,PFTKl是CDK家族的成員之一(Shu,F(xiàn).等(2007). Functional characterization of human PFTKl as a eye1 in-dependent kinase. ProcNatl Acad Sci USA 104,9248-53)。PFTKl 可以與細(xì)胞周期因子 Cyclin D3 (CCND3) 以及蛋白抑制因子Ρ21αρ1結(jié)合形成一個三元復(fù)合物,并參與對細(xì)胞周期G1/S的調(diào)控。已 有許多證據(jù)證明,只有細(xì)胞周期受到嚴(yán)密而精確的調(diào)控,細(xì)胞才能維持正常運(yùn)轉(zhuǎn),細(xì)胞周 期失控的超??焖龠\(yùn)行將導(dǎo)致細(xì)胞癌變。由此可見調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展的CDK家族成員 PFTKl是腫瘤發(fā)生過程的重要因素。此外PFTKl還被證明與細(xì)胞的癌化直接相關(guān)在癌化 的肝細(xì)胞中PFTKl表達(dá)量上調(diào);在侵入性Ifep3B細(xì)胞中抑制PFTKl的表達(dá)后導(dǎo)致細(xì)胞在侵 入,趨化遷移和運(yùn)動方面的能力明顯降低;相反的在非侵入性細(xì)胞HKCI-C3中提高PFTKl 的表達(dá)后細(xì)胞的微絲肌動蛋白聚合增強(qiáng),在侵入和運(yùn)動方面的能力提高(Pang,Ε. Y.等, N. (2007). Identification of PFTAIRE protein kinase 1, a novel cell division cycle-2 related gene,in the motile phenotype of hepatocellularcarcinoma cells. Hepatology 46,436_45)。說明PFTKl與細(xì)胞癌化引起的運(yùn)動表型直接相關(guān)。綜上,已有的研究已經(jīng)證明PFTKl參與細(xì)胞周期的調(diào)控,并且參與腫瘤發(fā)生過程, 因此本領(lǐng)域迫切需要找到調(diào)控PFTKl或與PFTKl相互作用的蛋白,以期找到新的調(diào)控細(xì)胞 周期或腫瘤發(fā)生發(fā)展的因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供細(xì)胞周期因子Y及其用途。在本發(fā)明的第一方面,提供細(xì)胞周期因子Y或其激動劑或拮抗劑的用途,用于制 備調(diào)控細(xì)胞周期的制劑。在一個優(yōu)選例中,所述的細(xì)胞周期因子Y或其激動劑用于制備促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程 的制劑;或所述的細(xì)胞周期因子Y的拮抗劑用于制備抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的制劑。在另一優(yōu)選例中,所述的促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程包括促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期或G2/M期; 或所述的抑制周期細(xì)胞進(jìn)程包括抑制細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期,或抑制細(xì)胞由Gl期進(jìn) 入S期。在另一優(yōu)選例中,所述的細(xì)胞周期因子Y的拮抗劑選自特異性結(jié)合細(xì)胞周期因 子Y的抗體;或特異性干擾細(xì)胞周期因子Y表達(dá)的干擾分子。
在另一優(yōu)選例中,所述的特異性干擾細(xì)胞周期因子Y表達(dá)的干擾分子是如SEQ IDNO 3-7任一(較佳地為SEQ ID NO :5(507-si))所示核苷酸序列的干擾分子。在另一優(yōu)選例中,所述的細(xì)胞周期因子Y通過與PFTAIRE蛋白激酶I(PFTKl)相互 作用調(diào)控細(xì)胞周期。在另一優(yōu)選例中,所述的細(xì)胞周期因子Y調(diào)控腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期,影響腫瘤的 發(fā)生或發(fā)展。在本發(fā)明的另一方面,提供一種篩選調(diào)控細(xì)胞周期的潛在物質(zhì)的方法,所述方法 包括(a)在測試組中,向表達(dá)細(xì)胞周期因子Y的體系中添加待篩選的候選物,并檢測細(xì) 胞周期因子Y的表達(dá)或活性;并且,在對照組中,在不添加所述候選物的、表達(dá)細(xì)胞周期因 子Y的體系中,檢測細(xì)胞周期因子Y的表達(dá)或活性;(b)將步驟(a)測試組中細(xì)胞周期因子Y的表達(dá)或活性與對照組中細(xì)胞周期因子 Y的表達(dá)或活性進(jìn)行比較,如果測試組中細(xì)胞周期因子Y的表達(dá)或活性在統(tǒng)計學(xué)上高于(優(yōu)選顯著高于,較 佳的高20%或更高;更佳的高40%或更高;進(jìn)一步更佳的高60%或更高)對照組,就表明 該候選物是促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期或G2/M期的潛在物質(zhì);若測試組中細(xì)胞周期因子Y的表達(dá)或 活性在統(tǒng)計學(xué)上低于(優(yōu)選顯著低于,較佳的低20%或更低;更佳的低40%或更低;進(jìn)一 步更佳的低60%或更低)對照組,就表明該候選物是抑制細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期,或抑制細(xì) 胞由Gl期進(jìn)入S期的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的另一方面,提供細(xì)胞周期因子Y的用途,用于與PFTAIRE蛋白激酶 1 (PFTKl)相互作用(相互結(jié)合),調(diào)控PFTAIRE蛋白激酶1的亞細(xì)胞定位或活性。在一個優(yōu)選例中,所述的細(xì)胞周期因子Y選自(a) SEQ ID NO=I所示氨基酸序列的蛋白;或(b) (a)限定的蛋白的保守性變異蛋白質(zhì)或其活性片段;或所述的PFTAIRE蛋白激酶1選自(i)SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白;或(ii) (i)限定的蛋白的保守性變異蛋白質(zhì)或其活性片段。在另一優(yōu)選例中,(b)項選自(1)具有SEQ ID NO=I中第143-243位氨基酸序列的蛋白;(2)具有SEQ ID NO :1中第55-341位氨基酸序列的蛋白;(3)具有SEQ ID NO :1中第84-341位氨基酸序列的蛋白;(4)具有SEQ ID NO=I中第1-310位氨基酸序列的蛋白;(5)具有SEQ ID NO=I中第1-243位氨基酸序列的蛋白;或(6)具有SEQ ID NO 1中第1-153位及第196-341位氨基酸序列的蛋白?;?ii)項選自(I)具有SEQ ID NO 2中第135-419位氨基酸序列的蛋白;或(II)具有SEQ ID NO 2中第135-430位氨基酸序列的蛋白。在本發(fā)明的另一方面,提供一種分離的蛋白,所述的蛋白選自(1)具有SEQ ID NO=I中第143-243位氨 酸序列的蛋白;
(2)具有SEQ ID NO :1中第55-341位氨基酸序列的蛋白;(3)具有SEQ ID NO :1中第84-341位氨基酸序列的蛋白;(4)具有SEQ ID NO=I中第1-310位氨基酸序列的蛋白;(5)具有SEQ ID NO=I中第1-243位氨基酸序列的蛋白;(6)具有SEQ ID NO 1中第1-153位及第196-341位氨基酸序列的蛋白;(7)具有SEQ ID NO 2中第135-419位氨基酸序列的蛋白;或(8)具有SEQ ID NO 2中第135-430位氨基酸序列的蛋白。在一個優(yōu)選例中,所述的蛋白不具有SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 2的全長序列。在本發(fā)明的另一方面,提供一種分離的多核苷酸,所述的多核苷酸編碼所述的蛋 白。在本發(fā)明的另一方面,提供一種質(zhì)粒載體,它含有所述的多核苷酸。在本發(fā)明的另一方面,提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞,它含有所述的載體;或其 基因組中整合有所述的多核苷酸。在本發(fā)明的另一方面,提供一種復(fù)合物,所述的復(fù)合物含有細(xì)胞周期因子Y和 PFTAIRE蛋白激酶1,兩者相互結(jié)合。在本發(fā)明的另一方面,提供所述的復(fù)合物的用途,用于篩選調(diào)控PFTAIRE蛋白激 酶1的亞細(xì)胞定位或活性的物質(zhì)。在本發(fā)明的另一方面,提供一種利用所述的復(fù)合物篩選調(diào)控PFTAIRE蛋白激酶1 的亞細(xì)胞定位或活性的潛在物質(zhì)的方法,所述方法包括(a)在測試組中,向細(xì)胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1相互作用的反應(yīng)體系中 添加待篩選的候選物,并檢測細(xì)胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1相互作用情況;并且, 在對照組中,在不添加所述候選物的、細(xì)胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1相互作用的反 應(yīng)體系中,檢測細(xì)胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用情況;(b)將步驟(a)測試組中細(xì)胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用情況 與對照組中細(xì)胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用情況進(jìn)行比較,如果測試組中細(xì)胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用在統(tǒng)計學(xué)上強(qiáng)于 (優(yōu)選顯著強(qiáng)于,較佳的強(qiáng)20%或更強(qiáng);更佳的強(qiáng)40%或更強(qiáng);進(jìn)一步更佳的強(qiáng)60%或更 強(qiáng))對照組,就表明該候選物是促進(jìn)PFTAIRE蛋白激酶1定位于細(xì)胞膜上或增強(qiáng)PFTAIRE 蛋白激酶1的激酶活性的潛在物質(zhì);如果測試組中細(xì)胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1 的相互作用在統(tǒng)計學(xué)上弱于(優(yōu)選顯著弱于,較佳的弱20%或更弱;更佳的弱40%或更弱; 進(jìn)一步更佳的弱60%或更弱)對照組,就表明該候選物是抑制PFTAIRE蛋白激酶1定位于 細(xì)胞膜上或降低PFTAIRE蛋白激酶1的激酶活性的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的另一方面,提供一種抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的制劑,所述制劑是干擾分子, 其核苷酸序列如SEQ ID NO 3-7任一(較佳地為SEQ ID NO 5)所示。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容,對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。


