專利名稱：一種分離、純化中藥整體效應(yīng)分子組的生物模擬集成技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離、純化中藥效應(yīng)成分的方法，特別涉及一種利用酶解、微生物轉(zhuǎn)化、超濾等若干生物模擬技術(shù)的集成，用于分離、純化中藥整體效應(yīng)分子組的方法。
背景技術(shù)：
中藥是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，以辨證論治為依據(jù)，針對證候確定的治則治法，依據(jù)那些經(jīng)過特殊方法炮制加工而成的各種不同藥材的性味、歸經(jīng)、功效等，按照君、臣、佐、使原則配伍，主要用于對“證”治療的藥物。因此，中藥是特指的，它與天然藥物、動植物及礦物藥等有著本質(zhì)上的不同。中藥現(xiàn)代化必須植根于中醫(yī)現(xiàn)代化的土壤才能有生命力。應(yīng)當(dāng)在遵循中醫(yī)藥基本理論和傳統(tǒng)用藥原則的前提下，合理采用恰當(dāng)?shù)默F(xiàn)代科技手段，較傳統(tǒng)分離方法更合理、有效地分離、純化中藥，達(dá)到提高藥效，創(chuàng)建具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新型中藥復(fù)方制劑的目的。整體調(diào)節(jié)是幾千年來中醫(yī)辨證論治的精髓，堅持標(biāo)本兼治原則，追求的是機體的陰陽平衡和協(xié)調(diào)。中藥的“君、臣、佐、使”配伍就是以實現(xiàn)此種整體平衡的調(diào)節(jié)效應(yīng)為目標(biāo)， 這里我們將這種中藥方劑的整體調(diào)節(jié)效應(yīng)簡稱為中藥的整體效應(yīng)。本發(fā)明認(rèn)為在目前尚難對中藥化學(xué)成分及其藥性等準(zhǔn)確定位的情況下，方劑的整體效應(yīng)只能依靠盡可能多的保持其中能被吸收的化學(xué)物質(zhì)來實現(xiàn)，尤其不能忽視的是其中大量低豐度的化學(xué)物質(zhì)及微量元素，他們很可能是方劑整體效應(yīng)中具有四兩撥千斤的重要效應(yīng)成分或減毒增效成分。胃腸道的消化、吸收作用對中藥方劑療效有著重要影響，對于這一關(guān)鍵環(huán)節(jié)必須充分重視。本發(fā)明認(rèn)為除部分胃腸道藥物外，中藥方劑中真正的藥物分子或前體即效應(yīng)分子應(yīng)是存在于通過消化道吸收后進入血液循環(huán)前(即進入門靜脈)的那些物質(zhì)之中，它們才是中藥方劑整體效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)或方劑的效應(yīng)物質(zhì)。在此將某一中藥或中藥方劑中能被吸收的全部效應(yīng)分子稱之為該中藥或中藥方劑的整體效應(yīng)分子組?；谝陨纤伎迹狙芯繌闹兴巶鹘y(tǒng)用藥習(xí)慣和整體效應(yīng)理論出發(fā)，通過體外模擬中藥湯劑經(jīng)酶及菌群作用并吸收入血的整個過程，將酶解、微生物轉(zhuǎn)化及超濾等若干生物工程技術(shù)模塊進行集成，建立一套以純化中藥、提高藥效、改變傳統(tǒng)給藥方式為主要目的的標(biāo)準(zhǔn)化分離純化中藥整體效應(yīng)分子組的技術(shù)模塊集成，為建立中藥制劑原料生產(chǎn)、制備藥效研究樣品的通用技術(shù)平臺提供基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種更加有效、合理的分離、純化中藥的方法，該方法較傳統(tǒng)分離方法有更的藥效。本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)本發(fā)明提供一種分離、純化中藥整體效應(yīng)分子組的生物模擬集成技術(shù)(一種提取中藥有效成分的方法)，包括下述至少2種模塊
