Pufa聚酮化合物合酶系統(tǒng)及其用途的制作方法

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專利名稱：Pufa聚酮化合物合酶系統(tǒng)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來(lái)自微生物，包括諸如Thraustochytrid微生物的真核生物的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及編碼非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的核酸，涉及非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)，涉及含有非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的遺傳修飾的生物體，且涉及制備和使用本文公開的非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的方法。本發(fā)明還涉及鑒定含有PUFA PKS系統(tǒng)的細(xì)菌和非細(xì)菌微生物的方法。
背景技術(shù)：
聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)是本領(lǐng)域普遍已知的脂肪酸合酶(FAS)系統(tǒng)衍生的酶復(fù)合物，但它通常被高度修飾以產(chǎn)生一般與脂肪酸有很小相似性的特異性產(chǎn)物。研究人員嘗試了開發(fā)在文獻(xiàn)中描述過(guò)的聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)，它們屬于一般稱為II型，I型和模塊的三種基本類型之一。II型系統(tǒng)的特征是可分離的蛋白質(zhì)，各蛋白質(zhì)完成不同的酶促反應(yīng)。酶協(xié)調(diào)作用以產(chǎn)生最終產(chǎn)物且該系統(tǒng)中的每個(gè)酶在最終產(chǎn)物的生產(chǎn)中一般參與幾次。這類系統(tǒng)以類似于在植物和細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的脂肪酸合酶(FAS)系統(tǒng)的方式操作。I型PKS 系統(tǒng)與II型系統(tǒng)的相似之處在于酶以反復(fù)的方式用于生產(chǎn)最終產(chǎn)物。I型與II型的區(qū)別在于酶活性發(fā)生在更大的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中，而不是與可分離的蛋白質(zhì)相關(guān)。該系統(tǒng)類似于在動(dòng)物和真菌中發(fā)現(xiàn)的I型FAS系統(tǒng)。與I型和II型系統(tǒng)相反，在模塊PKS系統(tǒng)中，各酶結(jié)構(gòu)域在最終產(chǎn)物的生產(chǎn)中只使用一次。該結(jié)構(gòu)域在極大型蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)且各反應(yīng)的產(chǎn)物傳遞到PKS蛋白質(zhì)的另一結(jié)構(gòu) 域上。另外，在上述所有PKS系統(tǒng)中，如果在最終產(chǎn)物中引入碳-碳雙鍵，_為反式構(gòu)型。在上述I型和II型PKS系統(tǒng)中，每次循環(huán)進(jìn)行同一組反應(yīng)直到獲得最終產(chǎn)物。在生物合成過(guò)程期間不允許導(dǎo)入特有反應(yīng)。模塊PKS系統(tǒng)需要的巨大蛋白質(zhì)在反復(fù)的反應(yīng)中不能節(jié)約利用(即，每次反應(yīng)需要不同的結(jié)構(gòu)域)。另外，如上所述，在所有以前所述PKS系統(tǒng)中以反式構(gòu)型導(dǎo)入碳-碳雙鍵。多不飽和脂肪酸(PUFA)是大多數(shù)真核生物中膜脂類的關(guān)鍵成份(Lauritzen等， Prog. Lipid Res. 401(2001) ；McConn 等，Plant J. 15，521 (1998))且是某些激素和信號(hào) 分子的前體(Heller 等，Drugs 55,487(1998) ；Creelman 等，Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol Biol. 48，355 (1997))。已知的PUFA合成途徑包含通過(guò)延長(zhǎng)和需氧去飽和反應(yīng) 加工脂肪酸合酶(FAS)產(chǎn)生的飽和16:0或18:0脂肪酸(縮寫X:Y表示含有X個(gè)碳原子和Y個(gè)順式雙鍵的酰基基團(tuán)；PUFA的雙鍵位置相對(duì)于脂肪酸鏈的甲基碳(ω3或ω6)用雙鍵的系統(tǒng)亞甲基中斷表示)(Sprecher，Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 2,135(1999)； Parker-Barnes φ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,8284(2000) ；Shanklin φ, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Nol. Biol. 49，611 (1998))。從乙酰-CoA 開始，DHA 的合成需要約 30
19個(gè)不同的酶活性和幾乎70個(gè)反應(yīng)，包括4個(gè)脂肪酸合成循環(huán)的重復(fù)步驟。聚酮化合物合酶 (PKSs)完成一些與 FAS 相同的反應(yīng)(Hopwood 等，Annu. Rev. Genet. 24, 37 (1990) ；Bentley 等，Annu. Rev. Microbiο 1. 53，411 (1999))且使用相同的小蛋白(或結(jié)構(gòu)域)，即?；d體蛋白(ACP)，作為生長(zhǎng)碳鏈的共價(jià)連接位點(diǎn)。然而，在這些酶系統(tǒng)中，通常省去了 FAS中所見的還原，脫水和還原的整個(gè)循環(huán)，從而產(chǎn)生高度衍生化的碳鏈，一般含有許多酮基和羥基以及反式構(gòu)型的碳-碳雙鍵。PKSs的線型產(chǎn)物通常環(huán)化以形成復(fù)雜的生化試劑，包括抗生素和許多其它次級(jí)產(chǎn)物(Hopwood等，(1990)出處同上；Bentley等，(1999)，出處同上；Keating 等，Curr. Opin. Chem. Biol. 3，598 (1999))。從包括希瓦氏菌屬(Shewanella)種類的海洋細(xì)菌的一些物種中已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了諸如二十二碳六烯酸φΗΑ;22:6ω3)和二十碳五烯酸(ΕΡΑ;20:5ω3)的極長(zhǎng)鏈PUFA(Nichols 等，Curr. Op. Biotechnol. 10,240(1999) ；Yazawa, Lipids 31, S (1996) ；DeLong 等，Appl. Environ. Microbiol. 51，730 (1986))。對(duì)來(lái)自希瓦氏菌屬種類菌株SCRC2738的基因組片段 (克隆為質(zhì)粒pEPA)的分析導(dǎo)致鑒定了 5個(gè)可讀框(Orfs)，總計(jì)20Kb，它們是大腸桿菌中生產(chǎn)EPA的必要和充分條件(Yazawa，(1996)，出處同上)。一些預(yù)測(cè)的蛋白結(jié)構(gòu)域是FAS酶的同源物，而其它區(qū)域與已知功能的蛋白質(zhì)無(wú)同源性。根據(jù)這些觀察和生化研究，表明希瓦氏菌屬中的PUFA合成包含F(xiàn)AS產(chǎn)生的16-或18-碳脂肪酸的延長(zhǎng)和通過(guò)不明確的需氧去飽和酶插入雙鍵(Watanabe等，J. Biochem. 122,467(1997))。對(duì)5個(gè)希瓦氏菌屬Orfs編碼的蛋白質(zhì)序列的再檢查得出了該假設(shè)并不正確的認(rèn)識(shí)。5個(gè)Orfs內(nèi)的至少11個(gè)區(qū)域可鑒定為推定的酶結(jié)構(gòu)域(參見Metz等，Science 293 :290_293 (2001))。與基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比較時(shí)，其中7個(gè)與PKS蛋白比與FAS蛋白相關(guān)性更強(qiáng)。該組中包含的結(jié)構(gòu)域推定為編碼丙二酰-CoA: ACP?；D(zhuǎn)移酶(MAT)，3-酮脂酰-ACP合酶(KS)，3-酮脂酰-ACP還原酶(KR)， ?；D(zhuǎn)移酶(AT)，磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶，鏈長(zhǎng)(或鏈起始)因子(CLF)和非常罕見的6 個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域簇(即，存在兩個(gè)以上聚集的ACP結(jié)構(gòu)域在PKS或FAS序列中以前未見報(bào)導(dǎo))。然而，三個(gè)區(qū)域與細(xì)菌FAS蛋白同源性更高。其中一個(gè)類似于最近描述的來(lái)自肺炎鏈球菌(Sti^ptococcus pneumoniae)的三氯苯氧氯酚抗性烯酰還原酶(ER) (Heath等，Nature 406,145(2000)；使用LALIGN程序(模型，BL0SUM50 ；間隔缺口罰分，-10 ；延長(zhǎng)罰分，-1)比較0RF8肽與肺炎鏈球菌烯酰還原酶在386aa的重疊區(qū)內(nèi)顯示出49%的相似性)。兩個(gè)區(qū) 域是fabA編碼的大腸桿菌FAS蛋白的同源物，它催化反式-2-癸烯酰-ACP的合成和該產(chǎn) 物向順式-3-癸烯酰-ACP的可逆異構(gòu)化(Heath等，J.Biol. Chem.，271，27795 (1996))。因此，很可能希瓦氏菌屬的EPA中的至少一些雙鍵由0rf7中的FabA-樣結(jié)構(gòu)域催化的脫水酶-異構(gòu)酶機(jī)制引入。厭氧生長(zhǎng)的含有pEPA質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞與需氧培養(yǎng)物積累相同水平的 EPA (Metz等，2001，出處同上)，表明在EPA合成中不涉及氧依賴型去飽和酶。當(dāng)pEPA導(dǎo)入不能合成單不飽和脂肪酸且生長(zhǎng)需要不飽和脂肪酸的大腸桿菌fabB_突變體時(shí)，所得的細(xì) 胞喪失其脂肪酸輔源營(yíng)養(yǎng)。它們也比其它含有PEPA的菌株積累更高水平的EPA，表明EPA 與內(nèi)源性產(chǎn)生的單不飽和脂肪酸競(jìng)爭(zhēng)轉(zhuǎn)移到甘油脂上。當(dāng)含有PEPA的大腸桿菌細(xì)胞在 [13C]-乙酸鹽存在下生長(zhǎng)時(shí)，對(duì)從細(xì)胞純化的EPA進(jìn)行13C-NMR分析的數(shù)據(jù)證實(shí)了 EPA的身份且提供了該脂肪酸從乙酰-CoA和丙二酰-CoA合成的證據(jù)(參見Metz等，2001，出處同上)。來(lái)自含有PEPA的fabB_細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞勻漿從[14C]-丙二酰-CoA合成EPA和飽和脂肪酸。當(dāng)勻漿分離成200，OOOxg高速沉淀和無(wú)膜的上清部分時(shí)，飽和脂肪酸合成局限于上清，與 II 型 FAS 酶的可溶性質(zhì)一致(Magnuson 等，Microbiol. Rev. 57，522 (1993))。僅在高速沉淀部分中發(fā)現(xiàn)EPA的合成，表明EPA合成的發(fā)生可不依賴于大腸桿菌FAS酶或細(xì)胞質(zhì) 成份的可溶性中間物(例如16:0-ACP)。由于希瓦氏菌屬EPA基因編碼的蛋白質(zhì)不特別疏水，因此EPA合成活性局限于該成分中反映了膜相聯(lián)性酰基受體分子的要求。另外，與大腸桿菌FAS相反，EPA合成是特異性的NADPH-依賴型且不需要NADH。所有這些結(jié)果與編碼多功能PKS的pEPA基因一致，該多功能PKS獨(dú)立于FAS，延長(zhǎng)酶，和去飽和酶活性起作用以直接合成EPA。很可能在希瓦氏菌屬中鑒定的PUFA合成的PKS途徑在海洋細(xì)菌中是普遍的。在 Photobacterium profundum(Allen 等，Appli. Environ. Microbiol. 65 1710 (1999))禾口 Moritella marina (Vibrio marinus) (Tanaka 等，Biotechnol. Lett. 21 939(1999))中已經(jīng) 鑒定了與希瓦氏菌屬基因簇高度同源的基因。對(duì)希瓦氏菌屬進(jìn)行的生化和分子遺傳分析提供了聚酮化合物合酶能夠從丙二酰-CoA合成PUFA的確鑿證據(jù)。由希瓦氏菌屬PKS合成EPA的完整方案已經(jīng)提出。與大腸桿菌FabA蛋白同源的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的鑒定，和細(xì)菌EPA合成在厭氧條件下發(fā)生的觀察結(jié)果提供了順式雙鍵的插入通過(guò)雙功能脫水酶/2-反式，3-順式異構(gòu)酶(DH/2，3I)的作用發(fā)生這一機(jī)制的證據(jù)。在大腸桿菌中，3-順式酰基中間物與丙二酰-ACP的縮合需要特定的酮脂酰-ACP合酶且這支持在希瓦氏菌屬基因簇中存在兩個(gè)KS (在0rf5和0rf7中)的理論。然而，PKS循環(huán)以兩個(gè)碳的增量延長(zhǎng)碳鏈，而在EPA產(chǎn)物中雙鍵在每第三個(gè)碳處出現(xiàn)。如果通過(guò)2-反式，2-順式異構(gòu)化(DH/2，2I)接著在延長(zhǎng)的脂肪酸鏈中摻入順式雙鍵在EPA的C-14 和C-8處產(chǎn)生雙鍵就可解決這一差異。在例如，視黃素類(retinoid)循環(huán)的11-順式-視黃醛合成中已知會(huì)發(fā)生反式雙鍵酶促轉(zhuǎn)化成順式構(gòu)型而不發(fā)生鍵遷移(Jang等，J.Biol. Chem. 275，28128 (2000))。盡管在希瓦氏菌屬PKS中尚未鑒定這樣的酶功能，但是它可能屬于一個(gè)未鑒定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。希瓦氏菌屬和另一海洋細(xì)菌Vibrio marinus中PUFA合成的PKS途徑在美國(guó)專利號(hào)6，140，486 (從1998年6月4日申請(qǐng)的，發(fā)明名稱為“通過(guò)在植物中表達(dá)聚酮化合物類合成基因生產(chǎn)多不飽和脂肪酸”的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09/090，793出版，在此引用以其整體作為參考)中進(jìn)行了詳細(xì)描述。多不飽和脂肪酸(PUFA)據(jù)認(rèn)為可用于營(yíng)養(yǎng)，制藥，工業(yè)，和其它目的。來(lái)自天然來(lái) 源和化學(xué)合成的PUFA的昂貴供應(yīng)不足以滿足商業(yè)需要。由于許多分離的去飽和酶和延長(zhǎng) 酶是從大多數(shù)植物物種中共有的亞油酸(LA，18:2 Δ 9，12)到更飽和且更長(zhǎng)鏈PUFA的脂肪酸合成中所必需的，因此改造植物宿主細(xì)胞以表達(dá)諸如EPA和DHA的PUFA可能需要表達(dá)5 種或6種分離的酶活性以實(shí)現(xiàn)至少EPA和DHA的表達(dá)。另外，為了生產(chǎn)可用量的該P(yáng)UFA，可能需要其它的改造努力，例如，下調(diào)競(jìng)爭(zhēng)底物的酶，通過(guò)例如誘變改造成具有更高的酶活性或者將酶定向到質(zhì)體細(xì)胞器上。因此有利的是從天然產(chǎn)生這些脂肪酸的物種獲得包含PUFA 生物合成的遺傳材料并單獨(dú)或與異源系統(tǒng)結(jié)合表達(dá)可改造成允許生產(chǎn)商品量的PUFA的該分離材料。在諸如希瓦氏菌屬和Vibrio marinus的海洋細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的PUFA PKS系統(tǒng)(參見美國(guó)專利號(hào)6，140，486，出處同上)為商品PUFA生產(chǎn)的新方法提供了資源。然而，這些海洋細(xì)菌具有的缺陷最終將限制其在商業(yè)水平上的利用。首先，盡管美國(guó)專利號(hào)6，140，486公開了海洋細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)可用于遺傳修飾植物，但是海洋細(xì)菌在寒冷的海洋環(huán)境中自然生活和生長(zhǎng)且這些細(xì)菌的酶系統(tǒng)在30°C以上不能很好地發(fā)揮功能。相反，許多農(nóng)作物植物作為使用PUFA PKS系統(tǒng)進(jìn)行遺傳改造的有吸引力的目標(biāo)在30°C以上和變動(dòng)到高于40°C的溫度下為正常的生長(zhǎng)條件。因此，海洋細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)預(yù)期不容易適應(yīng)正常生長(zhǎng)條件下的植物表達(dá)。而且海洋細(xì)菌PUFA PKS基因由于是細(xì)菌來(lái)源，可能與真核宿主細(xì)胞的基因組不相容，或者至少需要大量的修改以便在真核宿主中起作用。另外，已知的海洋細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)不能直接產(chǎn)生甘油三酯，而直接產(chǎn)生甘油三酯是所期望的，因?yàn)楦视腿ナ俏⑸?中的脂類儲(chǔ)存產(chǎn)物且因此可在微生物/植物細(xì)胞中以極高的水平(例如，高達(dá)80-85%的細(xì) 胞重量)積累(與一般僅以低水平(例如最大值不超過(guò)細(xì)胞重量的10-15% )積累的“結(jié) 構(gòu)”脂產(chǎn)物(例如磷脂)相反)。因此，本領(lǐng)域需要具有更大適應(yīng)性的其它PUFAPKS系統(tǒng)用于商業(yè)用途。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及含有選自如下的核酸序列的分離核酸分子(a)編碼選自SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :6，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序歹丨J ； (b)編碼選自 SEQ ID NO :8，SEQ IDNO :10，SEQ ID NO :13，SEQ ID NO :18，SEQ ID NO :20，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO :24，SEQ ID NO :26，SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，SEQ 18，SEQ ID NO 30, SEQ ID NO :32，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；(c)編碼與(a)的氨基酸序列中至少500個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60%相同的氨基酸序列的核酸序列，其中該氨基酸序列具有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè) 結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；(d)編碼與(b)的氨基酸序列至少約60%相同的氨基酸序列的核酸序列，其中該氨基酸序列具有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和(e)與(a), (b)，(c)，或(d)的核酸序列完全互補(bǔ)的核酸序列。在另一方面，該核酸序列編碼與(1)選自由SEQ ID NO :2，SEQ IDNO :4，和SEQ ID NO 6組成的組中的氨基酸序列的至少500個(gè)連續(xù)氨基酸至少約70%相同，或至少約80%相同，或至少約90%相同，或相同的氨基酸序列；和/或(2)編碼與選自SEQ ID NO :8，SEQ ID NO 10，SEQ ID NO 13, SEQ ID NO :18，SEQ ID NO -.20, SEQ ID NO :22，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO =26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，或 SEQ ID NO 32 的氨基酸序列至少約 70%相同的氨基酸序列的核酸序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸序列編碼選自SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :13，SEQ ID NO :18， SEQ IDNO :20, SEQ ID NO :22，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO -.26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO 30，SEQ ID NO :32和/或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列。在一個(gè)方面，該核酸序列選自 SEQ :ID NO :1，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :7，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :12， SEQ ID NO :17，SEQID NO :19，SEQ ID NO :21，SEQ ID NO :23，SEQ ID NO :25，SEQ ID NO 27，SEQ ID NO :29，禾口 SEQ ID NO :31。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及含有與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列可操作地相連的上述核酸分子的重組核酸分子。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及直接用上述重組核酸分子轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞。本發(fā)明的另一實(shí)施方案還涉及遺傳修飾的微生物，其中該微生物表達(dá)含有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的PKS系統(tǒng)。PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域由選自如下的核酸序列編碼(a)編碼來(lái)自 Thraustochytrid微生物的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè) 結(jié)構(gòu)域的核酸序列；(b)編碼來(lái)自本發(fā)明的篩選方法鑒定的微生物的PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；(c)編碼選自由SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :6，和其生物學(xué)活性片段組成的組中的氨基酸序列的核酸序列；(d)編碼選自SEQ ID N0:8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO =26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，SEQ ID NO :32，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；(e)編碼與選自SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO 6的氨基酸序列的至少500個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中該氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，(f)編碼與選自SEQ ID NO :8， SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :13，SEQ ID NO :18，SEQ ID NO :20，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO :32 的氨基酸序列具有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中該氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè) 結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。在該實(shí)施方案中，遺傳修飾該微生物以影響PKS系統(tǒng)的活性。在上文(b)中提到的本發(fā)明的篩選方法包括(i)選擇產(chǎn)生至少一種PUFA的微生物；和，(ii)從 (i)中鑒定與發(fā)酵培養(yǎng)基中在大于5%飽和度，且更優(yōu)選10%的飽和度，且更優(yōu)選大于15% 的飽和度，且更優(yōu)選大于20%的飽和度的溶氧條件下微生物產(chǎn)生的PUFA相比，在發(fā)酵培養(yǎng) 基中不足約5%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物。在一個(gè)方面，該微生物內(nèi)源性表達(dá)含有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的PKS 系統(tǒng)，且其中在編碼PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列中存在遺傳修飾。例如，在編碼具有至少一種下列蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的結(jié)構(gòu)域的核酸序列中存在遺傳修飾丙二酰-CoA = ACP?；D(zhuǎn)移酶(MAT)，β -酮脂酰-ACP合酶(KS)，酮還原酶(KR)，?；D(zhuǎn)移酶(AT)，F(xiàn)abA-樣β-羥酰-ACP脫水酶(DH)，磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶，鏈長(zhǎng)因子(CLF)，酰基載體蛋白(ACP)，烯酰ACP-還原酶(ER)，催化反式-2-癸烯酰-ACP合成的酶，催化反式-2-癸烯酰-ACP向順式-3-癸烯酰-ACP可逆異構(gòu)化的酶，和催化順式-3-癸烯酰-ACP 延長(zhǎng)成順式-11-十八碳烯酸的酶。在一個(gè)方面，在編碼選自下組的氨基酸序列的核酸序列中存在遺傳修飾(a)與選自SEQ ID NO :2，SEQ IDNO :4，或SEQ ID NO 6的氨基酸序列的至少500個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少約70%的相同性，且優(yōu)選至少約80%的相同性，且更優(yōu)選至少約90%的相同性且更優(yōu)選相同的氨基酸序列；其中該氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng) 的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，(b)與選自=SEQ ID NO :8，SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13，SEQ ID NO :18，SEQ ID NO :20，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO :24，SEQ ID NO :26，SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，或SEQID NO 32的氨基酸序列具有至少約70%相同性，且優(yōu)選至少約80%相同性，且更優(yōu)選至少約90%相同性且更優(yōu)選相同的氨基酸序列；其中該氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。在一個(gè)方面，該遺傳修飾的微生物是Thraustochytrid，它包括，但不限于，選自 Schizochytrium 禾口破囊壺菌屬(Thraustochytrium)中的 Thraustochytrid。在另一方面，該微生物進(jìn)一步被遺傳修飾成重組表達(dá)編碼來(lái)自細(xì)菌PUFAPKS系統(tǒng)，I型PKS系統(tǒng)，II型 PKS系統(tǒng)，和/或模塊PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)核酸分子。在該實(shí)施方案的另一方面，該微生物內(nèi)源性表達(dá)含有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的PUFA PKS系統(tǒng)，且其中該遺傳修飾包含表達(dá)選自由編碼來(lái)自第二種PKS 系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的重組核酸分子和編碼影響PUFA PKS系統(tǒng)活性的蛋白質(zhì)的重組核酸分子組成的組中的重組核酸分子。優(yōu)選的是，該重組核酸分子包含任一上述核酸序列。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，該重組核酸分子編碼磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶。在另一方面，該重組核酸分子包含編碼來(lái)自細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)，I型PKS系統(tǒng)，II型PKS系統(tǒng)，和/或模塊PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在該實(shí)施方案的另一方面，通過(guò)用編碼多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶 (PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的重組核酸分子轉(zhuǎn)染遺傳修飾該微生物。該重組核酸分子可包括含有任一上述核酸序列的任意重組核酸分子。在一個(gè)方面，該微生物進(jìn)一步被遺傳修飾成重組表達(dá)編碼來(lái)自細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)，I型PKS系統(tǒng)，II型PKS系統(tǒng)，或模塊PKS系統(tǒng) 的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)核酸分子。本發(fā)明的另一實(shí)施方案還涉及遺傳修飾的植物，其中該植物被遺傳修飾成重組表達(dá)含有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的PKS系統(tǒng)。該結(jié)構(gòu)域可由任一上述核酸序列編碼。在一個(gè)方面，該植物進(jìn)一步被遺傳修飾成重組表達(dá)編碼來(lái)自細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)，I型PKS系統(tǒng)，II型PKS系統(tǒng)，和/或模塊PKS 系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)核酸分子。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及鑒定具有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶 (PKS)系統(tǒng)的微生物的方法。該方法包括如下步驟(a)選擇產(chǎn)生至少一種PUFA的微生物；和，(b)從(a)中鑒定與發(fā)酵培養(yǎng)基中在大于5%飽和度的溶氧條件下，更優(yōu)選10%的飽和度，更優(yōu)選大于15%的飽和度，且更優(yōu)選大于20%的飽和度時(shí)微生物產(chǎn)生的PUFA相比，在發(fā)酵培養(yǎng)基中不超過(guò)約5%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物。產(chǎn) 生至少一種PUFA且在不超過(guò)約5%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物鑒定為含有PUFA PKS系統(tǒng)的候選微生物。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，步驟(b)包含從(a)中鑒定在不超過(guò)約2%飽和度的溶氧條件下，且更優(yōu)選在不超過(guò)約飽和度的溶氧條件下，甚至更優(yōu)選在約0%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物。在該實(shí)施方案的另一方面，在(a)中選擇的微生物具有通過(guò)吞噬作用消費(fèi)細(xì)菌的能力。在另一方面，在(a)中選擇的微生物具有簡(jiǎn)單的脂肪酸分布特征(profile)。在另一方面，在(a)中選擇的微生物是非細(xì)菌微生物。在另一方面，在(a)中選擇的微生物是真核生物。在另一方面，在(a)中選擇的微生物是Thraustochytriales目的一個(gè)成員。在另一方面，在(a)中選擇的微生物在高于約15°C，且優(yōu)選高于約20°C，且更優(yōu)選高于約25°C，且甚至更優(yōu)選高于約30°C的溫度下具有生產(chǎn)PUFA的能力。在另一方面，在(a)中選擇的微生物具有以高于5%的生物體干重，且更優(yōu)選高于10%的生物體干重生產(chǎn)所需生物活性化合物(例如，脂類)的能力。在還有另一方面，在(a)中選擇的微生物其總脂肪酸高于30%是 C14:0，C16:0和C16:1，同時(shí)也產(chǎn)生至少一種具有3個(gè)或更多個(gè)不飽和鍵的長(zhǎng)鏈脂肪酸，且優(yōu)選的是，在(a)中選擇的微生物其總脂肪酸高于40%是C14:0，C16:0和C16:l，同時(shí)也產(chǎn) 生至少一種具有3個(gè)或更多個(gè)不飽和鍵的長(zhǎng)鏈脂肪酸。在另一方面，在(a)中選擇的微生物其總脂肪酸高于30%是C14:0，C16:0和C16:1，同時(shí)也產(chǎn)生至少一種具有4個(gè)或更多個(gè)
24不飽和鍵的長(zhǎng)鏈脂肪酸，且更優(yōu)選同時(shí)也產(chǎn)生至少一種具有5個(gè)或更多個(gè)不飽和鍵的長(zhǎng)鏈
脂肪酸。在該實(shí)施方案的另一方面，該方法還包含檢測(cè)生物體是否含有PUFAPKS系統(tǒng)的步驟(C)。在該方面，該檢測(cè)步驟可包括檢測(cè)該微生物中與編碼來(lái)自Thraustochytrid PUFA PKS系統(tǒng)的氨基酸序列的核酸序列在嚴(yán)格條件下雜交的核酸序列。另外，該檢測(cè)步驟可包括檢測(cè)生物體中用來(lái)自ThaustochytridPUFAPKS系統(tǒng)的核酸序列的寡核苷酸引物擴(kuò)增的核酸序列。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及由上述篩選方法鑒定的微生物，其中該微生物被遺傳修飾成通過(guò)PUFA PKS系統(tǒng)調(diào)節(jié)分子的生產(chǎn)。本發(fā)明還有另一實(shí)施方案涉及生產(chǎn)生物活性分子的方法，該生物活性分子由聚酮化合物合酶系統(tǒng)產(chǎn)生。該方法包括在有效生產(chǎn)生物活性分子的條件下培養(yǎng)遺傳修飾的生物體的步驟，該生物體表達(dá)含有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)生物活性結(jié)構(gòu)域的PKS系統(tǒng)。PUFA PKS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域由任一上述核酸序列編碼。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，該生物體內(nèi)源性表達(dá)含有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié) 構(gòu)域的PKS系統(tǒng)，且該遺傳修飾在編碼PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列上。例如，該遺傳修飾與野生型生物體相比可改變至少一種由內(nèi)源性PKS系統(tǒng)產(chǎn)生的產(chǎn)物。在該實(shí)施方案的另一方面，該生物體內(nèi)源性表達(dá)含有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物活性結(jié)構(gòu)域的PKS系統(tǒng)，且該遺傳修飾包括用選自由編碼來(lái)自第二種PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的重組核酸分子和編碼影響PUFA PKS系統(tǒng)活性的蛋白質(zhì)的重組核酸分子組成的組中的重組核酸分子轉(zhuǎn)染該生物體。例如，該遺傳修飾與野生型生物體相比可改變由內(nèi)源性PKS系統(tǒng)產(chǎn)生的至少一種產(chǎn)物。在該實(shí)施方案的還有另一方面中，通過(guò)用編碼多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的重組核酸分子轉(zhuǎn)染遺傳修飾該生物體。在另一方面，該生物體產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸(PUFA)分布特征不同于沒(méi)有遺傳修飾的天然生物體。在另一方面，該生物體內(nèi)源性表達(dá)非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)，且其中該遺傳修飾包括來(lái)自不同 PKS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域取代編碼非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在還有另一方面，該生物體內(nèi)源性表達(dá)非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過(guò)用重組核酸分子轉(zhuǎn)染該生物體而被修飾，該重組核酸分子編碼的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)PUFA PKS系統(tǒng)產(chǎn)生的脂肪酸的鏈長(zhǎng)。例如，編碼調(diào)節(jié)脂肪酸鏈長(zhǎng)的蛋白質(zhì)的該重組核酸分子可取代非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)中編碼鏈長(zhǎng)因子的核酸序列。在另一方面，調(diào)節(jié)PUFA PKS系統(tǒng)產(chǎn)生的脂肪酸鏈長(zhǎng) 的蛋白質(zhì)是鏈長(zhǎng)因子。在另一方面，調(diào)節(jié)PUFA PKS系統(tǒng)產(chǎn)生的脂肪酸鏈長(zhǎng)的蛋白質(zhì)是指導(dǎo) 合成C20單位的鏈長(zhǎng)因子。在一個(gè)方面，該生物體表達(dá)在選自編碼FabA-樣β -羥酰-ACP脫水酶(DH)結(jié)構(gòu)域的區(qū)域和編碼β-酮脂酰-ACP合酶(KS)的區(qū)域中含有遺傳修飾的非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)，其中該修飾與沒(méi)有該修飾相比改變了 PUFA PKS系統(tǒng)產(chǎn)生的長(zhǎng)鏈脂肪酸的比率。在一個(gè)方面，該修飾包含用不具有異構(gòu)化活性的DH結(jié)構(gòu)域取代非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)中的FabA-樣 β-羥酰-ACP脫水酶(DH)。在另一方面，該修飾選自由缺失全部或部分該區(qū)域，用來(lái)自不同生物的同源區(qū)域取代該區(qū)域，和突變?cè)搮^(qū)域組成的組中。在另一方面，該生物體表達(dá)PKS系統(tǒng)且該遺傳修飾包含用來(lái)自PUFAPKS系統(tǒng)的FabA-樣β-羥酰-ACP脫水酶(DH)區(qū)域取代不具有異構(gòu)化活性的DH區(qū)域。在另一方面，該生物體表達(dá)在烯酰-ACP還原酶(ER)區(qū)域中含有修飾的非細(xì)菌 PUFA PKS系統(tǒng)，其中該修飾導(dǎo)致與沒(méi)有修飾相比產(chǎn)生不同的化合物。例如，該修飾可選自由缺失全部或部分ER區(qū)域，用來(lái)自不同生物的ER區(qū)域取代該ER區(qū)域，和突變?cè)揈R區(qū)域組成的組中。在一個(gè)方面，由本方法產(chǎn)生的生物活性分子可包括，但不限于抗炎癥配制品，化療劑，有效賦形劑，骨質(zhì)疏松癥藥物，抗抑郁劑，抗驚厥劑，抗幽門螺桿菌(Heliobactor pylori)藥物，治療神經(jīng)變性疾病的藥物，治療變性肝臟疾病的藥物，抗生素，和降膽固醇配制品。在一個(gè)方面，該生物活性分子是多不飽和脂肪酸(PUFA)。在另一方面，該生物活性分子是包含順式構(gòu)型的碳-碳雙鍵的分子。在另一方面，該生物活性分子是在每第三個(gè)碳包含一個(gè)雙鍵的分子。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，該生物體是微生物，在另一方面，該生物體是植物。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及產(chǎn)生一種植物的方法，該植物的多不飽和脂肪酸 (PUFA)分布特征不同于天然植物，該方法包括遺傳修飾該植物的細(xì)胞以表達(dá)含有至少一種重組核酸分子的PKS系統(tǒng)，該重組核酸分子含有編碼PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物活性結(jié) 構(gòu)域的核酸序列。該P(yáng)UFA PKS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域由任一上述核酸序列編碼。本發(fā)明還有另一實(shí)施方案涉及修飾含有至少一種脂肪酸的終產(chǎn)物的方法，包括向終產(chǎn)物中加入由重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生的油脂，該重組宿主細(xì)胞表達(dá)至少一種重組核酸分子，該重組核酸分子含有編碼PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物活性結(jié)構(gòu)域的核酸序列。PUFA PKS 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域由任一上述核酸序列編碼。在一個(gè)方面，該終產(chǎn)物選自由飲食添加劑，食品，藥物配制品，人源化動(dòng)物乳汁，和嬰兒配制品組成的組中。藥物配制品可包括，但不限于抗炎癥配制品，化療劑，有效賦形劑，骨質(zhì)疏松癥藥物，抗抑郁劑，抗驚厥劑，抗幽門螺桿菌藥物，治療神經(jīng)變性疾病的藥物，治療變性肝臟疾病的藥物，抗生素，和降膽固醇配制品。在一個(gè)方面，該終產(chǎn)物可用于治療選自由慢性炎癥，急性炎癥，胃腸疾病，癌癥，惡病質(zhì)，心臟再狹窄，神經(jīng)變性疾病，肝臟變性疾病，血脂疾病，骨質(zhì)疏松癥，骨關(guān)節(jié)炎，自身免疫疾病，先兆子癇，早產(chǎn)(preterm birth)，年老相關(guān)性黃斑病，肺病，和過(guò)氧化物酶體疾病組成的組中的一種癥狀。本發(fā)明還有另一實(shí)施方案涉及生產(chǎn)人源化動(dòng)物乳汁的方法，包括用含有編碼PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物活性結(jié)構(gòu)域的核酸序列的至少一個(gè)重組核酸分子遺傳修飾產(chǎn)奶動(dòng) 物的產(chǎn)奶細(xì)胞。該P(yáng)UFA PKS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域由任一上述核酸序列編碼。本發(fā)明還有另一實(shí)施方案涉及產(chǎn)生重組微生物的方法，包括遺傳修飾微生物細(xì)胞以表達(dá)含有編碼PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物活性結(jié)構(gòu)域的核酸序列的至少一種重組核酸分子。該P(yáng)UFA PKS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域由任一上述核酸序列編碼。本發(fā)明還有另一實(shí)施方案涉及被修飾成表達(dá)多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的重組宿主細(xì)胞，其中該P(yáng)KS催化重復(fù)的和非重復(fù)的酶反應(yīng)。PUFA PKS系統(tǒng)包含(a)至少兩個(gè)烯酰ACP-還原酶(ER)結(jié)構(gòu)域；(b)至少6個(gè)?；d體蛋白(ACP)結(jié) 構(gòu)域；(c)至少兩個(gè)β _酮脂酰-ACP合酶(KS)結(jié)構(gòu)域；(d)至少一個(gè)酰基轉(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu) 域；(e)至少一個(gè)酮還原酶(KR)結(jié)構(gòu)域；(f)至少兩個(gè)FabA-樣β -羥酰-ACP脫水酶(DH) 結(jié)構(gòu)域；(g)至少一個(gè)鏈長(zhǎng)因子(CLF)結(jié)構(gòu)域；和(h)至少一個(gè)丙二酰-CoA = ACP?；D(zhuǎn)移
