專利名稱：大黃素在制備P2X₃介導(dǎo)神經(jīng)病理痛/神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鎮(zhèn)痛藥物用途發(fā)明領(lǐng)域，尤其是涉及可用于防治疼痛的大黃素(單獨(dú) 用)在制備P2X3導(dǎo)神經(jīng)病理痛/神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
疼痛(pain)由痛覺(jué)(painperception)和痛反應(yīng)(pain response)兩部分組成， 是臨床上大多數(shù)疾病共有并最常見(jiàn)的癥狀之一，主要表現(xiàn)為機(jī)體對(duì)組織損傷或潛在的損傷 所產(chǎn)生的一種不愉快的主觀反應(yīng)。由于疼痛給人們?cè)斐蓸O大痛苦，據(jù)2001年第二期《國(guó)際 疼痛學(xué)會(huì)通迅》報(bào)道美國(guó)106次國(guó)會(huì)通過(guò)一項(xiàng)決議，宣布從2001年元月一日起的十年為 “疼痛控制和研究的十年”(Decadeof Pain Control and Research)。由此說(shuō)明各國(guó)對(duì)疼痛 研究的重視。根據(jù)疼痛時(shí)程可將疼痛分為急性痛(生理性痛)和慢性痛(病理性痛)。其 中慢性痛包括炎癥痛、神經(jīng)病理痛、癌癥痛。目前臨床上將疼痛作為繼體溫、脈搏、呼吸、血 壓等四大生命體征之后的第五大生命體征，是生命體征的重要指標(biāo)。由于慢性痛機(jī)理復(fù)雜， 其治療成為臨床上的難題。神經(jīng)病理痛是指由神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病所引起的疼痛綜合征， 常常表現(xiàn)為自發(fā)性的疼痛，對(duì)機(jī)械、冷、熱等傷害性刺激產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏；對(duì)非傷害性刺激產(chǎn) 生觸誘發(fā)痛、痛覺(jué)倒錯(cuò)和燒灼痛等神經(jīng)病理性痛覺(jué)過(guò)敏。由于慢性痛持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)人身心 健康危害較大，其研究成為疼痛領(lǐng)域的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。三叉神經(jīng)痛是臨床上發(fā)病率較高，對(duì)病 人的生活質(zhì)量影響較大的一種較難完全治愈的疾病。三叉神經(jīng)痛是一種慢性疼痛綜合癥， 藥物治療是首選，雖然治療藥物較多，但有效而副作用較小的藥很少，而且有些藥物可能一 開(kāi)始有效但很快會(huì)產(chǎn)生耐藥性。因此我們有必要探尋新的具有較好療效在而且副作用較小 的三叉神經(jīng)痛止痛藥物，為三叉神經(jīng)痛治療探索新的方法?；瘜W(xué)藥物鎮(zhèn)痛仍是目前最主要的疼痛治療手段，主要包括阿片類鎮(zhèn)痛藥、中樞作 用的非阿片類鎮(zhèn)痛藥、作用于外周的抗炎鎮(zhèn)痛藥和復(fù)方抗炎鎮(zhèn)痛藥。但阿片類等鎮(zhèn)痛藥物 的副作用如呼吸抑制、惡心、嘔吐、嗜睡、尿潴留等發(fā)生率較高，而且長(zhǎng)期應(yīng)用易產(chǎn)生藥物耐 受與依賴以及突然停藥導(dǎo)致的戒斷綜合征。奈福泮(Nefopam，平痛新)為一種新型的非 麻醉性鎮(zhèn)痛藥，兼有輕度的解熱和肌松作用，化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于環(huán)化鄰甲基苯海拉明，所以不具 有非留體抗炎藥的特性，亦非阿片受體激動(dòng)劑，對(duì)中、重度疼痛有效，主要用于術(shù)后止痛、牙 痛、癌癥痛、急性外傷痛，臨床亦用于三叉神經(jīng)痛治療。消炎痛(Indometacin，吲哚美辛)為 非甾體類抗炎藥，具有解熱、鎮(zhèn)痛及抗炎等作用，其作用機(jī)理為通過(guò)對(duì)環(huán)氧酶的抑制而減少 前列腺素的合成，制止炎癥組織痛覺(jué)神經(jīng)沖動(dòng)的形成，抑制炎性反應(yīng)，包括抑制白細(xì)胞的趨 化性及溶酶體酶的釋放等，由于消炎痛有多種嚴(yán)重的副作用，影響其使用范圍。因此，尋找 以新的分子靶標(biāo)為基礎(chǔ)的鎮(zhèn)痛藥物成為目前的研究熱點(diǎn)和面臨的首要任務(wù)。嘌呤類物質(zhì)三磷酸腺苷(ATP)作為重要的信使物質(zhì)參與痛覺(jué)信息傳遞。嘌呤 (Purine)受體分為嘌呤1和嘌呤2 (Purine LPurine 2 ;P1，P2)受體，ATP及其類似物作用 于P2受體。P2受體分為配體門控性離子通道型受體(P2X受體)和G蛋白偶聯(lián)型受體(P2Y
3受體)。P2X受體有七種亞型(P2U。英國(guó)“自然”雜志報(bào)道ATP作用的P2X3受體(P2X 受體的一種亞型)特異性地在與痛覺(jué)傳入有關(guān)的背根神經(jīng)節(jié)小、中神經(jīng)細(xì)胞克隆表達(dá)。將 ATP用離子透入法導(dǎo)入志愿者前臂皮膚亦可產(chǎn)生劑量依賴性的痛覺(jué)反應(yīng)。疼痛、傷害性刺 激使損傷細(xì)胞、應(yīng)激細(xì)胞以及感覺(jué)神經(jīng)末梢本身釋放大量ATP，ATP及其作用的P2X受體涉 及痛覺(jué)及傷害性信息在初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞的傳遞，其中主要是同聚性P2X3受體參與初級(jí)感 覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞的痛覺(jué)及傷害性信息傳遞。基因敲除P2X3受體的小鼠減小了對(duì)福爾馬林致痛 試驗(yàn)的兩相反應(yīng)。P2X3受體介導(dǎo)神經(jīng)病理痛的痛覺(jué)傳遞。