圖IA顯示了在16種人組織中CCNY轉(zhuǎn)錄成4kb和2kb兩個轉(zhuǎn)錄本。利用CCNY作為探針進(jìn)行Northern blot分析,β-actin作為內(nèi)參。圖IB顯示了在檢測的細(xì)胞系中,CCNY的轉(zhuǎn)錄本只有在肝癌細(xì)胞H印G2中才有高 表達(dá)。利用了 CCNY N端162bp的核苷酸作為探針進(jìn)行Northern blot分析,β-actin作 為內(nèi)參。圖2顯示了 CCNY具有影響細(xì)胞周期的功能。(A)用pEGFPN3-CCNY或作為對照的pEGFPN3分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,48h后進(jìn)行流式 細(xì)胞分析。 (B)用pEGFPN3-CCNY或作為對照的pEGFPN3分別轉(zhuǎn)染Ifep3B細(xì)胞,48h后進(jìn)行流 式細(xì)胞分析。(C)用pEGFPN3-CCNY或作為對照的pEGFPN3分別轉(zhuǎn)染H印G2細(xì)胞,48h后進(jìn)行流 式細(xì)胞分析。(D)分別用 pSUPER-GFP-466,pSUPER-GFP-489, pSUPER-GFP-507,pSUPER-GFP-754 或作為對照的pSUPER-GFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,48h后,提取RNA進(jìn)行熒光定量PCR分析。1代
表第一次實驗結(jié)果,2代表第二次實驗結(jié)果。(E) pSUPER-GFP-507 (CCNY RNAi)或作為對照的 pSUPER-GFP (Mock RNAi)分別轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞,72h后,提取RNA進(jìn)行熒光定量PCR分析,用β-actin RNA作為對照。(F) pSUPER-GFP-507 或作為對照的 pSUPER-GFP 分別轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞,通過 Double Thymidine法將細(xì)胞阻斷于G1/S過渡期,釋放后,在不同的時間點收取細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞 分析。其中,2N表示G0/G1期細(xì)胞,4N代表G2/M期細(xì)胞,中間值代表S期細(xì)胞。(G) pSUPER-GFP-507或作為對照的pSUPER-GFP分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,通過 Nocodazole將細(xì)胞阻斷于M期,釋放后,在不同的時間點收取細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析。其 中,2N表示G0/G1期細(xì)胞,4N代表G2/M期細(xì)胞,中間值代表S期細(xì)胞。(H)pSUPER-GFP-507或作為對照的pSUPER-GFP分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,G418篩選出 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。提取蛋白,用抗CCNY抗體Western檢測CCNY蛋白水平,抗tubIin抗體 作為上樣量對照。(I)用 0. 5mM Mimosine 分另Ij 處理 CCNY RNAi (pSUPER-GFP-507)禾Π 對照 (pSUPER-GFP)細(xì)胞株24小時,使其同步化于Gl期,釋放后,在不同的時間點收取細(xì)胞進(jìn)行 流式細(xì)胞分析。其中,2N表示G0/G1期細(xì)胞,4N代表G2/M期細(xì)胞,中間值代表S期細(xì)胞。圖3顯示了 CCNY與PFTKl的相互作用以及它們的相互作用所需位點。(A) CCNY與PFTKl在酵母雙雜交系統(tǒng)的相互作用。(B)在哺乳動物中CCNY與PFTKl的體內(nèi)免疫共沉淀實驗。(C)在酵母雙雜交系統(tǒng)的,利用CCNY與PFTKl的突變體尋找它們的相互作用所需 位點,為構(gòu)建的CCNY突變體。(D)在酵母雙雜交系統(tǒng)的,利用CCNY與PFTKl的突變體尋找它們的相互作用所需 位點,為構(gòu)建的PFTKl的突變體。圖4顯示了 CCNY調(diào)控PFTKl的定位。(A) CCNY多克隆抗體的特異性檢測。(B)內(nèi)源性CCNY或者PFTKl在小鼠睪丸不同亞細(xì)胞組分中的定位。(C) pEGFPC2-PFT和pMycN3_CCNY兩個真核表達(dá)載體單獨轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,外源性單獨表達(dá)的CCNY與PFTKl在293T細(xì)胞中的間接免疫熒光定位。(D)外源性共同表達(dá)的CCNY與PFTKl在293T細(xì)胞中的共定位。圖5顯示了 CCNY調(diào)控PFTKl的激酶活性。(A)用CCNY多克隆抗體從小鼠腦組織中免疫沉淀CCNY后,進(jìn)行Western blot分 析,用抗絲氨酸磷酸化的抗體進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性的CCNY發(fā)生絲氨酸磷酸化。 (B) pEGFPC2-PFTKl和pMgcN3_CCNY在293T細(xì)胞單獨表達(dá)或者共同表達(dá)后,提取細(xì) 胞總蛋白,進(jìn)行Western blot分析,用抗GFP或者M(jìn)yc的抗體來檢測各個蛋白的表達(dá)情況, 用抗磷酸化Ser檢測蛋白的磷酸化情況。發(fā)現(xiàn)在PFTKl存在時外源性CCNY的絲氨酸磷酸 化增強(qiáng)。(C)過量表達(dá)CCNY促使外源性PFTKl的激酶活性增強(qiáng)。在293T細(xì)胞中分別過量 表達(dá)PFTKl,CCNY以及CCNY/PFTK1,免疫沉淀相應(yīng)蛋白檢測對PFTKl以及Rba37的激酶活性。圖6顯示了 CCNY的第二位肉桂?;揎椢稽c決定它的膜定位。(A)CCNY的肉桂?;揎椢稽c及該位點上的G2A和N3A兩個點突變體。CCNYG2A 代表了 CCNY第2位甘氨酸突變成丙氨酸,CCNY N3A CCNY第3位天冬酰胺突變成丙氨酸。(B)pEGFPN3-CCNY(CCNY-GFP), pEGFPN3_CCNY G2A(G2A-GFP), pEGFPN3_CCNY N3A (N3A-GFP)以及 pEGFPC2_CCNY (GFP-CCNY)表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞,DNA 用 DAPI 標(biāo) 記DNA (藍(lán)色),在熒光顯微鏡下觀察各個融合蛋白的亞細(xì)胞定位。(C) pEGFPN3-CCNY和pEGFPN3_CCNY G2A分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收取細(xì)胞,將細(xì)胞的 細(xì)胞膜和胞質(zhì)/核組分分離后,進(jìn)行western blot分析。T 總蛋白;M 膜蛋白組分;C 胞 質(zhì)/核蛋白組分;NS 非特異性條帶可用于上樣量的參照。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究,首次確定了一個與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白,即細(xì) 胞周期因子Y(CyclinY,CCNY)。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn),CCNY能與蛋白激酶家族成員PFTAIRE蛋 白激酶I(PFTKl)相互作用,從而發(fā)揮調(diào)控PFTKl激酶活性或細(xì)胞定位的作用。如本文所用,“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì),原 始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化 的,但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開,則為分離純化 的。如本文所用,所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構(gòu)
成”、“基本上由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”;“主要由......構(gòu)成”、“基本上
由......構(gòu)成”和“由......構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。CCNY或其生物活性片段CCNY是一個能與PFTKl相互作用的蛋白,它屬于細(xì)胞周期因子家族中的一名 新成員。本發(fā)明人分離得到的編碼CCNY的cDNA片段全長為1723bp (GenBank登錄號 AY504868),其中含有一個1026bp的完整開放閱讀框,序列分析表明其編碼一個341氨基酸 的蛋白(SEQ ID NO :1)。BLAST搜索結(jié)果發(fā)現(xiàn),在該蛋白的143-243aa之間包含一個Cyclin 家族成員特有的Cyclin box結(jié)構(gòu)域,因此本發(fā)明人將之命名為細(xì)胞周期因子Y(CyclinY, CCNY)。
