專利名稱：一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體菌株及其作為食品添加成分在固態(tài)及 液態(tài)食品中的應用，尤其是能夠特異性裂解食品中污染的多種李斯特菌的噬菌體的應用。 屬于生物工程領域。
背景技術：
李斯特菌(Listeria)是一種能夠引起動物和人李斯特菌病的革蘭氏陽性細 菌，目前國際公認的李斯特菌共有六個種，其中單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)是最重要的食源性人獸共患病原菌。調查研究表明，96%的李斯特菌 病例都是由Lm中l(wèi)/2a，l/2b和4b血清型引發(fā)的，主要表現(xiàn)為胃腸炎、敗血癥、腦膜腦炎和 流產等，死亡率高達25-30%。在自然界中，Lm通常存在于土壤、河水、植物、屠宰場廢棄物 及動物源食品中(肉、奶及其制品、海產品等)，且與大多數(shù)人源病原菌不同的是Lm在低溫 環(huán)境中仍可生長繁殖(如2 8°C )，是冷藏食品以及即食(Ready-To-Eat，RTE)食品中威 脅人類健康的重要病原菌之一。國內主要城市食品污染調查研究顯示，北京8類食品中，Lm 平均檢出率為21. 5% ；浙江6類食品中的檢出率為7. 14% ；南京市連續(xù)兩年的李斯特菌檢 出率分別為18. 3%和17.9%，其污染狀況令人堪憂。在國外，美國和加拿大曾爆發(fā)過6起 重大的李斯特菌病，而這都與食用了污染李斯特菌的食品有關。噬菌體是一類細菌依賴性的病毒，又稱細菌病毒。裂解性噬菌體感染細菌后，可在 宿主菌內快速增殖，并使之裂解，故又稱毒性噬菌體。Lm噬菌體可以特異性感染并裂解李斯 特菌，因而具有殺菌作用。在感染模型中，噬菌體能夠特異殺死李斯特菌；而在食品中，噬菌 體能夠作為抗菌劑來控制細菌污染，具有潛在的開發(fā)價值。
發(fā)明內容
發(fā)明目的開發(fā)對李斯特菌具有強裂解作用的噬菌體制劑，該制劑可以單獨或復配使用，能 夠特異性的滅活多種食源性李斯特菌，為目前防控食品中李斯特菌污染提供一種安全、無 毒副作用的噬菌體產品來源。技術方案一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體，保藏號為CCTCC No. M 2010003，保藏日期2010 年1月15日，該菌株對李斯特菌有強的裂解作用。1.形態(tài)學特性取純化噬菌體懸液作電鏡觀察，加20 μ 1樣本滴在銅網(wǎng)上，待其沉淀15min，用 濾紙吸去多余的液體，用2%的磷鎢酸染色30min，干燥后電鏡觀察。頭部對稱，直徑約為 75nm，尾長約為262. 5nm，尾部直徑為12. 5nm。2.噬菌體基因組核酸類型鑒定根據(jù)國際病毒分類委員會2005年發(fā)表的《病毒分類_國際病毒分類委員會第八次報告》中對噬菌體的新分類方法，本發(fā)明獲得的噬菌體的形態(tài)學特征應歸于長尾噬菌體 科，其DNA鑒定結果顯示，該噬菌體為dsDNA，將其命名為單核細胞增生性李斯特菌噬菌體 LipG2_5。在本發(fā)明中所述的噬菌體菌株在30 50°C中放置60min，其活性穩(wěn)定；在60°C 以上孵育60min，則失活；噬菌體菌株在pH5. 0 8. 0環(huán)境下，其活性穩(wěn)定；一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體的制備方法，其特征在于取2ml新鮮培養(yǎng)的單 核細胞增生性李斯特菌過夜培養(yǎng)物，離心，0. 4ml TSB-YE (含0. 6%酵母浸膏的胰酪胨大 豆肉湯)培養(yǎng)基重懸，加0. Iml噬菌體、麥芽糖(0. 2% )、CaCl2(終濃度1.25mM)，3(TC溫 育30min，使噬菌體顆粒吸附于宿主菌；加入1 OOml TSB-YE培養(yǎng)基，30°C靜置培養(yǎng)6_8h ； 取上述培養(yǎng)物以13000\8.111^1，41，離心301^11，取上清；再用0. 22 μ m濾膜過濾上清， 形成噬菌體懸液。加 RNase A、DNase I 至 1 μ g/ml，37°C溫育 30min ；加 9. 3g PEG 8000， 5. 8g NaCl，搖勻至溶解，冰浴Ih或4°C過夜；4°C離心10000 X g. midOmin，去上清液；加 2ml SM