26酶(MAT)結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，PUFA PKS系統(tǒng)是真核PUFA PKS系統(tǒng)。在另一方面， PUFA PKS系統(tǒng)是藻類PUFA PKS系統(tǒng)，且優(yōu)選Thraustochytriales PUFAPKS系統(tǒng)，它包括，但不限于Schizochytrium PUFA PKS系統(tǒng)或破囊壺菌屬PUFA PKS系統(tǒng)。在該實(shí)施方案中，PUFA PKS系統(tǒng)可在原核宿主細(xì)胞或在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)。在一個(gè)方面，該宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是生產(chǎn)含有至少一種PUFA 的產(chǎn)物的方法，包括在有效產(chǎn)生該產(chǎn)物的條件下生長(zhǎng)含有該植物細(xì)胞的植物。宿主細(xì)胞可以是微生物且在這種情況下，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是生產(chǎn)含有至少一種PUFA的產(chǎn)物的方法，包括在有效產(chǎn)生該產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)含有該微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物。在一個(gè)方面，PKS 系統(tǒng)催化甘油三酯的直接生產(chǎn)。本發(fā)明還有另一實(shí)施方案涉及遺傳修飾的微生物，它含有多不飽和脂肪酸(PUFA) 聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)，其中該P(yáng)KS催化重復(fù)的和非重復(fù)的酶反應(yīng)。PUFA PKS系統(tǒng)包含(a)至少兩個(gè)烯酰ACP-還原酶(ER)結(jié)構(gòu)域；(b)至少6個(gè)?；d體蛋白(ACP)結(jié)構(gòu)域； (c)至少兩個(gè)β -酮脂酰-ACP合酶(KS)結(jié)構(gòu)域；(d)至少一個(gè)?；D(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域； (e)至少一個(gè)酮還原酶(KR)結(jié)構(gòu)域；(f)至少兩個(gè)FabA-樣β -羥酰-ACP脫水酶(DH)結(jié) 構(gòu)域；(g)至少一個(gè)鏈長(zhǎng)因子(CLF)結(jié)構(gòu)域；和(h)至少一個(gè)丙二酰-CoA = ACP?；D(zhuǎn)移酶 (MAT)結(jié)構(gòu)域。該遺傳修飾影響PUFAPKS系統(tǒng)的活性。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，該微生物是真核微生物。本發(fā)明還有另一實(shí)施方案涉及被修飾成表達(dá)非細(xì)菌多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的重組宿主細(xì)胞，其中該非細(xì)菌PUFA PKS催化重復(fù)的和非重復(fù)的酶反應(yīng)。該非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)包含(a)至少一個(gè)烯酰ACP-還原酶(ER)結(jié)構(gòu)域；(b)多個(gè)酰基載體蛋白(ACP)結(jié)構(gòu)域；(c)至少兩個(gè)β -酮脂酰-ACP合酶(KS)結(jié)構(gòu)域；(d)至少一個(gè)酰基轉(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域；(e)至少一個(gè)酮還原酶(KR)結(jié)構(gòu)域；(f)至少兩個(gè)FabA-樣 β-羥酰-ACP脫水酶(DH)結(jié)構(gòu)域；(g)至少一個(gè)鏈長(zhǎng)因子(CLF)結(jié)構(gòu)域；和(h)至少一個(gè) 丙二酰-CoA:ACP?；D(zhuǎn)移酶(MAT)結(jié)構(gòu)域。

圖1是Schizochytrium PUFA PKS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)示意圖。圖2顯示了來(lái)自Schizochytrium和希瓦氏菌屬的PKS結(jié)構(gòu)域的比較。圖3顯示了來(lái)自Schizochytrium的PKS結(jié)構(gòu)域和來(lái)自念珠藻屬(Nostoc)的其產(chǎn) 物是不含任何雙鍵的長(zhǎng)鏈脂肪酸的相關(guān)PKS系統(tǒng)的比較。發(fā)明詳述本發(fā)明一般涉及非細(xì)菌衍生的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)，一般涉及含有非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的遺傳修飾的生物體，涉及制備和使用該系統(tǒng)用于生產(chǎn)包括生物活性分子的目的產(chǎn)物的方法，涉及鑒定具有該P(yáng)UFA PKS系統(tǒng)的新真核微生物的新方法。本文所用的PUFA PKS系統(tǒng)一般具有下列鑒定特征(1)作為該系統(tǒng)的天然產(chǎn)物產(chǎn)生PUFAjP (2)它含有組裝進(jìn)復(fù)合物的幾個(gè)多功能蛋白質(zhì)，該復(fù)合物同時(shí)進(jìn)行脂肪酸鏈的反復(fù)加工和非反復(fù)加工，包括在選定循環(huán)中的反式-順式異構(gòu)化和烯酰還原反應(yīng)(例如，參見圖1)。更具體地說(shuō)，首先，構(gòu)成本發(fā)明基礎(chǔ)的PUFA PKS系統(tǒng)產(chǎn)生多不飽和脂肪酸(PUFA)作為產(chǎn)物(即，內(nèi)源性(天然)含有該P(yáng)KS系統(tǒng)的生物體使用該系統(tǒng)制備PUFA)。本文提及的PUFA優(yōu)選是具有至少16碳的碳鏈長(zhǎng)度的多不飽和脂肪酸，且更優(yōu)選至少18碳，且更優(yōu)選至少20碳，且更優(yōu)選22或更多個(gè)碳，且具有至少3個(gè)或更多個(gè)雙鍵，優(yōu)選4個(gè)或更多個(gè)，且更優(yōu)選5個(gè)或更多個(gè)，且甚至更優(yōu)選6個(gè)或更多個(gè)雙鍵，其中所有雙鍵是順式構(gòu)型。本發(fā)明的一個(gè)目的是通過(guò)遺傳操作或終產(chǎn)物的改造發(fā)現(xiàn)或創(chuàng)造產(chǎn)生具有所需鏈長(zhǎng)和所需數(shù) 目雙鍵的多不飽和脂肪酸的PKS系統(tǒng)。PUFA的例子包括，但不限于，DHA(二十二碳六烯酸 (22:6，ω-3))， ΡΑ(鯡油酸(C22:5，ω-6))，和 EPA( 二十碳五烯酸(C20:5，ω-3))。其次，本文所述PUFA PKS系統(tǒng)同時(shí)參與反復(fù)和非反復(fù)的反應(yīng)，使得該系統(tǒng)不同于以前所述PKS系統(tǒng)(例如，I型，II型或模塊型系統(tǒng))。更具體地說(shuō)，本文所述PUFA PKS系統(tǒng)含有在每次循環(huán)期間顯示功能的結(jié)構(gòu)域以及僅在某些循環(huán)中顯示功能的結(jié)構(gòu)域。該系統(tǒng) 的一個(gè)關(guān)鍵方面涉及與細(xì)菌Fab A酶表現(xiàn)出同源性的結(jié)構(gòu)域。例如，大腸桿菌的Fab A酶表現(xiàn)出具有兩種酶活性。它具有從含有羥基的碳鏈減去一個(gè)水分子(H2O),在該碳鏈中留下一個(gè)反式雙鍵的脫水活性。另外，它具有將反式雙鍵轉(zhuǎn)變成順式構(gòu)型的異構(gòu)酶活性。該異構(gòu)化與雙鍵位置遷移到相鄰碳結(jié)合完成。在PKS(和FAS)系統(tǒng)中，主碳鏈以2個(gè)碳的增量延長(zhǎng)。因此可預(yù)知這些PKS系統(tǒng)產(chǎn)生PUFA產(chǎn)物所需的延長(zhǎng)反應(yīng)的次數(shù)。例如，產(chǎn)生DHA (C22 6，均為順式)需要10次延長(zhǎng)反應(yīng)。由于在終產(chǎn)物中僅有6個(gè)雙鍵，這意味著在某些反應(yīng)循環(huán)期間，雙鍵被保留(作為順式異構(gòu)體)，而在其它循環(huán)期間，雙鍵在下一步延長(zhǎng)前被還原。在發(fā)現(xiàn)海洋細(xì)菌的PUFA PKS系統(tǒng)(參見美國(guó)專利號(hào)6，140, 486)前，還不了解PKS 系統(tǒng)具有這種反復(fù)性和選擇性酶反應(yīng)的組合，且認(rèn)為它們不能以順式構(gòu)型產(chǎn)生碳-碳雙鍵。然而，本發(fā)明所述PUFA PKS系統(tǒng)具有導(dǎo)入順式雙鍵的能力和改變循環(huán)中反應(yīng)順序的能力。因此，本發(fā)明人提出使用PUFA PKS系統(tǒng)的這些特征生產(chǎn)以前所述(II型，I型和模塊型)PKS系統(tǒng)不能產(chǎn)生的各種生物活性分子。這些生物活性分子包括，但不限于，多不飽和脂肪酸(PUFA)，抗生素或其它生物活性化合物，其中許多分子將在下文討論。例如，使用本文所述PUFA PKS基因結(jié)構(gòu)的知識(shí)，可使用許多方法中的任一種改變PUFA PKS基因，或者將這些基因的部分與包括其它PKS系統(tǒng)的其它合成系統(tǒng)結(jié)合以便產(chǎn)生新產(chǎn)物。該系統(tǒng)的特定類型同時(shí)進(jìn)行反復(fù)性和選擇性反應(yīng)的內(nèi)在能力使得該系統(tǒng)能夠產(chǎn)生對(duì)PKS系統(tǒng)的其它類型采用相似方法不能發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)物。在一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的PUFA PKS系統(tǒng)包含至少下列生物活性結(jié)構(gòu)域(a)至少兩個(gè)烯酰ACP-還原酶(ER)結(jié)構(gòu)域；(b)至少6個(gè)酰基載體蛋白(ACP)結(jié)構(gòu)域；(c)至少兩個(gè)β _酮脂酰-ACP合酶(KS)結(jié)構(gòu)域；(d)至少一個(gè)?；D(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域；(e)至少一個(gè)酮還原酶(KR)結(jié)構(gòu)域；(f)至少兩個(gè)FabA-樣β -羥酰-ACP脫水酶(DH)結(jié)構(gòu)域；(g) 至少一個(gè)鏈長(zhǎng)因子(CLF)結(jié)構(gòu)域；和(h)至少一個(gè)丙二酰-CoA: ACP?；D(zhuǎn)移酶(MAT)結(jié)構(gòu) 域。這些結(jié)構(gòu)域的功能分別是本領(lǐng)域公知的且在下文關(guān)于本發(fā)明的PUFA PKS系統(tǒng)中將進(jìn) 行詳細(xì)描述。在另一實(shí)施方案中，PUFA PKS系統(tǒng)包含至少下列生物活性結(jié)構(gòu)域(a)至少一個(gè) 烯酰ACP-還原酶(ER)結(jié)構(gòu)域；(b)多個(gè)?；d體蛋白(ACP)結(jié)構(gòu)域(至少4個(gè)，且優(yōu)選至少5個(gè)，且更優(yōu)選至少6個(gè)，甚至更優(yōu)選7，8，9，或9個(gè)以上)；(c)至少兩個(gè)β-酮脂酰-ACP 合酶(KS)結(jié)構(gòu)域；(d)至少一個(gè)?；D(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域；(e)至少一個(gè)酮還原酶(KR)結(jié)構(gòu)域；(f)至少兩個(gè)FabA-樣β -羥酰-ACP脫水酶(DH)結(jié)構(gòu)域；(g)至少一個(gè)鏈長(zhǎng)因子(CLF) 結(jié)構(gòu)域；和(h)至少一個(gè)丙二酰-CoA = ACP?；D(zhuǎn)移酶(MAT)結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的是，該P(yáng)UFA PKS系統(tǒng)是非細(xì)菌PUFA-PKS系統(tǒng)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PUFA PKS系統(tǒng)是非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)。換句話說(shuō)，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PUFA PKS系統(tǒng)從不是細(xì)菌的生物體中分離，或者是來(lái)自不是細(xì)菌的諸如真核生物或古細(xì)菌的生物體的PUFAPKS系統(tǒng)的同源物或衍生物。真核生物根據(jù) 細(xì)胞的分化程度與原核生物區(qū)分開來(lái)。具有更多分化的高等群體稱為真核生物。具有較少分化的細(xì)胞的低等其它稱為原核生物。一般來(lái)說(shuō)，原核生物不具有核膜，細(xì)胞分裂期間不表現(xiàn)為有絲分裂，僅有一個(gè)染色體，其細(xì)胞質(zhì)含有70S核糖體，它們不具有任何線粒體，內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)，葉綠體，溶酶體，或高爾基體，其鞭毛(如果存在)由單一原纖維組成。相反真核生物具有核膜，它們?cè)诩?xì)胞分裂期間表現(xiàn)為有絲分裂，它們具有許多染色體，其細(xì)胞質(zhì)含有80S核糖體，它們具有線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，葉綠體(在藻類中)，溶酶體和高爾基體，且其鞭毛(如果存在)由許多原纖維組成。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)菌是原核生物，而藻類，真菌，原生生物，原生動(dòng)物和高等植物是真核生物。海洋細(xì)菌(例如，希瓦氏菌屬和Vibrio marinus)的PUFAPKS系統(tǒng) 不是本發(fā)明的基礎(chǔ)，盡管本發(fā)明確實(shí)包含使用來(lái)自這些細(xì)菌PUFAPKS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域與本發(fā) 明的非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。例如，根據(jù)本發(fā)明，可產(chǎn)生遺傳修飾的生物體，它摻入了非細(xì)菌PUFAPKS功能域與細(xì)菌PUFA PKS功能域，以及來(lái)自其它PKS系統(tǒng)(I型，II 型，模塊型)或FAS系統(tǒng)的PKS功能域或蛋白質(zhì)。Schizochytrium是以DHA和鯡油酸(DPA ；22:5 ω-6)積累大量三酰甘油，例如，占干重 30% 的 DHA+DPA 的 Thraustochytrid 海洋微生物(Barclay 等，J. Appl. Phycol. 6， 123 (1994))。在通過(guò)延長(zhǎng)/去飽和途徑合成20-和22-碳PUFA的真核生物中，18-, 20-和 22-碳中間體的分子庫(kù)相當(dāng)大，因此使用[14C]-乙酸鹽的體內(nèi)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)揭示了預(yù)期中間體的清楚前體-產(chǎn)物動(dòng)力學(xué)(Gellerman 等，Biochim. Biophys. Acta 573:23(1979))。另外，給該生物體提供的外源性放射標(biāo)記的中間體轉(zhuǎn)變成最終的PUFA產(chǎn)物。本發(fā)明人顯示了 [I-14C]-乙酸鹽迅速被Schizochytrium細(xì)胞吸收且摻入脂肪酸，但在最短標(biāo)記時(shí)間(1分鐘)時(shí)，在脂肪酸中回收到含有31%標(biāo)記的DHA，且該百分?jǐn)?shù)在10-15分鐘的[14C]-乙酸鹽摻入和隨后24小時(shí)的培養(yǎng)物生長(zhǎng)期間基本上保持不變(參見實(shí)施例3)。同樣，DPA通過(guò)實(shí) 驗(yàn)表現(xiàn)出10%的標(biāo)記。沒(méi)有證據(jù)表明在16-或18-碳脂肪酸與22-碳多不飽和脂肪酸之間存在前體-產(chǎn)物關(guān)系。這些結(jié)果與從包含極小(很可能與酶結(jié)合的)中間體庫(kù)的[14C]-乙酸鹽迅速合成DHA—致。來(lái)自Schizochytrium培養(yǎng)物的無(wú)細(xì)胞勻漿將[I-14C]-丙二酰-CoA 摻入DHA，DPA，和飽和脂肪酸中。相同的生物合成活性在100，OOOxg的上清成分中保留但在膜沉淀中不存在。因此，Schizochytrium中的DHA和DPA合成不涉及類似于其它真核生物所述膜結(jié)合的去飽和酶或脂肪酸延長(zhǎng)酶(Parker-Barnes等，2000，出處同上；Shanklin 等，1998，出處同上)。這些分級(jí)分離數(shù)據(jù)與從希瓦氏菌屬酶獲得的數(shù)據(jù)相反(參見Metz 等，2001，出處同上)且表明Schizochytrium酶使用不同的(可溶性)酰基受體分子，例如 CoA。在共同未決的美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09/231，899中，從Schizochytrium構(gòu)建了 cDNA文庫(kù)且測(cè)序了約8，000個(gè)隨機(jī)克隆(ESTs)。在這些資料組中，僅鑒定了一個(gè)中度表達(dá)的基因 (全部序列的0.3%)是脂肪酸去飽和酶，盡管一個(gè)單一克隆(0.01%)代表第二個(gè)推定的
29去飽和酶。相反，圖2中所示的與希瓦氏菌屬PKS基因的11個(gè)結(jié)構(gòu)域中的8個(gè)表現(xiàn)出同源性的序列均以0. 2-0. 5%的頻率被鑒定。在美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09/231,899中，測(cè)序了與希瓦氏菌屬PKS基因表現(xiàn)出同源性的幾個(gè)cDNA克隆，且各種克隆裝配成代表兩個(gè)部分可讀框和一個(gè)完整可讀框的核酸序列。含有美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09/231，899所述第一個(gè)部分可讀框的 cDNA序列的核苷酸390-4443 (其中稱為SEQ ID NO 69)與本文稱為OrfA的序列(SEQ ID NO 1)的核苷酸4677-8730 (加上終止密碼子)匹配。含有美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09/231，899所述第二個(gè)部分可讀框的cDNA序列的核苷酸1-4876 (其中稱為SEQ ID NO 71)與本文稱為 OrfB的序列(SEQ IDNO 3)的核苷酸1311-6177 (加上終止密碼子)匹配。含有關(guān)國(guó)申請(qǐng) 系列號(hào)09Λ31，899所述完全可讀框的cDNA序列的核苷酸145-4653 (其中稱為SEQID NO 76且錯(cuò)誤地稱為部分可讀框)與本文稱為OrfC的序列(SEQ ID NO 5)的整個(gè)序列(加上終止密碼子)匹配。本發(fā)明人對(duì)cDNA和基因組克隆的進(jìn)一步測(cè)序得以鑒定OrfA，OrfB和OrfC各自的全長(zhǎng)基因組序列并完全鑒定了與希瓦氏菌屬中的那些結(jié)構(gòu)域同源的結(jié)構(gòu)域(參見圖 2)。應(yīng)注意在Schizochytrium中，基因組DNA與cDNA相同，因?yàn)楦鶕?jù)本發(fā)明人的了解，在該生物體基因組中沒(méi)有內(nèi)含子。因此，提及來(lái)自Schizochytrium的核苷酸序列時(shí)可以是指基因組DNA或cDNA。根據(jù)Schizochytrium PKS結(jié)構(gòu)域與希瓦氏菌屬的比較，很明顯 Schizochytrium基因組編碼與希瓦氏菌屬中能夠催化EPA合成的蛋白質(zhì)高度相似的蛋白質(zhì)。Schizochytrium中的該蛋白質(zhì)構(gòu)成催化DHA和DPA合成的PUFAPKS系統(tǒng)。正如本文進(jìn) 行的詳細(xì)討論，對(duì)希瓦氏菌屬鑒定的反應(yīng)程序的簡(jiǎn)單修飾將允許在Schizochytrium中合成DHA。原核希瓦氏菌屬和真核Schizochytrium基因之間的同源性表明PUFA PKS進(jìn)行橫向(lateral)基因轉(zhuǎn)移。圖1是來(lái)自Schizochytrium PUFA PKS系統(tǒng)的三個(gè)可讀框的示意圖，且包括該 PUFAPKS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。正如下面實(shí)施例1所述，各可讀框的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)如下可讀框A (OrfA)OrfA的完整核苷酸序列在本文中表示為SEQ ID NO :1。SEQ ID N0:1的核苷酸4677-8730相應(yīng)于美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09Λ31，899中稱為SEQ ID NO 69的序列的核苷酸 390-4443。因此，SEQ ID NO 1的核苷酸1-4676代表在美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09Λ31，899中未公開的另一序列。SEQ ID NO 1的這一新區(qū)域編碼OrfA中的下列結(jié)構(gòu)域(I)ORFA-KS結(jié)構(gòu) 域；(2) ORFA-MAT結(jié)構(gòu)域；和(3)至少部分ACP結(jié)構(gòu)域的區(qū)域(例如，至少ACP結(jié)構(gòu)域1_4)。應(yīng)注意美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09Λ31，899中的SEQ ID NO 69的核苷酸1-389與本文公開的SEQ ID NO :1中位置4677上游的389個(gè)核苷酸不匹配。因此，美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09/231，899中 SEQ ID NO 69的位置1-389似乎錯(cuò)誤地放在該序列的核苷酸390-4443之后。這些前389 個(gè)核苷酸中大多數(shù)(約位置60-389)與本發(fā)明的OrfA(SEQ ID N0:1)上游部分匹配，因此據(jù)信在美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09Λ31，899中在制備連續(xù)的cDNA構(gòu)建體的工作中出現(xiàn)了錯(cuò)誤。在美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09/231，899中出現(xiàn)排序錯(cuò)誤的區(qū)域在高度重復(fù)序列的區(qū)域內(nèi)(S卩，下面討論的ACP區(qū)域)，很可能在從各種cDNA克隆裝配該序列時(shí)產(chǎn)生了某種混淆。OrfA是一個(gè)8730個(gè)核苷酸的序列(不包括終止密碼子)，它編碼本文表示為SEQ ID NO 2的2910個(gè)氨基酸的序列。OrfA內(nèi)有12個(gè)結(jié)構(gòu)域(a) 一個(gè)β -酮脂酰-ACP合酶 (KS)結(jié)構(gòu)域；(b) —個(gè)丙二酰-CoA:ACP酰基轉(zhuǎn)移酶(MAT)結(jié)構(gòu)域；(c) 9個(gè)酰基載體蛋白(ACP)結(jié)構(gòu)域；和(d) 一個(gè)酮還原酶(KR)結(jié)構(gòu)域。OrfA的核苷酸序列以登錄號(hào)AF378327 (氨基酸序列登錄號(hào)AAK728879)保存在 GenBank中。在標(biāo)準(zhǔn)BLAST檢索(在所有6個(gè)可讀框中用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行BLAST 2. 0 Basic BLAST同源性檢索，使用blastp進(jìn)行氨基酸檢索，blastn用于核酸檢索，且blastX用于核酸檢索和翻譯的氨基酸序列檢索，其中，通過(guò)默認(rèn)篩選查詢序列的低復(fù)雜性區(qū)域(在 Altschul, S. F. ,Madden, Τ. L. , Schaaffer, Α. Α. , Zhang, J. , Zhang, Ζ.，Miller,W.& Lipman, D. J. (1997)，“間隔的BLAST和PSI -BLAST 新產(chǎn)生的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索程序”。Nucleic AcidsRes. 25 =3389-3402中描述，本文引用以其整體作為參考))中比較了 OrfA與已知的序列。在核酸水平上，OrfA與任何已知的核苷酸序列沒(méi)有明顯的同源性。在氨基酸水平上，與ORFA同源性程度最高的序列是念珠藻屬種類7120異型囊胞糖脂合酶(登錄號(hào) NC_003272)，它與 ORFA在 1001 個(gè)氨基酸殘基上有42%相同；和Moritella marinus (Vibrio marinus) 0RF8 (登錄號(hào)AB025342)，它與ORFA在993個(gè)氨基酸殘基上有40%相同。OrfA的第一個(gè)結(jié)構(gòu)域是KS結(jié)構(gòu)域，本文也稱為0RFA-KS。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從SEQ ID NO :1 (OrfA)的約位置1和40之間的起始位點(diǎn)到SEQID NO 1的約位置1428和 1500之間的終止位點(diǎn)的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼ORFA-KS結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列在本文中表示為SEQ ID NO :7(SEQID NO 1的位置1-1500)。含有KS結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ ID NO 2 (ORFA)的約位置1和14之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 2的約位置476和 500之間的終止位點(diǎn)。含有ORFA-KS結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為SEQID NO :8(SEQ ID NO 2的位置1-500)。應(yīng)注意ORFA-KS結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)活性位點(diǎn)基序DXA(f(*?；Y(jié)合位
占Γ )根據(jù)本發(fā)明，具有3-酮脂酰-ACP合酶(KS)生物學(xué)活性(功能)的結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)鑒定為完成FAS(和PKS)延長(zhǎng)反應(yīng)循環(huán)起始步驟的酶。用于延長(zhǎng)的?；鶊F(tuán)通過(guò)硫酯鍵連接到酶活性位點(diǎn)的半胱氨酸殘基上。在多步反應(yīng)中，酰基酶進(jìn)行與丙二酰-ACP的縮合形成酮脂酰-ACP，CO2和游離酶。KS在延長(zhǎng)循環(huán)中起關(guān)鍵作用且在許多系統(tǒng)中表現(xiàn)出比該反應(yīng)循環(huán)中的其它酶具有更大的底物特異性。例如，大腸桿菌具有三個(gè)不同的KS酶，它們?cè)谠撋矬w的生理學(xué)中分別具有各自特定的作用(Magnuson等，Microbiol. Rev. 57， 522(1993))。PUFA-PKS系統(tǒng)的這兩個(gè)KS結(jié)構(gòu)域在PUFA生物合成反應(yīng)程序中具有不同的作用。作為一類酶，KS已被充分鑒定。許多證實(shí)的KS基因的序列是已知的，已經(jīng)鑒定了活性位點(diǎn)基序且測(cè)定了一些的晶體結(jié)構(gòu)。由于屬于KS酶家族，通過(guò)與已知KS序列的同源性可容易地鑒定該蛋白質(zhì)。OrfA的第二個(gè)結(jié)構(gòu)域是MAT結(jié)構(gòu)域，本文也稱為ORFA MAT。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從SEQ ID NO :1 (OrfA)的約位置1723和1798之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 1的約位置 2805和3000之間的終止位點(diǎn)的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼ORFA-MAT結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO :9(SEQ ID NO 1的位置1723-3000)。含有MAT結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ ID NO 2 (ORFA)的約位置575和600之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO :2的約位置935和1000之間的終止位點(diǎn)。含有ORFA-MAT結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為SEQ ID NO 10 (SEQ ID NO 2的位置575-1000)。應(yīng)注意該ORFA-MAT結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)活性位點(diǎn) 基序:GHS*XG(*酰基結(jié)合位點(diǎn)S7J，本文表示為SEQ ID NO 110
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根據(jù)本發(fā)明，具有丙二酰-CoA: ACP?；D(zhuǎn)移酶(MAT)生物學(xué)活性(功能)的結(jié)構(gòu) 域或蛋白質(zhì)鑒定為從丙二酰-CoA轉(zhuǎn)移丙二酰半分子到ACP的結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)。除了該活性位點(diǎn)基序(GxSxG)外，這些酶具有一個(gè)延長(zhǎng)的基序和關(guān)鍵位置的Q氨基酸，因此將它們鑒定為MAT酶(與Schizochytrium Orf B的AT結(jié)構(gòu)域相反)。在一些PKS系統(tǒng)(但不是 PUFA PKS結(jié)構(gòu)域)中，MAT結(jié)構(gòu)域優(yōu)先將甲基-或乙基-丙二酰裝載到ACP基團(tuán)上(從相應(yīng)的CoA酯)，從而在線型碳鏈中導(dǎo)入分支。MAT結(jié)構(gòu)域可通過(guò)其與已知MAT序列的同源性和其延長(zhǎng)的基序結(jié)構(gòu)被識(shí)別。OrfA的結(jié)構(gòu)域3_11是9個(gè)串連的ACP結(jié)構(gòu)域，本文也稱為ORFA-ACP(該序列的第一個(gè)結(jié)構(gòu)域是0RFA-ACP1，第二個(gè)結(jié)構(gòu)域是0RFA-ACP2，第三個(gè)結(jié)構(gòu)域是0RFA-ACP3，等)。第一個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域，即0RFA-ACP1包含在覆蓋從SEQ ID NO=I(OrfA)的約位置3343到約位置3600的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼0RFA-ACP1結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO 12 (SEQ ID NO 1的位置3343-3600)。含有第一個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從 SEQ ID NO 2的約位置1115到約位置1200。含有0RFA-ACP1結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在本文中表示為SEQ ID NO 13 (SEQ ID NO 2的位置1115-1200)。應(yīng)注意該ORFA-ACP1結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)活性位點(diǎn)基序LGIDS*(*泛酰巰基乙胺結(jié)合基序S1157)，本文以SEQ IDNO 14表示。所有9個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域的核苷酸和氨基酸序列高度保守且，因此各結(jié)構(gòu)域的序列在本文中沒(méi)有用單獨(dú)的序列標(biāo)識(shí)符表示。然而，根據(jù)本文公開的信息，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地測(cè)定含有其它8個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域中每一個(gè)的序列(參見下面的討論)。所有9個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域一起覆蓋從SEQ ID NO 1的約位置3283到約位置6288的 OrfA區(qū)域，它相應(yīng)于SEQ ID NO 2從約1095到約2096的氨基酸位置。含有所有9個(gè)結(jié)構(gòu) 域的全部ACP區(qū)域的核苷酸序列在本文中表示為SEQ ID N0:16。以SEQ ID N0:16表示的區(qū)域包括各個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域之間的接頭片段。9個(gè)結(jié)構(gòu)域的重復(fù)間隔為SEQ ID N0:16中約每隔330個(gè)核苷酸(相鄰活性位點(diǎn)絲氨酸之間測(cè)定的實(shí)際氨基酸數(shù)目范圍從104到116個(gè) 氨基酸)。9個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域中每個(gè)含有一個(gè)泛酰巰基乙胺結(jié)合基序LGIDS*(本文中以SEQ ID NO 14表示)，其中S*是泛酰巰基乙胺結(jié)合位點(diǎn)絲氨酸(S)。泛酰巰基乙胺結(jié)合位點(diǎn)絲氨酸(S)位于各ACP結(jié)構(gòu)域序列的中心。ACP結(jié)構(gòu)域區(qū)域的每個(gè)末端和各ACP結(jié)構(gòu)域之間是高度富含脯氨酸(P)和丙氨酸(A)的區(qū)域，據(jù)信它是接頭區(qū)域。例如，ACP結(jié)構(gòu)域1和2 之間是序列APAPVKAAAPAAPVASAPAPA，本文表示為SEQ ID NO: 15。9個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域中每一個(gè)的活性位點(diǎn)絲氨酸殘基(即，泛酰巰基乙胺結(jié)合位點(diǎn))的位置，相對(duì)于SEQ ID N0:2的氨基酸序列如下=ACPl = S1157 ；ACP2 = S1266 ；ACP3 = S1377 ；ACP4 = S1488 ；ACP5 = S1604 ；ACP6 = S1715 ；ACP7 = S1819 ；ACP8 = S1930 ；和ACP9 = S2(134。由于ACP結(jié)構(gòu)域的平均大小是約85個(gè)氨基酸，不包括接頭，且包括接頭為約110個(gè)氨基酸，且活性位點(diǎn)絲氨酸約位于該結(jié)構(gòu)域的中心，因此本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地測(cè)定OrfA中9個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域中每一個(gè)的位置。根據(jù)本發(fā)明，具有?；d體蛋白(ACP)生物學(xué)活性(功能)的結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)鑒定為小多肽(一般80到100個(gè)氨基酸長(zhǎng))，它通過(guò)與該蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合的輔因子的硫酯鍵連接用作延長(zhǎng)脂肪酸鏈的載體。它們作為分離的單位或者作為更大蛋白質(zhì)內(nèi)的結(jié)構(gòu)域存在。ACPs通過(guò)將CoA的磷酸泛酰巰基乙胺基(phosphopantetheinyl)半分子轉(zhuǎn)移到ACP高度保守的絲氨酸殘基上從失活的無(wú)活性形式轉(zhuǎn)變成有功能的有活性形式。?；鶊F(tuán)通過(guò)在磷酸泛酰巰基乙胺基半分子游離末端的硫酯鍵附著到ACP上。通過(guò)用放射性泛酰巰基乙胺
32標(biāo)記和通過(guò)與已知ACPs的序列同源性可鑒定ACPs。存在上述基序(LGIDS*)的變異體也是 ACP的一個(gè)標(biāo)記。OrfA中的結(jié)構(gòu)域12是KR結(jié)構(gòu)域，本文也稱為0RFA-KR。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從 SEQ ID NO 1的約位置6598的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 1的約位置8730的終止位點(diǎn)的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼ORFA-KR結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO 17 (SEQ ID NO :1的位置6598-8730)。含有KR結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ ID NO 2 (ORFA)的約位置2200的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 2的約位置2910的終止位點(diǎn)。含有ORFA-KR結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為SEQ ID NO 18 (SEQ ID NO :2的位置2200-2910)。KR結(jié)構(gòu)域內(nèi)具有與短鏈乙醛脫氫酶(KR是該家族的一個(gè)成員)同源的核心區(qū)。該核心區(qū)跨越從SEQ ID NO 1的約位置7198至約位置7500，它相應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸位置2400-2500。根據(jù)本發(fā)明，具有酮還原酶活性，也稱為3-酮脂酰-ACP還原酶(KR)生物學(xué)活性 (功能)的結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)鑒定為催化ACP的3-酮脂酰形式的吡啶_核苷_依賴型還原的結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)。它是脂肪酸從頭生物合成延長(zhǎng)循環(huán)中的第一個(gè)還原步驟和通常在聚酮化合物生物合成中進(jìn)行的反應(yīng)。觀察到與烯酰ACP還原酶(ER)的一個(gè)家族，F(xiàn)AS的另一還原酶(但不是在PUFA PKS系統(tǒng)中存在的ER家族)，和短鏈乙醇脫氫酶家族有明顯的序列相似性。對(duì)上述PUFA PKS區(qū)域的Pfam分析揭示了在核心區(qū)與短鏈乙醇脫氫酶家族的同源性。對(duì)相同區(qū)域的Blast分析揭示了核心區(qū)與已知的KR酶匹配且延長(zhǎng)區(qū)與其它已鑒定的 PUFAPKS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域同源?？勺x框B (OrfB)OrfB的完整核苷酸序列在本文中表示為SEQ ID NO :3。SEQ ID NO :3的核苷酸1311-6177相應(yīng)于美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09Λ31，899中稱為SEQ ID N0:71的序列的核苷酸 1-4867 (在美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09/231，899中該cDNA序列在終止密碼子之外含有約345個(gè)另外的核苷酸，包括PolyA尾)。因此，SEQ IDNO 1的核苷酸1-1310代表在美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào) 09/231, 899中未公開的另一序列。SEQ ID NO 3的這一新區(qū)域含有由OrfB編碼的KS結(jié)構(gòu) 域的大部分。OrfB是一個(gè)6177個(gè)核苷酸的序列(不包括終止密碼子)，它編碼一個(gè)2059個(gè)氨基酸的序列，本文表示為SEQ ID NO :4。OrfB內(nèi)有4個(gè)結(jié)構(gòu)域(a) —個(gè)β -酮脂酰-ACP 合酶(KS)結(jié)構(gòu)域；(b) —個(gè)鏈長(zhǎng)因子(CLF)結(jié)構(gòu)域；(c) 一個(gè)?；D(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域；和， (d) 一個(gè)烯酰ACP-還原酶(ER)結(jié)構(gòu)域。OrfB的核苷酸序列以登錄號(hào)AF378328(氨基酸序列登錄號(hào)AAK728880)保存在 GenBank中。按上述標(biāo)準(zhǔn)BLAST檢索比較了 OrfB與已知序列。在核酸水平上，OrfB與任何已知的核苷酸序列沒(méi)有明顯的同源性。在氨基酸水平上，與ORFB同源性程度最大的序列是與ORFB在458個(gè)氨基酸殘基上有53 %相同性的希瓦氏菌屬種類假定蛋白(登錄號(hào)U73935)；與ORFB在460個(gè)氨基酸殘基上有53%相同性的Moritella marinus (Vibrio marinus) ORFl 1 (登錄號(hào)AB025342)；與ORFB在457個(gè)氨基酸殘基上有52 %相同性的 Photobacterium profundum ω-3 多不飽和脂肪酸合酶PfaD (登錄號(hào)AF409100)；和與 ORFB 在430個(gè)氨基酸殘基上有53 %相同性的念珠藻屬種類7120假定蛋白(登錄號(hào)NC_003272)。OrfB中的第一個(gè)結(jié)構(gòu)域是KS結(jié)構(gòu)域，本文也稱為0RFB-KS。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從SEQ ID NO 3 (OrfB)的約位置1和43之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 3的約位置1332和1350之間的終止位點(diǎn)的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼ORFB-KS結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO 19 (SEQ ID NO :3的位置1-1350)。含有KS結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從 SEQID NO 4 (ORFB)的約位置1和15之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 4的約位置444和450 之間的終止位點(diǎn)。含有ORFB-KS結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為SEQ ID NO 20 (SEQ ID NO 4的位置1-450)。應(yīng)注意ORFB-KS結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)活性位點(diǎn)基序DXA(f(*?；Y(jié)合位點(diǎn)C196)。KS的生物學(xué)活性和鑒定具有該活性的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的方法在上文中描述。OrfB中的第二個(gè)結(jié)構(gòu)域是CLF結(jié)構(gòu)域，本文也稱為0RFB-CLF。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從SEQ ID NO 3 (OrfB)的約位置1378和1402之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO :3的約位置 2682和2700之間的終止位點(diǎn)的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼ORFB-CLF結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO 21 (SEQ ID NO 3的位置1378-2700)。含有CLF結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ ID NO 4 (ORFB)的約位置460和468之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 4 的約位置894和900之間的終止位點(diǎn)。含有ORFB-CLF結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為SEQ ID NO 22 (SEQ ID NO 4的位置460-900)。應(yīng)注意ORFB-CLF結(jié)構(gòu)域含有KS活性位點(diǎn)基序但沒(méi)有結(jié)合?；陌腚装彼?。根據(jù)本發(fā)明，一個(gè)結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)根據(jù)下面的理論稱為鏈長(zhǎng)因子(CLF)。CLF最初描述為具有II型(分離的酶)PKS系統(tǒng)的特征且假定在確定延長(zhǎng)循環(huán)的次數(shù)，從而確定終產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)中起作用。CLF的氨基酸序列與KS結(jié)構(gòu)域具有同源性(且認(rèn)為與KS蛋白質(zhì)形成異二聚體)，但是它們沒(méi)有活性位點(diǎn)半胱氨酸。CLF在PKS系統(tǒng)中的作用目前尚有爭(zhēng)議。新證據(jù)(C. Bisang等，Nature401,502(1999))表明在PKS系統(tǒng)的引發(fā)中起作用(提供需要延長(zhǎng)的起始?；鶊F(tuán))。在該作用中，據(jù)認(rèn)為CLF結(jié)構(gòu)域使丙二酸鹽(以丙二酰-ACP)去羧基，從而形成可轉(zhuǎn)移到KS活性位點(diǎn)的乙酸基團(tuán)。因此該乙酸鹽充當(dāng)可進(jìn)行起始延長(zhǎng)(縮合)反應(yīng)的“引發(fā)”分子。已經(jīng)鑒定了 II型CLF的同源物在一些模塊型PKS系統(tǒng)中是“裝載”結(jié)構(gòu)域。具有CLF序列特征的結(jié)構(gòu)域在所有目前鑒定的PUFAPKS系統(tǒng)中均被發(fā)現(xiàn)且在各種情況下均發(fā)現(xiàn)它是多結(jié)構(gòu)域蛋白的一部分。在OrfB中的第三個(gè)結(jié)構(gòu)域是AT結(jié)構(gòu)域，本文也稱為0RFB-AT。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從SEQ ID NO 3 (OrfB)的約位置2701和3598之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 3的約位置3975和4200之間的終止位點(diǎn)的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼ORFB-AT結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO 23 (SEQ ID NO 3的位置2701-4200)。含有AT結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ ID NO 4 (ORFB)的約位置901和1200之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 4的約位置1325和1400之間的終止位點(diǎn)。含有ORFB-AT結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為 SEQ ID NO 24 (SEQ ID NO :4的位置901-1400)。應(yīng)注意該ORFB-AT結(jié)構(gòu)域含有活性位點(diǎn)基序GxSlG (*?；Y(jié)合位S114tl),它是酰基轉(zhuǎn)移酶(AT)蛋白的特征?！磅；D(zhuǎn)移酶”或“AT”是指能進(jìn)行許多不同?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的一大類酶。 Schizochytrium結(jié)構(gòu)域與目前檢查的所有其它PUFA PKS系統(tǒng)中存在的結(jié)構(gòu)域具有較好的同源性且與鑒定為具有特異性功能的一些?；D(zhuǎn)移酶(例如，與丙二酰-CoA:ACP?；D(zhuǎn)移酶，MAT)具有極弱的同源性。盡管與MAT的同源性弱，據(jù)信該AT結(jié)構(gòu)域不起MAT的作用，因?yàn)樗痪哂性撁傅难娱L(zhǎng)基序結(jié)構(gòu)特征(參見上文的MAT結(jié)構(gòu)域描述)。為了本說(shuō)明書的目的，PUFAPKS系統(tǒng)中的AT結(jié)構(gòu)域的功能包括，但不限于將脂肪?；鶑腛RFA ACP結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移到水上(即，硫酯酶_以游離脂肪酸釋放脂肪?；?，將脂肪酰基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到諸如CoA