在人的16個組織中,CCNY在睪丸中大量表達(dá),而在其他組織中表達(dá)量較低。在不 同的細(xì)胞系中,CCNY在肝癌細(xì)胞系HepG2中表達(dá)量最高,而在其它細(xì)胞系中表達(dá)量較低。通 過過量表達(dá)CCNY以及用RNAi抑制CCNY的表達(dá)以分析CCNY在細(xì)胞周期中的功能作用,結(jié) 果表明,過量表達(dá)的CCNY促進(jìn)S和G2/M期細(xì)胞的積累,而用RNAi抑制CCNY的表達(dá)后,細(xì) 胞周期的進(jìn)展受到抑制。在本發(fā)明中,所用的CCNY可以是天然存在的,比如其可被分離或純化自哺乳動 物。此外,所述的CCNY也可以是人工制備的,比如可以根據(jù)常規(guī)的基因工程重組技術(shù)來生 產(chǎn)重組CCNY。優(yōu)選的,本發(fā)明可采用重組的CCNY。任何適合的CCNY均可用于本發(fā)明。所述的CCNY包括全長的CCNY或其生物活性 片段(或稱為活性片段)。例如,所述的CCNY的氨基酸序列可以與SEQ ID N0:1所示的序 列基本上相同。經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的CCNY的氨基酸序列也 包括在本發(fā)明中。CCNY或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列,所述經(jīng)氨基 酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域公知的 技術(shù),所述技術(shù)可以很容易地被實施,并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使 本領(lǐng)域人員認(rèn)識到,一般來說,在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個氨基酸基本上不會改變 生物活性。見 Watson 等 Molecular Biology of The Gene,第四版,1987,The Benjamin/ Cummings Pub. Co. P224。任何一種CCNY的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里,CCNY的生物活 性片段的含義是指作為一種多肽,其仍然能保持全長的CCNY的全部或部分功能。通常情況 下,所述的生物活性片段至少保持50%的全長CCNY的活性。在更優(yōu)選的條件下,所述活性 片段能夠保持全長CCNY的60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、99 %或100 %的活性。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,所述的CCNY的生物活性片段選自具有SEQ ID NO 1中 第143-243位氨基酸序列的蛋白;具有SEQ ID NO=I中第55-341位氨基酸序列的蛋白;具 有SEQ ID NO :1中第84-341位氨基酸序列的蛋白;具有SEQ ID NO 1中第1-310位氨基酸 序列的蛋白;具有SEQ ID NO 1中第1-243位氨基酸序列的蛋白;或具有SEQ ID NO :1中 第1-153位及第196-341位氨基酸序列的蛋白。經(jīng)驗證,CCNY的上述生物活性片段保留了 全長CCNY的生物活性,或比全長CCNY具有更優(yōu)異的生物活性。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的CCNY,比如,可采用為了促進(jìn)其半衰期、有效性、 代謝和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的CCNY。所述經(jīng)過修飾或改良的CCNY可以是一 種CCNY的共軛物,或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述經(jīng)過修飾或改良的CCNY可 以是與天然存在的CCNY具有較小的共同點,但也能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期或與PFTKl相互作用,且 不會帶來其它不良影響或毒性。也就是說,任何不影響CCNY的生物活性的變化形式都可用 于本發(fā)明中。一旦分離獲得了所述蛋白的序列,就可以用重組法來大批量地獲得該蛋白。這通 常是將其編碼基因克隆入載體,再轉(zhuǎn)入細(xì)胞,然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分 離得到。此外,對于較短的蛋白而言,也可采用人工合成(如通過多肽合成儀合成)的方法 來合成有關(guān)序列,人工合成的方法可簡便且快速地得到所需要的蛋白。本發(fā)明還包括了編碼所述的CCNY的生物活性片段的分離的核酸,也可以是其互補(bǔ)鏈。編碼CCNY的生物活性片段的DNA序列,可以全序列人工合成,也可用PCR擴(kuò)增的方 法獲得。在獲得了編碼所述的CCNY的生物活性片段的DNA序列之后,將其連入合適的表達(dá) 載體,再轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞。最后通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞,通過分離純化得到所要的 蛋白。本發(fā)明還包括了包含編碼所述CCNY的生物活性片段的核酸分子的載體。所述的 載體還可包含與所述核酸分子的序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列,以便于蛋白的表達(dá)。所 述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況,即線性DNA序列的某些部分能夠 調(diào)節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如,如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄,那么它 就是可操作地連于編碼序列。此外,含有編碼所述CCNY的生物活性片段核酸序列的重組細(xì)胞也包括在本發(fā)明 中?!八拗骷?xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、枯草桿菌 等;例如可為大腸桿菌細(xì)胞(E. coli),如大腸桿菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真 核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞。PFTKl蛋白或其生物活性片段PFTKl基因是本發(fā)明人早期利用簡并PCR方法篩選得到的人Cdc2相關(guān)蛋白激酶基 因,其全長為1410bp (GenBank登錄號AF119833),編碼一個含469個氨基酸殘基的蛋白質(zhì) (SEQ ID NO :2)。任何適合的PFTKl均可用于本發(fā)明。所述的PFTKl包括全長的PFTKl或其生物活 性片段(或稱為活性片段)。例如,所述的PFTKl的氨基酸序列可以與SEQ ID NO 2所示 的序列基本上相同。任何一種PFTKl的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里,PFTKl的生物 活性片段的含義是指作為一種多肽,其仍然能保持全長的PFTKl的全部或部分功能。通常 情況下,所述的生物活性片段至少保持50%的全長PFTKl的活性。在更優(yōu)選的條件下,所述 活性片段能夠保持全長PFTKl的60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%的活性。本發(fā)明還包括PFTKl的保守性變異蛋白,其具有與PFTKl蛋白相同功能的、SEQID NO :2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個, 較佳地1-30個,更佳地1-20個,最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代,以及在 C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi),較佳地為10個以內(nèi),更佳地為5 個以內(nèi))氨基酸。例如,在本領(lǐng)域中,用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時,通常不會改 變蛋白質(zhì)的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變 蛋白質(zhì)的功能。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,所述的PFTKl的生物活性片段選自具有SEQ ID N0:2中 第135-419位氨基酸序列的蛋白;或具有SEQ ID NO :2中第135-430位氨基酸序列的蛋白。 經(jīng)驗證,PFTKl的上述生物活性片段保留了全長PFTKl的生物活性,或比全長PFTKl具有更 優(yōu)異的生物活性。CCNY的激動劑或拮抗劑及其用途如本文所用,所述的CCNY的激動劑包括了促進(jìn)劑、上調(diào)劑等。任何可提高CCNY 蛋白的活性、維持CCNY蛋白的穩(wěn)定性、促進(jìn)CCNY蛋白的表達(dá)、促進(jìn)CCNY蛋白的分泌、延長 CCNY蛋白有效作用時間、或促進(jìn)CCNY的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明,作為可用于調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,特別是促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期或G2/M期(即促進(jìn)細(xì)胞積累在S期或G2/M期)的 有效物質(zhì)。如本文所用,所述的CCNY的拮抗劑包括了抑制劑、下調(diào)劑、阻滯劑、阻斷劑等。任 何可降低CCNY蛋白的活性、降低CCNY蛋白的穩(wěn)定性、抑制CCNY蛋白的表達(dá)、減少CCNY蛋白 有效作用時間、抑制CCNY蛋白的分泌、或抑制CCNY的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明, 作為可用于調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,特別是抑制細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期、或抑制細(xì)胞由Gl期進(jìn)入S期 的有效物質(zhì)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,所述的CCNY的拮抗劑是(但不限于)特異性抗CCNY蛋 白的抗體,或特異性沉默CCNY基因表達(dá)的反義分子(如小干擾RNA或反義核苷酸等)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,所述的CCNY的拮抗劑是SEQ ID NO :3_7任一(較佳地為 SEQ ID NO 5)所示的干擾分子。其可良好地抑制CCNY的表達(dá)。篩選方法在得知了所述的CCNY對于調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的用途后,可以基于該特征來篩選調(diào)節(jié) CCNY的表達(dá)或活性,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的物質(zhì)。因此,本發(fā)明提供一種篩選可用于調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的潛在物質(zhì)的方法,所述的方法 包括將候選物質(zhì)與表達(dá)CCNY(包括其生物活性片段)的體系接觸;和檢測候選物質(zhì)對 CCNY的影響;若所述候選物質(zhì)可提高CCNY的表達(dá)或活性,則表明該候選物質(zhì)是就表明該候 選物是促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期或G2/M期的潛在物質(zhì);若所述候選物質(zhì)可降低CCNY的表達(dá)或活 性,就表明該候選物是抑制細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期,或抑制細(xì)胞由Gl期進(jìn)入S期的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中,在進(jìn)行篩選時,為了更易于觀察到CCNY的表達(dá)或活性的 改變,還可設(shè)置對照組,所述的對照組可以是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)CCNY的體系。所述的體系包括(但不限于)溶液體系、亞細(xì)胞體系、細(xì)胞體系、組織體系、器官 體系、或動物體系。本發(fā)明還提供一種復(fù)合物,所述的復(fù)合物含有CCNY蛋白和PFTKl蛋白,兩種蛋白 相互結(jié)合。