神經(jīng)病理痛刺激時(shí)，P2X3受體和 P2X3mRNA表達(dá)增加，感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞P2X3受體介導(dǎo)ATP激活的門控通道電流明顯增強(qiáng)。應(yīng)用 P2X3受體反義寡核苷酸及RNA干擾技術(shù)可使炎性痛大鼠模型背根神經(jīng)節(jié)的P2X3受體水平 下調(diào)，進(jìn)而明顯減輕P2X3受體激動(dòng)劑a，i3-meATP和福爾馬林所致的足底傷害性反應(yīng)。三 叉神經(jīng)傳導(dǎo)口腔粘膜的感覺(jué)。三叉神經(jīng)節(jié)有P2X3受體的表達(dá)，三叉神經(jīng)節(jié)對(duì)三叉神經(jīng)痛的 傳遞有著重要作用，P2X3受體參與三叉神經(jīng)痛的痛覺(jué)傳遞。疼痛狀態(tài)下P2X3受體對(duì)其激動(dòng) 劑的反應(yīng)性增加，P2X3受體拮抗劑A-317491明顯減小大鼠完全福氏佐劑誘導(dǎo)的慢性炎性熱 痛覺(jué)過(guò)敏和福爾馬林引起的痛覺(jué)行為。這些發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)病理痛和三叉神經(jīng)痛的發(fā)病機(jī)理提 供了新的依據(jù)。申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)室以前的研究也顯示傷害性刺激可導(dǎo)致背根感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞和三 叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞P2X3受體表達(dá)增加。目前國(guó)外已有研究生產(chǎn)P2X3受體拮抗劑(如R03) 用于臨床治療疼痛的報(bào)道。大黃素(emodin)是中藥大黃的主要有效成分，并且在正品大黃中的游離蒽醌中 占的比例較大，其藥理作用與大黃有許多相似之處。大黃味苦性寒，歸脾、胃、大腸、肝、心 經(jīng)；大黃有瀉火解熱、通瘀導(dǎo)滯、止痛止血等作用。大黃素是從豆科植物野葛及甘葛藤根中 提取的一種黃酮苷，臨床上主要用于心血管疾病和糖尿病的治療。文獻(xiàn)報(bào)道[丁艷，黃志 華·大黃素藥理作用研究進(jìn)展.中藥藥理與臨床，2007 ;23 (5) :236-238.]大黃素具有抗炎 作用，但目前尚無(wú)單獨(dú)用大黃素直接具有鎮(zhèn)痛作用的報(bào)道，臨床上也無(wú)大黃素通過(guò)鎮(zhèn)痛作 用機(jī)制進(jìn)行疼痛治療的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供大黃素的第一個(gè)新用途，即大黃素在制備治療慢性 痛(優(yōu)選神經(jīng)病理痛)的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供大黃素的第二個(gè)新用途，即大黃素在制備治療三叉 神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞介導(dǎo)疼痛藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供大黃素的第三個(gè)新用途，即大黃素在制備治療涉及 P2X3受體介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理機(jī)制防治藥物中的應(yīng)用。大黃素可減輕神經(jīng)病理痛及三叉神經(jīng)痛模型大鼠的痛行為反應(yīng)。大黃素治療疼痛 的作用機(jī)理為阻斷P2X3受體介導(dǎo)的疼痛信息傳遞，產(chǎn)生防治疼痛的作用。為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面結(jié)合附圖以實(shí)驗(yàn)和結(jié)果來(lái)證明大黃素的用 途。


圖1為大黃素神經(jīng)病理痛大鼠熱痛敏的影響圖2為大黃素神經(jīng)病理痛大鼠機(jī)械痛敏的影響圖；圖3為免疫組織化學(xué)方法觀察大黃素對(duì)神經(jīng)病理痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體免 疫反應(yīng)性的影響圖，其中A 正常組；B 假手術(shù)組；C 坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組；D 單獨(dú) 大黃素組；E 坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+大黃素處理組；F 坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消 炎痛處理組；圖4為原位雜交方法觀察大黃素對(duì)神經(jīng)病理痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體mRNA表 達(dá)的影響圖，其中A 正常組；B 假手術(shù)組；C 坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組；D 單獨(dú)大黃素 組；E 坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+大黃素處理組；F 坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消炎痛處