溶液，充分洗溶管壁及沉淀，室溫 作用Ih ；通過加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸液中的PEG和細胞碎片，溫和振蕩30s ；4°C, 3000 Xg. miiT1離心15min以分離有機相和親水相，回收含有噬菌體顆粒的親水相，獲得純 化的噬菌體。一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體的應用，其特征在于用于防止李斯特菌污染和抑制 李斯特菌過度生長。一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體的應用，其特征在于將噬菌體制成噴灑液或淋洗 液，用于對食品、生產環(huán)境或生產器具的噴灑或消殺，防止食品加工過程中造成的李斯特菌 污染。一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體的應用，其特征在于所述的食品為由肉類、或蛋類、 或奶制品、或糧食、或蔬菜、或它們之間的組合加工的固體或液體類食品。一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體的應用，其特征在于以所述的一種寬宿主譜李斯特 菌噬菌體的分離物或培養(yǎng)物制成殺菌劑。一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體的應用，其特征在于將噬菌體與賦形劑復配后，用 來抑制食品中李斯特菌的污染。一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體的應用，其特征在于所述的賦形劑為制藥領域普 遍使用的緩沖液、金屬離子、表面活性劑、明膠或海藻酸鹽。有益效果由于采用噬菌體特異性裂解李斯特菌可以殺死具有耐藥性的李斯特菌；由于采用 噬菌體特異性裂解李斯特菌能夠防止李斯特菌進化和耐藥毒株的產生；由于本發(fā)明涉及的 噬菌體菌株具有親水相，通過傳統(tǒng)的方法很容易配制成噴灑液或淋洗液，對環(huán)境或器具進 行消殺；由于本發(fā)明涉及的噬菌體菌株沒有毒副作用，可以作為食品添加劑，特異性裂解李 斯特菌，防止李斯特菌對食品的污染。
圖1噬菌體雙層板檢測結果圖2噬菌體電鏡照片
圖3噬菌體溫度敏感性檢測結果圖4噬菌體pH敏感性檢測結果圖5噬菌體宿主譜系分析結果圖6噬菌體在即食食品(火腿腸)中滅菌檢測結果(4°C )圖7噬菌體在即食食品(火腿腸)中滅菌檢測結果(25°C )圖8噬菌體在牛奶中滅菌作用檢測結果(4°C )圖9噬菌體在牛奶中滅菌作用檢測結果(25 °C )
具體實施例方式本發(fā)明試驗用噬菌體宿主菌單核細胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，簡稱 Lm 保藏號GIM1. 228)、威爾氏李斯特菌(Listeria welshimeri，保藏 號GIM 1. 231)、英諾克李斯特菌(Listeria innocua，保藏號GIM 1.230)購自廣東省微 生物研究所微生物菌種保藏中心。實施例1、噬菌體分離制備及純化噬菌體分離本發(fā)明樣品采自江蘇省宜興豬場污水，將樣品加入SM溶液，室溫震蕩2_4h，取上 清經雙層濾紙過濾，3000 Xg. miiT1離心20min，再用0. 