本發(fā)明人通過酵母雙雜交以及免疫共沉淀技術(shù)證明,CCNY與PFTKl能夠相互結(jié) 合,從而發(fā)揮調(diào)控PFTKl活性以及細(xì)胞內(nèi)定位的作用。因此,所述的復(fù)合物可以作為篩選改 變這種調(diào)控作用的篩選模型。因此,本發(fā)明還提供了一種篩選調(diào)控PFTAIRE蛋白激酶1的亞細(xì)胞定位或活性的 潛在物質(zhì)的方法,所述方法包括向CCNY蛋白(包括其生物活性片段)和PFTKl蛋白(包括 其生物活性片段)相互作用(相互結(jié)合)的反應(yīng)體系中添加待篩選的候選物,并檢測CCNY 蛋白和PFTKl蛋白相互作用情況;如果細(xì)胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用在 統(tǒng)計學(xué)上增強(qiáng),就表明該候選物是促進(jìn)PFTAIRE蛋白激酶1定位于細(xì)胞膜上或增強(qiáng)PFTAIRE 蛋白激酶1的激酶活性;如果細(xì)胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用在統(tǒng)計學(xué) 上減弱,就表明該候選物是抑制PFTAIRE蛋白激酶1定位于細(xì)胞膜上或降低PFTAIRE蛋白 激酶1的激酶活性。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中,在進(jìn)行篩選時,為了更易于觀察到CCNY蛋白 和PFTKl蛋白相互作用的變化,還可設(shè)置對照組,所述的對照組可以是不添加所述候選物 的、CCNY蛋白和PFTKl蛋白相互作用的反應(yīng)體系。本發(fā)明人還構(gòu)建了多種CCNY和PFTKl的突變體用于雙雜交實驗,證明了 PFTKl 與CCNY的相互作用,并確定了它們結(jié)合的區(qū)域,CCNY的cyclin box和PFTKl的PFTAIRE基序為它們的相互結(jié)合所必須。體內(nèi)和體外試驗證明內(nèi)源CCNY能與PFTKl在體內(nèi)結(jié)合, 外源表達(dá)的CCNY也與PFTKl結(jié)合,這種結(jié)合不受CCNY在細(xì)胞內(nèi)的定位所影響。外源表 達(dá)的CCNY定位于細(xì)胞膜上,內(nèi)源性CCNY也能與細(xì)胞膜結(jié)合,CCNY可能是通過肉桂?;?(Myristoylation)修飾而定位于膜上的蛋白。細(xì)胞定位實驗和磷酸化試驗證明CCNY對 PFTKl有調(diào)控作用,CCNY可以調(diào)控PFTKl在細(xì)胞內(nèi)的定位,PFTKl與CCNY結(jié)合后能使PFTKl 聚集在細(xì)胞質(zhì)膜周圍,而單獨表達(dá)的PFTKl定位于細(xì)胞質(zhì)中。CCNY的結(jié)合能夠激活PFTKl, CCNY與PFTKl的結(jié)合不但提高了 PFTKl自身磷酸化的能力,還提高了 PFTKl對RB的磷酸化 水平,而且膜結(jié)合的CCNY能發(fā)生絲氨酸磷酸化,這種磷酸化會因為PFTKl的結(jié)合而增強(qiáng)。在本發(fā)明中,檢測蛋白與蛋白之間相互作用以及相互作用的強(qiáng)弱可采用多種本領(lǐng) 域技術(shù)人員熟知的技術(shù),比如GST沉降技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、酵母雙雜交系統(tǒng)或免疫共沉 淀技術(shù)。其中,酵母雙雜交是一種大規(guī)模快速研究蛋白-蛋白間相互作用的方法,具有簡 單、穩(wěn)定的優(yōu)點。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中,采用了酵母雙雜交系統(tǒng)來鑒定CCNY蛋白和 PFTKl蛋白的相互作用。更具體的,在酵母細(xì)胞中,一種與DNA-結(jié)構(gòu)域融合的誘餌蛋白與一 種與活化域融合的獵物蛋白相互作用。相互作用的成對分子結(jié)合于專一的序列模式,從而 活化兩個獨立的報道基因的轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中,采用免疫沉淀技術(shù)來驗證蛋白與蛋白之間的特異性 相互作用。所述的免疫共沉淀技術(shù)的原理是在保持蛋白-蛋白相互作用的條件下,收獲和 裂解細(xì)胞,從細(xì)胞提取液中特異性地免疫沉淀目的蛋白,然后通過電泳等方法分離免疫沉 淀物。具有已知特性的蛋白的共沉淀,可采用抗該蛋白的抗體,通過比如Western印跡來檢 測。此外,如果細(xì)胞在裂解前已經(jīng)用標(biāo)記物進(jìn)行過標(biāo)記,則可通過放射自顯影或其它免疫學(xué) 技術(shù)來觀察共沉淀的蛋白。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,所述的方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì) 胞實驗和/或動物試驗,以進(jìn)一步選擇和確定對于調(diào)節(jié)細(xì)胞周期或調(diào)控PFTAIRE蛋白激酶 1的亞細(xì)胞定位或活性真正有用的物質(zhì)。另一方面,本發(fā)明還提供了采用所述篩選方法獲得的可用于調(diào)節(jié)細(xì)胞周期或調(diào)控 PFTAIRE蛋白激酶1的亞細(xì)胞定位或活性的潛在物質(zhì)。這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個 篩選庫,以便于人們最終可以從中篩選出真正有用的物質(zhì)。由于現(xiàn)有技術(shù)中已知PFTKl參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)以及參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,因此 對PFTKl具有調(diào)控作用的CCNY也具有潛在的調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的應(yīng)用價值??梢酝茰yCCNY 既可以直接涉及癌化過程中細(xì)胞周期的調(diào)控失常又能夠通過調(diào)控PFTKl的活性而干涉癌 化細(xì)胞的侵入和運(yùn)動能力,因而對CCNY的研究最終將對腫瘤發(fā)生的檢測、診斷和治療具有 重要的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)意義。下面結(jié)合具體實施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人,分子克隆實驗室指南(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明,否則百分比和 份數(shù)按重量計算。除非另行定義,文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外,任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。I、材料和方法Northern 分析不同細(xì)胞系(A431、ECV304、HELA、!fepG2、Huh7、293T、7721、C0S7、B16、NIH3T3;這 些細(xì)胞分別獲自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)的總RNA是利用Qiagen公司的RNeasy Mini Kit試 劑盒提取。20 μ 1上樣量包括RNA樣品12μ 1(25μ g),4y 1甲酸,2 μ 1 10XMOPS,2 μ 1上樣 緩沖液、65°C加熱10min,0°C冷卻2min,離心5s,上樣。電泳在含甲醛的變性膠上進(jìn)行(Ig 瓊脂糖,IOml 10XMOPS,87ml DEPC處理水,加熱融化稍冷后加入2. 7ml 37%甲醛)。電泳 條件為100mA,50-70V,5-7h電泳完成后同樣用毛細(xì)法轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜液用5 X SSC。轉(zhuǎn)膜過夜后, 取出膜,不能使膜干透,用Bio-Ra GS GeneLinker C3 protocol紫外交聯(lián),加入IOml預(yù)雜 交液,65°C,2h后更換為IOml雜交液,加入探針65°C雜交過夜,用2XSSC,0. 1% SDS, 65°C 洗膜兩次,每次30min。雜交好的膜不要晾干,用保鮮膜包好后_70°C壓片。重雜交洗膜用 0. 5% SDS,90-100°C加熱 5-10min,或按照 Clontech 推薦用 0. 5% SDS,90_100°C加熱 IOmin 后讓其自然冷卻IOmin后取出備用,若不立即用,用保鮮膜包好后置于-20°C保存。SiRNA介導(dǎo)的基因沉默和熒光定量PCR466 序列(466-si)489 序列(489-si)507 序列(507-si)754 序列(754-si)942 序列(942-si)
5,-GAAGTGCCACCAGATTATG-3,(SEQ ID NO 3) 5,-ACACAACCCAGAGCAGAAG-3,(SEQ ID NO 4) 5,-GCAGATTTACCGGTTCGTT-3’ (SEQ ID NO 5) 5,-CTAGAGCGACAGTTTCTTG-3’ (SEQ ID NO 6) 5,-GGACCTAAGAAGATCCGCG-3’ (SEQ ID NO 7)常規(guī)方法設(shè)計針對這些序列的pSuper載體,得到pSUPER_GFP_466, pSUPER-GFP-489, pSUPER-GFP-507,pSUPER-GFP-754 或作為對照的 pSUPER-GFP。使用熒光 定量PCR檢測干擾的有效性。利用Qiagen公司的RNeasy Mini Kit試劑盒提取轉(zhuǎn)染不同質(zhì) 粒293T細(xì)胞(獲自ATCC)的總RNA。取5 μ g總RNA使用Invitrogen公司的SuperScript III first-strand synthesis system試劑盒完成RNA的反轉(zhuǎn)錄。隨后的定量PCR實驗是 使用Qiagen公司的QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒,在ABI7500機(jī)器上完成。人的 β-actin持家基因作為對照。CCNY和β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線是分別pB42AD_Cyclin Y(酵 母雙雜交篩選人腦cDNA文庫獲得)和pRFP-actin (獲自Contech)為模板,設(shè)立5個稀釋 滴度,通過三次平行實驗建立。通過Primerbank的幫助,設(shè)計和使用如下Cyclin Y引物Cyclin Y 引物 1-F :5,-tcaatccttcagatcatcctcgg-3,(SEQ ID NO 8);Cyclin Y 引物 I-R :5,-tggttgactgactgtgctatca-3,(SEQ ID NO 9);Cyclin Y 弓丨物 2_F:5,-gaccgggagaacatagacga-3,(SEQ ID NO 10);