34的受體上，在各種ACP結(jié)構(gòu)域之間轉(zhuǎn)移?；?，或者將脂肪?；D(zhuǎn)移到親脂受體分子(例如，溶血磷脂酸)上。OrfB中的第四個(gè)結(jié)構(gòu)域是ER結(jié)構(gòu)域，本文也稱為0RFB-ER。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從SEQ ID NO 3 (OrfB)的約位置4648的起始位點(diǎn)到SEQ IDNO 3的約位置6177的終止位點(diǎn)的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼ORFB-ER結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO 25 (SEQ ID NO :3的位置4648-6177)。含有ER結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ ID NO 4 (ORFB)的約位置1550的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO :4的約位置2059的終止位點(diǎn)。含有 ORFB-ER結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為SEQ ID NO 26 (SEQ ID NO :4的位置1550-2059)。根據(jù)本發(fā)明，該結(jié)構(gòu)域具有烯酰還原酶(ER)的生物學(xué)活性。ER酶還原脂酰-ACP 中的反式雙鍵(由DH活性導(dǎo)入)，導(dǎo)致這些碳完全飽和。PUFA PKS中的ER結(jié)構(gòu)域與新鑒定的ER酶家族(Heath等，Nature 406，145 (2000))具有同源性。Heath和Rock通過(guò)從肺炎鏈球菌克隆目的基因，純化從該基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，并表明它在體外試驗(yàn)中具有ER活性鑒定了 ER酶的這一新類型。OrfB的Schizochytrium ER結(jié)構(gòu)域的序列與肺炎鏈球菌ER蛋白質(zhì)具有同源性。目前檢查的所有PUFA PKS系統(tǒng)均含有至少一個(gè)具有與SchizochytriumER 結(jié)構(gòu)域同源性極高的序列的結(jié)構(gòu)域。Schizochytrium PUFA PKS系統(tǒng)含有兩個(gè)ER結(jié)構(gòu)域 (一個(gè)在OrfB上，一個(gè)在OrfC上)?？勺x框C (OrfC)OrfC的完整核苷酸序列在本文中表示為SEQ ID NO :5。SEQ ID NO :5的核苷酸 1-4509 (即，完整可讀框序列，不包括終止密碼子)相應(yīng)于美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09/231，899中稱為SEQ ID NO 76的序列的核苷酸145-4653 (美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09Λ31，899中的cDNA序列在 OrfC起始密碼子的上游含有約144個(gè)核苷酸且在終止密碼子之后含有約110個(gè)核苷酸，包括PolyA尾)。OrfC是一個(gè)4509個(gè)核苷酸的序列(不包括終止密碼子)，它編碼1503個(gè)氨基酸的序列，本文表示為SEQ ID NO :6。OrfC內(nèi)含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域(a)兩個(gè)FabA-樣β-羥酰-ACP脫水酶(DH)結(jié)構(gòu)域；和(b) —個(gè)烯酰ACP還原酶(ER)結(jié)構(gòu)域。OrfC的核苷酸序列以登錄號(hào)AF378329(氨基酸序列登錄號(hào)AAK728881)保存在 GenBank中。按上述標(biāo)準(zhǔn)BLAST檢索比較了 OrfC與已知序列。在核酸水平上，OrfC與任何已知的核苷酸序列沒(méi)有明顯的同源性。在氨基酸水平(Blastp)上，與ORFC同源性程度最大的序列是與ORFC在514個(gè)氨基酸殘基上有45%相同性的Moritella marinus (Vibrio marinus) ORFlK登錄號(hào)AB025342)；與ORFC在447個(gè)氨基酸殘基上有49%相同性的希瓦氏菌屬種類假定蛋白8 (登錄號(hào)U73935)；與ORFC在430個(gè)氨基酸殘基上有49%相同性的念珠藻屬種類假定蛋白(登錄號(hào)NC_003272)；和與ORFC在930個(gè)氨基酸殘基上有37%相同性的希瓦氏菌屬種類假定蛋白7(登錄號(hào)U73935)。OrfC中的第一個(gè)結(jié)構(gòu)域是DH結(jié)構(gòu)域，本文也稱為ORFC-DHl。它是OrfC中的兩個(gè) DH結(jié)構(gòu)域之一，因此命名為DH1。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從SEQ ID NO 5 (OrfC)的約位置1 和778之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 5的約位置1233和1350之間的終止位點(diǎn)的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼0RFC-DH1結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO 27 (SEQ ID NO 5的位置1-1350)。含有DHl結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ ID NO 6 (ORFC)的約位置1和260之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 6的約位置411和450之間的終止位點(diǎn)。含有 0RFC-DH1結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為SEQ ID NO :28(SEQ ID NO 6的位置1-450)。
PUFA PKS系統(tǒng)中兩個(gè)DH結(jié)構(gòu)域(見下文DH2)的特征已經(jīng)在前面部分中描述。這類酶從β “酮脂酰-ACP去掉HOH并在碳鏈中留下反式雙鍵。PUFAPKS系統(tǒng)的DH結(jié)構(gòu)域與細(xì) 菌的FAS系統(tǒng)相關(guān)性DH酶(而不是其它PKS系統(tǒng)的DH結(jié)構(gòu)域)具有同源性。細(xì)菌DH的一個(gè)亞型，即 FabA-樣DH,具有順?lè)串悩?gòu)酶活性(Heath 等，J. Biol. Chem. ,271, 27795 (1996))。它與FabA-樣DH具有同源性表明DH結(jié)構(gòu)域之一或者兩個(gè)同時(shí)負(fù)責(zé)在PUFA PKS產(chǎn)物中插入順式雙鍵。OrfC中的第二個(gè)結(jié)構(gòu)域是DH結(jié)構(gòu)域，本文也稱為0RFC-DH2。它是OrfC中兩個(gè) DH結(jié)構(gòu)域的第二個(gè)，因此命名為DH2。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從SEQ ID NO 5 (OrfC)的約位置1351和2437之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 5的約位置2607和2850之間的終止位點(diǎn) 的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼0RFC-DH2結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO 29 (SEQ IDNO 5的位置1351-2850)。含有DH2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ ID NO 6 (ORFC)的約位置451和813之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 6的約位置869和950之間的終止位點(diǎn)。含有0RFC-DH2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為SEQ ID NO 30 (SEQ ID NO :6的位置451-950)。DH的生物學(xué)活性已在上文中描述。OrfC中的第三個(gè)結(jié)構(gòu)域是ER結(jié)構(gòu)域，本文也稱為0RFC-ER。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從SEQ ID NO 5 (OrfC)的約位置2998的起始位點(diǎn)到SEQ IDNO 5的約位置4509的終止位點(diǎn)的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼ORFC-ER結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO 31 (SEQ ID NO 5的位置2998-4509)。含有ER結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ ID NO 6 (ORFC)的約位置1000的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO :6的約位置1502的終止位點(diǎn)。含有 ORFC-ER結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為SEQ ID NO 32 (SEQ ID NO :6的位置1000-1502)。 ER的生物學(xué)活性已在上文中描述。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及含有來(lái)自非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的核酸序列，其同源物，其片段，和/或與任一該核酸序列互補(bǔ)的核酸序列的分離的核酸分子。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及含有選自下組的核酸序列的分離核酸分子(a)編碼選自由SEQ ID N0:2,SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :6及其生物學(xué)活性片段組成的組中的氨基酸序列的核酸序列；(b)編碼選自 SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :13，SEQ ID NO :18，SEQ ID NO :20，SEQ IDNO 22，SEQ ID NO :24，SEQ ID NO :26，SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，SEQ 18，SEQ ID NO :30， SEQ ID NO :32，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；(c)編碼與(a)所述氨基酸序列的至少500個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；(d)編碼與(b)所述氨基酸序列有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè) 結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；或(e)與(a)，(b)，(c)，或(d)的核酸序列完全互補(bǔ)的核酸序列。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含編碼幾個(gè)PUFA PKS結(jié)構(gòu)域的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域或上述其它功能基序的序列的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明，具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性的氨基酸序列是具有以Schizochytrium PUFA PKS系統(tǒng)例證的，本文詳細(xì)描述的PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè) 結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性的氨基酸序列。Schizochytrium PUFA PKS系統(tǒng)內(nèi)的各結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性已在上文中詳細(xì)描述。因此，本發(fā)明的分離的核酸分子可編碼任一 PUFA PKS可讀框
36的翻譯產(chǎn)物，PUFA PKS結(jié)構(gòu)域，其生物學(xué)活性片段，或天然PUFA PKS可讀框或具有生物學(xué) 活性的結(jié)構(gòu)域的任一同源物。給定蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的同源物是具有與天然對(duì)照氨基酸序列(即，對(duì)照蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域)區(qū)別在于有一個(gè)或幾個(gè)，但不限于一個(gè)或幾個(gè)的氨基酸缺失 (例如，蛋白質(zhì)的截短形式，如肽或片段)，插入，顛倒，取代和/或衍生化(例如，通過(guò)糖基化，磷酸化，乙?；?，豆蔻?；?，異戊二烯化，棕櫚酸化，酰胺化和/或添加糖基磷脂酰肌醇) 的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或多肽。PUFA PKS蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的優(yōu)選同源物在下文詳細(xì)描述。應(yīng)注意同源物可包括合成產(chǎn)生的同源物，給定蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的天然等位變異體，或來(lái)自不同于產(chǎn)生對(duì)照序列的生物的生物體的同源序列。一般來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性或生物學(xué)作用是指體內(nèi)(即，在該蛋白質(zhì)的天然生理學(xué)環(huán)境中)或體外(即，在實(shí)驗(yàn)室條件下)測(cè)量或觀察時(shí)由該蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu) 域表現(xiàn)或完成的歸因于該蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的天然存在形式的任何功能。PUFA PKS系統(tǒng)和組成PUFA PKS系統(tǒng)的單個(gè)蛋白質(zhì)/結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性本文在別處有詳細(xì)描述。蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的修飾，例如在同源物或模擬物(在下面討論)中的修飾可產(chǎn)生與天然蛋白質(zhì)或結(jié) 構(gòu)域具有相同生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域，或者產(chǎn)生與天然蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域相比具有降低或增加的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域。導(dǎo)致蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域表達(dá)降低或活性降低的修飾可稱為蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的失活(完全或部分)，下調(diào)，或作用減小。同樣，導(dǎo)致蛋白質(zhì)或結(jié) 構(gòu)域的表達(dá)增加或活性增加的修飾可稱為蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的放大，超產(chǎn)，活化，增強(qiáng)，上調(diào) 或作用增加。PUFA PKS系統(tǒng)的功能域是能夠完成生物學(xué)功能(即，具有生物學(xué)活性)的結(jié) 構(gòu)域(即，結(jié)構(gòu)域可以是蛋白質(zhì)的一部分)。根據(jù)本發(fā)明，分離的核酸分子是從其天然環(huán)境中取出(即，對(duì)其進(jìn)行了人工操作) 的核酸分子，其天然環(huán)境是天然狀態(tài)下發(fā)現(xiàn)該核酸分子的基因組或染色體。因此，“分離的” 不必反映該核酸分子被純化的程度，但是表明該核酸分子不包括天然狀況下發(fā)現(xiàn)該核酸分子的完整基因組或完整染色體。分離的核酸分子可包括基因。包括基因的分離的核酸分子不是包括該基因的染色體的一個(gè)片段，而是包括編碼區(qū)和與該基因相關(guān)的調(diào)控區(qū)，但是沒(méi) 有在同一染色體中天然發(fā)現(xiàn)的其它基因。分離的核酸分子也可包括一種特定的核酸序列，其側(cè)翼(即，在該序列的5’和/或3’端)為天然狀況下一般不是該特定核酸序列側(cè)翼的其它核酸(即，異源序列)。分離的核酸分子可包括DNA，RNA (即，mRNA)，或DNA或RNA之一的衍生物(例如，cDNA)。盡管短語(yǔ)“核酸分子”主要是指物理學(xué)核酸分子且短語(yǔ)“核酸序列”主要是指核酸分子上的核苷酸序列，但是兩個(gè)短語(yǔ)可交換使用，特別是對(duì)于能編碼蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域的核酸分子或核酸序列。優(yōu)選的是，使用重組DNA技術(shù)(S卩，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，克隆)或化學(xué)合成產(chǎn)生本發(fā)明的分離的核酸分子。分離的核酸分子包括天然的核酸分子及其同源物，包括，但不限于，天然等位基因變異體和修飾的核酸分子，其中的核苷酸以這樣的方式插入，缺失，取代，和/或顛倒，即該修飾對(duì)本文所述PUFA PKS系統(tǒng)的生物學(xué)活性產(chǎn)生了所需的影響。蛋白質(zhì)同源物(例如，由核酸同源物編碼的蛋白質(zhì))在上文中已有詳細(xì)討論?？墒褂帽绢I(lǐng)域的技術(shù)人員已知的許多方法來(lái)產(chǎn)生核酸分子同源物(參見，例如， Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory ManualiCold SpringHarbor Labs Press, 1989)。例如，可使用各種技術(shù)修飾核酸分子，該技術(shù)包括，但不限于，傳統(tǒng)誘變技術(shù)和重組 DNA技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變，化學(xué)處理核酸分子以誘導(dǎo)突變，限制性酶裂解核酸片段，連接核酸片段，核酸序列選定區(qū)域的PCR擴(kuò)增和/或誘變，合成寡核苷酸混合物并連接混合物組以 “構(gòu)建”核酸分子的混合體及其組合。通過(guò)篩選核酸編碼的蛋白質(zhì)的功能和/或通過(guò)與野生型基因雜交可從修飾的核酸混合物中選擇核酸分子同源物。本發(fā)明的核酸分子大小的最小值是足以形成探針或寡核苷酸引物的大小，該探針或寡核苷酸引物與本發(fā)明中有用的核酸分子的互補(bǔ)序列能夠形成穩(wěn)定的雜交體(例如，在中等，高度或極高嚴(yán)格條件下)，或者其大小足以編碼具有根據(jù)本發(fā)明的PUFA PKS系統(tǒng) 的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性的氨基酸序列。因此，編碼這一蛋白質(zhì)的核酸分子的大小取決于核酸組成和核酸分子與互補(bǔ)序列之間的同源性或相同性百分?jǐn)?shù)以及雜交條件本身 (例如，溫度，鹽濃度，和甲酰胺濃度)。用作寡核苷酸引物或探針的核酸分子大小的最小值一般是如果該核酸分子富含GC則為至少約12個(gè)到約15個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度且如果它們富含 AT則為至少約15到約18個(gè)堿基的長(zhǎng)度。對(duì)本發(fā)明的核酸分子大小的最大值沒(méi)有限制，實(shí) 際的限制是該核酸分子可包含足以編碼PUPA PKS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域的生物活性片段，PUFA PKS 系統(tǒng)的完整結(jié)構(gòu)域，PUFA PKS系統(tǒng)的可讀框(Orf)內(nèi)的幾個(gè)結(jié)構(gòu)域，PUFA PKS系統(tǒng)的一個(gè) 完整的Orf，或PUFA PKS系統(tǒng)的一個(gè)以上的Orf。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸分子含有選自SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :13，SEQ ID NO :18，SEQ ID NO :20，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO :24，SEQID NO :26，SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，SEQ ID NO :32，或其生物活性片段的組中的核酸序列或基本上由其組成。在一個(gè)方面，該核酸序列選自SEQID NO :1，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :7，SEQ ID NO :9，SEQ ID NO :12，SEQ ID NO :17，SEQ ID NO :19，SEQ ID NO :21，SEQ IDNO :23，SEQ ID NO :25，SEQ ID NO 27, SEQ ID NO :29 JPSEQ ID NO 31的組中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可產(chǎn)生在給定氨基酸序列的C-和/或N-末端各側(cè)帶有從至少一個(gè)，到多達(dá)約20個(gè)添加的異源氨基酸的任一上述PUFA PKS的氨基酸序列，以及該序列的同源物。所得的蛋白質(zhì)或多肽可稱為“基本上由給定的氨基酸序列組成”。根據(jù)本發(fā)明，異源性氨基酸是天然狀況下不是在給定氨基酸序列側(cè)翼發(fā)現(xiàn)(即，體內(nèi)天然狀況下未發(fā)現(xiàn))的或在該基因中存在時(shí)如果使用產(chǎn) 生該給定氨基酸序列的生物的標(biāo)準(zhǔn)密碼子用法翻譯天然序列中的該核苷酸時(shí)，不由編碼給定氨基酸序列的天然核酸序列側(cè)翼的核苷酸編碼的氨基酸序列。同樣，短語(yǔ)“基本上由其組成”在本文中當(dāng)用于指核酸序列時(shí)，是指編碼給定氨基酸序列的核酸序列在編碼給定氨基酸序列的核酸序列5’和/或3’末端各側(cè)帶有從至少一個(gè)到多達(dá)約60個(gè)添加的異源核苷酸。異源性核苷酸是在天然基因中存在時(shí)不是在編碼給定氨基酸序列的核酸序列側(cè)翼天然發(fā)現(xiàn)(即，體內(nèi)天然狀況下未發(fā)現(xiàn))的。本發(fā)明還包括分離的核酸分子，它含有編碼具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性的氨基酸序列的核酸序列。在一個(gè)方面，該核酸序列編碼包括SEQ ID NO :2， SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :13，SEQ ID NO :18， SEQ ID NO :20，SEQ IDNO :22，SEQ ID NO :24，SEQ ID NO :26，SEQ ID NO :28，SEQ ID NO 30，或SEQ ID NO :32的任一 Schizochytrium PUFA PKS ORFs或結(jié)構(gòu)域的同源物，其中該同源物具有本文前面所述PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明包含的Schizochytrium PUFA PKS蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的同源物含有與選自SEQ ID NO :2,SEQ ID NO :4，和SEQ IDNO :6的氨基酸序列的至少500個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60%相同性的氨基酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。在另一方面，該同源物的氨基酸序列與SEQ ID NO :2， SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :6中任一個(gè)的至少約600個(gè)連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約700個(gè) 連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約800個(gè)連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約900個(gè)連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約1000個(gè)連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約1100個(gè)連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約1200 個(gè)連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約1300個(gè)連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約1400個(gè)連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約1500個(gè)連續(xù)氨基酸，或與SEQ ID NO :6的全長(zhǎng)有至少約60%的相同性。在另一方面，該同源物的氨基酸序列與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :4中任一個(gè)的至少約1600 個(gè)連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約1700個(gè)連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約1800個(gè)連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約1900個(gè)連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約2000個(gè)連續(xù)氨基酸，或與SEQ ID NO 4的全長(zhǎng)有至少約60%的相同性。在另一方面，該同源物的氨基酸序列與SEQ ID N0:2的至少約2100個(gè)連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約2200個(gè)連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約2300個(gè) 連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約2400個(gè)連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約2500個(gè)連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約2600個(gè)連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約2700個(gè)連續(xù)氨基酸，且更優(yōu)選至少約 2800個(gè)連續(xù)氨基酸，且甚至更優(yōu)選與SEQ IDNO 2的全長(zhǎng)有至少約60%的相同性。在另一方面，本發(fā)明包含的Schizochytrium PUFA PKS蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的同源物含有與選自SEQ ID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列在上段所述任一連續(xù)氨基酸長(zhǎng)度上有至少約65%的相同性，且更優(yōu)選至少約70%的相同性，且更優(yōu)選至少約 75%的相同性，且更優(yōu)選至少約80%的相同性，且更優(yōu)選至少約85%的相同性，且更優(yōu)選至少約90 %的相同性，且更優(yōu)選至少約95 %的相同性，且更優(yōu)選至少約96 %的相同性，且更優(yōu)選至少約97%的相同性，且更優(yōu)選至少約98%的相同性，且更優(yōu)選至少約99%的相同性的氨基酸序列，其中該氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明包含的Schizochytrium PUFA PKS蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的同源物含有與選自SEQ ID NO :8,SEQ ID NO: 10，SEQ ID NO: 13，SEQ ID NO: 18，SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :22，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO -.26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，或 SEQ ID NO :32的氨基酸序列有至少約60%的相同性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。在另一方面，該同源物的氨基酸序列與選自SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :13，SEQID NO :18，SEQ ID NO :20，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO :24，SEQ ID NO :26，SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，或 SEQ ID NO 32 的氨基酸序列有至少約65%的相同性，且更優(yōu)選至少約70%的相同性，且更優(yōu)選至少約75% 的相同性，且更優(yōu)選至少約80%的相同性，且更優(yōu)選至少約85%的相同性，且更優(yōu)選至少約90%的相同性，且更優(yōu)選至少約95%的相同性，且更優(yōu)選至少約96%的相同性，且更優(yōu) 選至少約97%的相同性，且更優(yōu)選至少約98%的相同性，且更優(yōu)選至少約99%的相同性，其中該氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“鄰近的”或“連續(xù)的”對(duì)于本文所述核酸或氨基酸序列是指以不中斷的序列相連。例如，對(duì)于第一個(gè)序列含有第二個(gè)序列的30個(gè)相鄰(或連續(xù))的氨基酸，是指第一個(gè)序列包含與第二個(gè)序列中30個(gè)氨基酸殘基的不中斷的序列具有100%相同性的30個(gè)氨基酸殘基的不中斷的序列。同樣，對(duì)于第一個(gè)序列與第二個(gè)序列具有“100%相同性”是指第一個(gè)序列與第二個(gè)序列完全匹配，在核苷酸或氨基酸之間沒(méi)有間隔。
如本文所用，除非另有說(shuō)明，對(duì)于相同性百分?jǐn)?shù)(％)是指使用(1)在所有6個(gè) 可讀框中用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行BLAST 2.0 Basic BLAST同源性檢索，使用blastp進(jìn)行氨基酸檢索，blastn用于核酸檢索，且blastX用于核酸檢索和翻譯的氨基酸檢索，其中，通過(guò) 默認(rèn)篩選查詢序列的低復(fù)雜性區(qū)域(在Altschul，S. F.，Madden, Τ. L.，Schaaffer，Α. A.， Zhang, J.，Zhang, Ζ.，Miller, W. &Lipman, D. J. (1997)，“間隔的 BLAST 和 PSI-BLAST 新產(chǎn) 生的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索程序”。Nucleic Acids Res. 25 :3389_3402中描述，本文引用以其整體作為參考)；(2)BLAST 2序列對(duì)比(使用下述參數(shù))；(3)和/或使用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)參數(shù) 的PSI-BLAST(位置特異性重復(fù)BLAST)進(jìn)行的同源性評(píng)估。應(yīng)注意由于BLAST 2. OBasic BLAST和BLAST 2之間在標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)上的一些區(qū)別，兩個(gè)特定序列使用BLAST 2程序可能認(rèn) 為具有明顯的同源性，而使用一個(gè)序列作為查詢序列以BLAST 2.0 Basic BLAST進(jìn)行檢索時(shí)在最匹配的序列中可能沒(méi)有鑒定出第二個(gè)序列。另外，PSI-BLAST提供了一個(gè)“提問(wèn)檔 (profile)”檢索的自動(dòng)的，容易使用的版本，它是尋找序列同源性的一個(gè)敏感途徑。該程序首先進(jìn)行有間隔的BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。PSI-BLAST程序使用來(lái)自任何有效序列對(duì)比的信息返回構(gòu)建位置特異性記分矩陣，它代替查詢序列用于下一輪數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。因此，應(yīng)明白可使用這些程序中的任一種測(cè)定相同性百分?jǐn)?shù)。使用Tatusova和Madden，(1999) ,"Blast 2序列-用于比較蛋白質(zhì)和核苷酸序列的一種新工具”，F(xiàn)EMS Microbiol Lett. 174 :247_250所述BLAST 2序列可互相對(duì)比兩個(gè)具體序列，本文引用該文獻(xiàn)以其整體作為參考。使用BLAST 2.0算法以blastp或blastn進(jìn) 行BLAST 2序列對(duì)比，在兩個(gè)序列之間進(jìn)行有間隔的BLAST檢索(BLAST 2.0)允許在所得的序列對(duì)比中引入間隔(，缺失和插入)。為了本文清楚的目的，使用如下標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)參數(shù)進(jìn) 行BLAST 2序列對(duì)比。對(duì)于blastn，使用 0 BL0SUM62 矩陣匹配得分=1錯(cuò)配罰分=_2空出間隔(5)和延伸間隔(2)罰分間隔 _x 下降(dropoff) (50)期望(expect) (10)序列大小(word size) (11)篩選 (上)對(duì)于blastp，使用 0 BL0SUM62 矩陣空出間隔(11)和延伸間隔(1)罰分間隔_x下降(50)期望(10)序列大小(3)篩選(上)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，具有本發(fā)明的PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性的氨基酸序列包括與天然PUFA PKS蛋白質(zhì)或多肽足夠相似以致于編碼該氨基酸序列的核酸序列在中等，高度，或極高嚴(yán)格條件(下文描述)下能夠雜交到(即，與其雜交) 編碼天然PUFA PKS蛋白質(zhì)或多肽的核酸分子(即，編碼天然PUFA PKS蛋白質(zhì)或多肽的核酸鏈的互補(bǔ)鏈)上的氨基酸序列。優(yōu)選的是，具有本發(fā)明的PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu) 域的生物學(xué)活性的氨基酸序列由這樣一種核酸序列編碼，即該核酸序列在中等，高度或極高嚴(yán)格條件下雜交到編碼含有由SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :4，SEQ IDNO :6，SEQ ID NO :8， SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :13，SEQ ID NO :18，SEQ ID NO :20，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO 24，SEQ ID NO 26, SEQ IDNO 28，SEQ ID N0:30，或 SEQ ID NO :32 中任一個(gè)代表的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的核酸序列的互補(bǔ)鏈上。推定互補(bǔ)序列的方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。應(yīng)注意由于氨基酸測(cè)序和核酸測(cè)序技術(shù)不是完全無(wú)誤差的，因此本文提供的序列最多代表本發(fā)明的PUFAPKS結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)的表觀序列。本文使用的雜交條件是指標(biāo)準(zhǔn)雜交條件，在該條件下使用核酸分子鑒定相似的核酸分子。該標(biāo)準(zhǔn)條件在例如，Sambrook 等，Molecular Cloning :ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press，1989中公開。Sambrook等，出處同上，在本文中引用以其整體作為參考(具體參見，第9. 31-9.62頁(yè))。另外，計(jì)算合適的雜交和洗滌條件以完成允許各種程度的核苷酸錯(cuò)配的雜交的公式在例如，Meinkoth等，1984，Anal. Biochem. 138，267-284 中公開；Meinkoth等，出處同上，在本文中引用以其整體作為參考。更具體地說(shuō)，本文提及的中等嚴(yán)格的雜交和洗滌條件是指在雜交反應(yīng)中允許分離與用于探測(cè)的核酸分子具有至少約70%的核酸序列相同性的核酸分子的條件(即，允許約 30%或更少的核苷酸錯(cuò)配的條件)。本文提及的高度嚴(yán)格的雜交和洗滌條件是指在雜交反應(yīng)中允許分離與用于探測(cè)的核酸分子具有至少約80%的核酸序列相同性的核酸分子的條件(即，允許約20%或更少的核苷酸錯(cuò)配的條件)。本文提及的極高嚴(yán)格的雜交和洗滌條件是指在雜交反應(yīng)中允許分離與用于探測(cè)的核酸分子具有至少約90%的核酸序列相同性的核酸分子的條件(即，允許約10%或更少的核苷酸錯(cuò)配的條件)。如上所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用Meinkoth等，出處同上中的公式計(jì)算合適的雜交和洗滌條件以達(dá)到這些特定的核苷酸錯(cuò)配水平。該條件可依賴于形成的是DNA RNA還是DNA DNA雜交體而變化。計(jì)算的DNA DNA雜交體的解鏈溫度比DNA RNA雜交體低10°C。在具體實(shí)施方案中，DNA DNA雜交體的嚴(yán)格雜交條件包括在6X SSC (0. 9M Na+)的離子強(qiáng)度下在約20°C和約35°C之間(低度嚴(yán)格)，更優(yōu)選的是，在約28°C和約40°C之間(更嚴(yán)格)，且甚至更優(yōu)選的是，在約35°C和約45°C之間(甚至更嚴(yán)格)的溫度下，在合適的洗滌條件下的雜交。在具體實(shí)施方案中，DNA RNA雜交體的嚴(yán)格雜交條件包括在6X SSC(0. 9M Na+)的離子強(qiáng)度下在約30°C和約45°C之間，更優(yōu)選的是，在約38°C和約50°C之間，且甚至更優(yōu)選的是，在約 45°C和約55°C之間的溫度下，以同樣嚴(yán)格的洗滌條件的雜交。這些值根據(jù)大于約100個(gè)核苷酸，0%甲酰胺和約40%的G+C含量的分子的解鏈溫度計(jì)算。另外，可按Sambrook等，出處同上，第9. 31至9. 62頁(yè)提供的經(jīng)驗(yàn)計(jì)算Tm值。一般來(lái)說(shuō)，洗滌條件應(yīng)當(dāng)盡可能嚴(yán)格，且對(duì)于選定的雜交條件應(yīng)是合適的。例如，雜交條件可包括鹽和溫度條件的組合，該溫度比計(jì) 算的特定雜交體的Tm低約20-25°C，且洗滌條件一般包括鹽和溫度條件的組合，該溫度比計(jì) 算的特定雜交體的Tm低約12-20°C。適用于DNA DNA雜交體的雜交條件的一個(gè)例子包括在6X SSC(50%甲酰胺)中在約42°C下雜交2-24小時(shí)，接著進(jìn)行洗滌步驟，包括在室溫下在約2X SSC中的一次或多次洗滌，接著在更高溫度和更低離子強(qiáng)度下進(jìn)一步洗滌(例如，在約37°C下在約0. 1X-0. 5X SSC中洗滌至少一次，接著在約68°C下在約0. 1X-0. 5X SSC中洗滌至少一次)。本發(fā)明的另一實(shí)施方案包括含有重組載體和核酸分子的重組核酸分子，其中的核酸分子含有的核酸序列編碼具有本文所述PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性的氨基酸序列。該核酸序列在上文中有詳細(xì)描述。根據(jù)本發(fā)明，重組載體是一種改造的 (即，人工產(chǎn)生的)核酸分子，它用作處理選定核酸序列并將該核酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞的工具。因此重組載體適用于克隆，測(cè)序，和/或處理選定的核酸序列，例如通過(guò)表達(dá)和/或傳遞選定的核酸序列到宿主細(xì)胞中以形成重組細(xì)胞。該載體一般含有異源核酸序列，異源核酸序列是天然狀況下來(lái)發(fā)現(xiàn)與需要克隆或傳遞的核酸序列相連的核酸序列，盡管該載體也可含有天然狀況下發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明的核酸分子相連的或者用于表達(dá)本發(fā)明的核酸分子的調(diào) 控核酸序列(例如，啟動(dòng)子，非翻譯區(qū))(下面詳細(xì)討論)。該載體可以是RNA或者是DNA，是原核的或者真核的，且一般是一種質(zhì)粒。該載體可作為染色體外因子(例如，質(zhì)粒)維持或者可整合進(jìn)重組生物(例如，微生物或植物)的染色體中。該完整載體可在宿主細(xì)胞內(nèi)適當(dāng)保留，或者在某些情況下，可刪除質(zhì)粒DNA，留下本發(fā)明的核酸分子。整合的核酸分子可在染色體啟動(dòng)子控制下，在自身的或質(zhì)粒的啟動(dòng)子控制下，或者在一些啟動(dòng)子的結(jié)合控制下。可整合單個(gè)或多個(gè)拷貝的核酸分子進(jìn)入染色體中。本發(fā)明的重組載體可含有至少一個(gè)選擇標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的重組核酸分子的重組載體是一種表達(dá)載體。本文所用的短語(yǔ)“表達(dá)載體”用于指適合于產(chǎn)生編碼產(chǎn)物(例如，目的蛋白)的載體。在該實(shí) 施方案中，將編碼需要產(chǎn)生的產(chǎn)物(例如，PUFA PKS結(jié)構(gòu)域)的核酸序列插入重組載體中以產(chǎn)生重組核酸分子。編碼需要產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的核酸序列以這樣的方式插入載體中，即將該核酸序列與載體中的調(diào)控序列可操作地連接使得能夠在重組宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和翻譯該核酸序列。在另一實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的重組核酸分子的重組載體是一種定向載體。本文所用的短語(yǔ)“定向載體”用于指這樣一種載體，即它用于將特定核酸分子傳遞進(jìn)重組宿主細(xì)胞，其中該核酸分子用于刪除或滅活宿主細(xì)胞或微生物內(nèi)的內(nèi)源性基因(即，用于定向基因破壞或敲除技術(shù))。該載體本領(lǐng)域也稱為“敲除”載體。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，該載體的一部分，但更典型的是插入載體中的核酸分子(即，插入片段)具有與宿主細(xì)胞中靶基因(即，刪除或失活針對(duì)的基因)的核酸序列同源的核酸序列。載體插入片段的核酸序列設(shè)計(jì)成與靶基因結(jié)合以便靶基因與插入片段進(jìn)行同源重組，從而刪除，滅活或減弱該內(nèi) 源性靶基因(即，通過(guò)突變或刪除至少一部分內(nèi)源性靶基因)。一般來(lái)說(shuō)，重組核酸分子包括與一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列可操作地相連的至少一個(gè)本發(fā)明的核酸分子。本文所用的短語(yǔ)“重組分子”或“重組核酸分子”主要是指與轉(zhuǎn)錄調(diào) 控序列可操作地相連的核酸分子或核酸序列，但是當(dāng)核酸分子是本文討論的重組分子時(shí)，上述短語(yǔ)可與短語(yǔ)“核酸分子”交換使用。根據(jù)本發(fā)明，短語(yǔ)“可操作地相連”是指核酸分子與轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列以這樣的方式相連，即該連接使得該分子轉(zhuǎn)染(即，轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)染，接合或?qū)?進(jìn)宿主細(xì)胞時(shí)能夠表達(dá)。轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列是控制轉(zhuǎn)錄開始，延長(zhǎng)，或終止的序列。特別重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列是那些控制轉(zhuǎn)錄開始的序列，例如啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，操縱子和阻抑序列。合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列包括在該重組核酸分子導(dǎo)入的宿主細(xì)胞或生物體中能起作用的任何轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。