1、模擬胃部消化作用的胃酶轉(zhuǎn)化模塊；2、模擬十二指腸消化作用的胰酶轉(zhuǎn)化模塊；3、模擬小腸的腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化模塊；4、模擬腸壁吸收作用的膜濾純化模塊；所述模塊1的方法為將中藥提取物或提取液加入水，調(diào)節(jié)水溶液PH值為 1. 7士0. 5后加入適量胃酶，在35-50°C常壓狀態(tài)攪拌反應(yīng)0. 5-4小時；所述模塊2的方法為模塊1完成后，調(diào)節(jié)藥液PH值為7. 5士0. 5后加入適量胰酶，在35-50°C常壓狀態(tài)攪拌0. 5-4小時；所述模塊3的方法為模塊2完成后，調(diào)節(jié)藥液pH值為7. 5 士0. 5后加入適量腸內(nèi)菌酶，在35-50°C常壓狀態(tài)攪拌0. 5-36小時；所述模塊4的方法為模塊3完成后，過濾，濾液攝氏4度存放過夜，吸取上層清液進一步采用超濾分離純化，收集超濾液，即得中藥整體效應(yīng)分子組；上述4個模塊可以根據(jù)中藥的組成及胃腸道對其的作用特點進行靈活組合。上述模塊1中的胃酶可以由其他酶代替，如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳酶、組織蛋白酶等。上述模塊2中的胰酶可以由其他酶代替，如糜蛋白酶、羧肽酶、腸激酶、麥芽糖酶、 乳糖酶、淀粉酶、脂酶等。上述模塊3中腸內(nèi)菌酶可由人腸道中混合菌群或其他具有轉(zhuǎn)化中藥成份功能的細(xì)菌中的一種或幾種細(xì)菌的混合物替換，包括但不限于普通擬桿菌、青春雙歧桿菌、單形擬桿菌、頰擬桿菌、消化擬桿菌、兩歧雙歧桿菌、雙歧桿菌、消化球菌。上述模塊3中分離(制備)腸內(nèi)菌酶所用的腸內(nèi)菌為人腸道中混合菌群或其他具有轉(zhuǎn)化中藥成份功能的細(xì)菌中的一種或幾種細(xì)菌的混合物，包括但不限于普通擬桿菌、青春雙歧桿菌、單形擬桿菌、頰擬桿菌、消化擬桿菌、兩歧雙歧桿菌、雙歧桿菌、消化球菌等。上述模塊3中分離腸內(nèi)菌酶所用的腸內(nèi)菌培養(yǎng)基根據(jù)細(xì)菌生長需要選擇合適的培養(yǎng)基，包括但不限于胰蛋白胨2-15g、消化血清粉5-20g、酵母浸膏l(xiāng)-10g、牛肉膏1 一 5g、 牛肝浸出粉0. l_2g、葡萄糖l_5g、磷酸二氫鉀l_5g、氯化鈉l_5g、可溶性淀粉l-10g、L-2半胱氨酸鹽酸鹽0. I-Ig或硫代乙醇酸鈉0. Ι-lg，加蒸餾水至1L，調(diào)PH至7. 2 士0. 5配方中的一種或幾種。上述模塊3中腸內(nèi)菌酶的分離方法為菌液在3000-15000rpm、0-25°C條件下離心 5-20min，傾去上清液，即得腸內(nèi)菌酶。上述模塊4中過濾優(yōu)選常規(guī)過濾，包括但不限于離心除雜或常壓過濾中的板框過濾器或紗布過濾；離心除雜優(yōu)選500-7000r/min。上述模塊4中超濾技術(shù)包括超濾或反滲透，利用其不同孔徑或截流分子量的各種材料和裝置對藥液進行純化；超濾膜孔徑優(yōu)選5，000-500, 000分子量。上述模塊4中中藥整體效應(yīng)分子組為超濾液，也可將其經(jīng)常規(guī)濃縮、干燥處理后的濃縮液或浸膏，也可以將濃縮液或浸膏加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝進一步制成臨床可接受的制劑，包括但不限于口服液、片劑、膠囊、注射劑等。上述模塊1中優(yōu)選加入5-50倍浸膏重量的水，調(diào)節(jié)水溶液pH值為1. 7士0. 5(或所用酶的最適PH)后加入0. 005-0. 02倍浸膏重量份的胃酶，在35-50°C常壓狀態(tài)攪拌0. 5-4小時；上述模塊2中優(yōu)選調(diào)節(jié)藥液pH值優(yōu)選為7. 5士0. 5(或所用酶的最適pH)后加入 0. 005-0. 02倍浸膏重量的胰酶，在35-50°C常壓狀態(tài)攪拌0. 5-4小時；上述模塊3中優(yōu)選加水至25-250倍浸膏重量，調(diào)節(jié)藥液pH值為7. 5 士0. 5后加入0. 02-0. 10倍浸膏重量份的腸內(nèi)菌酶，在35-50°C攪拌0. 5-36小時；上述模塊4中優(yōu)選用5，000-500, 000分子量孔徑的超濾膜柱純化轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。