0143]Cyclin Y 引物 2_R :5,-aaatggtggagcaggaactg-3,(SEQ ID N0:11)。Actin則使用如下引物ACTIN. F 5' -gctccggcatgtgcaa—3,(SEQ ID NO 12);ACTIN. R :5,_aggatcttcatgaggtagt_3,(SEQ ID NO 13)。酵母雙雜交的方式鑒定蛋白的相互作用挑取1 3個2 3mm直徑的EGY48酵母(購自Clontech)菌落與50ml YPD (或?qū)?yīng)的營養(yǎng)篩選SD)培養(yǎng)基中;30°C 300rpm培養(yǎng)到穩(wěn)定態(tài)(0D600 > 1. 5);轉(zhuǎn)接到另一瓶 50ml YPD (或?qū)?yīng)的營養(yǎng)篩選SD)培養(yǎng)基中,0D600 = 0. 2 0. 3 ;30°C 300rpm培養(yǎng)約三個 小時,0D600 = 0. 4 0. 6時取出。室溫離心4000rpm 3min,棄上清,細(xì)胞重懸于25ml無菌 水中;室溫離心4000rpm 3min,棄上清;重懸于1. 5ml ρΗ7· 51ΧΤΕ/0. IMLiAc中。準(zhǔn)備PEG/ LiAc溶液;在1. 5ml Eppendof管中依次加入酵母質(zhì)粒0. 1 μ g(如果共轉(zhuǎn)化,則每種質(zhì)粒各 加入0. 1 μ g),10 μ 1 10mg/ml魚精DNA,混勻;加入0. Iml酵母感受態(tài)細(xì)胞和0. 6ml PEG/ LiAc,振蕩混勻;30°C 200rpm培養(yǎng)30min ;42°C熱沖擊15min,期間不時輕輕搖勻;冰浴1 2min ;高速離心15s,吸掉上清,用0. 2ml TE重懸細(xì)胞;涂布于適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)篩選SD平板上。 取一張Whatman濾紙,覆蓋于相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基上(碳源為半乳糖),用滅菌牙簽從選擇 性培養(yǎng)基平板上挑取酵母轉(zhuǎn)化子菌落(直徑1 2mm)點到濾紙上,30°C培養(yǎng)2天,然后取出 小心浸入液氮中(菌落面朝上),約半分鐘后取出,置室溫幾分鐘,將濾紙(菌落面朝上)放 于用 Z buffer/X-gal 溶液(100ml Zbuffer 中加入 1. 67ml 20g/L 的 X_gal,0. 27ml β -巰 基乙醇;Z buffer含6(kimoVLNa2HPO4,40mmol/L NaH2PO4, IOmmo 1/L KCl,lmmol/L MgSO4)預(yù) 濕的濾紙上,30°C培養(yǎng)0. 5 8h,檢驗菌落是否顯藍(lán)色,8h內(nèi)顯藍(lán)色的菌落β -半乳糖苷酶 活性為陽性。免疫共沉淀和激酶活性檢測實驗轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的哺乳細(xì)胞培養(yǎng)24-48小時,棄去細(xì)胞培養(yǎng)液,用PBS洗兩次。在RIPA 裂解液(50mM Tris-HCl pH 7. 5, ImM EDTA, 50mM NaCl,0. 5%NP-40, ImM EDTA)中補(bǔ)加各種 蛋白酶抑制劑,按60mm培養(yǎng)皿0. 5ml, IOOmm培養(yǎng)皿Iml的用量將裂解液均勻覆蓋在細(xì)胞表 面,在冰上放置20分鐘;然后刮下細(xì)胞,收集到1. 5ml離心管中,超聲4°C,12000rpm離心10 分鐘,上清即為細(xì)胞裂解液。按需要分裝成小份,保存于-80°C。當(dāng)從小鼠組織中提取總蛋 白時,取200mg組織,用2ml的PBS溶液洗滌后棄去上清,沉淀重懸于2ml的PBS溶液,將組 織勻漿后,IOOOg離心5分鐘,去掉上清,沉淀再重懸于RIPA裂解液中,超聲。在4°C 14000g 條件下離心lOmin,棄沉淀,上清即為組織裂解液。取500 μ 1細(xì)胞抽提物,加入25 μ 1床體積的蛋白G瓊脂糖珠,在4°C旋轉(zhuǎn)混合1小 時后低速離心,吸取上清加入5 μ g相應(yīng)的單抗,在4°C旋轉(zhuǎn)混合1小時,然后加入30 μ 1床 體積的蛋白G瓊脂糖珠,繼續(xù)混合2小時。用于Western Blot的免疫共沉淀物用裂解液洗滌五次,然后重懸在2X蛋白質(zhì)電 泳上樣緩沖液中,進(jìn)行SDS-PAGE電泳。用濕法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,用含5% 脫脂奶粉的TBS-T溶液封閉膜2-3小時,一抗4°C結(jié)合過夜。用TBS-T室溫洗膜1次,5分 鐘。用相應(yīng)的二抗于室溫結(jié)合1小時,再用TBS-T洗膜四次,每次5分鐘,用吸水紙吸盡多 余的液體,用SuperSignal ECL試劑顯色。用于激酶實驗的免疫共沉淀物,用裂解液洗滌三次,再用洗滌液(50mM HEPESpH 7. 5, ImM DTT)洗滌一次,離心,去上清。用 25 μ 1 反應(yīng)體系(50mM HEPES pH7. 5,ImM DTT, IOmM)將免疫沉淀的產(chǎn)物重懸,在30°C反應(yīng)30分鐘,加入SDS-PAGE上樣緩沖液阻斷反應(yīng), 進(jìn)行SDS-PAGE電泳,放射顯影。CCNY多克隆抗體的制備用引物5,-GATGGATCCAAGATGGGGAACACTACCTC-3,(SEQID NO 14),5,-ATACTCGAG CTCCGTAGTTAAGAGATGATG-3,(SEQ ID NO 15),以利用雙雜交篩選人腦CDNA文庫所獲的CCNY全長cDNA片段為模板,PCR擴(kuò)增CCNY基因的全長開放閱讀框,在其上下游分別引入BamHl/ Xhol酶切位點,將CCNY基因的全長開放閱讀框插入到pET28a(+)(購自MERCK)載體多克 隆位點的BamHl/Xhol酶切位點之間,構(gòu)建成為pET28a_CCNY質(zhì)粒。導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)菌株 BL21,0. ImMIPTG誘導(dǎo)3h,表達(dá)的His-CCNY融合蛋白大部分集中在包涵體中,因此取沉淀。 沉淀分別用1M,2M,4M尿素裂解緩沖液洗一次,然后于4°C 14000rpm離心20分鐘,棄上清。 沉淀用5XSDS蛋白緩沖液變性,8% SDS-PAGE膠分離,考馬斯亮蘭染色,將目的條帶,割膠 分離,電洗脫,洗脫液用作抗原,然后按照常規(guī)方法免疫兔子,獲得CCNY蛋白的抗體,經(jīng)驗 證發(fā)現(xiàn),該抗體結(jié)合CCNY的特異性良好(圖4A)。亞細(xì)胞定位檢測質(zhì)粒經(jīng)Qiaqen公司Plasmid Midi Kit純化后,用磷酸鈣法或者脂質(zhì)體法轉(zhuǎn) 染細(xì)胞,質(zhì)粒用量為20 μ g/Φ IOcm皿。培養(yǎng)48h。棄去培養(yǎng)液,用PBS洗滌細(xì)胞1次, 以4%多聚甲醛(paraformaldehyde)固定細(xì)胞20min ;用PBS洗滌細(xì)胞1次;用0. TritonX-IOO 處理 5min 后,細(xì)胞在 1 μ g/ml DAPI (4,,6-diamidino-2_phenylindole)中 進(jìn)行細(xì)胞核染色5min ;免疫熒光實驗時需要在含有0. 1% Triton X-100和5% BSA的PBS 溶液中封閉1小時,接著將anti-Myc (Santa Cruz,l 150稀釋)抗體加入1 % BSA的 PBS溶液中雜交3小時,用PBS洗滌細(xì)胞3次,每次5分鐘,接著孵育FITC或TRITC耦聯(lián) 的二抗(Sigma,1 400稀釋)1小時,再次用PBS洗滌細(xì)胞3次;再在lyg/mlDAPlG’, 6-diamidino-2-phenylindole)中進(jìn)行細(xì)胞核染色5min。用鑷子將盛有細(xì)胞的蓋玻片從培 養(yǎng)皿中揭起,置于暗房中晾干;用ProLong antifade (Invitrogen)將蓋玻片固定在載玻片 上,在暗房晾干;使用熒光顯微鏡在不同波長紫外光光源下觀察并拍照。載體構(gòu)建插入CCNY片段的雙雜交的表達(dá)質(zhì)粒(PB42AD-CCNY)的是本發(fā)明人篩選人腦cDNA 文庫時,直接獲得的含有CCNY基因的全長開放閱讀框的表達(dá)質(zhì)粒。PEGFPN3-CCNY的構(gòu)建如下以pB42AD_CCNY為模板,利用以下引物5,-CCGCTCGAGAGATGGGGAACACTACCTCGTGCT-3,(SEQ ID NO 16);5,-CGCGGATCCAGAGATGATGGCTGGGGACCA-3,(SEQ ID NO 17);PCR擴(kuò)增CCNY基因的全長開放閱讀框,在其上下游分別引入XhoI/BamHI酶切位 點,將CCNY基因的全長開放閱讀框插入到pEGFPN3 (購自Clontech)載體多克隆位點的 XhoI/BamHI酶切位點之間,構(gòu)建成為pEGFPN3_CCNY表達(dá)質(zhì)粒。插入片段經(jīng)測序確證。分別含有466序列、489序列、507序列、754序列、942序列的pSuper (獲自 Oligoengine)載體的構(gòu)建如下化學(xué)合成針對CCNY的發(fā)夾狀的寡核苷酸正反向各64個堿 基,將其退火形成雙鏈,插入到PSuper載體多克隆位點的Bglll/Hindlll酶切位點之間,構(gòu) 建相應(yīng)的RNAi質(zhì)粒。466序列、489序列、507序列、754序列、942序列對應(yīng)的CCNY的發(fā)夾 狀的寡核苷酸64個堿基的正反序列如下466 正向核苷酸片段(SEQ ID NO 18)5’ GATCCCCGAAGTGCCACCAGATTATGTTCAAGAGACATAATCTGGTGGCACTTCTTTTTA 3’ ;466 反向核苷酸片段(SEQ ID NO 19)5, AGCTTAAAAAGAAGTGCCACCAGATTATGTCTCTTGAACATAATCTGGTGGCACTTCGGG 3’ ;489 正向核苷酸片段(SEQ ID NO 20)
5’ GATCCCCACACAACCCAGAGCAGAAGTTCAAGAGACTTCTGCTCTGGGTTGTGTTTTTTA 3’ ;489 反向核苷酸片段(SEQ ID NO 21)5, AGCTTAAAAAACACAACCCAGAGCAGAAGTCTCTTGAACTTCTGCTCTGGGTTGTGTGGG 3,;507 正向核苷酸片段(SEQ ID NO 22)5’ GATCCCCGCAGATTTACCGGTTCGTTTTCAAGAGAAACGAACCGGTAAATCTGCTTTTTA 3’ ;507 反向核苷酸片段(SEQ ID NO 23)5, AGCTTAAAAAGCAGATTTACCGGTTCGTTTCTCTTGAAAACGAACCGGTAAATCTGCGGG 3’ ;754 正向核苷酸片段(SEQ ID NO 24)5’ GATCCCCCTAGAGCGACAGTTTCTTGTTCAAGAGACAAGAAACTGTCGCTCTAGTTTTTA 3’ ;754 反向核苷酸片段(SEQ ID NO 25)5, AGCTTAAAAACTAGAGCGACAGTTTCTTGTCTCTTGAACAAGAAACTGTCGCTCTAGGGG 3,;942 正向核苷酸片段(SEQ ID NO 26)5’ GATCCCCGGACCTAAGAAGATCCGCGTTCAAGAGACGCGGATCTTCTTAGGTCCTTTTTA 3’ ;942 反向核苷酸片段(SEQ ID NO 27)5 ’ AGCTTAAAAAGGACCTAAGAAGATCCGCGTCTCTTGAACGCGGATCTTCTTAGGTCCGGG3’。