本發(fā)明的重組核酸分子也可含有其它調(diào)控序列，例如翻譯調(diào)控序列，復(fù)制起點(diǎn)，和與該重組細(xì)胞相適應(yīng)的其它調(diào)控序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，包括整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體中的那些分子的本發(fā)明的重組分子還含有分泌信號(hào)(即，信號(hào)片段核酸序列)以便使得表達(dá) 的蛋白質(zhì)從產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的細(xì)胞中分泌出來(lái)。合適的信號(hào)片段包括天然狀況下與表達(dá)該蛋白質(zhì)相關(guān)的信號(hào)片段或者能夠指導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)分泌的任何異源性信號(hào)片段。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組分子包含使得表達(dá)蛋白能夠傳遞到宿主細(xì)胞膜上并插入膜中的前導(dǎo)序列。合適的前導(dǎo)序列包括天然狀況下與該蛋白質(zhì)相關(guān)的前導(dǎo)序列，或者能夠指導(dǎo) 該蛋白質(zhì)傳遞并插入細(xì)胞膜中的任何異源性前導(dǎo)序列。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Schizochytrium PUFA PKS Orfs A和B在基因組中緊密相連并測(cè)序了 Orfs之間的區(qū)域。Orfs以相反的方向排列且有4244個(gè)堿基對(duì)分開起始(ATG)密碼子(即，它們排列如下3，0rfA5，-4244bp-5，0rfB3，)。檢查4244bp的基因間區(qū)域沒(méi)有揭示出任何明顯的Orfs (在BlastX檢索中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的匹配)。Orfs A和B兩者在Schizochytrium中至少在產(chǎn)油期間都高度表達(dá)，意味著在該基因間區(qū)域包含有效啟動(dòng)子元件。據(jù)信這些遺傳因子在轉(zhuǎn)基因應(yīng)用中作為雙向啟動(dòng)子序列具有實(shí)用性。例如，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可克隆該區(qū)域，在其各端放置任意目的基因并將該構(gòu)建體導(dǎo)入 Schizochytrium(或者表明該啟動(dòng)子可發(fā)揮功能的一些其它宿主)中。預(yù)期該調(diào)控元件在合適條件下可為兩個(gè)導(dǎo)入的基因提供同等的高水平表達(dá)。含有Schizochytrium PUFA PKS 調(diào)控元件(例如，啟動(dòng)子)的該調(diào)控區(qū)的完整核苷酸序列本文表示為SEQ ID N0:36。同樣，OrfC在產(chǎn)油期間在Schizochytrium中高度表達(dá)且預(yù)期在其起始密碼子的上游區(qū)域存在調(diào)控元件。已克隆并測(cè)序了 OrfC的基因組DNA的上游區(qū)域并在本文中表示為(SEQ ID N0:37)。該序列含有3886nt，緊靠OrfC起始密碼子的上游。檢查該區(qū)域沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何明顯的Orfs (即，在BlastX檢索中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的匹配)。據(jù)信在該區(qū)域包含的調(diào)控元件在合適的條件下可為放在其后的基因提供高水平的表達(dá)。另外，在合適條件下，該表達(dá)水平與在A-B基因間區(qū)域(SEQ ID NO 36)控制下的基因等同。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，按本文所述用于本發(fā)明的重組核酸分子可包括SEQ ID NO 36和/或SEQ ID NO 37內(nèi)包含的PUFA PKS調(diào)控區(qū)。該調(diào)控區(qū)可包括至少具有基本 PUFA PKS轉(zhuǎn)錄活性的SEQ ID NO 36和/或SEQID NO 37的任一部分(片段)?？墒褂帽景l(fā)明的一種或多種重組分子產(chǎn)生本發(fā)明的編碼產(chǎn)物(例如，PUFA PKS結(jié) 構(gòu)域，蛋白質(zhì)，或系統(tǒng))。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在有效產(chǎn)生蛋白質(zhì)的條件下表達(dá)本文所述核酸分子來(lái)生產(chǎn)編碼產(chǎn)物。產(chǎn)生編碼蛋白的優(yōu)選方法是通過(guò)用一種或多種重組分子轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞以形成重組細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)染的合適宿主細(xì)胞包括，但不限于，可被轉(zhuǎn)染的任何細(xì)菌，真菌(例如，酵母)，昆蟲，植物或動(dòng)物細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或者是已被至少一個(gè)其它重組核酸分子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”用于指可將外源性核酸分子(即，重組核酸分子)插入細(xì)胞中的任一方法。術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”當(dāng)用于指將核酸分子導(dǎo)入微生物細(xì)胞，例如藻類，細(xì)菌和酵母時(shí)，可與術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”交換使用。在微生物系統(tǒng)中，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”用于描述由于該微生物獲得外源性核酸的遺傳改變且與術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”基本上同義。然而，在動(dòng)物細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化被賦予了第二種含義，例如，它可指細(xì)胞變成癌細(xì)胞后在培養(yǎng)中生長(zhǎng)特性的改變。因此，為了避免混淆，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”優(yōu)選用于將外源核酸導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的情況，且本文使用的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染” 一般包含動(dòng)物細(xì)胞，植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和微生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，該術(shù)語(yǔ)適用的范圍是將外源性核酸導(dǎo)入細(xì)胞。因此，轉(zhuǎn)染技術(shù)包括，但不限于，轉(zhuǎn)化，粒子轟擊，電穿孔，顯微注射，脂轉(zhuǎn)染，吸附，感染和原生質(zhì)體融合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將預(yù)料到使用重組DNA技術(shù)通過(guò)操縱例如，宿主細(xì)胞內(nèi)核酸分子的拷貝數(shù)，轉(zhuǎn)錄這些核酸分子的效率，翻譯所得轉(zhuǎn)錄子的效率，和翻譯后修飾的效率可改進(jìn)轉(zhuǎn)染的核酸分子的表達(dá)調(diào)控。另外，可遺傳改造啟動(dòng)子序列以便與天然啟動(dòng)子相
43比表達(dá)水平提高。用于控制核酸分子表達(dá)的重組技術(shù)包括，但不限于，將該核酸分子整合進(jìn)一個(gè)或多個(gè)宿主細(xì)胞染色體中，給質(zhì)粒添加載體穩(wěn)定性序列，取代或修飾轉(zhuǎn)錄控制信號(hào)(例如，啟動(dòng)子，操縱子，增強(qiáng)子)，取代或修飾翻譯控制信號(hào)(例如，核糖體結(jié)合位點(diǎn)， Shine-Dalgarno序列)，修飾核酸分子以符合該宿主細(xì)胞的密碼子用法，和缺失使轉(zhuǎn)錄子不穩(wěn)定的序列。上文對(duì)于重組核酸分子和宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染方面的一般性討論試圖應(yīng)用于本文討論的任一重組核酸分子，包括編碼具有PUFA PKS的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性的任一氨基酸序列的那些核酸分子，編碼其它PKS系統(tǒng)的氨基酸序列的那些核酸分子，和編碼其它蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的那些核酸分子。本發(fā)明還涉及使用一種新方法鑒定具有在結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)域組成和/或功能上與 Schizochytrium PUFA PKS系統(tǒng)同源的PUFA PKS系統(tǒng)的微生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該微生物是非細(xì)菌微生物，且優(yōu)選的是，以該方法鑒定的微生物是真核微生物。另外，本發(fā) 明涉及以該方法鑒定的微生物和這些微生物及來(lái)自這些微生物的PUFA PKS系統(tǒng)在用于根據(jù)本發(fā)明的PUFA PKS系統(tǒng)的各種應(yīng)用(例如，遺傳修飾的生物體和產(chǎn)生生物活性分子的方法)中的用途。本文所述并證實(shí)的獨(dú)特篩選方法使得能夠迅速鑒定含有與本發(fā)明的 Schizochytrium PUFA PKS系統(tǒng)同源的PUFA PKS系統(tǒng)的新微生物菌株。申請(qǐng)人使用該方法發(fā)現(xiàn)并在本文中公開了破囊壺菌屬微生物含有與Schizochytrium中的發(fā)現(xiàn)同源的PUFA PKS系統(tǒng)。該發(fā)現(xiàn)在下面實(shí)施例2中詳細(xì)描述。通過(guò)單獨(dú)使用下列方法或者以這些方法的任意組合可容易地鑒定/分離/篩選具有與Schizochytrium中的發(fā)現(xiàn)相似的PUFA PKS系統(tǒng)的微生物，例如本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)并在實(shí) 施例2中描述的破囊壺菌屬微生物。一般來(lái)說(shuō)，鑒定具有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的非細(xì)菌微生物的方法包括第一步(a)選擇產(chǎn)生至少一種PUFA的微生物；和第二步(b)從(a)鑒定與發(fā)酵培養(yǎng)基中在大于5%飽和度，更優(yōu)選10%的飽和度，更優(yōu)選大于15%的飽和度，且更優(yōu)選大于20%的飽和度的溶氧條件下所述微生物產(chǎn)生的PUFA相比，在發(fā)酵培養(yǎng)基中不超過(guò)約5%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物。產(chǎn)生至少一種PUFA 且在不超過(guò)約5%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物鑒定為含有 PUFA PKS系統(tǒng)的候選微生物。鑒定含有PUFA PKS系統(tǒng)的優(yōu)良候選微生物后，該方法可包括附加步驟(c)檢測(cè)在步驟(b)中鑒定的生物是否含有PUFA PKS系統(tǒng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在低氧/缺氧條件下和有氧條件下培養(yǎng)篩選過(guò) 程中選擇的該微生物，并進(jìn)一步測(cè)量該生物體中PUFA的含量進(jìn)行步驟(b)，測(cè)定脂肪酸的分布特征，以及脂肪含量。通過(guò)比較在低氧/缺氧條件下的結(jié)果與在有氧條件下的結(jié)果，該方法提供了試驗(yàn)微生物是否含有本發(fā)明的PUFA PKS系統(tǒng)的有力征兆。這一優(yōu)選的實(shí)施方案在下面詳細(xì)描述。首先，在有氧條件下培養(yǎng)需要檢查是否存在PUFA PKS系統(tǒng)的微生物菌株以誘導(dǎo)產(chǎn) 生大量的細(xì)胞(微生物生物量)。作為該鑒定方法的一部分，隨后將這些細(xì)胞放在低氧或缺氧培養(yǎng)條件下(例如不超過(guò)約5%飽和度的溶氧，更優(yōu)選不超過(guò)約2%，甚至更優(yōu)選不超過(guò) 約1%，且最優(yōu)選在培養(yǎng)基中約0%飽和度的溶氧)并使其再生長(zhǎng)約24-72小時(shí)。在該方法中，微生物應(yīng)在高于約15°C，且更優(yōu)選高于約20°C，且甚至更優(yōu)選高于約25°C，且甚至更優(yōu)
44選高于約30°C的溫度下培養(yǎng)。在能在培養(yǎng)箱中(且因此在培養(yǎng)物中)誘導(dǎo)這類大氣環(huán)境的培養(yǎng)箱中或者通過(guò)以在培養(yǎng)瓶/管本身中直接誘導(dǎo)該低氧環(huán)境的方式培養(yǎng)該細(xì)胞可容易地維持低氧或缺氧培養(yǎng)環(huán)境。在優(yōu)選的培養(yǎng)方法中，微生物可在搖瓶中培養(yǎng)，它不同于一般含有少量培養(yǎng)基 (不超過(guò)約50%的總?cè)莘e且通常不超過(guò)約25%的總?cè)莘e)以便在搖床上搖動(dòng)時(shí)保持培養(yǎng)基有氧，該搖瓶反而超過(guò)其容積的約50 %，且更優(yōu)選超過(guò)約60 %，且最優(yōu)選超過(guò)其容積的約 75%裝滿培養(yǎng)基。用培養(yǎng)基高裝載該搖瓶防止它放在搖床上時(shí)在瓶中充分混合，從而防止氧擴(kuò)散進(jìn)培養(yǎng)基。因此隨著微生物的生長(zhǎng)，它們用盡培養(yǎng)基中已有的氧并自然在搖瓶中產(chǎn) 生一個(gè)低氧或無(wú)氧的環(huán)境。培養(yǎng)期后，收獲細(xì)胞并分析目的生物活性化合物(例如，脂類)的含量，但最具體的是含有兩個(gè)或多個(gè)不飽和鍵，且更優(yōu)選3個(gè)或更多雙鍵，且甚至更優(yōu)選4個(gè)或更多雙鍵的化合物。對(duì)于脂類，將具有高于該微生物干重的約5%，且更優(yōu)選高于約10%，且更優(yōu)選高于約15%，且甚至更優(yōu)選高于約20%的該化合物的那些菌株鑒定為預(yù)期含有上述類型的新PKS系統(tǒng)。對(duì)于其它生物活性化合物，例如抗生素或以更少量合成的化合物，將具有高于該微生物干重的約0.5%，且更優(yōu)選高于約0.1%，且更優(yōu)選高于約0.25%，且更優(yōu)選高于約0. 5 %，且更優(yōu)選高于約0.75%，且更優(yōu)選高于約1 %，且更優(yōu)選高于約2.5%，且更優(yōu)選高于約5%的該化合物的那些菌株鑒定為預(yù)期含有上述類型的新PKS系統(tǒng)。作為另一選擇，或者與該方法相結(jié)合，通過(guò)檢查該菌株的脂肪酸分布特征(通過(guò) 培養(yǎng)該生物體或者通過(guò)公開的或其它容易獲得的來(lái)源獲得)可鑒定預(yù)期含有本文所述新 PUFA PKS系統(tǒng)的微生物菌株。如果該微生物含有高于約30%，且更優(yōu)選高于約40%，且更優(yōu)選高于約45 %，且甚至更優(yōu)選高于約50 %的其總脂肪酸是C14 0，C16 0和/或C16 1，盡管也產(chǎn)生至少一種具有三個(gè)或更多個(gè)不飽和鍵，且更優(yōu)選4個(gè)或更多個(gè)雙鍵，且更優(yōu)選5 個(gè)或更多個(gè)雙鍵，且甚至更優(yōu)選6個(gè)或更多個(gè)雙鍵的長(zhǎng)鏈脂肪酸，那么將該微生物菌株鑒定為具有本發(fā)明所述類型的新PUFA PKS系統(tǒng)的可能候選菌株。在上述低氧條件下篩選該生物體，并證實(shí)產(chǎn)生了含有兩個(gè)或更多個(gè)不飽和鍵的生物活性分子，這表明該生物體中存在新的PUFA PKS系統(tǒng)，通過(guò)分析該微生物的基因組可進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)。通過(guò)篩選已知含有C17:0和/或C17:1脂肪酸(與上述高百分比的C14:0,C16:0 和C16:1脂肪酸相結(jié)合)的真核菌株也可提高該方法的成功率，因?yàn)镃17:0和C17:1脂肪酸是細(xì)菌(原核)為基礎(chǔ)的或作用的脂肪酸生產(chǎn)系統(tǒng)的有效標(biāo)記。鑒定含有新PUFA PKS 系統(tǒng)的菌株的另一標(biāo)記是該生物體產(chǎn)生簡(jiǎn)單的脂肪酸分布特征。根據(jù)本發(fā)明，“簡(jiǎn)單的脂肪酸分布特征”定義為該菌株以高于總脂肪酸10%的水平產(chǎn)生8種或更少的脂肪酸。使用這些方法或標(biāo)記的任一種(單獨(dú)或者優(yōu)選相結(jié)合)使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠容易地鑒定可信地預(yù)期含有本發(fā)明所述類型的新PUFA PKS系統(tǒng)的微生物菌株。在結(jié)合上述眾多方法和標(biāo)記的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，建立了一個(gè)新的生物學(xué)合理的篩選系統(tǒng)(使用搖瓶培養(yǎng)物)用于檢測(cè)含有產(chǎn)生PUFA的PKS系統(tǒng)的微生物。該篩選系統(tǒng)按如下進(jìn)行將待測(cè)菌株/微生物的一部分培養(yǎng)物放在含有50mL培養(yǎng)基的250mL帶擋板的搖瓶中(有氧處理)，并將相同菌株的另一部分培養(yǎng)物放在含有200mL培養(yǎng)基的250mL無(wú)擋板的搖瓶中(缺氧/低氧處理)。根據(jù)被評(píng)估的微生物的類型和菌株采用不同的培養(yǎng)基。將兩種搖瓶放在200rpm的搖床上。培養(yǎng)48-72小時(shí)后，離心收獲培養(yǎng)基并通過(guò)氣相色譜法分析細(xì)胞的脂肪酸甲基酯含量以測(cè)定各培養(yǎng)物的下列數(shù)據(jù)(1)脂肪酸分布特征；(2)PUFA含量；和(3)脂肪含量(約計(jì)為脂肪酸總量/細(xì)胞干重)。然后分析這些數(shù)據(jù)并回答下列5個(gè)問(wèn)題(是/否)腕氏氧,/ _細(xì)_城氧細(xì)_ (1)與有氧培養(yǎng)物相比低氧培養(yǎng)物中的DHA (或其它PUFA含量)((脂肪酸甲酯))是否保持約相同或優(yōu)選提高？(2)缺氧培養(yǎng)物中的C14:0+C16:0+C16:l是否超過(guò)約40%的TFA ？(3)在缺氧培養(yǎng)物中對(duì)于常規(guī)氧依賴型延長(zhǎng)酶/去飽和酶途徑是否有極少(FAME < 1% )或者沒(méi)有前體(C18:3n-3+C18:2n-6+C18:3n-6) ？(4)與有氧培養(yǎng)相比低氧培養(yǎng)中的脂肪含量(以脂肪酸總量/細(xì)胞干重表示)是否提高？(5)與有氧培養(yǎng)相比低氧培養(yǎng)中以占細(xì)胞干重百分?jǐn)?shù)表示的DHA (或其它PUFA含量)是否增加？如果前3個(gè)問(wèn)題的答案為是，則它是該菌株含有形成長(zhǎng)鏈PUFA的PKS遺傳系統(tǒng)的良好征兆。答案為是的問(wèn)題越多(優(yōu)選前三個(gè)問(wèn)題的答案必須為是)，該菌株含有這種PKS 遺傳系統(tǒng)的征兆就越強(qiáng)。如果5個(gè)問(wèn)題的答案都為是，那么就是該菌株含有形成長(zhǎng)鏈PUFA 的PKS遺傳系統(tǒng)的極強(qiáng)征兆。缺少18 3n-3/18 2n-6/18:3n-6表明低氧條件關(guān)閉或者抑制了常規(guī)的PUFA合成途徑。高14:0/16:0/16:1脂肪是細(xì)菌作用的脂肪酸合成分布特征(存在C17 0和17 1也是它的指標(biāo))和簡(jiǎn)單的脂肪酸分布特征的初步指標(biāo)。在低氧條件下PUFA 合成和含有PUFA的脂肪合成增加是PUFA PKS系統(tǒng)的直接征兆，因?yàn)樵撓到y(tǒng)不需要氧形成高度不飽和脂肪酸。最后，在本發(fā)明的鑒定方法中，一旦鑒定了優(yōu)良的候選菌株，優(yōu)選篩選該微生物以檢測(cè)該微生物是否含有PUFA PKS系統(tǒng)。例如，可篩選該微生物的基因組以檢測(cè)是否存在編碼本文所述PUFA PKS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域的一種或多種核酸序列。優(yōu)選的是，該檢測(cè)步驟包括合適的核酸檢測(cè)方法，例如，對(duì)目的微生物中的一種或多種核酸序列的雜交，擴(kuò)增和測(cè) 序。用于該檢測(cè)方法的探針和/或引物可來(lái)源于任何已知的PUFA PKS系統(tǒng)，包括美國(guó)專利號(hào)6，140，486所述海洋細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)，或美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09/231，899和本文所述 Thraustochytrid PUFA PKS系統(tǒng)。一旦鑒定了新的PUFA PKS系統(tǒng)，來(lái)自這些系統(tǒng)的遺傳物質(zhì)也可用于檢測(cè)其它新的PUFA PKS系統(tǒng)。以鑒定和檢測(cè)序列為目的核酸雜交，擴(kuò)增和測(cè)序方法是本領(lǐng)域熟知的。使用這些檢測(cè)方法，可評(píng)估序列同源性和結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)(例如，各種 PUFA PKS功能域的存在，數(shù)目和/或排列)并與本文所述已知PUFA PKS系統(tǒng)進(jìn)行比較。在一些實(shí)施方案中，可使用生物學(xué)試驗(yàn)鑒定PUFA PKS系統(tǒng)。例如，在美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào)09/231,899的實(shí)施例7中，描述了使用一些類型的脂肪酸合成系統(tǒng)的熟知抑制劑，即，硫乳霉素的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。本發(fā)明人表明在Schizochytrium的所有細(xì)胞中可特異性抑制PUFA的合成而不抑制短鏈飽和脂肪酸的合成。該結(jié)果具有如下意義本發(fā)明人從 Schizochytrium的cDNA序列分析中了解到在Schizochytrium中存在I型脂肪酸合酶系統(tǒng)。已知硫乳霉素不能抑制I型FAS系統(tǒng)，這與本發(fā)明人的數(shù)據(jù)一致，S卩，用硫乳霉素處理沒(méi)有抑制飽和脂肪酸(在Schizochytrium中主要是C14:0和C16:0)的生產(chǎn)。在文獻(xiàn)和本發(fā)明人自己的數(shù)據(jù)中沒(méi)有硫乳霉素對(duì)C14:0或C16:0脂肪酸的延長(zhǎng)或其去飽和化(即，短鏈飽和脂肪酸通過(guò)傳統(tǒng)途徑轉(zhuǎn)變成PUFA)具有任何抑制作用的征兆。因此，硫乳霉素強(qiáng)烈抑制Schizochytrium中的PUFA生產(chǎn)的事實(shí)表明傳統(tǒng)PUFA合成途徑在Schizochytrium中 ^SM產(chǎn)生PUFA，而是涉及一個(gè)不同的合成途徑。另外，以前已經(jīng)確定硫乳霉素抑制希瓦氏菌屬PUFA PKS系統(tǒng)(注意本發(fā)明的PUFA PKS系統(tǒng)同時(shí)具有I型和II型系統(tǒng)的因子)，且已知硫乳霉素是II型FAS系統(tǒng)(例如在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的系統(tǒng))的抑制劑。因此，該實(shí)驗(yàn)表明Schizochytrium以不涉及I型FAS的途徑產(chǎn)生PUFA。使用相似的理論和檢測(cè)步驟可檢測(cè)使用本文公開的新篩選方法鑒定的微生物中的PUFA PKS系統(tǒng)。另外，實(shí)施例3顯示了其它的生化數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)提供了 Schizochytrium中的PUFA 不通過(guò)傳統(tǒng)途徑產(chǎn)生的證據(jù)(即，在所有細(xì)胞中沒(méi)有觀察到C16:0與DHA之間的前體產(chǎn)物動(dòng)力學(xué)，且體外PUFA合成可從膜成份分離——除了插入一系列雙鍵中的第一個(gè)雙鍵的δ 9 去飽和酶外，傳統(tǒng)PUFA合成途徑的所有脂肪酸去飽和酶都與細(xì)胞膜相聯(lián))。這類生化數(shù)據(jù) 可用于在以上述新篩選方法中鑒定的微生物中檢測(cè)PUFA PKS活性。需要使用本發(fā)明的篩選/鑒定方法篩選的優(yōu)選微生物菌株選自由細(xì)菌，藻類，真菌，原生動(dòng)物或原生生物組成的組中，但最優(yōu)選從由藻類，真菌，原生動(dòng)物和原生生物組成的真核微生物中選擇。這些微生物優(yōu)選在高于約15°C，更優(yōu)選高于約20°C，甚至更優(yōu)選高于約25°C且最優(yōu)選高于約30°C的溫度下能夠生長(zhǎng)并產(chǎn)生含有兩個(gè)或多個(gè)不飽和鍵的生物活性化合物。在本發(fā)明該方法的一些實(shí)施方案中，可在超過(guò)約20°C，優(yōu)選超過(guò)約25°C且甚至更優(yōu)選超過(guò)約30°C的溫度下產(chǎn)生PUFA的細(xì)菌中鑒定新的細(xì)菌PUFAPKS系統(tǒng)。如本文前面所述，美國(guó)專利6，140, 486中所述海洋細(xì)菌，希瓦氏菌屬和Vibrio marinus在較高溫度下不產(chǎn)生PUFA，這限制了來(lái)自這些細(xì)菌的PUFA PKS系統(tǒng)的有用性，特別是在野外條件下的植物應(yīng)用中的有用性。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的篩選方法可用于鑒定具有PUFA PKS 系統(tǒng)且能在較高溫度(例如，超過(guò)約20，25，或30°0下生長(zhǎng)并產(chǎn)生PUFA的細(xì)菌。在該實(shí) 施方案中，可將諸如制霉菌素(抗真菌劑)或放線菌酮(真核蛋白合成抑制劑)的真核生物生長(zhǎng)抑制劑加入瓊脂板中用于從下文所述生境/生態(tài)位類型收集的水樣品/土壤樣品培養(yǎng)/選擇起始菌株。該方法可幫助選擇沒(méi)有(或有最小的)真核菌株污染的細(xì)菌菌株富集物。該選擇方法與在高溫(例如，30°C)下培養(yǎng)平板，然后選擇產(chǎn)生至少一種PUFA的菌株相結(jié)合可初步鑒定具有在高溫下有效的PUFA PKS系統(tǒng)的候選細(xì)菌菌株(與現(xiàn)有技術(shù)中僅在不超過(guò)約20°C且更優(yōu)選低于約5°C的溫度下表現(xiàn)出PUFA生產(chǎn)的那些細(xì)菌菌株相反)。收集優(yōu)選的微生物類型用于篩選根據(jù)本發(fā)明的PUFA PKS系統(tǒng)的地點(diǎn)包括下列任一處低氧環(huán)境(或靠近這些類型的低氧環(huán)境的地點(diǎn)，包括在動(dòng)物的腸道中，該動(dòng)物包括消耗微生物或含有微生物的食物的無(wú)脊椎動(dòng)物(包括濾食性生物類型))，含有低氧或無(wú)氧的水中生境(包括淡水，鹽湖和海洋)，且特別是處于或者靠近海洋中的低氧環(huán)境(區(qū)域)。該微生物菌株優(yōu)選不是專性厭氧菌，而是可適應(yīng)在有氧及低氧或無(wú)氧環(huán)境中均可存活。同時(shí) 含有有氧及低氧或無(wú)氧環(huán)境的土壤環(huán)境也是發(fā)現(xiàn)這些生物體的優(yōu)良環(huán)境，特別是在含水生境或暫時(shí)含水生境的這些土壤類型中。特別優(yōu)選的微生物菌株可以是在其部分生活周期期間它能通過(guò)諸如吞噬作用，吞噬營(yíng)養(yǎng)或內(nèi)吞能力的機(jī)制消耗整個(gè)細(xì)菌細(xì)胞(食細(xì)菌生物)和/或在其生活周期中具有以變形蟲狀階段或裸露原生質(zhì)體存在的一個(gè)時(shí)期的一種菌株(選自由藻類，真菌(包括酵母)，原生動(dòng)物或原生生物組成的組中)。該營(yíng)養(yǎng)方法如果發(fā)生錯(cuò)誤且該細(xì)菌細(xì)胞(或其 DNA)不能被消化反而有效摻入真核細(xì)胞中將極大地增加將細(xì)菌PKS系統(tǒng)轉(zhuǎn)移進(jìn)真核細(xì)胞的可能性。能夠食細(xì)菌(特別是通過(guò)吞噬作用或內(nèi)吞)的微生物菌株(不是 Thraustochytrids的成員)可在下列微生物綱(包括但不限于舉例的屬)中找到在藻類和藻類樣微牛物(包括stramenoDiles)中裸藻綱(例如眼蟲屬 (Euglena),禾口 Peranerna),金藻綱(例如赭單胞菌屬(Ochromonas)), Dinobryaceae 綱(例如 Dirzobryon, Platychrysis,禾口 Chrysochromulina 屬),甲藻綱(包括 Crypthecodinium, Gymnodinium, Peridinium, Ceratium, Gyrodinium,禾口 Oxyrrhis 屬),隱藻綱(例如隱藻屬 (Cryptomonas)，和Rhodomonas)，黃藻綱(例如Olisthodiscus屬)(且包括存在變形蟲狀階段的藻類形式，如鞭毛蟲 Rhizochloridaceae,禾口 Aphanochaete pascheri, Bumilleria stigeoclonium 禾口 Vaucheria geminata 的坊字動(dòng)抱子 / 配子),Eustigmatophyceae 綱，禾口 Prymnesiopyceae 綱(包括 Prymnesium 禾口 Diacronema 屬)。在 Stramenopiles 中包括Proteromonads, Orpalines, Developayella, Diplophorys, Larbrinthulids, Thraustochytrids, Bicosecids, 卵菌綱， Hypochytridiomycetes, Commation, Reticulosphaera, Pelagomonas, Pelapococcus, Ollicola, Aureococcus, Par males, Raphidiophytes, Synurids, Rhizochromulinaales, Pedinellales, Dictyochales, Chrysomeridales, Sarcinochrysidales, Hydrurales, Hibberdiales,禾口 Chromulinales0在真菌中有粘菌綱(形成粘變形體)-粘液霉菌，聚粘菌亞綱，包括Acrasiceae 目(例如 Sappinia 屬),Guttulinaceae 綱(例如 Guttulinopsis,禾口 Guttulina 屬), Dictysteliaceae綱(例如宿曲滴菌屬(Acrasis)，盤基網(wǎng)柄菌屬(Dictyostelium), Polysphondylium,禾口 Coenonia)，禾口 Phycomyceae 包括壺菌巨，Ancylistales, Blastocladiales, Monoblepharidales，/K霉目，霜霉目，毛霉菌目，禾口蟲霉目。在原牛動(dòng)物中有具有能夠食細(xì)菌(包括通過(guò)吞噬作用)的生活階段的原生動(dòng)物株可選自分類為纖毛蟲，鞭毛蟲或變形蟲的類型。原生動(dòng)物纖毛蟲包括的種類漏斗蟲，腎形蟲，管口蟲，Haptorids，核殘跡蟲，寡膜蟲，Polyhymenophora(旋毛蟲)，Prostomes 和吸管綱。原生動(dòng)物鞭毛蟲包括Biosoecids，Bodonids，單鞭滴蟲，Chrysophytes (例如Anthophysa屬，Chrysamoemba,金球藻蟲屬，樹滴蟲屬，錐囊藻蟲屬，魚鱗藻蟲屬， it ^ ii, M Paraphysomonas, Poterioochromonas, Spumella, Syncrypta,屬，和Uroglena)，領(lǐng)鞭毛蟲，Cryptophytes (例如唇滴蟲屬，隱滴蟲屬，Cyanomonas,和 Goniomonas), Dinoflagellates, Diplomonads, Euglenoids, Heterolobosea,Pedinellids, Pelobionts,膠令頁(yè)鞭蟲，Pseudodendromonads, Spongomonads 禾口 Volvocales (禾口其它鞭毛蟲，包括未分類的鞭毛蟲Artodiscus屬，Clautriavia,曳鞭毛蟲屬，Kathablepharis和 Multicilia)。變形蟲狀原生動(dòng)物包括的種類有太陽(yáng)蟲，Centrohelids, Desmothoricids, Diplophryids, Eumamoebae, Heterolobosea, Leptomyxids, Nucleariid filose 變形蟲， Pelebionts, Testate變形蟲禾口 Vampyrellids (且包括未分類的變形蟲屬Gymnophrys, Biomyxa, Microcometes, Reticulomyxa, Belonocystis, Elaeorhanis, Allelogromia,Gromia 或 Lieberkuhnia) ο 原生動(dòng)物包括如下的目Percolomonadeae，Heterolobosea, Lyromonadea, Pseudociliata，Trichomonadea，Hypermastigea，Heteromiteae，Telonemea， Cyathobodonea， Ebridea, Pyytomyxea, Opalinea， Kinetomonadea， Hemimastigea， Protostelea, Myxagastrea, Dictyostelea, Choanomonadea, Apicomonadea, Eogregarinea, Neogregarinea，Coelotrolphea, Eucoccidea，血抱子蟲亞目，Piroplasmea，Spirotrichea， Prostomatea， Litostomatea， Phy1lopharyngea, Nassophorea， Oligohymenophorea, Colpodea， Karyorelicta， Nucleohelea， Centrohelea， Acantharea， Sticholonchea， Polycystinea, Phaeodarea，Lobosea，F(xiàn)ilosea，Athalamea，Monothalamea，Polythalamea, Xenophyophorea, Schizocladea, Holosea， Entamoebea，粘盤抱目，結(jié)線抱子目， Halosporea，Paramyxea, Rhombozoa 禾口 Orthonectea。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包括從上述一種優(yōu)選的生境中收集的上述微生物的菌株。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及使用上述新PUFAPKS篩選方法鑒定的任何微生物，涉及PUFA PKS基因及其編碼的蛋白質(zhì)，且涉及該微生物和/或PUFAPKS基因和蛋白質(zhì)(包括其同源物和片段)在本文所述任一方法中的用途。具體地說(shuō)，本發(fā)明包含以本發(fā)明的篩選方法鑒定的生物體，該生物體隨后被遺傳修飾成通過(guò)所述PUFA PKS系統(tǒng)調(diào)節(jié)生物活性分子的生產(chǎn)。本發(fā)明的另一實(shí)施方案還涉及一種分離的核酸分子，該分子含有編碼來(lái)自 Thraustochytrid微生物的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一種生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域或其生物學(xué)活性片段的核酸序列。如上所述，本發(fā)明人成功使用該方法鑒定了一種具有PUFA PKS系統(tǒng)的非細(xì)菌微生物，該系統(tǒng)用于鑒定含有PUFA PKS系統(tǒng)的Thraustochytriales目的其它成員。實(shí)施例2描述了三種該微生物的鑒定。具體地說(shuō)，本發(fā)明人使用本發(fā)明的篩選方法鑒定了認(rèn)為極有可能含有PUFA PKS系統(tǒng)的破囊壺菌23B(ATCC20892)，接著檢測(cè)了破囊壺菌屬種類23B基因組中與本文公開的 Schizochytrium PUFA PKS 基因雜交的序列。還將 Schizochytrium lirnacium(IFO 32693)和Ulkenia(BP5601)鑒定為含有PUFA PKS系統(tǒng)的良好候選菌株。根據(jù)這些數(shù) 據(jù)和Thraustochytriales目的成員之間的相似性，據(jù)信現(xiàn)在使用本發(fā)明提供的方法和工具可容易地鑒定許多其它Thraustochytriales的PUFAPKS系統(tǒng)。因此，本發(fā)明包括 Thraustochytriales的PUFAPKS系統(tǒng)和其部分和/或其同源物(例如，蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)域及其片段)，含有該系統(tǒng)和其部分和/或其同源物的遺傳修飾的生物體，使用該微生物和PUFA PKS系統(tǒng)的方法。開發(fā)導(dǎo)致對(duì)Thraustochytrids的分類學(xué)進(jìn)行了修正。分類學(xué)家將 Thraustochytrids放在藻類或藻類狀原生生物中。然而，由于分類不確定，對(duì)于本發(fā)明最好認(rèn)為本發(fā)明所述該菌株是Thraustochytrids (目=Thraustochytriales ；禾斗Thraustochytriaceae ；屬破囊壺菌屬，Schizochytrium, Labyrinthuloides, 或Japonochytrium)。對(duì)于本發(fā)明，Iabrinthulids的許多成員被認(rèn)為包含在 Thraustochytrids中。分類學(xué)改變?cè)谙挛闹懈爬ā１疚墓_的某些單細(xì)胞微生物菌株是Thraustochytriales目的成員。Thraustochytrids是分類史進(jìn)化的海洋真核生物。Moss (1986)，Bahnweb 和 Jackie (1986)，以及 Chamberlain 和 Moss (1988)對(duì)
49Thraustochytrids的分類地位問(wèn)題進(jìn)行了綜述。根據(jù)本發(fā)明，短語(yǔ)“Thraustochytrid”， "Thraustochytriales微生物”和"Thraustochytriales目的微生物”可互換使用。為了方便，分類學(xué)家首先將Thraustochytrids與藻菌目(藻類狀真菌)的其它無(wú)色游動(dòng)孢子真核生物放在一起。然而，藻菌目這一名稱最后從分類學(xué)地位中去掉，并將 Thraustochytrids保留在卵菌綱(雙鞭毛游動(dòng)孢子真菌)中。最初假定卵菌綱與異鞭毛藻類有親緣關(guān)系，且由Barr (Barr，1981，Biosystems 14 =359-370)總結(jié)的，廣泛的超微結(jié) 構(gòu)和生化研究最終支持了這一假定。事實(shí)上卵菌綱被Leedale (Leedale，1974，Taxon 23: 261-270)和其他藻類學(xué)家作為異鞭毛藻類的一部分接受。然而，事實(shí)上由于其異氧特性的方便性，卵菌綱和Thraustochytrids被真菌學(xué)家(研究真菌的科學(xué)家)而不是藻類學(xué)家 (研究藻類的科學(xué)家)大量研究。從另一分類學(xué)角度來(lái)看，進(jìn)化生物學(xué)家對(duì)于真核生物如何進(jìn)化形成了兩個(gè)系統(tǒng) 學(xué)派。一個(gè)學(xué)說(shuō)認(rèn)為膜結(jié)合細(xì)胞器通過(guò)一系列的內(nèi)共生的外生起源(MargUlis，1970， OriRin of Eukaryotic Cells. Yale University Press, New Haven)；例如線粒體起源于細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)共生生物，葉綠體起源于藍(lán)藻類，鞭毛起源于螺旋體。另一學(xué)說(shuō)提出膜結(jié)合的細(xì)胞器從原核祖先的無(wú)膜結(jié)合的系統(tǒng)通過(guò)自生加工逐漸進(jìn)化(CaValier-Smith，1975， Nature (Lond.) 256 :462_468)。然而兩組進(jìn)化生物學(xué)家都將卵菌綱和Thraustochytrids 從真菌中取出并與chromophyte藻類一起放在Chromophyta界中(Caval ier_Smith， 1981，BioSystems 14 :461_481)(該界最近擴(kuò)展到包括其它原生生物且該界的成員現(xiàn)在稱為 Stramenopiles)或與所有藻類一起放在 Protoctista 界中(Margulis 禾口 Sagen，1985， Biosystems 18:141-147)。隨著電子顯微鏡的發(fā)展，對(duì)Thraustochytrids的兩個(gè)屬，即，破囊壺菌屬和 Schizochytrium的游動(dòng)孢子超微結(jié)構(gòu)的研究(Perkins, 1976，第279-312頁(yè)，見"Recent Advances in Aquatic Mycology" (ed. Ε. B. G Jones), John Wiley &Sons, New York ； Kazama，1980，Can. J. Bot. 58 2434-2446 ；Barr,1981，Biosystems 14 :359_370)提供了 Thraustochytriaceae與卵菌綱僅具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系的良好證據(jù)。另外，對(duì)5S核糖體RNA序列的對(duì)應(yīng)分析(多元統(tǒng)計(jì)形式)得到的遺傳數(shù)據(jù)表明Thraustochytriales 明顯是一個(gè)獨(dú)特的真核類型，完全獨(dú)立于真菌，且與紅藻和褐藻，以及與卵菌綱的成員有最近的親緣關(guān)系(Mannella，等，1987，Mol.Evol.24 :228-235)。大多數(shù)分類學(xué)家同意將 Thraustochytrids 從卵菌綱中取出(Bartnicki-Garcia, 1987，第 389-403 頁(yè)，見 "Evolutionary Biology of the Fungi" (eds. Rayner,A. D. M. ,Brasier,C. M. Moore,D.), Cambridge University Press, Cambridge)?？傊捎肅avalier-Smith 的分類系統(tǒng)(Cavalier-Smith，1981， BioSystemsH 461-481,1983 ；Cavalier-Smith, 1993，Microbiol Rev. 57 :953_994)，將 Thraustochytrids 與 chromophyte 藻類一起分類進(jìn) Chromophyta(Stramenopiles)界中。最近 Cavalier Smith 等使用 Heterokonta 的 18s rRNA 標(biāo)記證實(shí) Thraustochytrids 是 chromists而不是真菌再次確認(rèn)了該分類地位(Cavalier-Smith等，1994，Phil. Tran. Roy. Soc. London Series Biosciences 346 :387_397)。該分類將它們放在與真菌完全不同的一個(gè)界中，而真菌都放在Eufungi界中。因此Thraustochytrids的分類地位總結(jié)如下界Chromophyta(Stramenopiles)