理組；圖5為蛋白印跡方法觀察大黃素對(duì)神經(jīng)病理痛大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X3受體蛋白表 達(dá)的影響圖，其中實(shí)驗(yàn)分組順序正常組(control)；假手術(shù)組(sham)；坐骨神經(jīng)慢性壓迫 性損傷組(Chronic constriction injury, CCI)；單獨(dú)大黃素處理組(Emodin)；坐骨神經(jīng) 慢性壓迫性損傷+大黃素處理組(CCI+emodin)；坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組 (CCI+Indo)；圖6為RT-PCR方法觀察大黃素對(duì)神經(jīng)病理痛大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X3受體mRNA表 達(dá)的影響圖，其中實(shí)驗(yàn)分組順序正常組(control)；假手術(shù)組(sham)；坐骨神經(jīng)慢性壓迫 性損傷組(Chronic constriction injury, CCI)；單獨(dú)大黃素處理組(Emodin)；坐骨神經(jīng) 慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組(CCI+Indo)；坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+大黃素處理組 (CCI+emodin)；圖7為大黃素三叉神經(jīng)痛大鼠機(jī)械痛敏的影響圖；圖8為大黃素對(duì)三叉神經(jīng)痛大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X3受體免疫反應(yīng)性的影響圖，其中 A 假手術(shù)組；B 三叉神經(jīng)損傷模型組；C 三叉神經(jīng)損傷+大黃素處理組；D 三叉神經(jīng)損傷 +奈福泮處理組；E 單獨(dú)大黃素處理組；圖9為原位雜交方法觀察大黃素對(duì)三叉神經(jīng)痛大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X3受體mRNA表 達(dá)的影響圖，其中A 假手術(shù)組；B 三叉神經(jīng)損傷模型組；C 三叉神經(jīng)損傷+大黃素處理組； D 三叉神經(jīng)損傷+奈福泮處理組；E 單獨(dú)大黃素處理組；圖10蛋白印跡方法觀察大黃素對(duì)三叉神經(jīng)痛大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X3受體蛋白表達(dá) 的影響圖，其中實(shí)驗(yàn)分組順序A 假手術(shù)組；B 三叉神經(jīng)損傷模型組；C 三叉神經(jīng)損傷+大 黃素處理組；D 三叉神經(jīng)損傷+奈福泮處理組；E 單獨(dú)大黃素處理組； 圖11為RT-PCR方法觀察大黃素對(duì)三叉神經(jīng)痛大鼠三叉神經(jīng)節(jié)P2X3受體mRNA表 達(dá)的影響圖，其中實(shí)驗(yàn)分組順序A 假手術(shù)組；B 三叉神經(jīng)損傷模型組；C 三叉神經(jīng)損傷+ 大黃素處理組；D 三叉神經(jīng)損傷+奈福泮處理組；E 單獨(dú)大黃素處理組。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以大黃素對(duì)神經(jīng)病理痛作用(作為慢性痛的代表)和三叉神經(jīng)痛(作為三 叉神經(jīng)介導(dǎo)疼痛的代表)作用兩部分。一、材料和方法(一 )大黃素對(duì)P2X3受體介導(dǎo)神經(jīng)病理痛作用研究1. 1動(dòng)物和分組
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雄性SD大鼠，220_250g，南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。將大鼠隨機(jī)分成5 組，每組12只。實(shí)驗(yàn)分組I組(正常組)(control) ； II組(假手術(shù)組)(sham) ；III組(坐 骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組)(Chronic constriction injury, CCI) ；IV組(單獨(dú)大黃素處理 組)(Emodin) ； V組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+大黃素處理組)(CCI+emodin) ； VI組(坐 骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組)(CCI+Indo)。將大黃素以20mg/ml溶于0. 5%的 羧甲基纖維素鈉，再按1 2的體積比用生理鹽水稀釋，50mg/kg的大黃素終濃度給予腹腔 注射。I組每天腹腔注射生理鹽水；II組每天腹腔注射大黃素注射液；III組(假手術(shù)組)切 開(kāi)皮膚暴露坐骨神經(jīng)，不結(jié)扎神經(jīng)即縫合皮膚。IV組CCI術(shù)后第1天開(kāi)始每天腹腔注射大 黃素注射液。VI組實(shí)驗(yàn)大鼠于術(shù)前半小時(shí)和術(shù)后每天腹腔注射消炎痛(4mg/kg/d)，每天一 次至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。1. 2藥物與試劑大黃素(中國(guó)藥品生物生物制品檢定所中藥化學(xué)對(duì)照品，編號(hào)110756)；硫噴 妥鈉，上海新亞藥業(yè)有限公司(生產(chǎn)批號(hào)050101)；消炎痛(廣東華南藥業(yè)，國(guó)藥準(zhǔn)字 H44020701) ；SP試劑盒，原位雜交試劑盒及DAB試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)； P2X3 抗體購(gòu)自美國(guó) CHEMIC0N INTERNATIONAL 公司。1. 