插入PFTKl片段的雙雜交的表達(dá)質(zhì)粒(PB42AD-PFTK1)的構(gòu)建如下通過兼并PCR 的方式獲得編碼PFTKl完整開放閱讀框的cDNA,以此為模版,利用引物5,-GACTGAATTCATGTGTGACCTCATTGAGCCGCAGCCGGC-3,(SEQ ID NO 28);5,-GACTGGATCCTGCTCTTGAGATTGTGCTGCTTGTCAGTG-3,(SEQ ID NO 29);PCR擴(kuò)增PFTKl基因的全長開放閱讀框,在其上下游分別引入EcoRI/BamHl酶切位 點,將PFTKl基因的全長開放閱讀框插入到pEGFPC2載體(購自Clontech)多克隆位點的 EcoRI/BamHl酶切位點之間,構(gòu)建成為pEGFPC2_PFTKl質(zhì)粒。插入片段經(jīng)測序確證。插入PFTKl片段的雙雜交的表達(dá)質(zhì)粒(pGiIda-PFTKl)的構(gòu)建如下將 PEGFPC2-PFTK1質(zhì)粒以EcoRI和BamHl雙酶切,得到PFTKl基因的全長開放閱讀框的帶有粘 性末端的的片段,將該片段插入到PGilda載體多克隆位點的EcoRI/BamHl酶切位點之間, 構(gòu)建成為融合蛋白酵母系統(tǒng)表達(dá)質(zhì)粒pGilda-PFTK,PFTKl基因的閱讀框與LexA的一致。包含PFTKl突變體的表達(dá)載體的構(gòu)建如下基于前述構(gòu)建pGiIda-PFTKl,采用常 規(guī)的定點突變方法,將其中對應(yīng)于編碼PFTKl氨基酸序列N端第119位和282位S的密碼 子突變?yōu)榫幋aA的密碼子(PFTK1 S119A/S282A);將其中對應(yīng)于編碼PFTKl氨基酸序列N端 第164位K的密碼子突變?yōu)榫幋aR的密碼子(PFTK1 K164R);將其中對應(yīng)于編碼PFTKl氨 基酸序列N端第176位F的密碼子缺失突變(PFTK1 F176 Δ );將其中對應(yīng)于編碼PFTKl氨 基酸序列N端第224位H的密碼子突變?yōu)榫幋aN的密碼子(PFTK1 Η224Ν);將其中對應(yīng)于 編碼PFTKl氨基酸序列N端第246位D的密碼子突變?yōu)榫幋aA的密碼子(PFTK1 D256A)。包含CCNY突變體的表達(dá)載體的構(gòu)建如下以PB42AD-CCNY為模板,利用引物5,-GATGGATCCAGATGGGGAACACTACCTC-3,(SEQ ID NO 30);5,-GATCTCGAGTAAGAGATGATGGCTGGGGAC-3,(SEQ ID NO 31);PCR擴(kuò)增CCNY基因的全長開放閱讀框,在其上下游分別引入BamHl/Xhol酶切位 點,將CCNY基因的全長開放閱讀框插入到pGilda載體(購自Clontech)的多克隆位點的 BamHl/Xhol酶切位點之間,構(gòu)建成為pGilda_CCNY表達(dá)質(zhì)粒。
以PB42AD-CCNY為模板,利用引物5,-GTACTCGAGATGGAATTCAATCCTTCAGATCATCC-3,(SEQ ID NO 32);5,-GATCTCGAGTAAGAGATGATGGCTGGGGAC-3,(SEQ ID NO 33);PCR擴(kuò)增編碼CCNY氨基酸序列55-341之間序列的片段,插入到pGilda載體的多 克隆位點的EcoRI/Xhol酶切位點之間,構(gòu)建成為pGiIda-CCNY(55-341)表達(dá)質(zhì)粒。以PB42AD-CCNY為模板,利用引物5,-ATAGAATTCCTCTTCATTAACCATCATC-3,(SEQ ID NO 34);5,-GATCTCGAGTAAGAGATGATGGCTGGGGAC-3,(SEQ ID NO 35);擴(kuò)增編碼CCNY 84-341之間序列的片段,插入到pGi 1 da載體的多克隆位點的 EcoRI/Xhol酶切位點之間,構(gòu)建成為pGiIda-CCNY(84-341)表達(dá)質(zhì)粒。以pB42AD-CCNY為模板,利用引物5,-ATAGAATTCGATGGAAGGATGCTCTTAG-3,(SEQ ID NO 36);5,-GATCTCGAGTAAGAGATGATGGCTGGGGAC-3,(SEQ ID NO 37);擴(kuò)增編碼CCNY 137-341之間序列的片段,插入到pGilda載體的多克隆位點的 EcoRI/Xhol酶切位點之間,構(gòu)建成為pGiIda-CCNY(137-341)表達(dá)質(zhì)粒。以pGilda-CCNY為模板,利用引物5,-CGTCAGCAGAGCTTCACCATT-3,(SEQ ID NO 38);5,-GATGGATCCGTTCAAATCGTCTATGTTCTCC-3,(SEQ ID NO 39);擴(kuò)增編碼CCNY 1-54之間序列的片段,插入到pGilda載體的多克隆位點的EcoRI/ BamHl酶切位點之間,構(gòu)建成為pGiIda-CCNY(1_54)表達(dá)質(zhì)粒。 以pB42AD-CCNY為模板,利用引物5,-GATGGATCCAGATGGGGAACACTACCTC-3,(SEQ ID NO 40);5,-ATACTCGAGGTCTTTCAGGATCTGGCAG-3,(SEQ ID NO 41);擴(kuò)增編碼CCNY 1-243之間序列的片段,插入到pGilda載體的多克隆位點的 BamHl/Xhol酶切位點之間,構(gòu)建成為pGilda-CCNY(l_243)表達(dá)質(zhì)粒。以pB42AD-CCNY為模板,利用引物5,-GATGGATCCAGATGGGGAACACTACCTC-3,(SEQ ID NO 42);5,-CGACTCGAGCTCGCAGAGGCGAGAGATG-3,(SEQ ID NO 43);擴(kuò)增編碼CCNY 1-310之間序列的片段,插入到pGilda載體的多克隆位點的 BamHl/Xhol酶切位點之間,構(gòu)建成為pGilda-CCNY(l_310)表達(dá)質(zhì)粒。以pB42AD-CCNY為模板,利用引物5,-GATGGATCCAGATGGGGAACACTACCTC-3,(SEQ ID NO 44);5,-GATGGTACCCGAAAGAGGGTGAAGATTTTCATC-3,(SEQ ID NO 45);擴(kuò)增編碼CCNY 1-153之間序列的片段,插入到pGilda載體的多克隆位點的 BamHl/Kpnl酶切位點之間,構(gòu)建成為pGiIda-CCNY(1-153)表達(dá)質(zhì)粒。以pB42AD-CCNY為模板,利用引物5,-GATGGTACCGAAAGACTTTTAACATACGCAGAG-3,(SEQ ID NO 46);5,-GATCTCGAGTAAGAGATGATGGCTGGGGAC-3,(SEQ ID NO 47);擴(kuò)增編碼CCNY 196-341之間序列的片段,插入到pGiIda-CCNY(1_153)載體的Kpnl/Xhol酶切位點之間,構(gòu)建成為pGilda-CCNYA (154-195)表達(dá)質(zhì)粒。pEGFPC2-PFTKl (表達(dá)GFP-PFTK1的表達(dá)載體)的構(gòu)建如下利用引物5,-GACTGAATTCATGTGTGACCTCATTGAGCCGCAGCCGGC-3,(SEQ ID NO 48);5,-GACTGGATCCTGCTCTTGAGATTGTGCTGCTTGTCAGTG-3,(SEQ ID NO 49);PCR擴(kuò)增PFTKl基因的全長開放閱讀框,在其上下游分別引入EcoRI/BamHl酶切位 點,將PFTKl基因的全長開放閱讀框插入到pEGFPC2載體多克隆位點的EcoRI/BamHl酶切 位點之間,構(gòu)建成為PEGFPC2-PFTK1質(zhì)粒。插入片段經(jīng)測序確證。 pMgcN3-CCNY (表達(dá)CCNY-Myc的表達(dá)載體)的構(gòu)建如下利用引物5,-CCGCTCGAGAGATGGGGAACACTACCTCGTGCT-3,(SEQ ID NO 50);5,-CGCGGATCCAGAGATGATGGCTGGGGACCA-3,(SEQ ID NO 51);PCR擴(kuò)增CCNY基因的全長開放閱讀框,在其上下游分別引入XhoI/BamHl酶切位 點,將CCNY基因的全長開放閱讀框插入到pMycN3載體(將pEGFPN3質(zhì)粒中標(biāo)簽蛋白GFP 替換為標(biāo)簽蛋白Myc改造成pMycN3載體)多克隆位點的XhoI/BamHl酶切位點之間,構(gòu)建 成為pMycN3-CCNY表達(dá)載體。插入片段經(jīng)測序確證。pEGFPN3-G2A的構(gòu)建如下基于前述構(gòu)建pEGFPN3_CCNY,采用常規(guī)的定點突變方 法,將其中對應(yīng)于編碼CCNY氨基酸序列N端第2位G的密碼子突變?yōu)榫幋aA的密碼子。pEGFPN3-N3A的構(gòu)建如下基于前述構(gòu)建pEGFPN3_CCNY,采用常規(guī)的定點突變方 法,將其中對應(yīng)于編碼CCNY氨基酸序列N端第3位N的密碼子突變?yōu)榫幋aA的密碼子。pEGFPC2-CCNY的構(gòu)建如下以pB42AD_CCNY為模板,利用引物5,-GATGGTACCAGATGGGGAACACTACCTCGTGC-3,(SEQ ID NO 52);5,-CGCGGATCCAGAGATGATGGCTGGGGACCA-3,(SEQ ID NO 53);PCR擴(kuò)增cylcinY基因的全長開放閱讀框,在其上下游分別引入Kpnl/BamHl酶切 位點,將cylcinY基因的全長開放閱讀框插入到pEGFPC2載體(購自Clontech)多克隆位 點的Kpnl/BamHl酶切位點之間,構(gòu)建成為pEGFPC2_cyclinY質(zhì)粒。II、實施例實施例1、CCNY基因的轉(zhuǎn)錄CCNY是本發(fā)明人利用酵母雙雜交的方法篩選得到的一個能與PFTKl相互作用的 蛋白,它屬于細(xì)胞周期因子家族中的一名新成員。本發(fā)明人以CCNY基因為模板來標(biāo)記探針,進(jìn)行雜交實驗,Northern雜交檢測到 CCNY大小分別為4. Okb和2. Okb的兩個轉(zhuǎn)錄本。在檢測的16個人組織(各組織代號如下 He為心臟;Br為腦;PL為胎盤;Lu為肺;Li為肝臟;SM為骨骼肌;Ki為腎;Pa表示胰腺;Sp 為脾;Th為胸腺;Pr為前列腺;Te為睪丸;Ov為卵巢;SI為小腸;Co為結(jié)腸;PBL為外周血 白細(xì)胞)中,4. Okb轉(zhuǎn)錄本呈組成性低水平表達(dá),然而2. Okb轉(zhuǎn)錄本則有所不同,它在不同組 織中的表達(dá)量差異很大,在睪丸中大量表達(dá),在心臟和骨骼肌中也有較高的表達(dá)量,而在其 他組織中卻表達(dá)量很低(圖1A)。本發(fā)明人以CCNY基因5’端162個核苷酸作為模板來標(biāo)記探針,進(jìn)行雜交實驗, 檢測CCNY基因在不同細(xì)胞系中的表達(dá)情況。雜交實驗結(jié)果表明,在這幾種細(xì)胞系中都有 4. Okb和2. Okb兩個CCNY轉(zhuǎn)錄本。雖然CCNY在各個細(xì)胞系中都有轉(zhuǎn)錄(圖1B),但是在大 部分細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄量都較低,只有在肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞中能檢測到高的轉(zhuǎn)錄量。