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門=Heterokonta巨Thraustochytriales:Thraustochytriaceae屬破囊壺菌屬，Schizochytrium, Labyrinthuloides, gJc Japonochytrium一些早期的分類學(xué)家將破囊壺菌屬的一些原始的成員(具有變形蟲狀生活階段的成員)分入一個(gè)稱為Ulkenia的獨(dú)立屬中。然而，現(xiàn)在知道大多數(shù)(如果不是全部的話) Thraustochytrids (包括破囊壺菌屬和Schizochytrium)表現(xiàn)出變形蟲狀階段且有人認(rèn)為 Ulkenia本身不是一個(gè)正確的屬。本文使用的破囊壺菌屬將包括Ulkenia。盡管門和界的高級(jí)分類中的分類學(xué)地位不確定，但是Thraustochytrids保持特有的和特征性的分類，其成員可分類在Thraustochytriales目?jī)?nèi)。多不飽和脂肪酸(PUFA)是高等真核生物中的基本膜成份和許多脂類衍生的信號(hào) 分子的前體。本發(fā)明的PUFA PKS系統(tǒng)使用不需要飽和脂肪酸去飽和并延長(zhǎng)的PUFA合成途徑。該途徑由結(jié)構(gòu)和機(jī)制上均不同于以前認(rèn)識(shí)的PKSs的PUFA PKSs催化。順式雙鍵的產(chǎn) 生表明包含位置特異性異構(gòu)酶，據(jù)信這些酶用于產(chǎn)生新家族的抗生素。為了使用本發(fā)明的PUFA PKS系統(tǒng)產(chǎn)生明顯高產(chǎn)的各種生物活性分子，可對(duì)一種生物體，優(yōu)選微生物或植物，進(jìn)行遺傳修飾以影響PUFA PKS系統(tǒng)的活性。在一個(gè)方面，該生物體內(nèi)源性含有并表達(dá)PUFA PKS系統(tǒng)，且該遺傳修飾可以是對(duì)內(nèi)源性PUFA PKS系統(tǒng)的一種或多種功能域的遺傳修飾，因此該修飾對(duì)PUFA PKS系統(tǒng)的活性具有某種影響。在另一方面，該生物體可內(nèi)源性含有并表達(dá)PUFA PKS系統(tǒng)，且該遺傳修飾可以是導(dǎo)入至少一種外源性核酸序列(例如，重組核酸分子)，其中該外源性核酸序列編碼第二種PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)和/或影響所述PUFA PKS系統(tǒng)的活性的蛋白質(zhì)(例如，磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶(PPTase)，下文討論)。在還有另一實(shí)施方案中，該生物體不必內(nèi)源性(天然)含有PUFA PKS系統(tǒng)，而是經(jīng)遺傳修飾導(dǎo)入編碼具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性的氨基酸序列的至少一個(gè)重組核酸分子。在該方面，通過(guò)在生物體中導(dǎo)入或提高PUFA PKS活性影響PUFA PKS的活性。與這些方面中任一種相關(guān)的各種實(shí)施方案在下面更詳細(xì)地討論。因此，根據(jù)本發(fā)明，一個(gè)實(shí)施方案涉及遺傳修飾的微生物，其中該微生物表達(dá)含有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的 PKS系統(tǒng)。PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域由選自如下的核酸序列編碼(a)編碼來(lái)自 Thraustochytrid微生物的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；(b)編碼來(lái)自以本發(fā)明的篩選方法鑒定的微生物的PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；(c)編碼與選自SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的至少500個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中該氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，(d)編碼與選自由SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :10，SEQ IDNO :13，SEQ ID NO :18，SEQ ID NO :20，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO :24，SEQ ID NO :26，SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，和 SEQ ID NO 32 組成的組中的氨基酸序列有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中該氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。該遺傳修飾影響生物體中PKS系統(tǒng)的活性。(b)部分中提及的篩選方法已在上文中詳細(xì)描述且包括如下步驟(a)選擇產(chǎn)生至少一種PUFA的微生物；和，(b)從(a)中鑒定與發(fā)酵培養(yǎng)基中在大于約5%飽和度，且優(yōu) 選約10%，且更優(yōu)選約15%，且更優(yōu)選約20%的飽和度的溶氧條件下微生物產(chǎn)生的PUFA相比，在發(fā)酵培養(yǎng)基中不超過(guò)約5%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物。該遺傳修飾的微生物可包括任意一種或多種上文鑒定的核酸序列，和/或任一上文詳細(xì)描述的Schizochytrium PUFA PKS ORFs或結(jié)構(gòu)域的任一其它同源物。本文所用的遺傳修飾的微生物包括遺傳修飾的細(xì)菌，原生生物，顯微藻類，真菌，或其它微生物，且特別是本文所述Thraustochytriales目(例如，Thraustochytrid)的任 ——屬(例如，Schizochytrium,破囊壺菌屬，Japonochytrium, Labyrinthuloides)。該遺傳修飾的微生物具有從其正常(即野生型或天然)形式進(jìn)行了修飾(即，突變或改變)以便達(dá)到所需結(jié)果(即，增加或修飾的PUFA PKS活性和/或使用PKS系統(tǒng)產(chǎn)生所需產(chǎn)物)的基因組。使用傳統(tǒng)的菌株開發(fā)和/或分子遺傳技術(shù)可完成對(duì)微生物的遺傳修飾。該技術(shù)是本領(lǐng)域已知的且一般公開用于微生物，例如，參見Sambrook等，1989，Molecular Cloning ALaboratory Manual，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版。該參考文獻(xiàn)Sambrook等，出處同上在本文中引用以其整體作為參考。遺傳修飾的微生物包括這樣的微生物，其中的核酸分子以該修飾提供微生物內(nèi)的所需效果的方式被插入，缺失或修飾(即，突變；例如，通過(guò)插入，缺失，取代，和/或核苷酸倒置)。根據(jù)本發(fā)明修飾的優(yōu)選微生物宿主細(xì)胞包括，但不限于，任一細(xì)菌，原生生物，顯微藻類，真菌，或原生動(dòng)物。在一個(gè)方面，遺傳修飾的優(yōu)選微生物包括，但不限于， Thraustochytriales目的任一微生物。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的宿主細(xì)胞可包括來(lái)自如下屬的微生物，該屬包括，但不限于破囊壺菌屬，Labyrinthuloides, Japonochytrium, 和Schizochytrium。這些屬內(nèi)優(yōu)選的種類包括，但不限于任一 Schizochytrium種類，包括 Schizochytriumaggregatum, Schizochytrium limacinum, Schizochytrium minutum ；任一破囊壺菌屬種類(包括以前的Ulkenia種類，例如U. Visurgensis, U. Amoeboida, U. Sarkariana, U. Profunda, U. radiata, U. Minuta 和Ulkenia sp. BP-5601),且包括 Thraustochytrium stratum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytriumroseum ；和任一 Japonochytrium種類。特別優(yōu)選的Thraustochytriales菌株包括，但不限于Schizochytrium sp. (S31) (ATCC 20888) ；Schizochytriumsp. (S8)(ATCC 20889)； Schizochytrium sp. (LC-RM)(ATCC 18915) ；Schizochytrium sp. (SR21) ；Schizochytrium aggregatum(Goldstein etBelsky)(ATCC 28209) ；Schizochytrium 1imacinum(Honda et Yokochi)(IF032693)；破囊壺菌屬種類(23B)(ATCC 20891) ；Thraustochytrium striatum (Schneider) (ATCC 24473) ；Thraustochytrium aureum (Goldstein) (ATCC34304) ；Thraustochytrium roseum(Goldstein)(ATCC 28210)；和 Japonochytrium sp. (Li) (ATCC 28207)。用于遺傳修飾的合適宿主微生物的其它例子包括，但不限于，酵母，包括啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)，卡爾斯伯糖酵母(Saccharomyces carlsbergensis)，或諸如念珠菌屬(Candida)，克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)的其它酵母，或其它真菌，例如，諸如曲霉屬(Aspergillus)，鏈孢霉屬(Neurospora)，青霉屬 (Penicillium)的絲狀真菌，等。細(xì)菌細(xì)胞也可用作宿主。它包括可用于發(fā)酵方法的大腸桿菌。另外，諸如乳酸桿菌屬(Lactobacillus)種類或桿菌屬(Bacillus)種類的宿主也可用作宿主。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及遺傳修飾的植物，其中該植物被遺傳修飾成重組表達(dá) 含有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)生物活性結(jié)構(gòu)域的PKS 系統(tǒng)。該結(jié)構(gòu)域由選自如下的一種核酸序列編碼(a)編碼來(lái)自Thraustochytrid微生物的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；(b)編碼來(lái)自本文所述篩選和選擇方法鑒定的微生物的PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列(參見上文在遺傳修飾的微生物的討論中的方法的簡(jiǎn)要小結(jié))；(c)編碼選自由SEQID NO :2，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :6，和其生物學(xué)活性片段組成的組中的氨基酸序列的核酸序列；(d)編碼選自SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :13，SEQ ID NO :18，SEQ ID NO 20,SEQ ID NO 22,SEQ IDNO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID NO 30,SEQ ID NO :32，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；(e)編碼與選自SEQ ID N0:2，SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中該氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué) 活性；和 / 或(f)編碼與選自SEQID NO :8,SEQ ID NO: 10，SEQ ID NO: 13，SEQ ID NO :18， SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :22，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO -.26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO 30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中該氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。該遺傳修飾的植物可包括任意一種或多種上文鑒定的核酸序列，和/或任一上文詳細(xì)描述的Schizochytrium PUFA PKS ORFs或結(jié)構(gòu)域的任一其它同源物。本文所用的遺傳修飾的植物可包括任一遺傳修飾的植物，包括高等植物且特別是任何可消費(fèi)的植物或用于產(chǎn)生本發(fā)明的所需生物活性分子的植物。該遺傳修飾的植物具有從其正常(即野生型或天然)形式進(jìn)行了修飾(即，突變或改變)以便實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果(即，增加或修飾的PUFA PKS活性和/或使用該P(yáng)KS系統(tǒng)產(chǎn)生所需產(chǎn)物)的基因組。使用傳統(tǒng) 的品系開發(fā)和/或分子遺傳技術(shù)可完成對(duì)植物的遺傳修飾。產(chǎn)生將編碼所需氨基酸序列的重組核酸分子插入植物基因組的轉(zhuǎn)基因植物的方法是本領(lǐng)域已知的。根據(jù)本發(fā)明用于遺傳修飾的優(yōu)選植物優(yōu)選是適合于被包括人類的動(dòng)物消費(fèi)的植物。根據(jù)本發(fā)明被遺傳修飾的優(yōu)選植物(即，植物宿主細(xì)胞)包括，但不限于任何高等植物，且特別是可消費(fèi)的植物，包括農(nóng)作物植物且特別是使用其油類的植物。該植物可包括，例如Kanola，大豆，油菜，亞麻，玉米，紅花，向日葵和煙草。其它優(yōu)選的植物包括已知產(chǎn) 生用作藥物試劑，調(diào)味劑，neutraceutical試劑，功能食品成份或美容活性劑的那些植物或遺傳修飾成產(chǎn)生這些化合物/試劑的植物。根據(jù)本發(fā)明，遺傳修飾的微生物或植物包括使用重組技術(shù)修飾的微生物或植物。本文使用的導(dǎo)致基因表達(dá)，基因功能，或基因產(chǎn)物(即，由該基因編碼的蛋白)功能降低的遺傳修飾可指基因的失活(完全或部分)，缺失，中斷，阻斷或下調(diào)。例如，導(dǎo)致該基因編碼的蛋白質(zhì)的功能下降的基因遺傳修飾可由該基因的完全缺失(即，該基因不存在，且因此該蛋白質(zhì)不存在)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不完全翻譯或不翻譯(例如，蛋白質(zhì)不表達(dá))的基因突變，或降低或消除該蛋白的天然功能(即表達(dá)降低或無(wú)酶活性或作用的蛋白質(zhì))的基因突變引起。導(dǎo)致基因表達(dá)或功能增強(qiáng)的遺傳修飾可指基因的擴(kuò)增，過(guò)度表達(dá)，激活，增強(qiáng)，增加，或上調(diào)。根據(jù)本發(fā)明的微生物或植物的遺傳修飾優(yōu)選影響植物表達(dá)的PKS系統(tǒng)的活性，無(wú)論該P(yáng)KS系統(tǒng)是內(nèi)源性且進(jìn)行了遺傳修飾的系統(tǒng)，即向生物體中導(dǎo)入了重組核酸分子的內(nèi) 源性系統(tǒng)，還是完全通過(guò)重組技術(shù)提供的系統(tǒng)。根據(jù)本發(fā)明，“影響PKS系統(tǒng)的活性”包括與不存在該遺傳修飾相比引起由該生物體表達(dá)的PKS系統(tǒng)中任何可檢測(cè)的或可測(cè)量的改變或修飾的任一遺傳修飾。PKS系統(tǒng)中可檢測(cè)的改變或修飾可包括，但不限于將PKS系統(tǒng)活性導(dǎo)入生物體中使得該生物體目前具有可測(cè)量的/可檢測(cè)的PKS系統(tǒng)活性(即，遺傳修飾前該生物體不含有PKS系統(tǒng))，將來(lái)自與該生物體內(nèi)源性表達(dá)的PKS系統(tǒng)不同的PKS系統(tǒng)的功能域?qū)朐撋矬w中使得PKS系統(tǒng)的活性得到修飾(例如，將細(xì)菌PUFA PKS結(jié)構(gòu)域或I 型PKS結(jié)構(gòu)域?qū)雰?nèi)源性表達(dá)非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的生物體中)，PKS系統(tǒng)產(chǎn)生的生物活性分子的量改變(例如，與不存在遺傳修飾相比該系統(tǒng)產(chǎn)生更多(量增大)或更少(量減少)的給定產(chǎn)物)，PKS系統(tǒng)產(chǎn)生的生物活性分子的類型改變(例如，該系統(tǒng)產(chǎn)生新的或不同的產(chǎn)物，或由該系統(tǒng)天然產(chǎn)物的變異體)，和/或PKS系統(tǒng)產(chǎn)生的多個(gè)生物活性分子的比率改變(例如，與不存在該遺傳修飾相比該系統(tǒng)產(chǎn)生不同比率的一種PUFA與另一 PUFA的比率，產(chǎn)生完全不同的脂類分布特性，或者與天然構(gòu)型相比將各種PUFA放在三酰甘油的不同位置)。該遺傳修飾包括任一類型的遺傳修飾且特別包括通過(guò)重組技術(shù)和通過(guò)傳統(tǒng)誘變作出的修飾。應(yīng)注意提及PUFA PKS系統(tǒng)中功能域或蛋白質(zhì)的活性增加是指在含有該結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)(或?qū)肓嗽摻Y(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì))的生物體中導(dǎo)致該結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)系統(tǒng)的功能增強(qiáng) 的任何遺傳修飾且可包括結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)的活性更高(例如，比活或體內(nèi)酶活性)，結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)系統(tǒng)的抑制或降解減少，和該結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)的過(guò)度表達(dá)。例如，基因拷貝數(shù)增加，通過(guò)使用與天然啟動(dòng)子相比產(chǎn)生更高表達(dá)水平的啟動(dòng)子來(lái)增加表達(dá)水平，或通過(guò)遺傳改造或傳統(tǒng)誘變改變基因以增加該基因編碼的結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)的活性。同樣，提及PUFA PKS系統(tǒng)中功能域或蛋白質(zhì)的活性降低是指在含有該結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)(或?qū)肓嗽摻Y(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì))的生物體中導(dǎo)致該結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)功能降低的任何遺傳修飾且包括該結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)的活性降低，該結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)的抑制或降解增加，和該結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)的表達(dá)減少或消除。例如，通過(guò)抑制或減少該結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，“敲除”編碼該結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)的基因或其部分，降低結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)活性，或抑制該結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)的活性可減小本發(fā)明的結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)的作用。抑制或減少結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)的生產(chǎn) 可包括將編碼該結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)的基因放在需要在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中存在誘導(dǎo)化合物的啟動(dòng) 子的控制下。通過(guò)形成耗盡培養(yǎng)基中的該誘導(dǎo)劑的條件，編碼該結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)(且因此蛋白質(zhì)的合成)可被關(guān)閉。抑制或減小結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)的活性也可包括使用相似于在美國(guó)專利號(hào)4，743，546中所述切除技術(shù)方案，本文引用以供參考。使用該方法，可將編碼目的蛋白的基因克隆到特定遺傳序列之間，允許從基因組中特異性，受控制地切除該基因。通過(guò)，例如，按美國(guó)專利號(hào)4，743，546轉(zhuǎn)換培養(yǎng)物的培養(yǎng)溫度，或者通過(guò)一些其它的物理或營(yíng)養(yǎng)信號(hào)可促進(jìn)切除。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳修飾包括修飾編碼具有本文所述非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性的氨基酸序列的核酸序列。該修飾可針對(duì)內(nèi)源性 (天然)表達(dá)的非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)內(nèi)的氨基酸序列，因此通過(guò)，例如，傳統(tǒng)誘變和選擇技術(shù)和/或分子遺傳技術(shù)，包括遺傳工程技術(shù)可對(duì)天然含有該系統(tǒng)的微生物進(jìn)行遺傳修飾。遺傳工程技術(shù)可包括，例如，使用定向重組載體缺失內(nèi)源性基因的一部分，或者用異源性序列取代內(nèi)源性基因的一部分?？蓪?dǎo)入宿主基因組的異源性序列的例子包括編碼來(lái)自諸如不同的非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)，細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)，I型PKS系統(tǒng)，II型PKS系統(tǒng)，或模塊PKS 系統(tǒng)的另一 PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)功能域的序列。導(dǎo)入宿主基因組的其它異源性序列包括編碼不是PKS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)或功能域，但是將影響內(nèi)源性PKS系統(tǒng)活性的序列。例如，可將編碼磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶的核酸分子導(dǎo)入宿主基因組中(下文討論)?？蓪?duì)內(nèi) 源性PUFA PKS系統(tǒng)作出的特異性修飾在下文中詳細(xì)討論。在本發(fā)明的該實(shí)施方案的另一方面，該遺傳修飾可包括向宿主中導(dǎo)入(1)編碼具有非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性的氨基酸序列的重組核酸分子；和/或(2)編碼影響PUFA PKS系統(tǒng)的活性的蛋白質(zhì)或功能域的重組核酸分子。該宿主可包括(1)不表達(dá)任一 PKS系統(tǒng)的宿主細(xì)胞，其中將PKS系統(tǒng)的所有功能域?qū)朐撍拗骷?xì)胞中，且其中至少一種功能域來(lái)自于非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)；(2)表達(dá)具有非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)功能域的PKS系統(tǒng)(內(nèi)源性或重組)的宿主細(xì)胞，其中導(dǎo)入的重組核酸分子可編碼至少一種其它非細(xì)菌PUFA PKS結(jié)構(gòu)域功能或者影響宿主PKS系統(tǒng)的活性的另一蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域；和(3)表達(dá)不必包括來(lái)自非細(xì)菌PUFAPKS的結(jié)構(gòu)域功能的PKS系統(tǒng)(內(nèi)源性或重組)的宿主細(xì)胞，且其中導(dǎo)入的重組核酸分子包括編碼非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)功能域的核酸序列。換句話說(shuō)，本發(fā)明試圖包括任何遺傳修飾的生物體(例如，微生物或植物)，其中該生物體包含至少一種非細(xì)菌PUFA PKS結(jié)構(gòu)域功能(內(nèi)源性或者通過(guò)重組修飾)，且其中當(dāng)該生物體包含功能性PKS系統(tǒng)時(shí)該遺傳修飾對(duì)非細(xì)菌PUFA PKS結(jié)構(gòu)域功能或PKS系統(tǒng)具有可測(cè)量的影響。因此，使用本發(fā)明的非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)，例如，利用來(lái)自Thraustochytrid PUFA PKS系統(tǒng)的基因，可使用基因混合將PUFA產(chǎn)物的范圍擴(kuò)展到包括EPA，DHA，ARA，GLA，SDA及其它產(chǎn)物，以及產(chǎn)生廣泛的生物活性分子，包括抗生素，其它藥用化合物，和其它所需產(chǎn)物。獲得這些生物活性分子的方法不僅包括混合來(lái)自各種生物的基因，而且還包括遺傳修飾本文公開的非細(xì)菌PUFA PKS基因的方法。對(duì)本發(fā)明的非細(xì)菌PUFAPKS系統(tǒng)的遺傳基礎(chǔ)和結(jié) 構(gòu)域結(jié)構(gòu)的了解提供了設(shè)計(jì)產(chǎn)生各種生物活性分子的遺傳修飾的新生物體的基礎(chǔ)。盡管本發(fā)明人預(yù)期可混合和修飾任一 PKS結(jié)構(gòu)域和有關(guān)基因，但是以舉例的方式，下面討論了在遺傳修飾和生物活性分子的生產(chǎn)中對(duì)PUFA-PKS系統(tǒng)的各種可能的操作。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)修飾CLF(鏈長(zhǎng)因子)結(jié)構(gòu)域改變非細(xì)菌PUFA-PKS 系統(tǒng)的產(chǎn)物，例如由Thraustochytrids產(chǎn)生的那些產(chǎn)物。該結(jié)構(gòu)域是II型(分離的酶) PKS系統(tǒng)的特征。其氨基酸序列與KS (酮合酶對(duì))結(jié)構(gòu)域具有同源性，但它缺乏活性位點(diǎn)半胱氨酸。CLF可發(fā)揮確定延長(zhǎng)循環(huán)次數(shù)，且因此確定最終產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)的功能。在本發(fā)明的該實(shí)施方案中，使用目前對(duì)FAS和PKS合成的了解情況，提供了通過(guò)定點(diǎn)修飾非細(xì)菌PUFA-PKS 系統(tǒng)產(chǎn)生ARA的合理策略。在文獻(xiàn)中關(guān)于CLF在PKS系統(tǒng)中的功能存在爭(zhēng)論(C.Bisang等， Nature 401,502(1999))且認(rèn)識(shí)到其它結(jié)構(gòu)域可能與最終產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)確定相關(guān)。然而，有意義的是 Schizochytrium 同時(shí)產(chǎn)生 DHA (C22 6，w-3)和 DPA(C22:5，w-6)。在 PUFA-PKS 系統(tǒng)中，在碳鏈生長(zhǎng)的合成期間導(dǎo)入順式雙鍵。由于在該分子合成的早期出現(xiàn)和(0-6雙鍵的放置，因此預(yù)期它們不會(huì)影響隨后的最終產(chǎn)物鏈長(zhǎng)確定。因此，不受理論的約束，本發(fā) 明人相信將指導(dǎo)C20單元(代替C22單元)合成的因子(例如，CLF)導(dǎo)入Schizochytrium PUFA-PKS系統(tǒng)中將導(dǎo)致產(chǎn)生EPA(C20:5， _3)和ARA(C20:4， _6)。例如，在異源性系統(tǒng)中，通過(guò)將來(lái)自產(chǎn)生EPA的系統(tǒng)的CLF(例如，來(lái)自發(fā)光菌屬(Photobacterium)的CLF)直接取代進(jìn)Schizochytrium基因組可利用該CLF。然后分析所得的轉(zhuǎn)化子的脂肪酸分布特征的變化以鑒定產(chǎn)生EPA和/或ARA的轉(zhuǎn)化子。除了依賴于異源性系統(tǒng)(重組系統(tǒng)，例如可導(dǎo)入植物中的系統(tǒng))的開發(fā)外，CLF的概念可在Schizochytrium中利用(即，通過(guò)修飾Schizochytrium基因組)。轉(zhuǎn)化和異源性重組已經(jīng)在Schizochytrium中得到證實(shí)。通過(guò)構(gòu)建帶有OrfB的CLF被來(lái)自C20 PUFA-PKS 系統(tǒng)的CLF取代的克隆可利用它。編碼區(qū)的下游可插入標(biāo)記基因。然后可轉(zhuǎn)化野生型細(xì)胞，選擇標(biāo)記表型，然后篩選插入了該新的CLF的細(xì)胞。接著可分析它們對(duì)脂肪酸分布特征的任何影響以鑒定產(chǎn)生EPA和/或ARA的轉(zhuǎn)化子。如果發(fā)現(xiàn)不同于與CLF相關(guān)的一些因子影響終產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)，則可采用相似的策略改變這些因子。涉及改變PUFA-PKS產(chǎn)物的另一優(yōu)選的實(shí)施方案包括修飾或取代0 -羥酰-ACP脫水酶/酮合酶對(duì)。在大腸桿菌的順式-11-十八碳烯酸(C18:l，All)合成期間，據(jù)信順式雙鍵的產(chǎn)生依賴于特異性DH酶，羥酰-ACP脫水酶，即FabA基因的產(chǎn)物。該酶從羥酰-ACP去掉H0H并在碳鏈中留下一個(gè)反式雙鍵。DH的一個(gè)亞型，即FabA-樣DH具有順?lè)?異構(gòu)酶活性(Heath等，1996，出處同上)。細(xì)菌和非細(xì)菌PUFA-PKS系統(tǒng)的一個(gè)新方面是存在兩個(gè)FabA-樣DH結(jié)構(gòu)域。不受理論的約束，本發(fā)明人相信這些DH結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或兩者都具有順?lè)串悩?gòu)酶活性(DH結(jié)構(gòu)域的操作在下面進(jìn)行更詳細(xì)地討論)。大腸桿菌中不飽和脂肪酸合成的另一方面是需要特定的KS酶，酮脂酰-ACP合酶，F(xiàn)abB基因的產(chǎn)物。它是完成對(duì)連接到活性位點(diǎn)的半胱氨酸殘基(通過(guò)硫酯鍵)上的脂肪酸與丙二酰-ACP進(jìn)行縮合的酶。在多步反應(yīng)中，釋放C02且以兩個(gè)碳延長(zhǎng)線型鏈。據(jù)信只有該KS延長(zhǎng)含有雙鍵的碳鏈。只有當(dāng)雙鍵為順式構(gòu)型時(shí)發(fā)生該延長(zhǎng)，如果為反式構(gòu)型，在延長(zhǎng)前雙鍵被烯酰-ACP還原酶(ER)還原(Heath等，1996，出處同上)。至今鑒定的所有 PUFA-PKS系統(tǒng)都具有兩個(gè)KS結(jié)構(gòu)域，一個(gè)與大腸桿菌的FabB-樣KS比與其它KS具有更高的同源性。同樣，不受理論的約束，本發(fā)明人相信在PUFA-PKS系統(tǒng)中，DH(FabA-樣)和 KS(FabB-樣)酶結(jié)構(gòu)域的特異性和相互作用確定了終產(chǎn)物中順式雙鍵的數(shù)目和位置。由于2-碳延長(zhǎng)反應(yīng)的次數(shù)比PUFA PKS終產(chǎn)物中存在的雙鍵數(shù)目更大，因此可確定在一些延長(zhǎng)循環(huán)中發(fā)生了完全還原。因此DH和KS結(jié)構(gòu)域可用作改變DHA/DPA比率或其它長(zhǎng)鏈脂肪酸比率的靶。通過(guò)導(dǎo)入來(lái)自其它系統(tǒng)的同源性結(jié)構(gòu)域或者通過(guò)對(duì)這些基因片段的誘變可修飾和/或評(píng)估它們。在另一實(shí)施方案中，可修飾或取代ER (烯酰-ACP還原酶，一種還原脂肪酸-ACP中的反式雙鍵產(chǎn)生完全飽和碳的酶)結(jié)構(gòu)域以改變PKS系統(tǒng)制備的產(chǎn)物類型。例如，本發(fā)明人已知Schizochytrium PUFA-PKS系統(tǒng)與以前描述的細(xì)菌系統(tǒng)的區(qū)別在于它具有兩個(gè)(而不是一個(gè))ER結(jié)構(gòu)域。不受理論的約束，本發(fā)明人相信這些ER結(jié)構(gòu)域可有效影響所得的PKS 生產(chǎn)產(chǎn)物。通過(guò)分別敲除單個(gè)結(jié)構(gòu)域或者通過(guò)修飾其核苷酸序列或者通過(guò)用來(lái)自其它生物的ER結(jié)構(gòu)域的取代可改變所得的PKS產(chǎn)物。在另一實(shí)施方案中，可將編碼不是PKS系統(tǒng)的一部分，但影響PKS系統(tǒng)的蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域的核酸分子導(dǎo)入生物體中。例如，上文所述所有PUFAPKS系統(tǒng)含有多個(gè)，串連的，ACP 結(jié)構(gòu)域。ACP(作為獨(dú)立的蛋白質(zhì)或者作為更大蛋白質(zhì)的一個(gè)結(jié)構(gòu)域)需要附著到磷酸泛酰巰基乙胺輔因子上以產(chǎn)生有活性的，完整(holo)-ACP。磷酸泛酰巰基乙胺與apo-ACP的附著通過(guò)酶超家族成員，即磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPTase)完成(Lambalot R.H.，等， Chemistry and Biology,3,923(1996))。與其它PKS和FAS系統(tǒng)相比，本發(fā)明人推定通過(guò)特異性，內(nèi)源性，PPTase可完成對(duì) Schizochytriurn 0RFA蛋白質(zhì)中存在的多個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域的激活。在Schizochytrium中尚未鑒定編碼該推定的PPTase的基因。如果在Schizochytrium中存在該基因，可預(yù)料到用于嘗試鑒定和克隆它的一些方法。這些方法包括(但不限于)從活躍生長(zhǎng)的Schizochytrium 細(xì)胞制備的cDNA文庫(kù)的產(chǎn)生和部分測(cè)序(注意，在目前獲得的Schizochytrium cDNA文庫(kù) 組中鑒定了與PPTase的序列具有同源性的一個(gè)序列；然而，它似乎是多結(jié)構(gòu)域的FAS蛋白質(zhì)的一部分，且本身不編碼所需的OrfA特異性PPTase)；使用在許多PPTase中存在的氨基酸基序設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并寡核苷酸引物用于PCR反應(yīng)(以獲得用于篩選基因組或cDNA文庫(kù)的核酸探針?lè)肿?；基于蛋白質(zhì)_蛋白質(zhì)相互作用的遺傳方法(例如，酵母雙雜交系統(tǒng))，其中 0RFA-ACP結(jié)構(gòu)域可用作“釣餌”以發(fā)現(xiàn)“靶”(即，PPTase)；以及純化和部分測(cè)序酶本身作為產(chǎn)生用于篩選基因組或cDNA文庫(kù)的核酸探針的工具。異源性PPTase也許能夠激活Schizochytrium ORFA ACP結(jié)構(gòu)域也是可預(yù)料到的。已經(jīng)表明一些PPTases，例如枯草桿菌(Bacillus subtilis)的sfp酶(Lambalot等，出處同上)禾口 Streptomyces verticillus 的 svp 酶(Sanchez 等，2001, Chemistry & Biology 8 :725-738)，具有廣泛的底物耐受性?？稍囼?yàn)這些酶以觀察它們是否激活Schizochytrium ACP結(jié)構(gòu)域。另外，最近的一篇文獻(xiàn)描述了真菌PKS蛋白質(zhì)在煙草中的表達(dá)(Yalpani等， 2001，The Plant Cell 13:1401-1409)。在該轉(zhuǎn)基因植物中檢測(cè)到導(dǎo)入的PKS系統(tǒng)(由展青霉(Penicilliumpatulum)的 6-甲基水楊酸(6-methylsalicyclic acid)合酶基因編碼)的產(chǎn)物，盡管在這些植物中不存在相應(yīng)的真菌PPTase。這表明內(nèi)源性植物PPTase (s) 識(shí)別并激活真菌PKS ACP結(jié)構(gòu)域。與該觀察結(jié)果相關(guān)聯(lián)，本發(fā)明人在擬南芥整體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定了很可能編碼PPTases的兩個(gè)序列(基因)。這些序列(GenBank登錄號(hào) AAG51443和AAC05345)目前列為編碼“未知蛋白”。根據(jù)在翻譯的蛋白質(zhì)序列中存在包括 G(I/V)D 禾口 WxxKE (A/S) xxK (SEQ IDN0 33)的一些標(biāo)記基序(在 Lambalot 等，1996 中作為所有PPTases的特征列出)將它們鑒定為推定的PPTases。另外，這兩個(gè)推定的蛋白質(zhì)含有一般在PPTases中發(fā)現(xiàn)的另外兩個(gè)基序，這兩個(gè)基序一般與PKS和非核糖體肽合成系統(tǒng) 相關(guān)；即 FN(I/L/V)SHS(SEQ ID NO 34)和(I/V/L) G (I/L/V) D (I/L/V) (SEQID NO :35)。而且，這些基序在該蛋白質(zhì)序列的預(yù)期相關(guān)位置出現(xiàn)。很可能在諸如煙草的其它植物中存在該擬南芥基因的同源物。同樣，可克隆并表達(dá)這些基因以觀察它們編碼的酶是否可激活 Schizochytrium ORFA ACP結(jié)構(gòu)域，或者作為選擇，可在該轉(zhuǎn)基因植物中直接表達(dá)OrfA (靶向質(zhì)體或細(xì)胞質(zhì))?？勺R(shí)別ORFA ACP結(jié)構(gòu)域作為底物的另一異源性PPTase是念珠藻屬(Nostoc)種類的PCC 7120(以前稱為魚腥藻屬(Anabaena)種類的PCC 7120)的Het I蛋白質(zhì)。正如美國(guó)專利號(hào)6，140，486中所述，希瓦氏菌屬的一些PUFA-PKS基因與在念珠藻屬中發(fā)現(xiàn)的 PKS基因簇中存在的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域具有高度同源性(該專利的圖2)。該念珠藻屬PKS系統(tǒng)與長(zhǎng)鏈(C26或C28)羥基脂肪酸的合成相關(guān)，該脂肪酸與糖類半分子酯化形成異形囊胞細(xì)胞壁的一部分。這些念珠藻屬PKS結(jié)構(gòu)域也與Schizochytrium PKS蛋白質(zhì)的Orfs B 和C中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域(即，相應(yīng)于在希瓦氏菌屬PKS蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的那些結(jié)構(gòu)域的相同結(jié)
57構(gòu)域)具有高度同源性。直到最近，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有一個(gè)念珠藻屬PKS結(jié)構(gòu)域與 Schizochytrium OrfA的任一結(jié)構(gòu)域(或同源性希瓦氏菌屬Orf 5蛋白質(zhì))具有高度同源性。然而，最近已經(jīng)測(cè)序了念珠藻屬的全部基因組，因此，現(xiàn)在可得到緊靠該P(yáng)KS基因簇上游區(qū)域的序列。在該區(qū)域中有三個(gè)Orfs與OrfA的該結(jié)構(gòu)域(KS，MAT，ACP和KR)具有同源性(見圖3)。在這組中包含兩個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域，都與0RFAACP結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出高度同源性。在念珠藻屬PKS基因簇的末端是編碼Het I PPTase的基因。以前，不清楚Het I酶的底物是什么，然而在該基因簇中新鑒定的Orf (Hgl E)中存在串連的ACP結(jié)構(gòu)域強(qiáng)烈地啟發(fā)了本發(fā) 明人該底物是那些ACPs。Schizochytrium與念珠藻屬的ACP結(jié)構(gòu)域的同源性，以及在兩種蛋白質(zhì)中該結(jié)構(gòu)域的串連排列使得Het I很可能是Schizochytrium ORFA ACPs的異源性激活的候選物。本發(fā)明人相信首次認(rèn)識(shí)到并推測(cè)了念珠藻屬Het I PPTase的該用途。正如在Metz等，2001，出處同上中所述，PUFA PKS系統(tǒng)的一個(gè)新特征是存在兩個(gè) 脫水酶結(jié)構(gòu)域，兩者都與大腸桿菌的FabA蛋白質(zhì)具有同源性。利用上述新的念珠藻屬PKS 基因序列，現(xiàn)在可比較兩個(gè)系統(tǒng)及其產(chǎn)物。念珠藻屬基因簇(從HglE到Het I)中結(jié)構(gòu)域的順序本發(fā)明人將它們確定為(參見圖3)KS-MAT-2xACP, KR, KS, CLF-AT，ER (HetM, HetN) Het I在Schizochytrium PUFA-PKS 的 Orfs A，B 和 C 中，該順序(OrfA-B-C)是KS-MAT-9xACP-KR KS—CLF—AT—ER DH—DH—ER可見結(jié)構(gòu)域順序相對(duì)應(yīng)(也具有較高的氨基酸序列同源性)。念珠藻屬PKS系統(tǒng)的產(chǎn)物是不含雙鍵(順式或反式)的長(zhǎng)鏈羥基脂肪酸(具有一個(gè)或兩個(gè)羥基的C26或C28)。 Schizochytrium PKS系統(tǒng)的產(chǎn)物是長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(C22，具有5個(gè)或6個(gè)雙鍵，均為順式)。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組之間的明顯差異是在Schizochytrium蛋白質(zhì)中存在兩個(gè)DH結(jié)構(gòu)域，正好該結(jié)構(gòu)域涉及DHA和DPA中順式雙鍵的形成(推測(cè)念珠藻屬系統(tǒng)中的HetM和HetN涉及包含羥基且也含有DH結(jié)構(gòu)域，其起源不同于在PUFA中發(fā)現(xiàn)的DH)。另外，在Schizochytrium Orfs B和C中兩份ER結(jié)構(gòu)域的作用尚不清楚(在其它鑒定的PUFA PKS系統(tǒng)中不存在第二個(gè)ER結(jié)構(gòu)域)。兩組結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸序列同源性隱含著一種進(jìn)化關(guān)系?？烧J(rèn)為該 PUFA PKS基因組起源于(在進(jìn)化意義上)一種插入了 DH (FabA樣)結(jié)構(gòu)域的祖先念珠藻屬樣PKS基因組。DH結(jié)構(gòu)域的加入導(dǎo)致在新的PKS終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中導(dǎo)入了順式雙鍵。Schizochytrium和念珠藻屬PKS結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的比較以及Schizochytrium與希瓦氏菌屬PUFA-PKS蛋白質(zhì)之間的結(jié)構(gòu)域組織的比較證實(shí)了改變結(jié)構(gòu)域順序以及插入新的結(jié) 構(gòu)域產(chǎn)生新終產(chǎn)物的天然能力。另外，現(xiàn)在可在實(shí)驗(yàn)室改造該基因以產(chǎn)生新產(chǎn)物。這些觀察結(jié)果的含義是以定向或隨機(jī)的方式繼續(xù)改造該系統(tǒng)可影響終產(chǎn)物。例如，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可設(shè)想用PUFA-PKS系統(tǒng)的一個(gè)DH(FabA-樣)結(jié)構(gòu)域取代不具有異構(gòu)化活性的DH 結(jié)構(gòu)域，可能產(chǎn)生具有順式和反式雙鍵混合體的分子。Schizochytrium PUFAPKS系統(tǒng)的普遍產(chǎn)物是DHA和DPA (C22 5 6)。如果改造產(chǎn)生C20脂肪酸的系統(tǒng)，可預(yù)期該產(chǎn)物是EPA和 ARA(C20:4 6)。這可為ARA提供一種新來(lái)源。也可使用產(chǎn)生不同的DHA與DPA比率的有關(guān)PUFA-PKS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域取代，例如，使用來(lái)自破囊壺菌屬23B的基因(本文首次鑒定了其PUFAPKS系統(tǒng))。另外，可設(shè)想特異性改變Schizochytrium PUFA PKS系統(tǒng)(至今描述的其它PUFA PKS系統(tǒng)沒(méi)有兩個(gè)ER結(jié)構(gòu)域)中的一個(gè)ER結(jié)構(gòu)域(例如，去掉，或失活)以測(cè)定其對(duì)終產(chǎn)物分布特征的影響?？墒褂脧?fù)雜性更高或更低的方案對(duì)PUFA-PKS蛋白質(zhì)的各個(gè)不同的結(jié) 構(gòu)域以定向的方式嘗試相似的策略。當(dāng)然可不限于改造單個(gè)結(jié)構(gòu)域。最后，通過(guò)混合來(lái)自 PUFA-PKS系統(tǒng)和其它PKS或FAS系統(tǒng)(例如，I型，II型，模塊型)的結(jié)構(gòu)域可擴(kuò)展該研究以產(chǎn)生全部范圍的新終產(chǎn)物。例如，可將PUFA-PKS DH結(jié)構(gòu)域?qū)胝Ｇ闆r下在其終產(chǎn)物中不摻入順式雙鍵的系統(tǒng)中。因此，本發(fā)明包含通過(guò)遺傳修飾生物體中編碼具有根據(jù)本發(fā)明的非細(xì)菌PUFA PKS 系統(tǒng)的至少一個(gè)功能域的生物學(xué)活性的氨基酸序列的至少核酸序列，和/或表達(dá)含有編碼該氨基酸序列的核酸序列的至少一個(gè)重組核酸分子來(lái)遺傳修飾微生物或植物細(xì)胞的方法。上文已經(jīng)詳細(xì)描述了該序列，用于遺傳修飾生物體的方法，和具體修飾的各種實(shí)施方案。一般來(lái)說(shuō)，該方法用于產(chǎn)生可生產(chǎn)一種或多種特定的生物活性分子的特定遺傳修飾的生物體。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及被修飾成表達(dá)多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的重組宿主細(xì)胞，其中該P(yáng)KS催化重復(fù)的和非重復(fù)的酶反應(yīng)，且其中該P(yáng)UFA PKS系統(tǒng)包括(a)至少兩個(gè)烯酰ACP-還原酶(ER)結(jié)構(gòu)域；(b)至少6個(gè)?；d體蛋白 (ACP)結(jié)構(gòu)域；(c)至少兩個(gè)0 -酮脂酰-ACP合酶(KS)結(jié)構(gòu)域；(d)至少一個(gè)酰基轉(zhuǎn)移酶 (AT)結(jié)構(gòu)域；(e)至少一個(gè)酮還原酶(KR)結(jié)構(gòu)域；(f)至少兩個(gè)FabA-樣3 -羥酰-ACP脫水酶(DH)結(jié)構(gòu)域；(g)至少一個(gè)鏈長(zhǎng)因子(CLF)結(jié)構(gòu)域；和(h)至少一個(gè)丙二酰-CoA: ACP 酰基轉(zhuǎn)移酶(MAT)結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，PUFA PKS系統(tǒng)是真核PUFA PKS系統(tǒng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，PUFA PKS系統(tǒng)是藻類PUFA PKS系統(tǒng)。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，該P(yáng)UFA PKS系統(tǒng)是Thraustochytriales PUFA PKS系統(tǒng)。該P(yáng)UFA PKS系統(tǒng)可包括，但不限于Schizochytrium PUFA PKS系統(tǒng)，和破囊壺菌屬PUFA PKS系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該P(yáng)UFA PKS系統(tǒng)可在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，該P(yáng)UFA PKS系統(tǒng)可在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及被修飾成表達(dá)非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的重組宿主細(xì)胞，其中該P(yáng)KS系統(tǒng)催化重復(fù)的和非重復(fù)的酶反應(yīng)，且其中該非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)包括至少下列生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域(a)至少一個(gè)烯酰ACP-還原酶(ER)結(jié)構(gòu)域；(b)多個(gè)?；d體蛋白(ACP)結(jié)構(gòu)域(至少4個(gè))；(c)至少兩個(gè)0 -酮脂酰-ACP合酶(KS)結(jié)構(gòu)域；(d)至少一個(gè)?；D(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域；(e)至少一個(gè)酮還原酶(KR)結(jié)構(gòu)域；(f)至少兩個(gè)FabA-樣