22 μ m濾膜過濾上清。取IOml過 濾上清，加入Iml Lm過夜培養(yǎng)物，再加入無菌CaCl2母液至終濃度1. 25mM混勻后，加入 20ml TSB-YE培養(yǎng)基，室溫作用30min，再放置于30°C，待培養(yǎng)至6 8h后，取上述培養(yǎng)物以 13000 Xg. mirTWC，離心30min，取上清；再用0. 22 μ m濾膜過濾上清，形成噬菌體原液。將TSA-YE(含0. 6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂)平板分為2個區(qū)域吸取宿主 菌液0. Iml滴于普通營養(yǎng)瓊脂平板正中央，將菌液均勻地涂開；待其晾干后，取噬菌體原液 0.01ml穿刺于其中一個區(qū)域；待自然晾干后，置于30°C溫箱培養(yǎng)IOh后，觀察穿刺區(qū)域的變 化。同時設立對照，對照中僅涂噬菌體原液，以鑒定噬菌體中是否含有宿主菌。取噬菌體原液0. 1ml，進行10倍稀釋，取IO2UO4和IO6稀釋液各0. Iml與過夜培 養(yǎng)的宿主菌液0. Iml混勻，室溫作用15min后，加入約5ml 0. 7% LB培養(yǎng)基，混勻后迅速傾 倒入TSA-YE平板上層，搖勻平置5min，待其凝固，置于30°C溫箱培養(yǎng)12h后觀察，獲得形成 噬菌斑的雙層平板。噬菌體純化取2ml新鮮培養(yǎng)的Lm過夜培養(yǎng)物，離心，0. 4ml TSB-YE培養(yǎng)基重懸，加0. Iml噬菌 體(以單個噬菌體培養(yǎng)物與宿主菌分別按照1 1、1 10和1 100的比例)。加麥芽糖 (0. 2% ) ,CaCl2 (終濃度1. 25mM)，30°C溫育30min，使噬菌體顆粒吸附于宿主菌；加入IOOml TSB-YE培養(yǎng)基，30°C靜置培養(yǎng)6-8h ；取上述培養(yǎng)物以13000 X g. mirT1，4°C，離心30min，取 上清；再用0. 22 μ m濾膜過濾上清，形成噬菌體懸液。加RNase A、DNase I至1 μ g/ml, 37°C溫育30min ；加9. 3g PEG 8000,5. 8g NaCl，搖勻至溶解，冰浴Ih或4°C過夜；4°C離心 lOOOOXg.midOmin，去上清液；加2ml SM溶液，充分洗溶管壁及沉淀，室溫作用Ih ；通過 加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸液中的PEG和細胞碎片，溫和振蕩30s ；4°C，3000Xg. mirT1 離心15min以分離有機相和親水相，回收含有噬菌體顆粒的親水相，獲得純化的噬菌體，雙 層平板檢測純化噬菌體(如圖1所示)。噬菌體電鏡檢測
取純化噬菌體懸液作電鏡觀察，加20 μ 1樣本滴在銅網(wǎng)上，待其沉淀15min，用濾 紙吸去多余的液體，用2%的磷鎢酸染色30min，干燥后電鏡觀察。如圖2所示，噬菌體LipG2-5屬于長尾噬菌體科，頭部對稱，直徑約為75nm，尾長約 為262. 5nm，尾部直徑為12. 5nm。 溫度及pH對噬菌體的影響取0. ImllX 108pfu/ml純化噬菌體于30°C 90°C水浴分別作用lh，將樣品冷卻后 測其效價；分別取PH3. 0 10. 0的蛋白胨水和2X 108pfu/ml純化噬菌體等量混合，37°C水 浴作用2h后測其效價。結果如圖3所示，噬菌體在30 50°C分別作用Ih后，其活性無顯著變化；60°C 90°C作用Ih后，噬菌體低于可檢測水平。結果如圖4所示，在pH為3禾Π 4時，均檢測不到噬菌體；pH為5. 0 8. 0時，其效 價與初始效價無顯著性差異；當PH為9.0時，其效價降低了 31og，而當pH為10時，檢測不 到噬菌體。