3主要儀器BME-403 Von Frey細(xì)絲(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)；BME-410C型全 自動(dòng)熱痛刺激儀(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)；消毒紗布、手巾、棉簽等，碘酒及 75%酒精，手術(shù)器械包剪刀、眼科小彎鑷、血管鉗、絲線、有齒鑷、神經(jīng)剝離子等。 1.4慢性神經(jīng)病理痛模型制作用硫噴妥鈉麻醉大鼠(30mg/kg，腹腔注射)，在無(wú)菌條件下于大鼠右大腿后外側(cè) 切開(kāi)皮膚，鈍性分離出坐骨神經(jīng)，以4-0含鉻腸線輕度結(jié)扎坐骨神經(jīng)，共結(jié)扎4道，每個(gè)結(jié) 之間間隔約1mm。結(jié)扎過(guò)程中可見(jiàn)坐骨神經(jīng)被結(jié)扎處直徑略減小，并伴有右后肢一過(guò)性抽 動(dòng)，并注意不要結(jié)扎太緊以至于完全阻斷神經(jīng)外周的血流。大鼠術(shù)后單籠飼養(yǎng)，分別于術(shù)前 (Od)及術(shù)后l，3，5，7，9，ll，14d測(cè)量機(jī)械縮足反射閾值和熱縮足反射潛伏期(測(cè)定時(shí)間恒 定于每日10:00-14:00，室溫維持在22 士 0.5 °C )。1. 5神經(jīng)病理痛大鼠機(jī)械痛敏檢測(cè)用BME-403 Von Frey細(xì)絲(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)測(cè)定機(jī)械 縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。置大鼠于透明的有機(jī)玻璃箱 (22 X 12 X 22cm3)中，有機(jī)玻璃箱底為1 X Icm2的鐵絲網(wǎng)。術(shù)后大鼠放置于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，測(cè) 試前將大鼠放在有機(jī)玻璃箱中適應(yīng)15min。折力分別為0. 13，0. 20，0. 33，0. 60，1. 30，3. 60， 5. 00，7. 30，9. 90，20. lg，折力彡20. Ig時(shí)均記為20. Igo從最小折力開(kāi)始，每根試驗(yàn)10次， 直至出現(xiàn)縮足反射次數(shù)大于5/10，即50%反應(yīng)閾值(即引起10次試驗(yàn)中5次反應(yīng)的值。重 復(fù)三次，取其平均值)。每次刺激間隔時(shí)間至少大于15s，并待刺激引起的反應(yīng)(如舔足、甩 腿等)完全消失。1. 6神經(jīng)病理痛大鼠熱痛敏檢測(cè)將有機(jī)玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，用BME-410C型全自動(dòng)熱痛刺激儀(中國(guó)醫(yī) 學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)照射大鼠足底。熱輻射刺激儀照射大鼠足底至出現(xiàn)抬腿回 避時(shí)間為熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency, TffL) 0切斷時(shí)間為30秒，以防止組織灼傷。1. 7大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG) P2X3受體的表達(dá)五組實(shí)驗(yàn)大鼠于術(shù)后第14天腹腔注射硫噴妥鈉(30mg/kg)深麻醉，經(jīng)升主動(dòng)脈灌 注4%多聚甲醛(0. lmol/L 8，？!17.4)，分離出大鼠1^4、1^5段01 ，取出固定，放入4%多聚 甲醛/0. ImPBS(含0. 1%DEPC)中固定2小時(shí)，用20%蔗糖脫水，在恒冷箱切片機(jī)上行冰凍 切片，厚度為15ym.放入4%的多聚甲醛中保存。每只大鼠的DRG切片隔5張取一張二步 法免疫組織化學(xué)染色測(cè)定DRG神經(jīng)細(xì)胞P2X3受體的表達(dá)，DAB顯色。與此同時(shí)對(duì)DRG切片 進(jìn)行原位雜交測(cè)定P2X3受體mRNA的表達(dá)，雜交前所用液體和器皿都經(jīng)0. 1 %的DEPC嚴(yán)格 處理。冰凍切片在0. 05%的H2O2室溫下作用30分鐘，以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，胃蛋白酶 消化1-2分鐘，37°C預(yù)雜交液中孵育2小時(shí)，棄去預(yù)雜交液，轉(zhuǎn)入雜交液于水浴中37°C過(guò)夜。 次日，用梯度枸櫞酸鹽水(2XSSC，0. 5XSSC和0. 2XSSC)沖洗切片各15分鐘。入37°C封閉 液30分鐘，轉(zhuǎn)入生物素化的地高辛中37°C孵育30分鐘，0. 05%的PBS沖洗15分鐘，相繼 在SABC-POD和生物素化的過(guò)氧化物酶中各孵育30分鐘，DAB顯色。結(jié)果用圖像分析系統(tǒng) 軟件(武漢天平影像技術(shù)有限公司，HMIAS-2000高清晰彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng))對(duì)P2X3陽(yáng) 性神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行平均光密度值分析。蛋白印跡檢測(cè)大鼠DRG的P2X3蛋白表達(dá)變化結(jié)果通過(guò) AlphaImager 2200圖像分析軟件讀取目的條帶在X光膠片上測(cè)得的光密度掃描值，以各組 β -actin條帶的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)組P2X3的蛋白表達(dá)量。1. 8實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理各組數(shù)據(jù)以χ士sem表示。