本發(fā)明具體提供一種桂枝湯生物提取方法，該方法包括如下步驟步驟1 桂枝湯用常規(guī)方法提取，得浸膏。步驟2 取Ig浸膏，加入IOmL水，調(diào)pH值至1. 7，加入胃酶10mg，36_45°C水浴，振搖反應(yīng)l-2h ；步驟3 反應(yīng)完成后，調(diào)pH值至7. 5，加入胰酶10mg，36_45°C水浴，時時振搖反應(yīng) l-2h ；步驟4 反應(yīng)完成后，加水至50mL，調(diào)pH值至7. 5，加入蛋白質(zhì)含量為65mg的腸內(nèi)菌酶，42 °C水浴，振搖反應(yīng)12-24h ；步驟5 反應(yīng)完成后，3000rpm離心或者濾紙過濾，將濾液用分子量為100，000的中
空纖維超濾柱超濾，超濾產(chǎn)物即所得桂枝湯湯劑整體效應(yīng)分子組。本發(fā)明從傳統(tǒng)中藥湯劑口服方式出發(fā)，按照中醫(yī)藥整體效應(yīng)理論，模擬胃腸道消化吸收過程，綜合利用酶解、微生物轉(zhuǎn)化、超濾等若干生物工程技術(shù)模塊進行集成，建立了一套系統(tǒng)的分離、純化中藥整體效應(yīng)分子組的技術(shù)集成平臺。本發(fā)明充分體現(xiàn)了中醫(yī)辨證施治及中藥復(fù)方配伍的科學(xué)內(nèi)涵，可基本上改變現(xiàn)有絕大部分傳統(tǒng)中藥制劑技術(shù)的落后狀態(tài)，也為實現(xiàn)大規(guī)模篩選中藥方劑配伍的藥效物質(zhì)提供標(biāo)準(zhǔn)化制備技術(shù)。原則上適合全部口服中藥制劑的分離純化，可預(yù)先去除傳統(tǒng)的中藥湯劑及丸、散、膏、丹中那些不能被吸收的大部分物質(zhì)，有利于提高藥物制劑的吸收和利用，產(chǎn)物可直接用于藥物研究的體外實驗及藥物分析等，克服了血清藥物采血時間和血清的非藥物性以及藥物分子代謝產(chǎn)物的干擾和動物個體差異造成的巨大誤差。本發(fā)明在分離過程中加入消化酶、腸道微生物或其酶類，使得藥物在體外分離、純化的過程就發(fā)生了與體內(nèi)相似的變化過程，盡可能地保留了原方的效應(yīng)物質(zhì)，提高了藥效。 藥效學(xué)實驗證明較傳統(tǒng)分離、純化中藥的方法，本發(fā)明分離、純化方法獲得的產(chǎn)品藥效顯著增強。本發(fā)明利用超濾技術(shù)，除去大量的雜質(zhì)，降低了藥物的服用量，方便制劑，一般中藥分離物重量為藥材的10—20%，服用量較大，而經(jīng)超濾純化后，在藥效提高的同時，固形物含量為藥材水提液的5—10%，便于制劑。下述實驗例與實施例用于進一步說明本發(fā)明但不限于本發(fā)明。實驗例1桂枝湯生物模擬轉(zhuǎn)化方法與傳統(tǒng)分離、純化方法的比較1、藥效學(xué)比較實驗采用IL-I刺激rCMEC的細(xì)胞發(fā)熱模型，比較桂枝湯湯劑生物轉(zhuǎn)化模擬產(chǎn)物、桂枝湯湯劑生物轉(zhuǎn)化模擬產(chǎn)物血清藥、桂枝湯湯劑血清藥對IL-I β介導(dǎo)rCMEC表達(dá)cPLA2、 PGES、15-P⑶H、SPLA2 的影響。1. 1實驗方法
1. 1. 1動物與細(xì)胞雄性SD大鼠30只，體重250 士 10g，大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株(rCMEC)1. 1. 2 藥物桂枝湯湯劑生物模擬產(chǎn)物(實施例1方法制備)減壓濃縮至1. Og生藥/mL。桂枝湯湯劑生物轉(zhuǎn)化模擬產(chǎn)物血清藥、桂枝湯湯劑血清藥的制備大鼠隨機分為3組，每組各 10只，桂枝湯湯劑生物轉(zhuǎn)化模擬產(chǎn)物、桂枝湯湯劑按桂枝湯臨床等效劑量的10倍生藥/kg Bff)進行灌胃，按常規(guī)方法制備桂枝湯湯劑生物轉(zhuǎn)化模擬產(chǎn)物血清藥及桂枝湯湯劑