實施例2、CCNY影響細(xì)胞周期的進(jìn)展從結(jié)構(gòu)上分析,CCNY蛋白是Cyclin家族的成員,從功能上分析,CCNY參與對細(xì)胞 周期的調(diào)控。將構(gòu)建CCNY的真核表達(dá)載體pEGFPN3-CCNY并將它和空載體pEGFPN3 (購自 Clontech)分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,培養(yǎng)48小時后進(jìn)行流式細(xì)胞分析,分析過量表達(dá)CCNY對細(xì) 胞周期的影響。結(jié)果表明,外源性過量表達(dá)CCNY的細(xì)胞S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)目增多,S 期細(xì)胞數(shù)目從32%增加到41%,G2/M細(xì)胞數(shù)目從8%增加到16%,而Gl細(xì)胞數(shù)目由58% 降到41% (圖2A)。本發(fā)明人在其它細(xì)胞株中也檢測到相似的趨勢變化。以H印3B細(xì)胞(獲自中國科 學(xué)院細(xì)胞庫)作為實驗對象,將真核表達(dá)載體PEGFPN3-CCNY轉(zhuǎn)染!fep3B細(xì)胞或H印G2細(xì) 胞,分析過量表達(dá)CCNY對細(xì)胞周期的影響。與對照相比,過表達(dá)CCNY之后,!fep3B細(xì)胞處于 G2/M期的細(xì)胞從19. 90%增加到29. 16% (圖2B) ;HepG2細(xì)胞處于S期的細(xì)胞從18. 11% 增加到25. 01% (圖2C)。結(jié)果表明,過表達(dá)CCNY能夠改變細(xì)胞周期的分布,提示CCNY在 調(diào)控細(xì)胞周期的過程中發(fā)揮作用。本發(fā)明人通過基因沉默的手段抑制內(nèi)源性CCNY在293T細(xì)胞中的表達(dá)。在293T細(xì) 胞中轉(zhuǎn)染目的siRNA載體(466,489,507,754和942)或者作為對照的siRNA (pSuper-GFP) 載體,培養(yǎng)48小時后,收獲細(xì)胞,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR試驗,結(jié)果表明 466-si,489-si,507-si和754-si都能有效抑制CCNY在293T細(xì)胞中的表達(dá)(圖2D)。選 用507-si來進(jìn)行進(jìn)一步的研究,它可以將CCNY的mRNA水平降低60%以上(圖2E)。507-si轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞,培養(yǎng)24小時后,通過雙胸腺嘧啶脫氧核苷 (DoubleThymidine)阻斷的方法把細(xì)胞同步化于G1/S期,釋放細(xì)胞后,每隔1小時胰酶消 化,收取細(xì)胞,碘化丙啶染色后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。結(jié)果表明G2/M過渡期的細(xì)胞進(jìn) 程受到抑制(圖2F)。接著用507-si轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,培養(yǎng)24小時后,通過600ng/ml Nocodazole將細(xì) 胞同步化于M期,釋放細(xì)胞,每隔2小時胰酶消化,收取細(xì)胞,碘化丙啶染色后通過流式細(xì)胞 儀進(jìn)行分析。結(jié)果表明G1/S過渡期的細(xì)胞進(jìn)程受到抑制(圖2G)。本發(fā)明人進(jìn)一步用G418篩選出了穩(wěn)定表達(dá)507_siRNA和對照空載體siRNA的細(xì) 胞株,抽提總蛋白后進(jìn)行Western檢測,結(jié)果顯示與對照相比507-si穩(wěn)定株中CCNY蛋白水 平得到了顯著的下調(diào)(圖2H)。用0. 5mM Mimosine分別處理細(xì)胞24小時,使其同步化于 Gl期,釋放后,在不同的時間點收取細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析。結(jié)果顯示釋放11個小時之后 對照組細(xì)胞大部分進(jìn)入了 S期,而CCNY RNAi組細(xì)胞在13個小時后才大部分進(jìn)入S期,此 時對照組細(xì)胞已有一部分進(jìn)入G2/M期了(圖21)。說明RNAi CCNY能夠抑制細(xì)胞從Gl期 進(jìn)入S期,揭示了 CCNY具有促進(jìn)細(xì)胞從Gl期向S期轉(zhuǎn)化的功能。圖2F,圖2G和圖21都說 明,利用RNAi下調(diào)細(xì)胞內(nèi)CCNY水平,并分別把細(xì)胞同步化于G1/S期,M期或Gl期,都能減 慢細(xì)胞周期的進(jìn)程。綜合上述結(jié)果,表明CCNY對于細(xì)胞周期的進(jìn)程有作用。實施例3、CCNY與PFTKl的結(jié)合作用為了驗證PFTKl與CCNY的相互作用,將插入PFTKl片段和CCNY片段的兩種雙雜 交的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母受體菌EGY48 (獲自Clontech),通過檢測共轉(zhuǎn)化子的β _半乳糖 苷酶活力檢測它們在酵母雙雜交系統(tǒng)的相互作用,結(jié)果顯示CCNY能與PFTKl結(jié)合(圖3Α)。
為了進(jìn)一步證實CCNY與PFTKl的相互作用,本發(fā)明人運(yùn)用免疫共沉淀的方法研究 內(nèi)源性的CCNY與內(nèi)源性的PFTKl在老鼠腦組織中的相互作用,結(jié)果證實二者在小鼠腦組織 中能夠結(jié)合(圖3B)。為了確定CCNY上與PFTKl結(jié)合的區(qū)域,本發(fā)明人用PCR的方法構(gòu)建CCNY (位點計 算參照GenBank登錄號AY504868公開的序列)的各種突變體到雙雜交的表達(dá)載體pGilda 上,在酵母雙雜交系統(tǒng)中分別檢測它們與PB42AD-PFTK1的相互作用,結(jié)果表明cyclin box 結(jié)構(gòu)域?qū)烧叩南嗷プ饔檬种匾?,而N端和C端的區(qū)域的缺失并不影響CCNY與PFTKl的 結(jié)合(圖3C)。盡管cyclin box兩側(cè)的序列也是CCNY與PFTKl結(jié)合所需要的,但這些序列 可能只是在維持cyclin box的正常結(jié)構(gòu)中起作用。PFTKl是一個⑶K分子,分析PFTKl的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),像其它⑶K分子一樣,在PFTKl從 第135-430 (位點計算參照GenBank登錄號AF119833公開的序列)約300個氨基酸的這 個保守的激酶催化結(jié)構(gòu)域區(qū)段中可以預(yù)測到許多潛在的功能結(jié)構(gòu)域和活性位點,比如,ATP 結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Ser/Thr激酶活性位點和PSTAIRE基序(圖3D)。針對PFTKl上這些預(yù)測的 功能位點,本發(fā)明人構(gòu)建了一系列的突變。其中包括=PFTKl的PFTAIRE序列中的苯丙氨酸 Phe (F)缺失的突變體F176A,突變了 14_3_3相互作用位點的突變體S119A/S282A(第119 位由S突變?yōu)锳/第282位由S突變?yōu)锳),預(yù)測的ATP結(jié)合位點突變了的突變體K164R(第 164位由K突變?yōu)镽),預(yù)測的亞鐵血紅素結(jié)合位點突變了的突變體H224N(第224位由H突 變?yōu)镹),以及預(yù)測的激酶活性位點突變了的突變體D256A (第256位由D突變?yōu)锳)(圖3D), 將這些突變體構(gòu)建到雙雜交的表達(dá)載體PGilda中,在酵母雙雜交系統(tǒng)中分別檢測它們與 PB42AD-CCNY的相互作用,結(jié)果表明除了 F176A外,剩余的這些突變體均不影響PFTKl與 CCNY的相互作用(圖3D)。在酵母雙雜交系統(tǒng)中,只有PFTKl的F176 Δ突變體不能與CCNY 相互作用,從而證明了 PFTAIRE序列是參與結(jié)合CCNY的重要位點(圖3D)。本發(fā)明人同時 證明了 PFTAIRE序列是一個CCNY特異的結(jié)合位點,因為PFTAIRE序列中的苯丙氨酸的缺失 并不能影響PFTKl與其它蛋白比如14-3-3的結(jié)合,CCNY含有一個cyclin box結(jié)構(gòu)域,而 這個結(jié)構(gòu)域是Cyclin結(jié)合并激活⑶K所必需。實施例4、CCNY是PFTKl的調(diào)控亞基利用細(xì)胞組分分離的方法,本發(fā)明人檢測了內(nèi)源性PFTKl在睪丸組織中的表達(dá)情 況。結(jié)果表明,內(nèi)源的PFTKl和CCNY主要定位于睪丸組織的細(xì)胞膜和胞質(zhì)中,只有極少部 分能存在于細(xì)胞核內(nèi)(圖4B)。所用CCNY抗體(anti-CCNY)為多克隆抗體,它的特異性檢 測如圖4A所示。本發(fā)明人通過熒光定位的方式觀察外源性PFTKl (GFP-PFTK1)或CCNY融合蛋白 (CCNY-Myc)在293T細(xì)胞內(nèi)單獨表達(dá)時的定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與內(nèi)源性PFTKl不同,外源性表 達(dá)的PFTKl融合蛋白只能定位于胞質(zhì)中,而外源性表達(dá)的CCNY融合蛋白則定位于細(xì)胞膜 上,提示在體內(nèi)PFTKl的膜定位極受到CCNY的調(diào)控(圖4C)。為了檢驗以上假設(shè),本發(fā)明人通過熒光定位的方式觀察外源性PFTKl (GFP-PFTK1) 或CCNY融合蛋白(CCNY-Myc)在細(xì)胞內(nèi)共同表達(dá)時的亞細(xì)胞定位。盡管單獨表達(dá)的 GFP-PFTK1融合蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中,而單獨表達(dá)的CCNY-Myc融合蛋白則基本結(jié)合在膜上 (圖4C);一旦將CCNY融合蛋白和PFTKl融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)共同表達(dá),它們會呈現(xiàn)出明顯的 共定位于膜上的現(xiàn)象(圖4D)。