多組間比較用單因素方差分析，繼以最小顯著差法 (LSD)行兩兩比較。用SPSS11. 0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。ρ < 0. 05為差異有顯著性。 (二)大黃素對(duì)P2X3受體介導(dǎo)三叉神經(jīng)痛作用研究2. 1動(dòng)物和分組雄性SD大鼠，220_250g，60只，南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。隨機(jī)將大鼠 分為假手術(shù)組、三叉神經(jīng)痛模型組、三叉神經(jīng)痛模型大黃素處理組、三叉神經(jīng)痛模型奈福泮 處理組和單獨(dú)大黃素處理對(duì)照組。將大黃素以20mg/ml溶于0. 5%的羧甲基纖維素鈉，再按 1 2的體積比用生理鹽水稀釋，50mg/kg的大黃素終濃度給予腹腔注射。奈福泮(56. 9mg/ kg/d)肌肉注射，每天一次至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。2. 2藥物與試劑大黃素(中國(guó)藥品生物生物制品檢定所中藥化學(xué)對(duì)照品，編號(hào)110756)；奈福泮 (山東方明藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H37021048)；乙醚，天津市大茂化學(xué)試劑廠(生產(chǎn) 批號(hào)050801)；硫噴妥鈉，上海新亞藥業(yè)有限公司(生產(chǎn)批號(hào)050101) ；SP試劑盒，DAB試 劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)；P2X3抗體(CHEMICON INTERNATIONAL，美國(guó))；SlOO抗 體(武漢博士德公司)。2. 3主要儀器BME-403 Von Frey細(xì)絲(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)等。2. 4三叉神經(jīng)痛模型制作建立眶下神經(jīng)慢性壓迫性損傷大鼠動(dòng)物模型。測(cè)定各組動(dòng)物臉部機(jī)械性異常痛 敏。2. 5三叉神經(jīng)痛大鼠機(jī)械痛敏測(cè)定
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用BME-403 Von Frey細(xì)絲測(cè)定機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrawalthreshold，MWT)。置大鼠于透明的有機(jī)玻璃箱(22X 12X22cm3)中，有機(jī)玻璃 箱底為IX Icm2的鐵絲網(wǎng)。術(shù)后大鼠放置于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，測(cè)試前將大鼠放在有機(jī)玻璃箱中適 應(yīng) 15min。折力分別為 0. 13，0. 20，0. 33，0. 60，1. 30，3. 60，5. 00，7. 30，9. 90，20. Igo 從最小 折力開(kāi)始，每根試驗(yàn)10次，直至出現(xiàn)縮足反射次數(shù)大約5/10，即50%反應(yīng)閾值(即引起10 次試驗(yàn)中5次反應(yīng)的值)。最大折力為20. lg，大于此值時(shí)記為20. lg。每次試驗(yàn)至少間隔 15s，并待刺激引起的反應(yīng)(如舔足、甩腿等)完全消失。2.6各組數(shù)據(jù)以1士^!11表示。多組間比較用單因素方差分析，繼以最小顯著差法 (LSD)行兩兩比較。用SPSS11. 0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。ρ < 0. 05為差異有顯著性。二、結(jié)果(一 )大黃素對(duì)P2X3受體介導(dǎo)的神經(jīng)病理痛作用的研究結(jié)果各組大鼠術(shù)后均未見(jiàn)肢體運(yùn)動(dòng)障礙和自殘現(xiàn)象。1. 1行為學(xué)研究1. 1. 1神經(jīng)病理痛大鼠熱痛敏檢測(cè)坐骨神經(jīng)被結(jié)扎4天后神經(jīng)病理通模型基本形成，III組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損 傷組；Chronic constriction injury，CCI)、V組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+大黃素組； CCI+emodin)和VI組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組，CCI+Indocin)的熱縮足 反射潛伏期(thermal withdrawal latency, TffL)較 I 組(正常對(duì)照組，control)、II 組(假 手術(shù)組，sham)和IV組(單獨(dú)大黃素組，emodin)顯著性下降(ρ < 0. 01)，而I組(control)、 II組(sham)和IV組(emodin)之間相比較無(wú)顯著性差異(ρ > 0. 05)。V組(CCI+emodin) 熱縮足反射潛伏期與I組(control)、II組(sham)和IV組(emodin)之間相比較仍下降(ρ < 0. 01)，但與III組(CCI)之間比較顯著性增加(ρ < 0. 01)。14d后，V組(CCI+emodin)熱 縮足反射潛伏期與I組(control)之間相比較無(wú)顯著性意義(ρ > 0. 05)，而III組(CCI)仍 較低(ρ < 0. 01)。坐骨神經(jīng)被結(jié)扎7d后，VI組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組， CCI+Indocin)與CCI組實(shí)驗(yàn)大鼠比較其熱縮足反射潛伏期增大，有明顯差異(ρ < 0. 