羥酰-ACP脫水酶(DH)結(jié)構(gòu)域；(g)至少一個(gè)鏈長(zhǎng)因子(CLF)結(jié)構(gòu)域；和(h)至少一個(gè) 丙二酰-CoA:ACP?；D(zhuǎn)移酶(MAT)結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的該實(shí)施方案的一個(gè)方面涉及產(chǎn)生含有至少一種PUFA的產(chǎn)物的方法，包括在有效產(chǎn)生該產(chǎn)物的條件下生長(zhǎng)含有上述任一重組宿主細(xì)胞的植物，其中該重組宿主細(xì) 胞是植物細(xì)胞。本發(fā)明的該實(shí)施方案的另一方面涉及生產(chǎn)含有至少一種PUFA的產(chǎn)物的方法，包括在有效產(chǎn)生該產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)含有任一上述重組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中該宿主細(xì)胞是微生物細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該宿主細(xì)胞中的PKS系統(tǒng)催化三酰甘油的定向生產(chǎn)。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及含有非細(xì)菌多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶 (PKS)系統(tǒng)的微生物，其中該P(yáng)KS催化重復(fù)的和非重復(fù)的酶反應(yīng)，且其中該P(yáng)UFA PKS系統(tǒng) 包括(a)至少兩個(gè)烯酰ACP-還原酶(ER)結(jié)構(gòu)域；(b)至少6個(gè)?；d體蛋白(ACP)結(jié)構(gòu)域；(c)至少兩個(gè)0 -酮脂酰-ACP合酶(KS)結(jié)構(gòu)域；(d)至少一個(gè)?；D(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu) 域；(e)至少一個(gè)酮還原酶(KR)結(jié)構(gòu)域；(f)至少兩個(gè)FabA-樣0 -羥酰-ACP脫水酶(DH) 結(jié)構(gòu)域；(g)至少一個(gè)鏈長(zhǎng)因子(CLF)結(jié)構(gòu)域；和(h)至少一個(gè)丙二酰-CoA:ACP?；D(zhuǎn)移酶(MAT)結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的是，該微生物是非細(xì)菌微生物且更優(yōu)選的是真核微生物。本發(fā)明還有另一實(shí)施方案涉及含有非細(xì)菌多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的微生物，其中該P(yáng)KS催化重復(fù)的和非重復(fù)的酶反應(yīng)，且其中該P(yáng)UFA PKS系統(tǒng)包括(a)至少一個(gè)烯酰ACP-還原酶(ER)結(jié)構(gòu)域；(b)多個(gè)酰基載體蛋白(ACP)結(jié)構(gòu)域 (至少4個(gè))；(c)至少兩個(gè)0 -酮脂酰-ACP合酶(KS)結(jié)構(gòu)域；(d)至少一個(gè)?；D(zhuǎn)移酶 (AT)結(jié)構(gòu)域；(e)至少一個(gè)酮還原酶(KR)結(jié)構(gòu)域；(f)至少兩個(gè)FabA-樣3 -羥酰-ACP脫水酶(DH)結(jié)構(gòu)域；(g)至少一個(gè)鏈長(zhǎng)因子(CLF)結(jié)構(gòu)域；和(h)至少一個(gè)丙二酰-CoA: ACP 酰基轉(zhuǎn)移酶(MAT)結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)期可結(jié)合誘變程序與選擇性篩選程序以獲得目的生物活性分子。它可包括尋找各種生物活性化合物的方法。該尋找不限于產(chǎn)生具有順式雙鍵的那些分子。該誘變方法可包括，但不限于化學(xué)誘變，基因改組，編碼特定酶結(jié)構(gòu)域的基因區(qū)域的交換，或局限于這些基因的特定區(qū)域的誘變，以及其它方法。例如，可使用高通量誘變方法影響或優(yōu)化目的生物活性分子的生產(chǎn)。一旦形成有效的模型系統(tǒng)，可以高通量方式修飾這些基因?？稍O(shè)想在兩種水平上利用這些技術(shù)。首先，如果可設(shè)計(jì)足夠的選擇性篩選方法用于產(chǎn)生目的產(chǎn)物(例如，ARA)，則可用于嘗試改變?cè)?系統(tǒng)以產(chǎn)生該產(chǎn)物(例如，代替諸如上文討論的其它策略，或者與其協(xié)同作用)。另外，如果上文列出的該策略導(dǎo)致一組基因不產(chǎn)生該目的產(chǎn)物，那么可使用該高通量技術(shù)優(yōu)化該系統(tǒng)。例如，如果導(dǎo)入的結(jié)構(gòu)域僅在相當(dāng)?shù)偷臏囟认缕鹱饔?，則可設(shè)計(jì)允許去掉該限制的選擇方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，篩選方法可用于鑒定具有與本文所述Schizochytrium 的PUFA PKS系統(tǒng)相似的新PKS系統(tǒng)的其它非細(xì)菌生物體(參見上文)。在該生物體中鑒定的同源性PKS系統(tǒng)可用于與本文所述用于Schizochytrium，以及用于其它遺傳物質(zhì)來(lái)源的方法相似的方法中，其中從該來(lái)源產(chǎn)生，進(jìn)一步修飾和/或突變PKS系統(tǒng)用于在該微生物中，在另一微生物中，或在高等植物中表達(dá)以產(chǎn)生各種化合物。應(yīng)認(rèn)識(shí)到可導(dǎo)入天然(內(nèi)源性，原始的)PKS系統(tǒng)中的隨機(jī)的或者定向的許多遺傳改變會(huì)導(dǎo)致酶功能的失活。本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案包括的系統(tǒng)僅選擇不抑制PKS系統(tǒng)產(chǎn) 生一種產(chǎn)物的能力的那些修飾。例如，大腸桿菌的FabB-菌株不能合成不飽和脂肪酸且為了生長(zhǎng)需要向培養(yǎng)基中補(bǔ)充可代替其正常不飽和脂肪酸的脂肪酸(參見Metz等，2001，出處同上)。然而，當(dāng)用有功能的PUFA-PKS系統(tǒng)(即，在大腸桿菌宿主中產(chǎn)生PUFA產(chǎn)物的系統(tǒng)，參見(Metz等，2001，出處同上，圖2A)轉(zhuǎn)化該菌株時(shí)可取消該需要(對(duì)培養(yǎng)基的補(bǔ)充需要)。轉(zhuǎn)化的FabB-菌株現(xiàn)在需要有功能的PUFA-PKS系統(tǒng)(以產(chǎn)生該不飽和脂肪酸)用于生長(zhǎng)而不需要補(bǔ)充該脂肪酸。該例子中的關(guān)鍵因素在于廣泛的不飽和脂肪酸的生產(chǎn)可以滿足(即使不飽和脂肪酸代替例如支鏈脂肪酸)。因此，在本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，可在本文公開的一種或多種PUFAPKS基因中產(chǎn)生大量突變，然后轉(zhuǎn)化適當(dāng)修飾的FabB-菌株(例如在含有ER結(jié)構(gòu)域的表達(dá)構(gòu)建體中產(chǎn)生突變并轉(zhuǎn)化具有其它必需結(jié)構(gòu)域在獨(dú)立的質(zhì)粒中或者整合進(jìn)染色體中的FabB菌株)并僅選擇不需補(bǔ)充培養(yǎng)基就能生長(zhǎng)(即，仍然具有產(chǎn)生能補(bǔ)充FabB-缺陷的分子)的那些轉(zhuǎn)化子?？砷_發(fā)其它篩選工具用于尋找在有活性的PKS系統(tǒng)的該選擇性亞型中產(chǎn)生的特定的化合物(例如，對(duì)于脂肪酸使用GC)。可設(shè)想許多相似的選擇性篩選工具用于目的生物活性分子。如上所述，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，遺傳修飾的微生物或植物包括合成所需生物活性分子(產(chǎn)物)的能力增強(qiáng)或者新導(dǎo)入了合成特定產(chǎn)物(例如，合成特定抗生素) 的能力的微生物或植物。根據(jù)本發(fā)明，“增強(qiáng)合成產(chǎn)物的能力”是指在與該產(chǎn)物合成相關(guān)的途徑中使得與在相同條件下培養(yǎng)或生長(zhǎng)的野生型微生物或植物相比該微生物或植物產(chǎn)生的產(chǎn)物量(包括任何以前不存在的產(chǎn)物的生產(chǎn))增加的任何增強(qiáng)或上調(diào)。產(chǎn)生該遺傳修飾的生物體的方法在上文中已有詳細(xì)描述。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)生長(zhǎng)或培養(yǎng)本發(fā)明的遺傳修飾的微生物或植物 (在上文中詳細(xì)描述)產(chǎn)生所需生物活性分子(也稱為產(chǎn)物或化合物)的方法。該方法包括分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)或在合適的環(huán)境，例如土壤中生長(zhǎng)具有按本文前面所述且根據(jù)本發(fā)明遺傳修飾的微生物或植物的步驟。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，產(chǎn)生本發(fā)明的生物活性分子的方法包括在有效產(chǎn)生該生物活性分子的條件下培養(yǎng)表達(dá)包含多不飽和脂肪酸 (PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)生物活性結(jié)構(gòu)域的PKS系統(tǒng)的遺傳修飾的生物體的步驟。在該優(yōu)選的方面，PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域由選自下組的核酸序列編碼(a)編碼來(lái)自Thraustochytrid微生物的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶 (PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；(b)編碼來(lái)自以本發(fā)明的新篩選方法鑒定的微生物(在上文中詳細(xì)描述)的PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；(c)編碼選自由SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4, SEQ ID NO :6，和其生物學(xué)活性片段組成的組中的氨基酸序列的核酸序列；(d)編碼選自:SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :13，SEQ ID NO 18，SEQ ID NO :20, SEQ ID NO :22，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO -.26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO =30, SEQ ID NO :32，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；(e)編碼與選自 SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO 6的氨基酸序列的至少500個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中該氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，(f)編碼與選自SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO 13，SEQ ID NO :18, SEQ ID NO -.20, SEQ ID NO :22，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO -.26, SEQ ID NO =28, SEQ ID N0:30，或SEQID NO :32的氨基酸序列具有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中該氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。在該方法的這一優(yōu)選方面中，該生物體被遺傳修飾成影響PKS系統(tǒng)的活性(在上文中詳細(xì)描述)。用于與本發(fā)明的PUFA PKS系統(tǒng)相關(guān)的遺傳修飾的優(yōu)選宿主細(xì)胞在上文中描述。在生產(chǎn)本發(fā)明的所需生物活性化合物的方法中，在合適的培養(yǎng)基中在有效產(chǎn)生該生物活性化合物的條件下培養(yǎng)或生長(zhǎng)遺傳修飾的微生物。合適的或有效的培養(yǎng)基是指本發(fā) 明的遺傳修飾的微生物在其中培養(yǎng)時(shí)，能夠產(chǎn)生所需產(chǎn)物的任何培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基一般是含有可同化的碳，氮和磷酸鹽來(lái)源的含水培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基也可包含合適的鹽，無(wú)機(jī)物，金屬和其它營(yíng)養(yǎng)成分。本發(fā)明的微生物可在常規(guī)發(fā)酵生物反應(yīng)器中培養(yǎng)?？赏ㄟ^(guò)包括，但不限于，分批，補(bǔ)料分批，細(xì)胞再循環(huán)，和連續(xù)發(fā)酵的任何發(fā)酵方法培養(yǎng)該微生物。用于根據(jù)本發(fā)明的潛在宿主微生物的優(yōu)選生長(zhǎng)條件是本領(lǐng)域熟知的。該遺傳修飾的微生物產(chǎn)生的所需生物活性分子可使用常規(guī)分離和純化技術(shù)從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收。例如，可過(guò)濾或離心該發(fā) 酵培養(yǎng)基以去掉微生物，細(xì)胞碎片和其它特定物質(zhì)，并通過(guò)例如，離子交換，色譜法，萃取，溶劑萃取，膜分離，電透析，逆向滲透，蒸餾，化學(xué)衍生化和結(jié)晶的常規(guī)方法從無(wú)細(xì)胞上清中回收該產(chǎn)物。作為選擇，可使用產(chǎn)生所需化合物的微生物，或其提取物和各種分級(jí)分離成份而不必從該產(chǎn)物中去掉微生物成份。在生產(chǎn)本發(fā)明的所需生物活性化合物的方法中，在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)或在諸如土壤的合適培養(yǎng)基中生長(zhǎng)遺傳修飾的植物。合適的，或有效的發(fā)酵培養(yǎng)基在上文中詳細(xì)討論。用于高等植物的合適生長(zhǎng)培養(yǎng)基包括用于植物的任何生長(zhǎng)培養(yǎng)基，包括，但不限于，土壤，沙土，支持根生長(zhǎng)的任何其它顆粒培養(yǎng)基(例如，蛭石，perlite，等)或水耕法培養(yǎng)基，以及優(yōu)化該高等植物生長(zhǎng)的合適的光照，水和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充物。本發(fā)明的遺傳修飾的植物可通過(guò)按照本發(fā)明遺傳修飾的PKS系統(tǒng)的活性改造成產(chǎn)生大量所需產(chǎn)物。通過(guò)從該植物中提取該化合物的純化方法可回收該化合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)收獲該植物回收該化合物。在該實(shí)施方案中，可以其天然狀態(tài)消費(fèi)該植物或者進(jìn)一步加工成可消費(fèi)的產(chǎn)物。如上所述，在一個(gè)方面，用于本發(fā)明的遺傳修飾的微生物可內(nèi)源性含有并表達(dá) PUFA PKS系統(tǒng)，且該遺傳修飾可以是對(duì)內(nèi)源性PUFA PKS系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)功能域的遺傳修飾，因此該修飾對(duì)PUFA PKS系統(tǒng)的活性具有一些影響。在另一方面，該生物體可內(nèi)源性含有并表達(dá)PUFA PKS系統(tǒng)，且該遺傳修飾可以是導(dǎo)入至少一個(gè)外源性核酸序列(例如，重組核酸分子)，其中該外源性核酸分子編碼第二個(gè)PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物活性結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)和/或影響所述PUFA PKS系統(tǒng)的活性的蛋白質(zhì)(例如，磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶 (PPTase)，下文討論)。在還有另一方面，該生物體不必內(nèi)源性(天然)含有PUFA PKS系統(tǒng)，但是被遺傳修飾成導(dǎo)入至少一個(gè)編碼具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性的氨基酸序列的重組核酸分子。在該方面，通過(guò)在該生物體中導(dǎo)入或增加PUFA PKS活性來(lái)影響PUFA PKS的活性。分別與這些方面相關(guān)的各種實(shí)施方案已在上文中詳細(xì)討論。在產(chǎn)生生物活性化合物的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，與野生型生物體相比，該遺傳修飾改變了由內(nèi)源性PKS系統(tǒng)產(chǎn)生的至少一種產(chǎn)物。在另一實(shí)施方案中，該生物體內(nèi)源性表達(dá)含有該P(yáng)UFA PKS系統(tǒng)的至少一種生物學(xué) 活性結(jié)構(gòu)域的PKS系統(tǒng)，且該遺傳修飾包含用選自由編碼來(lái)自第二個(gè)PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的重組核酸分子和編碼影響PUFA PKS系統(tǒng)的活性的蛋白質(zhì)的重組核酸分子組成的組中的重組核酸分子轉(zhuǎn)染該生物體。在該實(shí)施方案中，與野生型生物體相比，該遺傳修飾優(yōu)選改變由內(nèi)源性PKS系統(tǒng)產(chǎn)生的至少一種產(chǎn)物。第二個(gè)PKS系統(tǒng)可包括另一 PUFA PKS系統(tǒng)(細(xì)菌或非細(xì)菌)，I型PKS系統(tǒng)，II型PKS系統(tǒng)，和/或模塊型PKS系統(tǒng)。影響PKS系統(tǒng)的活性的蛋白質(zhì)的例子已在上文中描述(例如，PPTase)。在另一實(shí)施方案中，該生物體通過(guò)用編碼多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的重組核酸分子轉(zhuǎn)染來(lái)進(jìn)行遺傳修飾。該重組核酸分子在本文前面進(jìn)行了詳細(xì)描述。在另一實(shí)施方案中，該生物體內(nèi)源性表達(dá)非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)，且該遺傳修飾包括用來(lái)自不同PKS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域取代編碼該非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列。在另一實(shí)施方案中，該生物體內(nèi)源性表達(dá)非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)，且通過(guò)用編碼調(diào) 節(jié)PUFA PKS系統(tǒng)產(chǎn)生的脂肪酸的鏈長(zhǎng)的蛋白質(zhì)的重組核酸分子轉(zhuǎn)染該生物體進(jìn)行了修飾。在一個(gè)方面，編碼調(diào)節(jié)脂肪酸鏈長(zhǎng)的蛋白質(zhì)的重組核酸分子取代編碼該非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)中的鏈長(zhǎng)因子的核酸序列。在另一方面，調(diào)節(jié)PUFA PKS系統(tǒng)產(chǎn)生的脂肪酸的鏈長(zhǎng)的蛋白質(zhì)是鏈長(zhǎng)因子。在另一方面，調(diào)節(jié)PUFA PKS系統(tǒng)產(chǎn)生的脂肪酸的鏈長(zhǎng)的蛋白質(zhì)是指導(dǎo)C20 單位合成的鏈長(zhǎng)因子。在另一實(shí)施方案中，該生物體表達(dá)在選自由編碼0 -羥酰-ACP脫水酶(DH)的結(jié) 構(gòu)域和編碼酮脂酰-ACP合酶(KS)的結(jié)構(gòu)域組成的組中的一個(gè)結(jié)構(gòu)域中包含遺傳修飾的非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)，其中與沒(méi)有該修飾相比，該修飾改變了由PUFA PKS系統(tǒng)產(chǎn)生的長(zhǎng) 鏈脂肪酸的比率。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，該修飾選自由該結(jié)構(gòu)域的全部或部分缺失，用來(lái)自不同生物體的同源性結(jié)構(gòu)域取代該結(jié)構(gòu)域，和該結(jié)構(gòu)域的突變組成的組中。在另一實(shí)施方案中，該生物體表達(dá)在烯酰-ACP還原酶(ER)結(jié)構(gòu)域中含有修飾的非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)，其中與沒(méi)有該修飾相比，該修飾導(dǎo)致產(chǎn)生不同化合物。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面，該修飾選自由該ER結(jié)構(gòu)域的全部或部分缺失，用來(lái)自不同生物體的ER結(jié)構(gòu) 域取代該ER結(jié)構(gòu)域，和該ER結(jié)構(gòu)域的突變組成的組中。在產(chǎn)生生物活性分子的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，該生物體產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸 (PUFA)分布特征不同于沒(méi)有遺傳修飾的天然生物體。用于產(chǎn)生生物活性分子的許多其它遺傳修飾對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言在本說(shuō) 明書的教導(dǎo)下是顯而易見的，且各種其它修飾已在本文前面進(jìn)行了討論。本發(fā)明包含導(dǎo)致產(chǎn)生所需生物活性分子的與本文所述PUFAPKS系統(tǒng)相關(guān)的任何遺傳修飾。根據(jù)本發(fā)明的生物活性分子包括具有生物學(xué)活性且可由包含具有本文所述非細(xì) 菌PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)功能域的生物學(xué)活性的至少一種氨基酸序列的PKS系統(tǒng)產(chǎn) 生的任何分子(化合物，產(chǎn)物，等)。該生物活性分子可包括，但不限于多不飽和脂肪酸 (PUFA)，抗炎癥配制品，化療劑，有效賦形劑，骨質(zhì)疏松癥藥物，抗抑郁劑，抗驚厥劑，抗幽門螺桿菌(Heliobactorpylori)藥物，治療神經(jīng)變性疾病的藥物，治療變性肝臟疾病的藥物，抗生素，和降膽固醇配制品。本發(fā)明的非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是該系統(tǒng)具有誘導(dǎo) 順式構(gòu)型的碳_碳雙鍵的能力，且該分子在每第三個(gè)碳包含一個(gè)雙鍵。該能力可用于產(chǎn)生各種化合物。優(yōu)選的是，目的生物活性化合物由該遺傳修飾的微生物以高于約0.05%，且優(yōu)選高于約0.1%，且更優(yōu)選高于約0.25%，且更優(yōu)選高于約0.5%，且更優(yōu)選高于約0. 75 %，且更優(yōu)選高于約1 %，且更優(yōu)選高于約2.5%，且更優(yōu)選高于約5 %，且更優(yōu)選高于約10 %，且更優(yōu)選高于約15%，且更優(yōu)選高于約20%的微生物干重的量產(chǎn)生。對(duì)于脂類化合物，優(yōu)選的是，該化合物以高于約5%的微生物干重的量產(chǎn)生。對(duì)于其它生物活性化合物，例如抗生素或以更少量合成的化合物，將在微生物干重中具有該化合物的那些菌株鑒定為預(yù)期含有上述類型的新PKS系統(tǒng)。在一些實(shí)施方案中，特定的生物活性分子(化合物)由該微生物分泌，而不是累積。因此，該生物活性分子一般從培養(yǎng)基中回收且產(chǎn)生的分子濃度隨該微生物和培養(yǎng)規(guī)模而變化。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及修飾含有至少一種脂肪酸的終產(chǎn)物的方法，包括向所述終產(chǎn)物中添加一種由重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生的油類，該重組宿主細(xì)胞表達(dá)至少一個(gè)含有編碼 PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物活性結(jié)構(gòu)域的核酸序列的重組核酸分子。該P(yáng)UFA PKS系統(tǒng) 是任一非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)，且優(yōu)選選自(a)編碼來(lái)自Thraustochytrid微生物的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；(b)編碼來(lái) 自以本文公開的新篩選方法鑒定的微生物的PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；
63(c)編碼選自由SEQ ID NO :2,SEQ ID NO :4,SEQ ID NO :6，和其生物學(xué)活性片段組成的組中的氨基酸序列的核酸序列；(d)編碼選自SEQ IDN0 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO :13, SEQ ID NO :18, SEQ ID NO -.20, SEQ ID NO :22，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO -.26, SEQ ID NO 28，SEQ IDN0:30，SEQ ID NO :32，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；(e)編碼與選自SEQ ID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中該氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和(f)編碼與選自SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :13,SEQID NO 18,SEQ ID NO 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO =28, SEQ ID NO :30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中該氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。上文中已經(jīng)詳細(xì)描述了這些核酸序列的變化。優(yōu)選的是，該終產(chǎn)物選自由食品，飲食添加劑，藥物配制品，人源化動(dòng)物乳汁，和嬰兒配制品組成的組中。合適的藥物配制品包括，但不限于抗炎癥配制品，化療劑，有效賦形劑，骨質(zhì)疏松癥藥物，抗抑郁劑，抗驚厥劑，抗幽門螺桿菌藥物，治療神經(jīng)變性疾病的藥物，治療變性肝臟疾病的藥物，抗生素，和降膽固醇配制品。在一個(gè)實(shí)施方案中，該終產(chǎn)物用于治療選自由慢性炎癥，急性炎癥，胃腸疾病，癌癥，惡病質(zhì)，心臟再狹窄，神經(jīng)變性疾病，肝臟變性疾病，血脂疾病，骨質(zhì)疏松癥，骨關(guān)節(jié)炎，自身免疫疾病，先兆子癇，早產(chǎn)，年老相關(guān)性黃斑病，肺病，和過(guò)氧化物酶體疾病組成的組中的一種癥狀。合適的食品包括，但不限于，精細(xì)面包商品，面包卷(bread and rolls)，早餐谷類食品，加工的和未加工的乳酪，調(diào)味品(番茄醬，蛋黃醬，等)，乳制品(奶，酸乳酪)，布丁和膠質(zhì)甜點(diǎn)，碳酸飲料，茶，粉末狀飲料混合物，加工的魚產(chǎn)物，水果類飲料，口香糖，硬甜食，冷凍乳制品，加工的肉類產(chǎn)物，堅(jiān)果和堅(jiān)果餅(nut-based spreads)，意大利面食，加工的家禽產(chǎn)物，肉汁和醬，馬鈴薯片和其它片狀食品或松脆食品，巧克力和其它甜食，湯和湯混合物，大豆類產(chǎn)物(奶，飲料，乳酪，whiteners)，以植物油為基礎(chǔ)的餅(spreads)，和蔬菜類飲料。本發(fā)明的另一實(shí)施方案涉及生產(chǎn)人源化的動(dòng)物乳汁的方法。該方法包括用至少一種含有編碼PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物活性結(jié)構(gòu)域的核酸序列的重組核酸分子遺傳修飾產(chǎn)奶動(dòng)物的產(chǎn)奶細(xì)胞的步驟。該P(yáng)UFA PKS系統(tǒng)是一種非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)，且優(yōu)選的是，該P(yáng)UFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域由選自下組的核酸序列編碼(a)編碼來(lái)自 Thraustochytrid微生物的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；(b)編碼來(lái)自以本文前面描述的新篩選方法鑒定的微生物的PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；(c)編碼選自由SEQ ID NO 2, SEQ IDN0 4, SEQ ID NO :6，和其生物學(xué)活性片段組成的組中的氨基酸序列的核酸序列；(d)編碼選自SEQ ID NO :8,SEQ ID NO 10,SEQ ID NO 13,SEQ ID NO 18,SEQ ID NO 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24, SEQ IDN0 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO :32，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；(e)編碼與選自:SEQ ID NO :2，SEQ IDN0 :4，或SEQ ID NO 6的氨基酸序列的至少500個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中該氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和/或(f)編碼與選自 SEQ ID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ IDN0 :22，SEQ ID NO 24, SEQ ID NO :26，SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，或 SEQ ID NO 32 的氨基酸序列具有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中該氨基酸序列具有PUFA PKS 系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。遺傳修飾宿主細(xì)胞并產(chǎn)生遺傳修飾的非人產(chǎn)奶動(dòng)物的方法是本領(lǐng)域已知的?？尚?飾的宿主動(dòng)物的例子包括牛，綿羊，豬，山羊，牦牛，等，它們易于進(jìn)行遺傳操作和克隆用于迅速擴(kuò)大表達(dá)轉(zhuǎn)基因的群體。對(duì)于動(dòng)物，通過(guò)修飾基因調(diào)控區(qū)可使PKS-樣轉(zhuǎn)基因適應(yīng)于在靶器官，組織和體液中表達(dá)。特別所需是在宿主動(dòng)物乳腺乳汁中生產(chǎn)PUFA。提供下面的實(shí)施例用于說(shuō)明的目的而不打算用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1下面的實(shí)施例描述了對(duì)來(lái)自Schizochytrium的PKS相關(guān)性序列的進(jìn)一步分析。本發(fā)明人使用PCT公開號(hào)W0 0042195的實(shí)施例8和9和美國(guó)申請(qǐng)系列號(hào) 09/231,899中列出的一般方法測(cè)序了包含Schizochytrium PUFA PKS系統(tǒng)中所有三個(gè)可讀框(Orfs)全長(zhǎng)的基因組DNA。Schizochytrium PKS蛋白質(zhì)中的生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域在圖 1中以圖示進(jìn)行了描述。Schizochytrium PUFA PKS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)更具體地描述如下?？勺x框A (OrfA)OrfA的完整核苷酸序列本文表示為SEQ ID N0 1。OrfA是一個(gè)8730個(gè)核苷酸的序列(不包括終止密碼子)，它編碼一個(gè)2910個(gè)氨基酸的序列，本文表示為SEQ ID NO :2。 OrfA內(nèi)有12個(gè)結(jié)構(gòu)域(a) 一個(gè)3 -酮脂酰-ACP合酶(KS)結(jié)構(gòu)域；(b) 一個(gè)丙二酰-CoA:ACP?；D(zhuǎn)移酶(MAT)結(jié)構(gòu)域；(c) 9個(gè)?；d體蛋白(ACP)結(jié)構(gòu)域；(d) 一個(gè)酮還原酶(KR)結(jié)構(gòu)域。OrfA內(nèi)包含的結(jié)構(gòu)域根據(jù)如下測(cè)定(l)Pfam程序分析的結(jié)果(Pfam是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域或保守蛋白區(qū)域的多個(gè)序列對(duì)比的數(shù)據(jù)庫(kù))。該序列對(duì)比表示了可暗示該蛋白質(zhì)功能的一些進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)。從Pfam序列對(duì) 比建立的概形隱藏馬爾可夫模型(概形HMMs)對(duì)于自動(dòng)識(shí)別屬于已有蛋白質(zhì)家族的新蛋白質(zhì)非常有用，即使該同源性較弱。不同于標(biāo)準(zhǔn)的逐對(duì)序列對(duì)比方法(例如BLAST，F(xiàn)ASTA)， Pfam HMMs可明智地處理多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)。涉及所用的Pfam版本的參考文獻(xiàn)是Bateman A, Birney E, Cerruti L, Durbin R, Etwiller L, Eddy SR, Griffiths-Jones S, Howe KL, Marshall M, Sonnhammer EL(2002)Nucleic Acids Research 30(1) 276-280)；禾口 / 或(2)使用BLAST 2. 0 Basic BLAST同源性檢索與細(xì)菌PUFA-PKS系統(tǒng)(例如，希瓦氏菌屬)的同源性比較，使用blastp用標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行氨基酸檢索，其中，通過(guò)默認(rèn)篩選查詢序列的低復(fù)雜性區(qū)域(在 Altschul, S. F.，Madden, T. L.，Schaaffer, A. A.，Zhang, J.，Zhang, Z.，Miller, ff. &Lipman, D. J. (1997)，“間隔的 BLAST 和 PS I-BLAST 新產(chǎn)生的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索程序”。Nucleic AcidsRes. 25 =3389-3402中描述，本文引用以其整體作為參考)。據(jù)信提供的單個(gè)結(jié)構(gòu)域的序列含有編碼功能域的全長(zhǎng)序列，且在Orf內(nèi)可含有其它側(cè)翼序列。0RFA-KSOrfA中的第一個(gè)結(jié)構(gòu)域是KS結(jié)構(gòu)域，本文也稱為0RFA-KS。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從SEQ ID NO :1 (OrfA)的約位置1和40之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 1的約位置1428和 1500之間的終止位點(diǎn)的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼0RFA-KS結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列在本文中表示為SEQ ID NO :7(SEQ ID NO 1的位置1-1500)。含有KS結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ IDN0 2 (0RFA)的約位置1和14之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 2的約位置476和 500之間的終止位點(diǎn)。含有0RFA-KS結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為SEQ ID NO 8 (SEQ ID NO 2的位置1-500)。應(yīng)注意0RFA-KS結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)活性位點(diǎn)基序DXA(f(*?；Y(jié)合位
占r )0RFA-MATOrfA的第二個(gè)結(jié)構(gòu)域是MAT結(jié)構(gòu)域，本文也稱為ORFA MAT。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從SEQ ID NO :1 (OrfA)的約位置1723和1798之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 1的約位置 2805和3000之間的終止位點(diǎn)的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼0RFA-MAT結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO :9(SEQ ID NO 1的位置1723-3000)。含有MAT結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ ID NO 2 (ORFA)的約位置575和600之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO :2的約位置935和1000之間的終止位點(diǎn)。含有0RFA-MAT結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為SEQ ID NO 10 (SEQ ID NO 2的位置575-1000)。應(yīng)注意該0RFA-MAT結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)活性位點(diǎn) 基序:GHS*XG(*酰基結(jié)合位點(diǎn)S7Q6)，本文表示為SEQ ID N0 :11。0RFA-ACP#1_9OrfA的結(jié)構(gòu)域3_11是9個(gè)串連的ACP結(jié)構(gòu)域，本文也稱為0RFA-ACP(該序列的第一個(gè)結(jié)構(gòu)域是0RFA-ACP1，第二個(gè)結(jié)構(gòu)域是0RFA-ACP2，第三個(gè)結(jié)構(gòu)域是0RFA-ACP3，等)。第一個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域，即0RFA-ACP1包含在覆蓋從SEQ ID NO :1 (OrfA)的約位置3343到約位置3600的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼0RFA-ACP1結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為 SEQ ID NO 12 (SEQ ID NO 1的位置3343-3600)。含有第一個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ ID NO 2的約位置1115到約位置1200。含有0RFA-ACP 1結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在本文中表示為SEQ ID NO 13 (SEQ ID NO 2的位置1115-1200)。應(yīng)注意該0RFA-ACP1結(jié) 構(gòu)域含有一個(gè)活性位點(diǎn)基序LGIDS>泛酰巰基乙胺結(jié)合基序S1157)，本文以SEQ IDN0 14 表示。所有9個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域的核苷酸和氨基酸序列高度保守且，因此各結(jié)構(gòu)域的序列在本文中沒(méi)有用單獨(dú)的序列標(biāo)識(shí)符表示。然而，根據(jù)該信息，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地測(cè)定其它8個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域各自的序列。9個(gè)結(jié)構(gòu)域的重復(fù)間隔是SEQ ID N0 :1的接近約110到約 330核苷酸。所有9個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域一起覆蓋從SEQ ID NO :1的約位置3283到約位置6288的 OrfA區(qū)域，它相應(yīng)于SEQ ID NO 2從約1095到約2096的氨基酸位置。該區(qū)域包括各個(gè)ACP 結(jié)構(gòu)域之間的接頭片段。9個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域中每個(gè)含有一個(gè)泛酰巰基乙胺結(jié)合基序LGIDS*(本文中以SEQ ID NO: 14表示)，其中*是泛酰巰基乙胺結(jié)合位點(diǎn)S。ACP結(jié)構(gòu)域區(qū)域的每個(gè) 末端和各ACP結(jié)構(gòu)域之間是高度富含脯氨酸(P)和丙氨酸(A)的區(qū)域，據(jù)信它是接頭區(qū)域。例如，ACP結(jié)構(gòu)域1和2之間是序列APAPVKAAAPAAPVASAPAPA，本文表示為SEQ ID NO :15。0RFA-KR
OrfA中的結(jié)構(gòu)域12是KR結(jié)構(gòu)域，本文也稱為0RFA-KR。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從 SEQ ID NO 1的約位置6598的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 1的約位置8730的終止位點(diǎn)的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼0RFA-KR結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO 17 (SEQ ID NO :1的位置6598-8730)。含有KR結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ ID NO 2 (ORFA)的約位置2200的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 2的約位置2910的終止位點(diǎn)。含有0RFA-KR結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為SEQ ID NO 18 (SEQ ID NO :2的位置2200-2910)。KR結(jié)構(gòu)域內(nèi)具有與短鏈乙醛脫氫酶(KR是該家族的一個(gè)成員)同源的核心區(qū)。該核心區(qū)跨越從SEQ ID NO 1的約位置7198至約位置7500，它相應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸位置2400-2500。可讀框B (OrfB)OrfB的完整核苷酸序列在本文中表示為SEQ ID NO :3。OrfB是一個(gè)6177個(gè)核苷酸的序列(不包括終止密碼子)，它編碼一個(gè)2059個(gè)氨基酸的序列，本文表示為SEQ ID NO: 4。OrfB內(nèi)有4個(gè)結(jié)構(gòu)域(a) 3 -酮脂酰-ACP合酶(KS)結(jié)構(gòu)域；(b) 一個(gè)鏈長(zhǎng)因子(CLF)結(jié)構(gòu)域；(c) 一個(gè)?；D(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域；(d) 一個(gè)烯酰ACP-還原酶(ER)結(jié)構(gòu)域。0RFB內(nèi)包含的結(jié)構(gòu)域根據(jù)如下結(jié)果確定(1)上述用Pfam程序分析的結(jié)果；和/ 或(2)也在上文描述的使用BLAST 2.0 Basic BLAST同源性檢索與細(xì)菌PUFA-PKS系統(tǒng)(例如，希瓦氏菌屬)的同源性比較。據(jù)信提供的單個(gè)結(jié)構(gòu)域的序列含有編碼功能域的全長(zhǎng)序列，且在Orf內(nèi)可含有其它側(cè)翼序列。0RFB-KSOrfB中的第一個(gè)結(jié)構(gòu)域是KS結(jié)構(gòu)域，本文也稱為0RFB-KS。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從SEQ ID NO 3 (OrfB)的約位置1和43之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 3的約位置1332和 1350之間的終止位點(diǎn)的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼0RFB-KS結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO 19 (SEQ ID NO :3的位置1-1350)。含有KS結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從 SEQID NO 4 (ORFB)的約位置1和15之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 4的約位置444和450 之間的終止位點(diǎn)。含有0RFB-KS結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為SEQ ID NO 20 (SEQ ID NO 4的位置1-450)。應(yīng)注意0RFB-KS結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)活性位點(diǎn)基序DXA(f(*?；Y(jié)合位