CCNY-PFTK1的亞細(xì)胞定位分析的結(jié)果揭示該復(fù)合可能作用的活性空間,對進(jìn)一步 研究它們的功能,尋找它們的作用底物提供了線索。Cyclin分子可以調(diào)控⑶K的亞細(xì)胞定位,更是Cdk蛋白激酶活性和底物的專一性 方面所必需的。因而本發(fā)明人檢測了 CCNY對PFTKl的激酶活性的調(diào)控。本發(fā)明人通過免 疫沉淀和Western blot分析的方式發(fā)現(xiàn)小鼠腦組織中內(nèi)源性的CCNY的絲氨酸位點上存在 磷酸化(圖5A)。而當(dāng)本發(fā)明人將pEGFPC2-PFTKl和pMgcN3_CCNY在293T細(xì)胞共同表達(dá)時,發(fā)現(xiàn) CCNY的這種絲氨酸磷酸化在PFTKl存在下被明顯增強(qiáng)(圖5B)。上述結(jié)果表明CCNY發(fā)生絲氨酸磷酸化,并且這種磷酸化在PFTKl的存在下被明顯 增強(qiáng)。PFTKl除了可以增強(qiáng)CCNY的磷酸化外,它對其它底物的激酶活性也受到CCNY的 調(diào)控。通過免疫共沉淀和激酶實驗檢測CCNY對PFTKl激酶活性的影響,結(jié)果表明在CCNY 存在時,PFTKl對Rba37的磷酸化作用增強(qiáng)(圖5C)。同時本發(fā)明人在該激酶實驗也檢測到 PFTKl自身的磷酸化,并且發(fā)現(xiàn)CCNY會使它的自身磷酸化水平增強(qiáng)(圖5C)。綜合以上結(jié)果,可以得出,CCNY是一個PFTKl的調(diào)控亞基,它可以調(diào)控PFTKl的亞 細(xì)胞定位,并增強(qiáng)PFTKl的激酶活性。實施例5、CCNY與細(xì)胞膜的結(jié)合是由肉桂?;揎棝Q定CCNY的膜定位現(xiàn)象引起了本發(fā)明人的注意,蛋白定位于膜上的方式通常有兩種 自身存在能定位到膜上的信號;或者與其它蛋白結(jié)合后被定位到膜上。對CCNY的蛋白序列 分析后,本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在它的N端存在一個潛在的肉桂?;揎椢稽c(圖6A)。提示由于肉 桂酰化的修飾影響了 CCNY蛋白的亞細(xì)胞定位,導(dǎo)致CCNY能夠結(jié)合在細(xì)胞膜上。為了檢驗CCNY是不是因為肉桂?;ㄎ挥谀ど?,本發(fā)明人利用PCR方法,構(gòu)建 了兩個CCNY點突變的表達(dá)質(zhì)粒編碼CCNY氨基酸序列第2位Gly突變成Ala的表達(dá)載體 PEGFPN3-G2A和編碼CCNY氨基酸序列第3位N突變成A的表達(dá)載體pEGFPN3_N3A。這兩個 突變體的熒光定位實驗結(jié)果表明,第2位氨基酸突變的突變體G2A完全喪失了與膜結(jié)合的 功能,只能彌散在胞質(zhì)并大量聚集于細(xì)胞核。第3位氨基酸突變的突變體N3A顯示出與野 生型CCNY相似的定位,表明這種膜結(jié)合能力的喪失完全是第2位Gly特異性的(圖6B)。同時本發(fā)明人構(gòu)建了 pEGFPC2-CCNY表達(dá)質(zhì)粒,在這個載體中,CCNY蛋白的N端融 合了一個GFP蛋白,從而可以屏蔽肉桂?;男揎椢稽c。對PEGFPC2-CCNY表達(dá)的蛋白進(jìn)行 定位分析,結(jié)果表明,與G2A突變體相同,GFP-CCNY蛋白只能彌散在胞質(zhì)并大量聚集于細(xì)胞 核(圖6B)。為了充分證明這一點,本發(fā)明人對轉(zhuǎn)染了 pEGFPN3-G2A和pEGFPN3_CCNY的293T 細(xì)胞進(jìn)行組分分離試驗,將分離的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜組分進(jìn)行Western blot檢測,結(jié)果表明 只CCNY能在膜組分中檢測到(圖6C)。以上實驗充分證明,CCNY是一個由于肉桂酰化修飾定位于膜上的蛋白。N-肉桂 酰化是一個重要的不可逆修飾。但是在某些條件下,比如PH的改變,鈣離子的結(jié)合或其他 蛋白的結(jié)合等等,蛋白的結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變,N端的myristoyl基被掩蓋,此時蛋白就可以與 膜解離,因而,肉桂?;揎棝Q定的蛋白與膜的結(jié)合是一個可逆的過程。因為這種由肉桂酰 化修飾決定的膜定位存在著復(fù)雜調(diào)控,決定CCNY在體內(nèi)的定位也存在復(fù)雜調(diào)控,因而它對PFTKl的調(diào)控將更加復(fù)雜,提示這一蛋白及它與PFTKl的復(fù)合物對細(xì)胞的生命活動具有重 要的影響。 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考,就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解,在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后,本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改,這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
細(xì)胞周期因子Y或其激動劑或拮抗劑的用途,其特征在于,用于制備調(diào)控細(xì)胞周期的制劑。
2.如權(quán)利要求1所述的用途,其特征在于,所述的細(xì)胞周期因子Y或其激動劑用于制備 促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的制劑;或所述的細(xì)胞周期因子Y的拮抗劑用于制備抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的制劑。
3.如權(quán)利要求2所述的用途,其特征在于,所述的促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程包括促進(jìn)細(xì)胞進(jìn) 入S期或G2/M期;或所述的抑制周期細(xì)胞進(jìn)程包括抑制細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期,或抑制細(xì)胞由Gl期進(jìn)入S期。
4.如權(quán)利要求1所述的用途,其特征在于,所述的細(xì)胞周期因子Y的拮抗劑選自特異 性結(jié)合細(xì)胞周期因子Y的抗體;或特異性干擾細(xì)胞周期因子Y表達(dá)的干擾分子。
5.如權(quán)利要求4所述的用途,其特征在于,所述的特異性干擾細(xì)胞周期因子Y表達(dá)的干 擾分子是SEQ ID NO :3-7任一所示核苷酸序列的干擾分子。
6.一種篩選調(diào)控細(xì)胞周期的潛在物質(zhì)的方法,其特征在于,所述方法包括(a)在測試組中,向表達(dá)細(xì)胞周期因子Y的體系中添加待篩選的候選物,并檢測細(xì)胞周 期因子Y的表達(dá)或活性;并且,在對照組中,在不添加所述候選物的、表達(dá)細(xì)胞周期因子Y的 體系中,檢測細(xì)胞周期因子Y的表達(dá)或活性;(b)將步驟(a)測試組中細(xì)胞周期因子Y的表達(dá)或活性與對照組中細(xì)胞周期因子Y的 表達(dá)或活性進(jìn)行比較,如果測試組中細(xì)胞周期因子Y的表達(dá)或活性在統(tǒng)計學(xué)上高于對照組,就表明該候選物 是促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期或G2/M期的潛在物質(zhì);若測試組中細(xì)胞周期因子Y的表達(dá)或活性在統(tǒng) 計學(xué)上低于對照組,就表明該候選物是抑制細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期,或抑制細(xì)胞由Gl期進(jìn)入 S期的潛在物質(zhì)。
7.細(xì)胞周期因子Y的用途,其特征在于,用于與PFTAIRE蛋白激酶1相互作用,調(diào)控 PFTAIRE蛋白激酶1的亞細(xì)胞定位或活性。
8.如權(quán)利要求7所述的用途,其特征在于,所述的細(xì)胞周期因子Y選自(a)SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的蛋白;或(b)(a)限定的蛋白的保守性變異蛋白質(zhì)或其活性片段;或所述的PFTAIRE蛋白激酶1選自(i)SEQID NO :2所示氨基酸序列的蛋白;或(ii)(i)限定的蛋白的保守性變異蛋白質(zhì)或其活性片段。
9.如權(quán)利要求8所述的用途,其特征在于,(b)項選自(1)具有SEQID NO 1中第143-243位氨基酸序列的蛋白;(2)具有SEQID NO :1中第55-341位氨基酸序列的蛋白;(3)具有SEQID NO :1中第84-341位氨基酸序列的蛋白;(4)具有SEQID NO 1中第1-310位氨基酸序列的蛋白;(5)具有SEQID NO 1中第1-243位氨基酸序列的蛋白;或(6)具有SEQID NO 1中第1-153位及第196-341位氨基酸序列的蛋白?;?ii)項選自(I)具有SEQID NO 2中第135-419位氨基酸序列的蛋白;或(II)具有SEQID NO 2中第135-430位氨基酸序列的蛋白。
10.一種分離的蛋白,其特征在于,所述的蛋白選自(1)具有SEQID NO 1中第143-243位氨基酸序列的蛋白;(2)具有SEQID NO :1中第55-341位氨基酸序列的蛋白;(3)具有SEQID NO :1中第84-341位氨基酸序列的蛋白;(4)具有SEQID NO 1中第1-310位氨基酸序列的蛋白;(5)具有SEQID NO 1中第1-243位氨基酸序列的蛋白;(6)具有SEQID NO 1中第1-153位及第196-341位氨基酸序列的蛋白;(7)具有SEQID NO 2中第135-419位氨基酸序列的蛋白;或(8)具有SEQID NO 2中第135-430位氨基酸序列的蛋白。
11.一種篩選調(diào)控PFTAIRE蛋白激酶1的亞細(xì)胞定位或活性的潛在物質(zhì)的方法,其特征 在于,所述方法包括(a)在測試組中,向細(xì)胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1相互作用的反應(yīng)體系中添加 待篩選的候選物,并檢測細(xì)胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1相互作用情況;并且,在對 照組中,在不添加所述候選物的、細(xì)胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1相互作用的反應(yīng)體 系中,檢測細(xì)胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用情況;(b)將步驟(a)測試組中細(xì)胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用情況與對 照組中細(xì)胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用情況進(jìn)行比較,如果測試組中細(xì)胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作用在統(tǒng)計學(xué)上強(qiáng)于對照 組,就表明該候選物是促進(jìn)PFTAIRE蛋白激酶1定位于細(xì)胞膜上或增強(qiáng)PFTAIRE蛋白激酶 1的激酶活性的潛在物質(zhì);如果測試組中細(xì)胞周期因子Y和PFTAIRE蛋白激酶1的相互作 用在統(tǒng)計學(xué)上弱于對照組,就表明該候選物是抑制PFTAIRE蛋白激酶1定位于細(xì)胞膜上或 降低PFTAIRE蛋白激酶1的激酶活性的潛在物質(zhì)。
12.—種抑制細(xì)胞周期進(jìn)程的制劑,所述制劑是干擾分子,其核苷酸序列如SEQ IDNO 3-7任一所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞周期因子Y及其用途。本發(fā)明首次確定了一個與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白,即細(xì)胞周期因子Y(CCNY)。CCNY能與蛋白激酶家族成員PFTAIRE蛋白激酶1(PFTK1)相互作用,從而發(fā)揮調(diào)控PFTK1激酶活性或細(xì)胞定位的作用。
文檔編號A61K48/00GK101920006SQ20101020870
公開日2010年12月22日 申請日期2010年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月16日
發(fā)明者姜梅, 李珊, 陳江野, 高衍昆 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
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