01)， 與V組相比無(wú)明顯差異性(ρ > 0. 05)。見(jiàn)圖1。1.1.2神經(jīng)病理痛大鼠機(jī)械痛敏檢測(cè)坐骨神經(jīng)被結(jié)扎4d后神經(jīng)病理通模型基本形成，III組(Chronic constrictioninjury, CCI)、V組(CCI+emodin)和VI組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消 炎痛處理組，CCI+Indocin)與 I 組(control)、II 組(sham)和IV組(emodin)相比，其機(jī) 械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)顯著性下降(ρ < 0.01)，而 I組(control)、II組(sham)和IV組(emodin)之間相比較無(wú)顯著性差異(ρ > 0. 05)。坐 骨神經(jīng)被結(jié)扎7d后，雖V組(CCI+emodin)與I組(control)相比，其機(jī)械縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)仍低(ρ < 0.01)，但與III組(CCI)之間比較， 機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrawalthreshold, MWT)已顯著性增加(ρ < 0. 01)。 坐骨神經(jīng)被結(jié)扎7d后，VI組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組，CCI+Indocin)與 CCI組實(shí)驗(yàn)大鼠比較其機(jī)械縮足反射閾值增大，有明顯差異(ρ < 0. 01)，與V組相比無(wú)明顯 差異性(P > 0.05)。見(jiàn)圖2。1. 1. 3免疫組織化學(xué)方法測(cè)定大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG) P2X3受體的表達(dá)變化
術(shù)后14d，用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定大鼠1^4、L5手術(shù)側(cè)背根神經(jīng)節(jié)(DRG) 2&受 體的表達(dá)。每只大鼠背根神經(jīng)節(jié)L4、L5段切片中隔5張取一張切片，用圖像分析系統(tǒng)軟件 分析P2XJ0性神經(jīng)細(xì)胞的平均光密度值變化。I組(正常組，control)、II組(假手術(shù) 組，Sham)、III組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組，CCI)、IV組(單獨(dú)大黃素組，Emodin)、V 組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+大黃素組，CCI+emodin)和VI組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損 傷+消炎痛處理組，CCI+Indocin)的平均光密度值值分別為110. 84士 19. 86 (Control)、 112. 40 + 26. 76( Sham),217. 02 + 33. 64( CC I)U08. 08 + 20. 87 (emodin)、 123. 72士34. 24 (CCI+emodin)和 135. 58士32. 32 (CCI+Indo)(各組 η = 10)。I 組、II 組、 IV組之間Ρ2Χ3受體表達(dá)無(wú)顯著性差異(ρ > 0. 05) ；III組DRG的Ρ2Χ3受體的表達(dá)較I組、 II組、IV組明顯增加(P < 0. 01) ； V組DRG的Ρ2Χ3受體的表達(dá)較I組、II組、IV組高(ρ < 0. 05)，但和III組相比仍較低(ρ < 0. 05) ；VI組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消炎痛處理 組，CCI+Indocin)與CCI組實(shí)驗(yàn)大鼠比較P2X3受體表達(dá)明顯降低(ρ < 0. 01) ,VBiDRG的 Ρ2Χ3受體表達(dá)較I組、II組、V組明顯增高(ρ < 0. 01)，但和IV組相比稍增高(ρ < 0. 05)。 見(jiàn)圖3。1. 1. 4原位雜交方法測(cè)定大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG) Ρ2Χ3受體mRNA的表達(dá)變化術(shù)后14d，采用原位雜交方法測(cè)定大鼠L4、L5段手術(shù)側(cè)背根神經(jīng)節(jié)(DRG) 2&受 體mRNA的表達(dá)。每只大鼠L4、L5背根神經(jīng)節(jié)切片中隔5張取一張切片，用圖像分析系 統(tǒng)軟件分析P2X3陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞的平均光密度值變化。與免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果非常相 似，I組(正常組，control)、II組(假手術(shù)組，Sham)、III組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷 組，CCI)、IV組(單獨(dú)大黃素組，Emodin)、V組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+大黃素組， CCI+emodin)和VI組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組，CCI+Indocin)的平均光 密度值值分別為94. 40 士 21. 24 (Control)、95. 42 士 17. 25 (Sham)、171. 89 士 50. 27 (CCI)、 90. 12 士 19. 