噬菌體宿主譜系檢測將TSA-YE平板分為若干個區(qū)域，吸取不同宿主菌過夜培養(yǎng)物單核細胞增生性李 其J 特菌(Listeria monocytogenes)、威爾氏李其jf特菌(Listeria welshimeri GIM 1. 231)、 英諾克李斯特菌(Listeria innocua GIM 1. 230)、綿羊李斯特菌(Listeria ivanovii，本 室分離鑒定并保存)0. Iml滴于TSA-YE平板正中央，將菌液均勻地涂開；同時也加入副傷寒 沙門菌(ATCC 50073)、腸炎沙門菌(ATCC 13073)以及大腸桿菌(ATCC 25922)待其晾干后， 取噬菌體原液0. 1ml，進行10倍稀釋，取IO2UO4和IO6稀釋液0. Olml分別滴加于涂有不同 宿主菌的平板中，正放待自然晾干后，置于30°C溫箱培養(yǎng)IOh后，觀察噬菌體對不同宿主菌 的裂解作用。結果見圖5，噬菌體對僅對李斯特菌屬宿主菌有特異性裂解作用，即對單核細胞增 生性李斯特菌、威爾氏李斯特菌、英諾克李斯特菌以及綿羊李斯特菌具有良好的裂解特性， 對其他細菌無裂解作用，平板中無透明斑。實施例2、噬菌體在固態(tài)食品中的殺菌作用即食性食品(火腿腸)，將其切成約面積為2cmX2cm的小塊(約lg)，將肉塊過火 焰滅菌；制備5X 105Cfu/ml李斯特菌菌液；制備5X 109pfu/ml的噬菌體樣品。無菌室溫環(huán) 境下，將宿主菌菌液以20μ l(lX104cfu/ml)滴于肉塊表面，約151^11后，滴2(^1不同濃 度的噬菌體，同時設立宿主菌對照；將制備好的樣品分別置于4°C和25°C，分別于24h、72h、 168h檢測宿主菌數(shù)量。結果如圖6中所示，4°C作用24h后，與對照組相比較，加入噬菌體組中，宿主菌數(shù) 量下降；72h后，宿主菌數(shù)量顯著降低；至168h，宿主菌數(shù)量與對照組呈極顯著性差異。如圖7中所示，25°C作用24h后，與對照組相比較，宿主菌數(shù)量下降；72h后，宿主 菌數(shù)量降低；至168h，宿主菌與對照組呈顯著性差異。實施例3、噬菌體在液態(tài)食品中的殺菌作用將巴氏殺菌牛奶，分成兩組，A組接種宿主菌104cfu/ml，同時加入108pfu/ml噬菌 體，B組中僅加入宿主菌作為對照，將制備好的樣品分別置于4°C和25°C，分別于24h、72h、 168h檢測宿主菌數(shù)量。
結果如圖8所示，4°C作用24h后，宿主菌數(shù)量下降；至72h，宿主菌數(shù)量降至對照 組50%以下；至168h，宿主菌數(shù)量與對照組呈顯著性差異。如圖9中所示，25°C作用24h后，與對照組相比較，即5X 109pfu/ml的噬菌體劑量 能有效夠殺滅宿主菌，宿主菌數(shù)量下降；72h后，宿主菌數(shù)量降低；至168h，宿主菌與對照組 呈顯著性差異，此時宿主菌長生較快。實施例4、噬菌體在加工器械中的殺菌作用挑取單核增生性李斯特菌單克隆，經過夜培養(yǎng)后，調整期濃度為104cfu/ml，噴灑 在加工用刀具表面；然后將純化噬菌體以107pfU/ml、108pfU/ml濃度對刀具實施噴灑消殺， 120min后，檢測宿主菌的數(shù)量。檢測結果顯示，在以107pfu/ml和108pfu/ml濃度噬菌體實施噴灑消殺120min后， 食槽表面宿主菌顯著下降，因此以濃度> 107pfu/ml噬菌體能夠有效的殺滅器具表面污染 的李斯特菌。實施例5、噬菌體安全性實驗8周齡雌性SPF級BALB/c小鼠，27g士2g，共20只，購自揚州大學比較醫(yī)學中心。 隨機分為2組，各10只；其中一組口服噬菌體10、偽/0. Iml/只；對照組口服等體積PBS。 連續(xù)口服14d，脫勁致死小鼠，觀察內臟、消化道及黏膜變化情況。結果顯示，此計量的噬菌體對小鼠日常行為沒有影響，解剖檢查無異常，且在飼喂 結束兩天后，在小鼠糞便中檢測不到噬菌體。
權利要求