占r )0RFB-CLFOrfB中的第二個(gè)結(jié)構(gòu)域是CLF結(jié)構(gòu)域，本文也稱為0RFB-CLF。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從SEQ ID NO 3 (OrfB)的約位置1378和1402之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO :3的約位置 2682和2700之間的終止位點(diǎn)的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼0RFB-CLF結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO 21 (SEQ ID NO 3的位置1378-2700)。含有CLF結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ ID NO 4 (ORFB)的約位置460和468之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 4 的約位置894和900之間的終止位點(diǎn)。含有0RFB-CLF結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為SEQ ID NO 22 (SEQ ID NO 4的位置460-900)。應(yīng)注意0RFB-CLF結(jié)構(gòu)域含有KS活性位點(diǎn)基序但沒(méi)有結(jié)合酰基的半胱氨酸。0RFB-AT
在OrfB中的第三個(gè)結(jié)構(gòu)域是AT結(jié)構(gòu)域，本文也稱為0RFB-AT。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從SEQ ID NO 3 (OrfB)的約位置2701和3598之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 3的約位置3975和4200之間的終止位點(diǎn)的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼0RFB-AT結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO 23 (SEQ ID NO 3的位置2701-4200)。含有AT結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ ID NO 4 (ORFB)的約位置901和1200之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 4的約位置1325和1400之間的終止位點(diǎn)。含有0RFB-AT結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為 SEQ ID NO 24 (SEQ ID NO :4的位置901-1400)。應(yīng)注意該0RFB-AT結(jié)構(gòu)域含有AT活性位點(diǎn)基序GXS、G(*?；Y(jié)合位S114Q)。0RFB-EROrfB中的第四個(gè)結(jié)構(gòu)域是ER結(jié)構(gòu)域，本文也稱為0RFB-ER。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從SEQ ID NO 3 (OrfB)的約位置4648的起始位點(diǎn)到SEQ IDN0 3的約位置6177的終止位點(diǎn)的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼0RFB-ER結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO 25 (SEQ ID NO :3的位置4648-6177)。含有ER結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ ID NO 4 (ORFB)的約位置1550的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO :4的約位置2059的終止位點(diǎn)。含有 0RFB-ER結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為SEQ ID NO 26 (SEQ ID NO :4的位置1550-2059)?？勺x框C(0rfC)OrfC的完整核苷酸序列在本文中表示為SEQ ID NO :5。OrfC是一個(gè)4509個(gè)核苷酸的序列(不包括終止密碼子)，它編碼1503個(gè)氨基酸的序列，本文表示為SEQ ID NO :6。 OrfC內(nèi)含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域 (a)兩個(gè)FabA-樣3 -羥酰-ACP脫水酶(DH)結(jié)構(gòu)域；(b) —個(gè)烯酰ACP還原酶(ER)結(jié)構(gòu)域。0RFC內(nèi)包含的結(jié)構(gòu)域根據(jù)如下結(jié)果確定(1)上述用Pfam程序分析的結(jié)果；和/ 或(2)也在上文描述的使用BLAST 2.0 Basic BLAST同源性檢索與細(xì)菌PUFA-PKS系統(tǒng)(例如，希瓦氏菌屬)的同源性比較。據(jù)信提供的單個(gè)結(jié)構(gòu)域的序列含有編碼功能域的全長(zhǎng)序列，且在Orf內(nèi)可含有其它側(cè)翼序列。0RFC-DH1OrfC中的第一個(gè)結(jié)構(gòu)域是DH結(jié)構(gòu)域，本文也稱為0RFC-DH1。它是OrfC中的兩個(gè) DH結(jié)構(gòu)域之一，因此命名為DH1。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從SEQ ID NO 5 (OrfC)的約位置1 和778之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 5的約位置1233和1350之間的終止位點(diǎn)的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼0RFC-DH1結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO 27 (SEQ ID NO 5的位置1-1350)。含有DH1結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ ID NO 6 (ORFC)的約位置1和260之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 6的約位置411和450之間的終止位點(diǎn)。含有 0RFC-DH1結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為SEQ ID NO :28(SEQ ID NO 6的位置1-450)。0RFC-DH2OrfC中的第二個(gè)結(jié)構(gòu)域是DH結(jié)構(gòu)域，本文也稱為0RFC-DH2。它是OrfC中兩個(gè) DH結(jié)構(gòu)域的第二個(gè)，因此命名為DH2。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從SEQ ID NO 5 (OrfC)的約位置1351和2437之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 5的約位置2607和2850之間的終止位點(diǎn) 的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼0RFC-DH2結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO 29 (SEQ IDN0 :5的位置1351-2850)。含有DH2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ ID NO:6 (0RFC)的約位置451和813之間的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 6的約位置869和950之間的終止位點(diǎn)。含有0RFC-DH2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為SEQ ID NO 30 (SEQ ID NO :6的位置 451-950)。0RFC-EROrfC中的第三個(gè)結(jié)構(gòu)域是ER結(jié)構(gòu)域，本文也稱為0RFC-ER。該結(jié)構(gòu)域包含在覆蓋從SEQ ID NO 5 (OrfC)的約位置2998的起始位點(diǎn)到SEQ IDN0 5的約位置4509的終止位點(diǎn)的核苷酸序列內(nèi)。含有編碼0RFC-ER結(jié)構(gòu)域的序列的核苷酸序列本文表示為SEQ ID NO :31(SEQ ID NO :5的位置2998-4509)。含有ER結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列覆蓋從SEQ ID NO 6 (ORFC)的約位置1000的起始位點(diǎn)到SEQ ID NO 6的約位置1502的終止位點(diǎn)。含有 0RFC-ER結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列本文表示為SEQ ID NO 32 (SEQ ID NO :6的位置1000-1502)。實(shí)施例2下面的實(shí)施例描述了使用本發(fā)明的篩選方法鑒定含有根據(jù)本發(fā)明的PUFAPKS系統(tǒng)的三個(gè)其它的非細(xì)菌生物。按照美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)60/298，796中所述和本文詳細(xì)描述的篩選方法培養(yǎng)破囊壺菌 23B(ATCC 20892)。用于檢測(cè)含有產(chǎn)生PUFA的PKS系統(tǒng)的微生物而形成的生物學(xué)合理的篩選系統(tǒng) (使用搖瓶培養(yǎng)物)按如下進(jìn)行將待測(cè)菌株/微生物的2mL培養(yǎng)物放在含有50mL培養(yǎng)基的250mL帶擋板的搖瓶中(有氧處理)，并將相同菌株的另一 2mL培養(yǎng)物放在含有200mL培養(yǎng)基的250mL無(wú)擋板的搖瓶中(缺氧處理)。將兩種搖瓶放在200rpm的搖床上。培養(yǎng)48-72小時(shí)后，離心收獲培養(yǎng)物并通過(guò)氣相色譜法分析細(xì)胞的脂肪酸甲基酯以測(cè)定各培養(yǎng)物的下列數(shù)據(jù)(1)脂肪酸分布特征；(2)PUFA含量；(3)脂肪含量(評(píng)估為脂肪酸總量(TFA))。然后分析這些數(shù)據(jù)并回答下列5個(gè)問(wèn)題誅雇佳彳氏氧/缺ilffiii有ilffi(是/否)(1)與有氧培養(yǎng)物相比低氧培養(yǎng)物中的DHA (或其它PUFA含量)(以％ FAME)是否保持約相同或優(yōu)選提高？(2)缺氧培養(yǎng)物中的C14:0+C16:0+C16:l是否超過(guò)約40%的TFA ？(3)在缺氧培養(yǎng)物中對(duì)于常規(guī)氧依賴型延長(zhǎng)酶/去飽和酶途徑是否有極少(FAME > 1% )或者沒(méi)有前體(C18:3n-3+C18:2n-6+C18:3n-6) ？(4)與有氧培養(yǎng)相比低氧培養(yǎng)中的脂肪含量(以脂肪酸總量/細(xì)胞干重表示)是否提高？(5)與有氧培養(yǎng)相比低氧培養(yǎng)中以占細(xì)胞干重百分?jǐn)?shù)表示的DHA(或其它PUFA含量)是否增加？如果前3個(gè)問(wèn)題的答案為是，則它是該菌株含有形成長(zhǎng)鏈PUFA的PKS遺傳系統(tǒng)的良好征兆。答案為是的問(wèn)題越多(優(yōu)選前三個(gè)問(wèn)題的答案必須為是)，該菌株含有這種PKS 遺傳系統(tǒng)的征兆就越強(qiáng)。如果5個(gè)問(wèn)題的答案都為是，那么就是該菌株含有形成長(zhǎng)鏈PUFA 的PKS遺傳系統(tǒng)的極強(qiáng)征兆。在上述方法之后，使用破囊壺菌屬種類23B(ATCC 20892)的冷凍小瓶接種含有 50mL RCA培養(yǎng)基的250mL搖瓶。25°C下在搖床上搖動(dòng)(200rpm)培養(yǎng)物72小時(shí)。RCA培養(yǎng)基含有如下成份RCA培養(yǎng)基去離子水Reef Crystals 海鹽葡萄糖谷氨酸一鈉(MSG)酵母提取物PII 金屬 *維生素混合物*pH
20g/L
20g/L
lg/L
5mL/L
lmL/L
7. 0
lOOOmL
40g/L*PII金屬混合物和維生素混合物與美國(guó)專利號(hào)5，130，742所述相同，本文引用以其整體作為參考。然后使用25mL 72小時(shí)的舊培養(yǎng)物接種含有50mL低氮RCA培養(yǎng)基(10g/L MSG代替20g/L)的另一 250mL搖瓶，且使用另一 25mL的培養(yǎng)物接種含有175mL低氮RCA培養(yǎng)基的250mL搖瓶。然后將兩個(gè)搖瓶放在25°C下的搖床(200rpm)上72小時(shí)。然后通過(guò)離心收獲細(xì)胞并冷凍干燥。使用標(biāo)準(zhǔn)氣相色譜步驟(例如在US 5，130，742中所述)分析干燥細(xì) 胞的脂肪含量和脂肪酸分布特征和含量。破囊壺菌屬23B的篩選結(jié)果如下以％ FAME表示的DHA是否增加？是(38 — 44 % )C14:0+C16:0+C16:l 是否高于約 40% TFA ？是(44% )是否無(wú)C18:3(n-3)或 C18:3(n-6) ？是(0% )脂肪含量是否增加？是(增加2倍)DHA (或其它HUFA含量)是否增加？是(增加2. 3_倍)該結(jié)果，特別是在低氧條件下DHA含量(表示為％ FAME)明顯增加有力地表明在該破囊壺菌屬菌株中存在產(chǎn)生PUFA的PKS系統(tǒng)。為了提供證實(shí)存在PUFA PKS系統(tǒng)的其它數(shù)據(jù)，使用來(lái)自Schizochytrium菌株 20888的PKS探針對(duì)破囊壺菌23B進(jìn)行southern印跡，其中菌株20888已經(jīng)確定含有產(chǎn)生 PUFA的PKS系統(tǒng)(即，上述SEQ ID Nos :1_32)。使用Southern印跡技術(shù)檢測(cè)與來(lái)自PKS PUFA合成基因的雜交探針同源的破囊壺菌23B基因組DNA的片段。用Clal或Kpnl限制性核酸內(nèi)切酶消化破囊壺菌23B基因組DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離(0. 7%瓊脂糖，在標(biāo)準(zhǔn) Tris-乙酸鹽-EDTA緩沖液中)，并通過(guò)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移印跡到Schleicher & SchuellNytran Supercharge膜上。使用兩個(gè)地高辛配基標(biāo)記的雜交探針，一個(gè)對(duì)Schizochytrium PKS OrfB的烯酰還原酶(ER)區(qū)域(Orf B的核苷酸5012-5511 ；SEQ ID NO 3)具有特異性，另一個(gè)對(duì)在Schizochytrium PKS OrfC的開始處的保守區(qū)(Orf C的核苷酸76-549 ;SEQ ID NO: 5)具有特異性。0rfB-ER探針在破囊壺菌23B基因組DNA中檢測(cè)到一個(gè)約13kb的Clal片段和一個(gè)約3. 6kb的Kpnl片段。OrfC探針在破囊壺菌23B基因組DNA中檢測(cè)到一個(gè)約7. 5kb的 Clal片段和一個(gè)約4. 6kb的Kpnl片段。最后，使用地高辛配基標(biāo)記的相應(yīng)于Schizochytrium 20888PUFA-PKS基因下列片段0rfA 的核苷酸 7385-7879 (SEQ ID NO :1)，0rfB 的核苷酸 5012-5511 (SEQ ID NO 3), 和OrfC的核苷酸76-549 (SEQ ID NO 5)的探針篩選由來(lái)自破囊壺菌23B基因組DNA的DNA 片段插入載體XFIX Il(Stratagene)組成的重組基因組文庫(kù)。這些探針?lè)謩e從破囊壺菌 23B文庫(kù)檢測(cè)到陽(yáng)性噬斑，表明Schizochytrium PUFA-PKS基因與破囊壺菌23B基因之間具有廣泛同源性?？傊?，這些結(jié)果證實(shí)破囊壺菌23B基因組DNA含有與來(lái)自Schizochytrium 20888 的PKS基因同源的序列。本文包括的該Thraustochytrid微生物作為用于上述實(shí)施方案的這些基因的另一來(lái)源。破囊壺菌23B(ATCC 20892)在其脂肪酸分布特征方面明顯不同于 Schizochytrium sp. (ATCC 20888)。破囊壺菌 23B 具有高達(dá) 14 1 的 DHA DPA(n_6)比率，相比之下Schizochytrium(ATCC 20888)中僅為2_3 1。破囊壺菌23B也具有高水平的C20 5 (n-3)。與已知的Schizochytrium PUFA PKS系統(tǒng)相比對(duì)破囊壺菌23B的PUFA PKS 系統(tǒng)中的結(jié)構(gòu)域的分析給我們提供了關(guān)于如何修飾這些結(jié)構(gòu)域以影響使用這些系統(tǒng)產(chǎn)生的PUFA的比率和類型的關(guān)鍵信息。使用上述篩選方法可鑒定含有PUFA PKS系統(tǒng)的其它潛在候選菌株。本發(fā)明人鑒定的具有PUFA PKS系統(tǒng)的兩個(gè)其它菌株是Schizochytriumlimacium(SR21)Honda & Yokochi (IF032693)和 Ulkenia(BP-5601)。除了在 N2 培養(yǎng)基(葡萄糖:60g/L ；KH2P04 4. 0g/l ；酵母提取物1. 0g/L ；玉米漿:lmL/L ；NH4N03 1. 0g/L ；人工海鹽(Reef Crystals) 20g/L ；所有上述濃度在去離子水中混合)中外按上述篩選兩個(gè)菌株。對(duì)于Schizochytrium 和Ulkenia這兩個(gè)菌株，用于破囊壺菌23B的上述前三個(gè)篩選問(wèn)題的答案均為是，即 (Schizochytrium-有氧對(duì)缺氧的 DHA% FAME 為 32 — 41%，58% 的 14:0/16:0/16:1，0% 的前體)和(Ulkenia-有氧對(duì)缺氧的 DHA% FAME 為 28 — 44%，63%的 14:0/16:0/16:1,0% 的前體)，表明這些菌株是含有PUFA PKS系統(tǒng)的良好候選菌株。各菌株的最后兩個(gè)問(wèn)題得到了否定的答案在S. Limacium中脂肪從61%干重下降到22%干重，且DHA從21%下降至Ij9%干重，Ulkenia中脂肪從59%下降到21%干重且DHA從16%下降到9%干重。這些 Thraustochytrid微生物本文也聲明作為用于上述實(shí)施方案的基因的另外來(lái)源。實(shí)施例3下面的實(shí)施例證實(shí)了 Schizochytrium中的DHA和DPA合成不涉及膜結(jié)合的去飽和酶或脂肪酸延長(zhǎng)酶，與對(duì)其它真核生物所述情況一樣(Parker-Barnes等，2000，出處同上；Shanklin等，1998，出處同上)。Schizochytrium積累大量富含DHA和鯡油酸(DPA ；22:5 6)的三酰甘油；例如，占干重30%的DHA+DPA。在通過(guò)延長(zhǎng)/去飽和化途徑合成20-和22-碳的PUFA的真核生物中，18-，20_和22-碳中間體的分子庫(kù)相當(dāng)大，因此使用[14C]_乙酸鹽的體內(nèi)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)揭示了預(yù)測(cè)的中間體的清楚前體-產(chǎn)物動(dòng)力學(xué)。另外，給該生物體提供的外源性放射標(biāo)記的中間體轉(zhuǎn)變成最終的PUFA產(chǎn)物。在開始時(shí)以單次脈沖給2日齡的培養(yǎng)物補(bǔ)充[1_14C]乙酸鹽。然后離心收獲細(xì)胞樣品并提取脂類。另外，通過(guò)測(cè)量離心之前和之后樣品的放射活性估計(jì)細(xì)胞的[i-14c]乙酸鹽吸收。以AgN03-TLC(溶劑，己烷二乙基醚乙酸，體積比為70 30 2)分離從總細(xì)胞脂類衍生的脂肪酸甲酯。以氣相色譜法證實(shí)脂肪酸帶的身份，通過(guò)液閃計(jì)數(shù)測(cè)量它們的放射活性。結(jié)果表明[1_14C]_乙酸鹽被Schizochytrium細(xì)胞迅速吸收并摻入脂肪酸中，但是在最短標(biāo)記時(shí)間(1分鐘)時(shí)，DHA含有在脂肪酸中回收的標(biāo)記物的31%且在[14C]_乙酸鹽摻入的10-15分鐘期間和隨后24小時(shí)的培養(yǎng)物生長(zhǎng)中該百分?jǐn)?shù)基本上保持不變(數(shù)據(jù) 未顯示)。同樣，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中DPA代表了 10%的標(biāo)記物。沒(méi)有關(guān)于16-或18-碳脂肪酸與22-碳多不飽和脂肪酸之間存在前體-產(chǎn)物關(guān)系的證據(jù)。這些結(jié)果與從包含極小(很可能是酶結(jié)合的)中間體分子庫(kù)的[14C]_乙酸鹽迅速合成DHA—致。接著，在含有2mM DTT,2mM EDTA，和10 %甘油的100mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.2) 中通過(guò)用玻璃珠攪拌破碎細(xì)胞。以100，000g離心無(wú)細(xì)胞勻漿1小時(shí)。在25°C下在補(bǔ)充了 20 uM 乙酰-CoA, 100 u M[1-14C]丙二酰-CoA (0. 9Gbq/mol)，2mM NADH,和 2mM NADPH 的勻漿緩沖液中培養(yǎng)總勻漿，沉淀(H-S沉淀)，和上清(H-S上清)分級(jí)分離成份的相當(dāng)?shù)确衷?樣60分鐘。提取試驗(yàn)物，制備脂肪酸甲酯并在用Instantimager (Packard Instruments, Meriden,CT)檢測(cè)放射性前按上文所述分離。結(jié)果表明來(lái)自Schizochytrium培養(yǎng)物的無(wú)細(xì) 胞勻漿將[1-14C]_丙二酰-CoA摻入DHA，DPA，和飽和脂肪酸中(數(shù)據(jù)未顯示)。100, 000xg 的上清成份保留相同的生物合成活性但在膜沉淀中不存在該活性。將這些數(shù)據(jù)與細(xì)菌酶試驗(yàn)期間獲得的數(shù)據(jù)(參見Metz等，2001，出處同上)相對(duì)照且可表明使用了不同的(可溶的)酰基受體分子。因此，Schizochytrium中的DHA和DPA合成不涉及膜結(jié)合的去飽和酶或脂肪酸延長(zhǎng)酶，與對(duì)其它真核生物所述一樣。盡管已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明的各種實(shí)施方案，但是顯而易見的是本領(lǐng)域的技術(shù)人員可想到對(duì)這些實(shí)施方案進(jìn)行改良和改編。然而應(yīng)清楚地明白，這些改良和改編在下面權(quán) 利要求書所述本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種分離的核酸分子，它含有選自下組的核酸序列a.編碼選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；b.編碼選自SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO13，SEQ IDNO18，SEQ ID NO20，SEQ ID NO22，SEQ ID NO24，SEQ ID NO26，SEQ ID NO28，SEQ ID NO30，SEQ I8，SEQ ID NO30，SEQ ID NO32，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；c.編碼與(a)所述氨基酸序列中至少500個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60％相同的氨基酸序列的核酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；d.編碼與(b)所述氨基酸序列有至少約60％相同性的氨基酸序列的核酸序列，其中所述氨基酸序列具有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和e.與(a)，(b)，(c)，或(d)的核酸序列完全互補(bǔ)的核酸序列。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述核酸序列選自a.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約70%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有 PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和b.編碼與選自SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQ IDNO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列有至少約70%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
3.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述核酸序列選自a.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約80%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有 PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，b.編碼與選自SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQ IDNO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列有至少約80%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
4.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述核酸序列選自a.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約90%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有 PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，b.編碼與選自SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQ IDNO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列有至少約90%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
5.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述核酸序列編碼選自SEQIDNO 2, SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :10，SEQID NO :13，SEQ ID NO :18，SEQ IDNO :20，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO :24，SEQ ID NO :26，SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，SEQ ID N0:32或其生物活性片段的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述核酸分子包含選自SEQIDNO 1, SEQ ID NO :3,SEQ ID N0:5，SEQ ID N0:7，SEQ ID NO :9, SEQID NO 12, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID N0:21，SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID N0:27，SEQ ID N0:29，或SEQ ID NO :31的核酸序列。
7.—種重組核酸分子，它包含與至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列可操作地相連的權(quán)利要求1的核酸分子。
8.用權(quán)利要求7的重組核酸分子轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞。
9.一種遺傳修飾的微生物，其中所述微生物表達(dá)含有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的PKS系統(tǒng)，其中所述PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域由選自下組的核酸序列編碼a.編碼來(lái)自Thraustochytrid微生物的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶 (PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；b.編碼來(lái)自以下述方法鑒定的微生物的PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列(i)選擇產(chǎn)生至少一種PUFA的微生物；和，( )從(i)中鑒定與發(fā)酵培養(yǎng)基中在大于約5%飽和度的溶氧條件下所述微生物產(chǎn)生的PUFA相比，在發(fā)酵培養(yǎng)基中不超過(guò)約5%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物；c.編碼選自SEQID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :6，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；d.編碼選自SEQID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQ IDNO :18，SEQ ID NO: 20，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO -.26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，SEQ ID NO :32，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；e.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有 PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，f.編碼與選自:SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQID NO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；其中所述微生物被遺傳修飾成影響所述PKS系統(tǒng)的活性。
10.權(quán)利要求9的遺傳修飾的微生物，其中所述微生物內(nèi)源性表達(dá)含有所述PUFAPKS 系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的PKS系統(tǒng)，且其中在編碼所述PUFA PKS系統(tǒng)的所述至少一個(gè)結(jié)構(gòu) 域的核酸序列中存在所述遺傳修飾。
11.權(quán)利要求10的遺傳修飾的微生物，其中在編碼具有下列至少一種蛋白質(zhì)的生物學(xué) 活性的結(jié)構(gòu)域的核酸序列中存在所述遺傳修飾丙二酰-CoA = ACP?；D(zhuǎn)移酶(MAT)，β -酮脂酰-ACP合酶(KS)，酮還原酶(KR)，?；D(zhuǎn)移酶(AT)，F(xiàn)abA-樣β -羥酰-ACP脫水酶(DH)，磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶，鏈長(zhǎng)因子(CLF)，酰基載體蛋白(ACP)，烯酰ACP-還原酶(ER)，催化反式-2-癸烯酰-ACP合成的酶，催化反式-2-癸烯酰-ACP向順式-3-癸烯酰-ACP可逆異構(gòu)化的酶，和催化順式-3-癸烯酰-ACP延長(zhǎng)成順式-11-十八碳烯酸的酶。
12.權(quán)利要求10的遺傳修飾的微生物，其中在編碼選自下組的氨基酸序列的核酸序列中存在所述遺傳修飾a.與選自SEQID NO :2，SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500個(gè) 連續(xù)氨基酸具有至少約70%相同性的氨基酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，b.與選自SEQID NO :8，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :13，SEQ ID NO :18，SEQ ID NO 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約70%相同性的氨基酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
13.權(quán)利要求10的遺傳修飾的微生物，其中在編碼選自下組的氨基酸序列的核酸序列中存在所述遺傳修飾a.與選自SEQID NO :2，SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500個(gè) 連續(xù)氨基酸具有至少約80%相同性的氨基酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，b.與選自SEQID NO :8，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :13，SEQ ID NO :18，SEQ ID NO 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約80%相同性的氨基酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
14.權(quán)利要求10的遺傳修飾的微生物，其中在編碼選自下組的氨基酸序列的核酸序列中存在所述遺傳修飾a.與選自SEQID NO :2，SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500個(gè) 連續(xù)氨基酸具有至少約90%相同性的氨基酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，b.與選自SEQID NO :8，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :13，SEQ ID NO :18，SEQ ID NO 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約90%相同性的氨基酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
15.權(quán)利要求10的遺傳修飾的微生物，其中在編碼選自SEQID NO 2, SEQ ID NO :4， SEQ ID NO :6,SEQ ID N0:8，SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO -.20, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO -.24, SEQID NO -.26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，SEQ ID NO 32或其生物活性片段的氨基酸序列的核酸序列中存在所述遺傳修飾。
16.權(quán)利要求10的遺傳修飾的微生物，其中所述微生物是Thraustochytrid。
17.權(quán)利要求16的遺傳修飾的微生物，其中所述Thraustochytrid來(lái)自于 Schizochytrium屬或破囊壺菌屬。
18.權(quán)利要求10的遺傳修飾的微生物，其中所述微生物進(jìn)一步被遺傳修飾成重組表達(dá) 編碼來(lái)自細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)核酸分子。
19.權(quán)利要求10的遺傳修飾的微生物，其中所述微生物進(jìn)一步被遺傳修飾成重組表達(dá) 來(lái)自I型PKS系統(tǒng)的一個(gè)PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域。
20.權(quán)利要求10的遺傳修飾的微生物，其中所述微生物進(jìn)一步被遺傳修飾成重組表達(dá) 來(lái)自II型PKS系統(tǒng)的一個(gè)PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域。
21.權(quán)利要求10的遺傳修飾的微生物，其中所述微生物進(jìn)一步被遺傳修飾成重組表達(dá) 來(lái)自模塊PKS系統(tǒng)的一個(gè)PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域。
22.權(quán)利要求9的遺傳修飾的微生物，其中所述微生物內(nèi)源性表達(dá)含有PUFAPKS系統(tǒng) 的所述至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的PUFA PKS系統(tǒng)，且其中所述遺傳修飾包含表達(dá)選自由編碼來(lái)自第二種PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的重組核酸分子和編碼影響所述 PUFA PKS系統(tǒng)活性的蛋白質(zhì)的重組核酸分子組成的組中的一個(gè)重組核酸分子。
23.權(quán)利要求22的遺傳修飾的微生物，其中所述重組核酸分子包含選自下組的核酸序列a.編碼來(lái)自Thraustochytrid微生物的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶 (PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；b.編碼來(lái)自以下述方法鑒定的微生物的PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列(i)選擇產(chǎn)生至少一種PUFA的微生物；和，( )從(i)中鑒定與發(fā)酵培養(yǎng)基中在大于約5%飽和度的溶氧條件下所述微生物產(chǎn)生的PUFA相比，在發(fā)酵培養(yǎng)基中不足約5%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物；c.編碼選自SEQID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :6，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；d.編碼選自SEQID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13，SEQ IDNO :18，SEQ ID NO: 20，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO -.26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，SEQ IDNO :32，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；e.編碼與(a)中所述氨基酸序列的至少500個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶 (PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和f.編碼與(b)中所述氨基酸序列具有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié) 構(gòu)域的生物學(xué)活性。
24.權(quán)利要求23的遺傳修飾的微生物，其中(a)中所述Thraustochytrid微生物來(lái)自于Schizochytrium屬或破囊壺菌屬。
25.權(quán)利要求23的遺傳修飾的微生物，其中所述重組核酸分子包含選自下組的核酸序列a.編碼與選自氨基酸序列SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的至少500個(gè) 連續(xù)氨基酸具有至少約70%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有 PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，b.編碼與選自SEQ ID NO :8,SEQ ID NO: 10，SEQ ID NO: 13，SEQ IDNO 18, SEQ ID NO:`20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約70%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
26.權(quán)利要求23的遺傳修飾的微生物，其中所述重組核酸分子包含選自下組的核酸序列a.編碼與選自SEQID NO :2，SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO 6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少約80%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，b.編碼與選自SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQID NO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約80%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
27.權(quán)利要求23的遺傳修飾的微生物，其中所述重組核酸分子包含選自下組的核酸序列a.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少約90%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，b.編碼與選自SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQID NO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約90%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
28.權(quán)利要求23的遺傳修飾的微生物，其中所述重組核酸分子包含編碼選自SEQID NO :2,SEQ ID N0:4，SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:8，SEQ IDNO 10, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO: 18，SEQ ID NO -.20, SEQ ID NO :22，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO -.26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO =30, SEQ IDNO 32或其生物活性片段的氨基酸序列的核酸序列。
29.權(quán)利要求22的遺傳修飾的微生物，其中所述重組核酸分子編碼磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶。
30.權(quán)利要求22的遺傳修飾的微生物，其中所述重組核酸分子包含編碼來(lái)自細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
31.權(quán)利要求22的遺傳修飾的微生物，其中所述重組核酸分子包含編碼來(lái)自I型PKS 系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
32.權(quán)利要求22的遺傳修飾的微生物，其中所述重組核酸分子包含編碼來(lái)自II型PKS 系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
33.權(quán)利要求22的遺傳修飾的微生物，其中所述重組核酸分子包含編碼來(lái)自模塊型 PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
34.權(quán)利要求9的遺傳修飾的微生物，其中所述微生物通過(guò)用編碼多不飽和脂肪酸 (PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的所述至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的重組核酸分子轉(zhuǎn)染進(jìn)行遺傳修飾。
35.權(quán)利要求34的遺傳修飾的微生物，其中所述重組核酸分子包含選自下組的核酸序列a.編碼來(lái)自Thraustochytrid微生物的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶 (PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；b.編碼來(lái)自以下述方法鑒定的微生物的PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列(i)選擇產(chǎn)生至少一種PUFA的微生物；和，( )從(i)中鑒定與發(fā)酵培養(yǎng)基中在大于約5%飽和度的溶氧條件下所述微生物產(chǎn)生的PUFA相比，在發(fā)酵培養(yǎng)基中不足約5%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物；c.編碼選自SEQID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :6，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；d.編碼選自SEQID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13，SEQ IDNO :18，SEQ ID NO: 20，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO -.26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，SEQ IDNO :32，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；e.編碼與(a)中所述氨基酸序列的至少500個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶 (PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和f.編碼與(b)中所述氨基酸序列具有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié) 構(gòu)域的生物學(xué)活性。