12 (emodin)、98· 38 士 13. 66 (CCI+emodin)、112. 53 士 15. 73 (CCI+Indo)(各組 η =10)。I組、II組、IV組、V組之間Ρ2Χ3受體表達(dá)無(wú)顯著性差異(ρ > 0. 05) ；III組DRG的 Ρ2Χ3受體的表達(dá)較I組、II組、IV組明顯增加(ρ < 0. 01) ； V組DRG的Ρ2Χ3受體的表達(dá)較I 組高(P < 0. 05) ；VI組與III組比較Ρ2Χ3受體mRNA表達(dá)下降(ρ < 0. 05)，與I組、II組、IV 組、V組比較表達(dá)升高(ρ <0.05)。見(jiàn)圖4。1. 1. 5蛋白印跡檢測(cè)大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)P2X3蛋白表達(dá)變化于術(shù)后14d，用Western Blot方法進(jìn)一步證實(shí)大黃素對(duì)CCI大鼠手術(shù)側(cè)L4/L5 段背根神經(jīng)節(jié)？2&受體蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果采用Alphalmager 2200圖像分析軟件， 讀取目的條帶在X光膠片上測(cè)得的光密度掃描值，與其對(duì)應(yīng)的β -actin條帶的比值作 為P2X3蛋白表達(dá)的相對(duì)水平量。結(jié)果顯示I組(正常組，control)、II組(假手術(shù)組， sham)、III組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組，CCI)、IV組(單獨(dú)大黃素組，Emodin)、乂組(坐 骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+大黃素組，CCI+emodin)和VI組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+ 消炎痛處理組，CCI+Indocin)的P2X3的蛋白表達(dá)量(經(jīng)對(duì)應(yīng)的β-actin標(biāo)化后)分別 為 0. 59 士0. 05 (Control)、0· 62 + 0. 05 (Sham) U. 43 + 0. 37 (CCI)、0· 54士0· 03 (emodin)、 0. 56 士 0· 03 (CCI+emodin)、0· 68 士 0· 06 (CCI+Indo)(各組 η = 5)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，CCI 組 Ρ2Χ3 蛋白的表達(dá)明顯高于 Ctrl 組、Sham 組、Ctrl+Emodin 組、CCI+Emodin 組、CCI+Indocin 組(ρ < 0.01), Sham組與Ctrl組以及Ctrl+Emodin組和Ctrl組之間相比，P2X3蛋白的表
9達(dá)無(wú)顯著性差異(P > 0. 05)；而CCI+Emodin組與CCI+Indocin組之間相比，DRG的P2X3蛋 白的表達(dá)相對(duì)量更低，但無(wú)顯著性差異(P > 0. 05) ；CCI+Emodin組及CCI+Indocin組與CCI 組比較，DRG的P2X3蛋白的表達(dá)相對(duì)量明顯下降(ρ < 0. 01)。見(jiàn)圖5。1.1. 6RT-PCR檢測(cè)大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG) P2X3mRNA的表達(dá)于術(shù)后14d，用RT-PCR法檢測(cè)結(jié)扎側(cè)DRG P2X3mRNA的表達(dá)，采用凝膠成像分析系 統(tǒng)讀取目的電泳條帶的斑點(diǎn)密度(平均光密度)掃描值，將？2&條帶與其對(duì)應(yīng)的β-actin 條帶的比值作為P2X3mRNA表達(dá)的相對(duì)量。結(jié)果顯示，Ctrl對(duì)照組、Sham組、CCI神經(jīng)病 理痛模型組、Ctrl+Emodin組、CCI+Emodin治療組和CCI+Indo組的大鼠DRG的P2X3mRNA 的P2X3mRNA表達(dá)相對(duì)量(經(jīng)對(duì)應(yīng)的β -actin標(biāo)化后)分別為0. 67士0. 44(Control)、 0. 75 士 0. IO(Sham)、0. 84 士 0. 14 (CCI)、0. 70 士 0. 10(emodin)、0. 68 士 0. 03 (CCI+emodin)、 0.76士0.05 (CCI+Indo)(各組η = 10)。CCI神經(jīng)病理痛模型組實(shí)驗(yàn)大鼠的背根神經(jīng)節(jié) 的P2X3mRNA表達(dá)與Ctrl對(duì)照組、Sham組、Ctrl+Emodin組相比明顯升高，且有顯著性意 義(P < 0. 01)，CCI+Emodin治療組與CCI神經(jīng)病理痛模型組DRGP2X3mRNA的表達(dá)量相比， CCI+Emodin治療組實(shí)驗(yàn)大鼠DRG的P2X3mRNA的表達(dá)顯著性下降(ρ < 0. 01) ；CCI+Emodin 治療組與CCI+Indo組相比實(shí)驗(yàn)大鼠DRG的P2X3mRNA的表達(dá)下降，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ρ