血清藥。1. 1. 3實驗分組空白對照組、桂枝湯湯劑生物模擬產(chǎn)物組(10^^20^^50% )、桂枝湯湯劑生物模擬產(chǎn)物血清藥組(5^^10^^20% )、桂枝湯湯劑血清藥組(5^^10^^20% )1. 1.4 細(xì)胞處理以胰酶將rCMEC消化成WlO6濃度，接種于M孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔0. 5ml。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)Mh，待細(xì)胞長至融合狀態(tài)后，換液以無血清DMEM液繼續(xù)培養(yǎng)Mh。分別給予不同組藥物孵育Mh，再以30ng/ml IL-I β刺激rCMEC IOh0吸取細(xì)胞外液用于檢測。1. 1.5檢測指標(biāo)及方法以雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定標(biāo)本中15-P⑶H、PGES, cPLA2水平。1. 1. 6分析方法組間兩兩比較采用方差分析。1. 2實驗結(jié)果1. 2. 1桂枝湯湯劑生物模擬產(chǎn)物對IL-I β介導(dǎo)rCMEC表達(dá)cPLA2、PGES、15-P⑶H、 SPLA2的影響表1不同濃度桂枝湯湯劑生物模擬產(chǎn)物對IL-I β介導(dǎo)rCMEC表達(dá)cPLA2、PGES, 15-PGDH、SPLA2 的影響
ControlIL-ΙβIL-I β+10%IL-ip+20%IL-I β十 50%cPLA216.99±1.20**25.15±1.367.32 土 1.71**5.60±0.13**5.73±0.37**PGES30.94土 0.44**34.42±1.0318.49±2.26**14.54 士 5.03**11.28 士 2.48**15-PGDH12.21 土 1.30**20.00±1.339.22±0.80**7.38±1.29**5.86±1.76**sPLA2153.97 + 26.77**275.25±34.95242.63 ±75.05111.66 土 24.20**63.25±2.06**與IL-I β 組(模型組)比較，*Ρ < 0. 05，**Ρ < 0. 01實驗結(jié)果表明桂枝湯湯劑生物模擬產(chǎn)物可顯著降低IL-I β介導(dǎo)的 rCMEC15-P⑶H、PGES, cPLA2的表達(dá)，與模型組比較均有顯著性差異，P < 0. 01。1.2.2桂枝湯原藥血清藥與桂枝湯湯劑生物模擬產(chǎn)物血清藥組對IL-I β介導(dǎo) rCMEC 表達(dá) cPLA2、PGES, 15_P⑶H、SPLA2 的影響表2不同濃度桂枝湯湯劑生物模擬產(chǎn)物對IL-I β介導(dǎo)rCMEC表達(dá)cPLA2、PGES, 15-PGDH、SPLA2 的影響
權(quán)利要求
1.一種分離、純化中藥整體效應(yīng)分子組的生物模擬集成技術(shù)，其特征在于包括下述模塊中的至少2種模塊1、模擬胃部消化作用的胃酶轉(zhuǎn)化模塊； 模塊2、模擬十二指腸消化作用的胰酶轉(zhuǎn)化模塊； 模塊3、模擬小腸的腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化模塊； 模塊4、模擬腸壁吸收作用的膜濾純化模塊；所述模塊1的方法為調(diào)節(jié)藥液PH值為1.7士0.5后加入適量胃酶，在35-50°C常壓狀態(tài)攪拌反應(yīng)0. 5-4小時；所述模塊2的方法為調(diào)節(jié)藥液pH值為7. 5士0. 5后加入適量胰酶，在35-50°C常壓狀態(tài)攪拌0. 5-4小時。所述模塊3的方法為調(diào)節(jié)藥液pH值為7. 5士0. 5后加入適量腸內(nèi)菌酶，在35-50°C常壓狀態(tài)攪拌0. 5-36小時。所述模塊4的方法為轉(zhuǎn)化藥液過濾，濾液攝氏4°C存放，吸取上層清液采用超濾分離純化，收集超濾液。