36.權(quán)利要求35的遺傳修飾的微生物，其中(a)中所述Thraustochytrid來(lái)自于 Schizochytrium屬或破囊壺菌屬。
37.權(quán)利要求35的遺傳修飾的微生物，其中所述重組核酸分子包含選自下組的核酸序列a.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少約70%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，b.編碼與選自SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQID NO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約70%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
38.權(quán)利要求35的遺傳修飾的微生物，其中所述重組核酸分子包含選自下組的核酸序列a.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少約80%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，b.編碼與選自SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQID NO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO ,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約80%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
39.權(quán)利要求35的遺傳修飾的微生物，其中所述重組核酸分子包含選自下組的核酸序列a.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少約90%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，b.編碼與選自SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQID NO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約90%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
40.權(quán)利要求35的遺傳修飾的微生物，其中所述重組核酸分子包含編碼選自SEQID NO :2,SEQ ID N0:4，SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:8，SEQ IDNO 10, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO: 18，SEQ ID NO -.20, SEQ ID NO :22，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO -.26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO =30, SEQ IDNO 32或其生物活性片段的氨基酸序列的核酸序列。
41.權(quán)利要求34的遺傳修飾的微生物，其中所述微生物被進(jìn)一步遺傳修飾成重組表達(dá) 編碼來(lái)自細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的至少一種核酸分子。
42.權(quán)利要求34的遺傳修飾的微生物，其中所述微生物被進(jìn)一步遺傳修飾成重組表達(dá) 來(lái)自I型PKS系統(tǒng)的一種PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域。
43.權(quán)利要求34的遺傳修飾的微生物，其中所述微生物被進(jìn)一步遺傳修飾成重組表達(dá) 來(lái)自II型PKS系統(tǒng)的一種PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域。
44.權(quán)利要求34的遺傳修飾的微生物，其中所述微生物被進(jìn)一步遺傳修飾成重組表達(dá) 來(lái)自模塊型PKS系統(tǒng)的一種PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域。
45.一種遺傳修飾的植物，其中所述植物被遺傳修飾成重組表達(dá)包含多不飽和脂肪酸 (PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的PKS系統(tǒng)，其中所述結(jié) 構(gòu)域由選自下組的核酸序列編碼a.編碼來(lái)自Thraustochytrid微生物的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶 (PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；b.編碼來(lái)自以下述方法鑒定的微生物的PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列(i)選擇產(chǎn)生至少一種PUFA的微生物；和，( )從(i)中鑒定與發(fā)酵培養(yǎng)基中在大于約5%飽和度的溶氧條件下所述微生物產(chǎn)生的PUFA相比，在發(fā)酵培養(yǎng)基中不足約5%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物；c.編碼選自SEQID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :6，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；d.編碼選自SEQID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQ IDNO :18，SEQ ID NO: 20，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO -.26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，SEQ ID NO :32，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；e.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有 PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，f.編碼與選自:SEQ ID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQID NO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
46.權(quán)利要求45的遺傳修飾的植物，其中所述核酸序列選自a.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少約70%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，b.編碼與選自SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQID NO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約70%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
47.權(quán)利要求45的遺傳修飾的植物，其中所述核酸序列選自a.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少約80%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，b.編碼與選自SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQID NO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約80%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
48.權(quán)利要求45的遺傳修飾的植物，其中所述核酸序列選自a.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少約90%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，b.編碼與選自SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQID NO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約90%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
49.權(quán)利要求45的遺傳修飾的植物，其中所述核酸序列編碼選自SEQIDN0:2，SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :13，SEQ ID NO :18，SEQ ID NO 20,SEQ ID NO 22,SEQ IDNO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID NO 30,SEQ ID NO 32或其生物活性片段的氨基酸序列。
50.權(quán)利要求45的遺傳修飾的植物，其中(a)中所述Thraustochytrid來(lái)自于 Schizochytrium屬或破囊壺菌屬。
51.權(quán)利要求45的遺傳修飾的植物，其中所述植物被進(jìn)一步遺傳修飾成重組表達(dá)編碼來(lái)自細(xì)菌PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)核酸分子。
52.權(quán)利要求45的遺傳修飾的植物，其中所述植物被進(jìn)一步遺傳修飾成重組表達(dá)來(lái)自I型PKS系統(tǒng)的一種PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域。
53.權(quán)利要求45的遺傳修飾的植物，其中所述植物被進(jìn)一步遺傳修飾成重組表達(dá)來(lái)自 II型PKS系統(tǒng)的一種PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域。
54.權(quán)利要求45的遺傳修飾的植物，其中所述植物被進(jìn)一步遺傳修飾成重組表達(dá)來(lái)自模塊型PKS系統(tǒng)的一種PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域。
55.一種鑒定具有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的微生物的方法，包括a.選擇產(chǎn)生至少一種PUFA的微生物；和，b.從(a)中鑒定與發(fā)酵培養(yǎng)基中在大于約5%飽和度的溶氧條件下所述微生物產(chǎn)生的 PUFA相比，在發(fā)酵培養(yǎng)基中不足約5%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物；其中將產(chǎn)生至少一種PUFA且在不足約5%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA 的能力的微生物鑒定為含有PUFAPKS系統(tǒng)的候選微生物。
56.權(quán)利要求55的方法，其中步驟(b)包括從(a)中鑒定在不足約2%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物。
57.權(quán)利要求55的方法，其中步驟(b)包括從(a)中鑒定在不足約飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物。
58.權(quán)利要求55的方法，其中步驟(b)包括從(a)中鑒定在約0%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物。
59.權(quán)利要求55的方法，其中在(a)中所選微生物具有通過(guò)吞噬作用消費(fèi)細(xì)菌的能力。
60.權(quán)利要求55的方法，其中在(a)中所選微生物具有簡(jiǎn)單的脂肪酸分布特征。
61.權(quán)利要求55的方法，其中在(a)中所選微生物是非細(xì)菌微生物。
62.權(quán)利要求55的方法，其中在(a)中所選微生物是真核生物。
63.權(quán)利要求55的方法，其中在(a)中所選微生物是Thraustochytriales目的一個(gè)成員O
64.權(quán)利要求55的方法，其中在(a)中所選微生物在高于約15°C的溫度下具有生產(chǎn) PUFA的能力。
65.權(quán)利要求55的方法，其中在(a)中所選微生物在高于約20°C的溫度下具有生產(chǎn) PUFA的能力。
66.權(quán)利要求55的方法，其中在(a)中所選微生物在高于約25°C的溫度下具有生產(chǎn) PUFA的能力。
67.權(quán)利要求55的方法，其中在(a)中所選微生物在高于約30°C的溫度中具有生產(chǎn) PUFA的能力。
68.權(quán)利要求55的方法，其中在(a)中所選微生物具有產(chǎn)生生物體干重的約5%以上的所需生物活性化合物的能力。
69.權(quán)利要求55的方法，其中在(a)中所選微生物具有產(chǎn)生生物體干重的約10%以上的所需生物活性化合物的能力。
70.權(quán)利要求55的方法，其中在(a)中所選微生物的總脂肪酸約30%以上是C14:0， C16:0和C16:1，同時(shí)也產(chǎn)生至少一種具有3個(gè)或更多個(gè)不飽和鍵的長(zhǎng)鏈脂肪酸。
71.權(quán)利要求55的方法，其中在(a)中所選微生物的總脂肪酸約40%以上是C14:0， C16:0和C16:1，同時(shí)也產(chǎn)生至少一種具有3個(gè)或更多個(gè)不飽和鍵的長(zhǎng)鏈脂肪酸。
72.權(quán)利要求55的方法，其中在(a)中所選微生物的總脂肪酸約30%以上是C14:0， C16:0和C16:1，同時(shí)也產(chǎn)生至少一種具有4個(gè)或更多個(gè)不飽和鍵的長(zhǎng)鏈脂肪酸。
73.權(quán)利要求55的方法，其中在(a)中所選微生物的總脂肪酸約30%以上是C14:0， C16:0和C16:1，同時(shí)也產(chǎn)生至少一種具有5個(gè)或更多個(gè)不飽和鍵的長(zhǎng)鏈脂肪酸。
74.權(quán)利要求55的方法，還包含a.檢測(cè)所述生物體是否含有PUFA PKS系統(tǒng)。
75.權(quán)利要求74的方法，其中所述檢測(cè)步驟包括檢測(cè)在所述微生物中與編碼來(lái)自 Thraustochytrid PUFA PKS系統(tǒng)的氨基酸序列的核酸序列在嚴(yán)格條件下雜交的核酸序列。
76.權(quán)利要求74的方法，其中所述檢測(cè)步驟包括檢測(cè)在所述生物體中用來(lái)自 Thaustochytrid PUFA PKS系統(tǒng)的核酸序列的寡核苷酸引物擴(kuò)增的核酸序列。
77.由權(quán)利要求55的方法鑒定的且被遺傳修飾成調(diào)節(jié)所述PUFAPKS系統(tǒng)產(chǎn)生的分子的微生物。
78.—種生產(chǎn)由聚酮化合物合酶系統(tǒng)產(chǎn)生的生物活性分子的方法，包括在有效產(chǎn)生所述生物活性分子的條件下培養(yǎng)表達(dá)PKS系統(tǒng)的遺傳修飾的生物體，所述PKS系統(tǒng)含有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域，其中所述 PUFAPKS系統(tǒng)的所述至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域由選自下組的核酸序列編碼a.編碼來(lái)自Thraustochytrid微生物的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶 (PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；b.編碼來(lái)自以下述方法鑒定的微生物的PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列(i)選擇產(chǎn)生至少一種PUFA的微生物；和，( )從(i)中鑒定與發(fā)酵培養(yǎng)基中在大于約5%飽和度的溶氧條件下所述微生物產(chǎn)生的PUFA相比，在發(fā)酵培養(yǎng)基中不足約5%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物；c.編碼選自SEQID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :6，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；d.編碼選自SEQID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQ IDNO :18，SEQ ID NO: 20，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO -.26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，SEQ ID NO :32，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；e.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有 PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，f.編碼與選自SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQID NO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；其中所述生物體被遺傳修飾成影響所述PKS系統(tǒng)的活性。
79.權(quán)利要求78的方法，其中(a)中所述Thraustochytrid來(lái)自于破囊壺菌屬或 Schizochytrium 屬。
80.權(quán)利要求78的方法，其中(a)中所述Thraustochytrid是破囊壺菌23B(ATCC 20892)。
81.權(quán)利要求78的方法，其中(a)中所述Thraustochytrid是Schizochytrium sp.SR21。
82.權(quán)利要求78的方法，其中(a)中所述Thraustochytrid是Schizochytrium菌株 ATCC 20888。
83.權(quán)利要求78的方法，其中(a)中所述Thraustochytrid是Schizochytrium IimaeiumdFO 32693)。
84.權(quán)利要求78 的方法，其中(a)中所述 Thraustochytrid 是 Ulkenia(BP-5601)。
85.權(quán)利要求78的方法，其中所述核酸序列選自a.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少約70%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，b.編碼與選自SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQID NO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約70%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
86.權(quán)利要求78的方法，其中所述核酸序列選自a.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少約80%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，b.編碼與選自SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQID NO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約80%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
87.權(quán)利要求78的方法，其中所述核酸序列選自a.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸具有至少約90%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，b.編碼與選自SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQID NO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約90%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
88.權(quán)利要求78的方法，其中所述核酸序列編碼選自=SEQID N0:2，SEQ ID N0:4，SEQ ID NO 6, SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :13，SEQ ID NO :18，SEQ ID NO -.20, SEQ ID NO :22, SEQ ID NO -.24, SEQID NO -.26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，SEQ ID NO 32 或其生物活性片段的氨基酸序列。
89.權(quán)利要求78的方法，其中所述生物體內(nèi)源性表達(dá)含有所述PUFAPKS系統(tǒng)的所述至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的PKS系統(tǒng)，且其中所述遺傳修飾處在編碼所述PUFAPKS系統(tǒng)的所述至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列上。
90.權(quán)利要求89的方法，其中所述遺傳修飾與野生型生物體相比改變了由所述內(nèi)源性 PKS系統(tǒng)產(chǎn)生的至少一種產(chǎn)物。
91.權(quán)利要求78的方法，其中所述生物體內(nèi)源性表達(dá)含有所述PUFAPKS系統(tǒng)的所述至少一個(gè)生物活性結(jié)構(gòu)域的PKS系統(tǒng)，且其中所述遺傳修飾包括用選自由編碼來(lái)自第二種 PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的重組核酸分子和編碼影響所述PUFAPKS系統(tǒng)活性的蛋白質(zhì)的重組核酸分子組成的組中的一種重組核酸分子轉(zhuǎn)染所述生物體。
92.權(quán)利要求91的方法，其中所述遺傳修飾使得與野生型生物體相比改變了由所述內(nèi) 源性PKS系統(tǒng)產(chǎn)生的至少一種產(chǎn)物。
93.權(quán)利要求78的方法，其中所述生物體通過(guò)用編碼所述多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的所述至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的重組核酸分子轉(zhuǎn)染而被遺傳修飾。
94.權(quán)利要求78的方法，其中所述生物體產(chǎn)生一種多不飽和脂肪酸(PUFA)的分布特征，該分布特征不同于沒(méi)有遺傳修飾的天然生物體。
95.權(quán)利要求78的方法，其中所述生物體內(nèi)源性表達(dá)非細(xì)菌PUFAPKS系統(tǒng)，且其中所述遺傳修飾包括來(lái)自不同PKS系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)域取代編碼所述非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè) 結(jié)構(gòu)域的核酸序列。
96.權(quán)利要求78的方法，其中所述生物體內(nèi)源性表達(dá)非細(xì)菌PUFAPKS系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過(guò) 用重組核酸分子轉(zhuǎn)染所述生物體而被修飾，該重組核酸分子編碼能對(duì)所述PUFA PKS系統(tǒng)產(chǎn) 生的脂肪酸的鏈長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)。
97.權(quán)利要求96的方法，其中編碼調(diào)節(jié)脂肪酸鏈長(zhǎng)的蛋白質(zhì)的所述重組核酸分子取代了所述非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)中編碼鏈長(zhǎng)因子的核酸序列。
98.權(quán)利要求96的方法，其中調(diào)節(jié)所述PUFAPKS系統(tǒng)產(chǎn)生的脂肪酸的鏈長(zhǎng)的所述蛋白質(zhì)是鏈長(zhǎng)因子。
99.權(quán)利要求96的方法，其中調(diào)節(jié)所述PUFAPKS系統(tǒng)產(chǎn)生的脂肪酸的鏈長(zhǎng)的所述蛋白質(zhì)是指導(dǎo)合成C20單位的鏈長(zhǎng)因子。
100.權(quán)利要求96的方法，其中所述生物體表達(dá)非細(xì)菌PUFAPKS系統(tǒng)，該在編碼 FabA-樣β-羥酰-ACP脫水酶(DH)結(jié)構(gòu)域的區(qū)域或編碼β _酮脂酰-ACP合酶(KS)的區(qū) 域中含有遺傳修飾，其中所述修飾與沒(méi)有所述修飾相比改變了所述PUFAPKS系統(tǒng)產(chǎn)生的長(zhǎng) 鏈脂肪酸的比率。
101.權(quán)利要求100的方法，其中所述修飾包含用不具有異構(gòu)化活性的DH結(jié)構(gòu)域取代所述非細(xì)菌PUFA PKS系統(tǒng)中的FabA-樣β -羥酰-ACP脫水酶(DH)。
102.權(quán)利要求100的方法，其中所述修飾選自缺失所述區(qū)域的全部或部分，用來(lái)自不同生物的同源區(qū)域取代所述區(qū)域，或突變所述區(qū)域。
103.權(quán)利要求96的方法，其中所述生物體表達(dá)非-PUFAPKS系統(tǒng)且其中所述遺傳修飾包含用來(lái)自PUFA PKS系統(tǒng)的FabA-樣β -羥酰-ACP脫水酶(DH)區(qū)域取代不具有異構(gòu)化活性的DH區(qū)域。
104.權(quán)利要求78的方法，其中所述生物體表達(dá)在烯酰-ACP還原酶(ER)區(qū)域中含有修飾的非細(xì)菌PUFAPKS系統(tǒng)，其中所述修飾導(dǎo)致與沒(méi)有所述修飾相比產(chǎn)生不同的化合物。
105.權(quán)利要求104的方法，其中所述修飾選自缺失所述ER區(qū)域的全部或部分，用來(lái)自不同生物的ER區(qū)域取代所述ER區(qū)域，或突變所述ER區(qū)域。
106.權(quán)利要求78的方法，其中所述生物活性分子選自抗炎癥配制品，化療劑，有效賦形劑，骨質(zhì)疏松癥藥物，抗抑郁劑，抗驚厥劑，抗幽門螺桿菌< >(Heliobactor pylori)藥物，治療神經(jīng)變性疾病的藥物，治療變性肝臟疾病的藥物，抗生素，或降膽固醇配制品。
107.權(quán)利要求78的方法，其中所述生物活性分子是抗生素。
108.權(quán)利要求78的方法，其中所述生物活性分子是多不飽和脂肪酸(PUFA)。
109.權(quán)利要求78的方法，其中所述生物活性分子是包含順式構(gòu)型的碳-碳雙鍵的分子。
110.權(quán)利要求78的方法，其中所述生物活性分子是在每第三個(gè)碳包含一個(gè)雙鍵的分子。
111.權(quán)利要求78的方法，其中所述生物體是微生物。
112.權(quán)利要求78的方法，其中所述生物體是植物。
113.產(chǎn)生具有不同于天然植物的多不飽和脂肪酸(PUFA)分布特征的植物的方法，包括對(duì)所述植物的細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以表達(dá)含有至少一種重組核酸分子的PKS系統(tǒng)，該重組核酸分子含有編碼PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物活性結(jié)構(gòu)域的核酸序列，其中所述PUFA PKS系統(tǒng)的所述至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域由選自下組的核酸序列編碼a.編碼來(lái)自Thraustochytrid微生物的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶 (PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；b.編碼來(lái)自以下述方法鑒定的微生物的PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列(i)選擇產(chǎn)生至少一種PUFA的微生物；和，( )從(i)中鑒定與發(fā)酵培養(yǎng)基中在大于約5%飽和度的溶氧條件下所述微生物產(chǎn)生的PUFA相比，在發(fā)酵培養(yǎng)基中不足約5%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物；c.編碼選自SEQID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :6，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；d.編碼選自SEQID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQ IDNO :18，SEQ ID NO: 20，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO -.26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，SEQ ID NO :32，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；e.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有 PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，f.編碼與選自:SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQID NO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
114.一種修飾含有至少一種脂肪酸的終產(chǎn)物的方法，包括向所述終產(chǎn)物中添加一種由重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生的油類，該重組宿主細(xì)胞表達(dá)含有編碼PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物活性結(jié)構(gòu)域的核酸序列的至少一個(gè)重組核酸分子，其中所述PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域由選自下組的核酸序列編碼a.編碼來(lái)自Thraustochytrid微生物的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶 (PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；b.編碼來(lái)自以下述方法鑒定的微生物的PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列(i)選擇產(chǎn)生至少一種PUFA的微生物；和，( )從(i)中鑒定與發(fā)酵培養(yǎng)基中在大于約5%飽和度的溶氧條件下所述微生物產(chǎn)生的PUFA相比，在發(fā)酵培養(yǎng)基中不足約5%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物；c.編碼選自SEQID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :6，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；d.編碼選自SEQID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQ IDNO :18，SEQ ID NO: 20，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO -.26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，SEQ ID NO :32，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；e.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有 PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，f.編碼與選自:SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQID NO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
115.權(quán)利要求114的方法，其中所述終產(chǎn)物選自飲食添加劑，食品，藥物配制品，人源化動(dòng)物乳汁，或嬰兒配制品。
116.權(quán)利要求115的方法，其中所述藥物配制品選自由抗炎癥配制品，化療劑，有效賦形劑，骨質(zhì)疏松癥藥物，抗抑郁劑，抗驚厥劑，抗幽門螺桿菌藥物，治療神經(jīng)變性疾病的藥物，治療變性肝臟疾病的藥物，抗生素，和降膽固醇配制品組成的組中。
117.權(quán)利要求114的方法，其中所述終產(chǎn)物用于治療下述疾病慢性炎癥，急性炎癥，胃腸疾病，癌癥，惡病質(zhì)，心臟再狹窄，神經(jīng)變性疾病，肝臟變性疾病，血脂疾病，骨質(zhì)疏松癥，骨關(guān)節(jié)炎，自身免疫疾病，先兆子癇，早產(chǎn)，年老相關(guān)性黃斑病，肺病，或過(guò)氧化物酶體疾病。
118.一種生產(chǎn)人源化動(dòng)物乳汁的方法，包括用含有編碼PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物活性結(jié)構(gòu)域的核酸序列的至少一種重組核酸分子對(duì)產(chǎn)奶動(dòng)物的產(chǎn)奶細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，其中所述PUFA PKS系統(tǒng)的所述至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域由選自下組的核酸序列編碼a.編碼來(lái)自Thraustochytrid微生物的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶 (PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；b.編碼來(lái)自以下述方法鑒定的微生物的PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列(i)選擇產(chǎn)生至少一種PUFA的微生物；和，( )從(i)中鑒定與發(fā)酵培養(yǎng)基中在大于約5%飽和度的溶氧條件下所述微生物產(chǎn)生的PUFA相比，在發(fā)酵培養(yǎng)基中不足約5%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物；c.編碼選自SEQID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :6，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；d.編碼選自SEQID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQ IDNO :18，SEQ ID NO: 20，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO -.26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，SEQ ID NO :32，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；e.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有 PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，f.編碼與選自:SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQID NO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
119. 一種產(chǎn)生重組微生物的方法，包括對(duì)微生物細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以表達(dá)含有編碼 PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)生物活性結(jié)構(gòu)域的核酸序列的至少一種重組核酸分子，其中所述 PUFA PKS系統(tǒng)的所述至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域由選自下組的核酸序列編碼a.編碼來(lái)自Thraustochytrid微生物的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶 (PKS)系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列；b.編碼來(lái)自以下述方法鑒定的微生物的PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的核酸序列(i)選擇產(chǎn)生至少一種PUFA的微生物；和，( )從(i)中鑒定與發(fā)酵培養(yǎng)基中在大于約5%飽和度的溶氧條件下所述微生物產(chǎn)生的PUFA相比，在發(fā)酵培養(yǎng)基中不足約5%飽和度的溶氧條件下具有產(chǎn)生增加的PUFA的能力的微生物；c.編碼選自SEQID NO 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :6，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；d.編碼選自SEQID NO 8, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13，SEQ IDNO :18，SEQ ID NO: 20，SEQ ID NO :22，SEQ ID NO -.24, SEQ ID NO -.26, SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :30，SEQ ID NO :32，或其生物學(xué)活性片段的氨基酸序列的核酸序列；e.編碼與選自SEQID NO :2,SEQ ID NO :4，或SEQ ID NO :6的氨基酸序列的至少500 個(gè)連續(xù)氨基酸有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有 PUFAPKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性；和，f.編碼與選自:SEQID NO :8,SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 13, SEQID NO 18, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO 22,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 26,SEQ ID NO 28,SEQ ID N0:30，或SEQ ID NO 32的氨基酸序列具有至少約60%相同性的氨基酸序列的核酸序列；其中所述氨基酸序列具有PUFA PKS系統(tǒng)的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。
120.一種被修飾成表達(dá)多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的重組宿主細(xì)胞，其中所述PKS催化重復(fù)的和非重復(fù)的酶反應(yīng)，且其中所述PUFA PKS系統(tǒng)包含a.至少兩個(gè)烯酰ACP-還原酶(ER)結(jié)構(gòu)域；b.至少6個(gè)酰基載體蛋白(ACP)結(jié)構(gòu)域；c.至少兩個(gè)β-酮脂酰-ACP合酶(KS)結(jié)構(gòu)域；d.至少一個(gè)?；D(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域；e.至少一個(gè)酮還原酶(KR)結(jié)構(gòu)域；f.至少兩個(gè)FabA-樣β-羥酰-ACP脫水酶(DH)結(jié)構(gòu)域；g.至少一個(gè)鏈長(zhǎng)因子(CLF)結(jié)構(gòu)域；和h.至少一個(gè)丙二酰-CoA:ACP酰基轉(zhuǎn)移酶(MAT)結(jié)構(gòu)域。
121.權(quán)利要求120的重組宿主細(xì)胞，其中所述PUFAPKS系統(tǒng)是真核PUFA PKS系統(tǒng)。
122.權(quán)利要求120的重組宿主細(xì)胞，其中所述PUFAPKS系統(tǒng)是藻類PUFA PKS系統(tǒng)。
123.權(quán)利要求120的重組宿主細(xì)胞，其中所述PUFAPKS系統(tǒng)是Thraustochytriales PUFA PKS 系統(tǒng)。
124.權(quán)利要求120的重組宿主細(xì)胞，其中所述PUFAPKS系統(tǒng)是Schizochytrium PUFA PKS系統(tǒng)。
125.權(quán)利要求120的重組宿主細(xì)胞，其中所述PUFAPKS系統(tǒng)是破囊壺菌屬PUFAPKS系統(tǒng)。
126.權(quán)利要求120的重組宿主細(xì)胞，其中所述PUFAPKS系統(tǒng)可在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)。
127.權(quán)利要求120的重組宿主細(xì)胞，其中所述PUFAPKS系統(tǒng)可在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)。
128.權(quán)利要求120的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
129.—種生產(chǎn)含有至少一種PUFA的產(chǎn)物的方法，包括在有效產(chǎn)生該產(chǎn)物的條件下生長(zhǎng)含有權(quán)利要求128的植物細(xì)胞的植物。
130.權(quán)利要求120的重組宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是微生物細(xì)胞。
131.一種生產(chǎn)含有至少一種PUFA的產(chǎn)物的方法，包括在有效產(chǎn)生所述產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)含有權(quán)利要求130的所述微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物。
132.權(quán)利要求120的重組宿主細(xì)胞，其中所述PUFAPKS系統(tǒng)催化甘油三酯的直接產(chǎn)生。
133.—種含有多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的遺傳修飾的微生物，其中所述PKS催化重復(fù)的和非重復(fù)的酶反應(yīng)，且其中所述PUFAPKS系統(tǒng)包含a.至少兩個(gè)烯酰ACP-還原酶(ER)結(jié)構(gòu)域；b.至少6個(gè)?；d體蛋白(ACP)結(jié)構(gòu)域；c.至少兩個(gè)β-酮脂酰-ACP合酶(KS)結(jié)構(gòu)域；d.至少一個(gè)酰基轉(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域；e.至少一個(gè)酮還原酶(KR)結(jié)構(gòu)域；f.至少兩個(gè)FabA-樣β-羥酰-ACP脫水酶(DH)結(jié)構(gòu)域；g.至少一個(gè)鏈長(zhǎng)因子(CLF)結(jié)構(gòu)域；和h.至少一個(gè)丙二酰-CoA: ACP?；D(zhuǎn)移酶(MAT)結(jié)構(gòu)域；其中該遺傳修飾影響所述PUFA PKS系統(tǒng)的活性。
134.權(quán)利要求133的遺傳修飾的微生物，其中所述微生物是真核微生物。
135.—種被修飾成表達(dá)非細(xì)菌多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)的重組宿主細(xì)胞，其中所述非細(xì)菌PUFA PKS催化重復(fù)的和非重復(fù)的酶反應(yīng)，且其中所述非細(xì) 菌PUFA PKS系統(tǒng)包含a.至少一個(gè)烯酰ACP-還原酶(ER)結(jié)構(gòu)域；b.多個(gè)?；d體蛋白(ACP)結(jié)構(gòu)域；c.至少兩個(gè)β-酮脂酰-ACP合酶(KS)結(jié)構(gòu)域；d.至少一個(gè)?；D(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域；e.至少一個(gè)酮還原酶(KR)結(jié)構(gòu)域；f.至少兩個(gè)FabA-樣β-羥酰-ACP脫水酶(DH)結(jié)構(gòu)域；g.至少一個(gè)鏈長(zhǎng)因子(CLF)結(jié)構(gòu)域；和h.至少一個(gè)丙二酰-CoA:ACP酰基轉(zhuǎn)移酶(MAT)結(jié)構(gòu)域。
全文摘要
本發(fā)明一般涉及從非細(xì)菌生物分離或衍生的多不飽和脂肪酸(PUFA)聚酮化合物合酶(PKS)系統(tǒng)，涉及其同源物，涉及編碼該P(yáng)UFA PKS系統(tǒng)的生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)域的分離的核酸分子和重組核酸分子，涉及制備和使用該系統(tǒng)用于生產(chǎn)所需生物活性分子的方法，且涉及鑒定具有該P(yáng)UFA PKS系統(tǒng)的新細(xì)菌和非細(xì)菌微生物的新方法。
文檔編號(hào)A61P3/06GK101892249SQ20101022221
公開日2010年11月24日申請(qǐng)日期2002年4月16日優(yōu)先權(quán)日2001年4月16日
發(fā)明者威廉·R·巴克利, 杰里·M·庫(kù)納, 詹姆斯·G·梅茨, 詹姆斯·H·弗拉特申請(qǐng)人:馬泰克生物科學(xué)公司

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該技術(shù)已申請(qǐng)專利。僅供學(xué)習(xí)研究，如用于商業(yè)用途，請(qǐng)聯(lián)系技術(shù)所有人。
技術(shù)研發(fā)人員：詹姆斯.Ｇ.梅茨;威廉.Ｒ.巴克利;詹姆斯.Ｈ.弗拉特;杰里.Ｍ.庫(kù)納
技術(shù)所有人：馬泰克生物科學(xué)公司
我是此專利的發(fā)明人

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