一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體，其特征在于保藏號為CCTCC M 2010003，對李斯特菌具有實質性裂解潛力。
2.一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體的制備方法，其特征在于按如下步驟實現(xiàn)取2ml新鮮培養(yǎng)的單核細胞增生性李斯特菌過夜培養(yǎng)物，離心，0. 4ml TSB-YE培養(yǎng)基 重懸，加0. Iml噬菌體、0. 2%麥芽糖、終濃度1. 25mM CaCl2, 30°C溫育30min，使噬菌體顆粒 吸附于宿主菌；加入100ml TSB-YE培養(yǎng)基，30°C靜置培養(yǎng)6-8h ；取上述培養(yǎng)物以13000Xg. miiT1，4°C，離心30min，取上清；再用0. 22 μ m濾膜過濾上清，形成噬菌體懸液；加RNase A、 DNase I 至 1 μ g/ml，37°C溫育 30min ；加 9. 3g PEG 8000,5. 8g NaCl，搖勻至溶解，冰浴 Ih或 4°C過夜；4°C離心lOOOOXg.midOmin，去上清液；加2ml SM溶液，充分洗溶管壁及沉淀， 室溫作用Ih ；通過加入等體積的氯仿抽提噬菌體懸液中的PEG和細胞碎片，溫和振蕩30s ； 43000Xg. HiirT1離心15min以分離有機相和親水相，回收含有噬菌體顆粒的親水相，獲 得純化的噬菌體。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體的應用，其特征在于用于防止 李斯特菌污染和抑制李斯特菌過度生長。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體的應用，其特征在于將噬菌體 制成噴灑液或淋洗液，用于對食品、生產環(huán)境或生產器具的噴灑或消殺，防止食品加工過程 中造成的李斯特菌污染。
5.根據(jù)權利要求4所述的一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體的應用，其特征在于所述的食 品為由肉類、或蛋類、或奶制品、或糧食、或蔬菜、或它們之間的組合加工的固體或液體類食PΡΠ O
6.根據(jù)權利要求1所述的一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體的應用，其特征在于以所述的 一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體的分離物或培養(yǎng)物制成殺菌劑。
7.根據(jù)權利要求1所述的一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體的應用，其特征在于將噬菌 體與賦形劑復配后，用來抑制食品中李斯特菌的污染。
8.根據(jù)權利要求7所述的一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體的應用，其特征在于所述的 賦形劑為制藥領域普遍使用的緩沖液、金屬離子、表面活性劑、明膠或海藻酸鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種寬宿主譜李斯特菌噬菌體及其作為生物殺菌劑在食品中的應用。分離的單核細胞增生性李斯特菌噬菌體命名為LipG2-5(保藏號CCTCC M 2010003)，對單核細胞增生性李斯特菌、英諾克李斯特菌及威爾氏李斯特菌均具有強裂解活性，其分離培養(yǎng)物及復配制劑能夠作為食品添加劑防控食品中李斯特菌的污染。
文檔編號A61L2/18GK101955916SQ20101021957
公開日2011年1月26日 申請日期2010年7月6日 優(yōu)先權日2010年7月6日
發(fā)明者包紅朵, 張輝, 王冉 申請人:江蘇省農業(yè)科學院