2.如權(quán)利要求1所述的生物模擬集成技術(shù)，其特征在于包括下述模塊模塊1 將中藥提取物或提取液用水配制成合適濃度，調(diào)節(jié)溶液PH值為1. 7士0. 5后加入適量胃酶，在35-50°C常壓狀態(tài)攪拌反應(yīng)0. 5-4小時；模塊2為模塊1完成后，調(diào)節(jié)藥液pH值為7. 5士0. 5后加入適量胰酶，在35-50°C常壓狀態(tài)攪拌0. 5-4小時；模塊3為模塊2完成后，調(diào)節(jié)藥液pH值為7. 5 士 0. 5后加入適量腸內(nèi)菌酶，在35-50 °C 常壓狀態(tài)攪拌0. 5-36小時；模塊4為模塊3完成后，過濾，濾液攝氏4度存放過夜，吸取上層清液進一步采用超濾分離，收集超濾液，即得中藥整體效應(yīng)分子組。
3.如權(quán)利要求2所述的生物模擬集成技術(shù)，其特征在于模塊1的方法為加入5-50倍浸膏重量的水，調(diào)節(jié)水溶液PH值為所用酶的最適pH后加入0. 005-0. 02倍浸膏重量份的胃酶，在35-50°C常壓狀態(tài)攪拌0. 5-4小時。
4.如權(quán)利要求2所述的生物模擬集成技術(shù)，其特征在于模塊2的方法為調(diào)節(jié)藥液 PH值為所用酶的最適pH后加入0. 005-0. 02倍浸膏重量的胰酶，在35_50°C常壓狀態(tài)攪拌 0. 5-4小時；
5.如權(quán)利要求2所述的生物模擬集成技術(shù)，其特征在于模塊3的方法為加水至 25-250倍浸膏重量，調(diào)節(jié)藥液pH值為7. 5 士0. 5后加入0. 02-0. 10倍浸膏重量份的腸內(nèi)菌酶，在35-50°C攪拌0. 5-36小時；
6.如權(quán)利要求2所述的生物模擬集成技術(shù)，其特征在于模塊4的方法為用 5，000-500，000分子量孔徑的超濾膜柱純化轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
7.如權(quán)利要求2所述的生物模擬集成技術(shù)，其特征在于所述中藥為復(fù)方中藥或單味中藥。
8.如權(quán)利要求7所述的生物模擬集成技術(shù)，其特征在于所述中藥為桂枝湯或丹參。
9.如權(quán)利要求1或2所述的生物模擬集成技術(shù)，其特征在于胃酶可由胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳酶、組織蛋白酶任意一種或幾種酶的混合物替胰酶可由糜蛋白酶、羧肽酶、腸激酶、麥芽糖酶、乳糖酶、淀粉酶、脂酶任意一種或幾種酶的混合物替換；腸內(nèi)菌酶由人腸道中混合菌群或其他具有轉(zhuǎn)化中藥成份功能的細(xì)菌中的一種或幾種細(xì)菌的混合物替換，包括但不限于普通擬桿菌、青春雙歧桿菌、單形擬桿菌、頰擬桿菌、消化擬桿菌、兩歧雙歧桿菌、雙歧桿菌、消化球菌；
10.如權(quán)利要求1或2所述的生物模擬集成技術(shù)，其特征在于胃酶可由胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、凝乳酶、組織蛋白酶任意一種或幾種酶的混合物替換；胰酶可由糜蛋白酶、羧肽酶、腸激酶、麥芽糖酶、乳糖酶、淀粉酶、脂酶任意一種或幾種酶的混合物替換；分離腸內(nèi)菌酶所用的腸內(nèi)菌為人腸道中混合菌群或其他具有轉(zhuǎn)化中藥成份功能的細(xì)菌中的一種或幾種細(xì)菌的混合物，包括但不限于普通擬桿菌、青春雙歧桿菌、單形擬桿菌、 頰擬桿菌、消化擬桿菌、兩歧雙歧桿菌、雙歧桿菌、消化球菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離、純化中藥整體效應(yīng)分子組的生物模擬集成技術(shù)，其特征在于包括下述模塊中的至少2種模塊1、模擬胃部消化作用的胃酶轉(zhuǎn)化模塊；模塊2、模擬十二指腸消化作用的胰酶轉(zhuǎn)化模塊；模塊3、模擬小腸的腸內(nèi)菌轉(zhuǎn)化模塊；模塊4、模擬腸壁吸收作用的膜濾純化模塊。本發(fā)明制備的提取物具有更明顯的藥效。
文檔編號A61K36/537GK102283893SQ20101021331
公開日2011年12月21日 申請日期2010年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月18日
發(fā)明者宋劍南, 柏冬 申請人:中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所