<0. 05)。見(jiàn)圖 6。( 二 )大黃素對(duì)Ρ2Χ3受體介導(dǎo)的三叉神經(jīng)痛作用的研究結(jié)果2. 1. 1三叉神經(jīng)大鼠機(jī)械痛敏測(cè)定用BME-403 Von Frey細(xì)絲測(cè)定機(jī)械縮足反射閾值(mechanical withdrawalthreshold，MWT)。置大鼠于透明的有機(jī)玻璃箱(22X 12X22cm3)中，有機(jī)玻璃 箱底為IXlcm2的鐵絲網(wǎng)。術(shù)后大鼠放置于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，測(cè)試前將大鼠放在有機(jī)玻璃箱中 適應(yīng) 15min。折力分別為 0. 13，0. 20，0. 33，0. 60，1. 30，3. 60，5. 00，7. 30，9. 90,20. lg，折力 ^ 20. Ig時(shí)均記為20. lg。從最小折力開(kāi)始，每根試驗(yàn)10次，直至出現(xiàn)縮足反射次數(shù)大于 5/10，即50%反應(yīng)閾值(即引起10次試驗(yàn)中5次反應(yīng)的值。重復(fù)三次，取其平均值)。每 次刺激間隔時(shí)間至少大于15s，并待刺激引起的反應(yīng)(如舔足、甩腿等)完全消失。術(shù)后第7天神經(jīng)病理通模型基本形成，II組(三叉神經(jīng)痛模型組， TrigeminalNeuralgia, TN)、III組(三叉神經(jīng)痛模型+大黃素處理組；TN+emodin)和IV組 (三叉神經(jīng)痛模型+奈福泮處理組，TN+Nefopam)的機(jī)械刺激閾值較I組(假手術(shù)組對(duì)照 組，sham)和V組(單獨(dú)大黃素處理組，emodin)顯著性下降(ρ < 0.01)，而II組(TN)JII 組(TN+emodin)和IV組(TN+Nefopam)之間相比較無(wú)顯著性差異(ρ > 0. 05)。9d后，II、 III、IV組的機(jī)械刺激閾值仍低于I組和V組(ρ < 0.01)，但I(xiàn)V組(TN+Nefopam)高于II組 (ρ<0·01)?？粝律窠?jīng)被結(jié)扎Ild后，III組與TN組實(shí)驗(yàn)大鼠比較其機(jī)械刺激閾值增大(ρ <0. 05)，與IV組相比無(wú)明顯差異性(P >0. 05)，持續(xù)至術(shù)后15d，TN組大鼠的機(jī)械刺激閾 值維持在低水平，而與TN+emodin組和TN+Nefopam組大鼠比較均存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(ρ
<0. 01)。見(jiàn)圖 7。2. 1. 2免疫組化檢測(cè)大鼠三叉神經(jīng)節(jié)(TG) Ρ2Χ3表達(dá)變化隨機(jī)將SD大鼠(體重200 士 20g)分為I組(假手術(shù)組，Sham)、II組(三叉神經(jīng)痛 模型組，Trigeminal Neuralgia, TN)、III組(三叉神經(jīng)痛模型+大黃素處理組，TN+Emodin)、 IV組(三叉神經(jīng)痛模型+奈福泮處理組，TN+Nefopam)和V組(單獨(dú)大黃素處理對(duì)照組，
10Emodin)。于術(shù)后14d，用免疫組織化學(xué)方法測(cè)定大鼠三叉神經(jīng)節(jié)(TG)P2X3受體的表達(dá)。 免疫組化結(jié)果經(jīng)Hmias-2000高清晰彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)分析，結(jié)果顯示假手術(shù)組、三 叉神經(jīng)痛模型組、大黃素處理三叉神經(jīng)痛模型組、奈福泮處理三叉神經(jīng)痛模型組和單獨(dú) 大黃素處理對(duì)照組的平均光密度值分別為=183. 02 士 23. 30 (Sham), 330. 31 士 68. 27 (TN)、 193. 01 士38. 81 (TN+Emodin) ,316. 92士51. 43 (TN+Nefopam)、191. 86士28. 13 (Emodin)(各組 η = 10)。II (三叉神經(jīng)痛模型組)明顯高于I組(假手術(shù)組)、ΙΙΙ組(三叉神經(jīng)痛模型+ 大黃素處理組)、V組(單獨(dú)大黃素處理對(duì)照組)(ρ < 0. 01)。I、111、V組之間Ρ2Χ3受體 表達(dá)無(wú)顯著性差異(P > 0. 05) ；IV (三叉神經(jīng)痛模型+奈福泮處理組)與I、111、V組之間 Ρ2Χ3受體表達(dá)相比增高(ρ < 0.01)，但其與II組(三叉神經(jīng)痛模型組)比較，DRG的Ρ2Χ3 受體的表達(dá)量下降(P < 0. 05)。見(jiàn)圖8。2.1.3原位雜交檢測(cè)大鼠三叉神經(jīng)節(jié)(TG) Ρ2Χ3的mRNA表達(dá)變化SD大鼠(體重200 士 20g)隨機(jī)分為I組(假手術(shù)組，Sham)、II組(三叉神經(jīng)痛模 型組，Trigeminal Neuralgia, TN)、III組(三叉神經(jīng)痛模型+大黃素處理組，TN+Emodin)、 IV組(三叉神經(jīng)痛模型+奈福泮處理組，TN+Nefopam)和V組(單獨(dú)大黃素處理對(duì)照組， Emodin)。于術(shù)后14d，采用原位雜交方法測(cè)定大鼠三叉神經(jīng)節(jié)(DRG) P2X3受體mRNA的 表達(dá)。原位雜交結(jié)果經(jīng)Hmias-2000高清晰彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)測(cè)定大鼠三叉神經(jīng) 節(jié)(TG)P2X3受體的表達(dá)。結(jié)果顯示各組的平均光密度值分別為83.02士23.30(Sham)、 96. 77 + 9. 11 (TN) ,82. 17 + 9. 95 (TN+Emodin) ,90. 98 + 20. 09 (TN+Nefopam)、 79. 71 士 14. 09 (Emodin)(各組η = 10)。II組(三叉神經(jīng)痛模型組)明顯高于I組(假手術(shù) 組)、ΙΙΙ組(三叉神經(jīng)痛模型+大黃素處理組)、V組(單獨(dú)大黃素處理對(duì)照組)(ρ < 0. 01)。 I、111、乂組之間卩2\受體表達(dá)無(wú)顯著性差異(ρ >0.05) ；IV (三叉神經(jīng)痛模型+奈福泮處 理組)與I、111、乂組之間？2&受體表達(dá)相比增高(P <0.01)，但其與II組(三叉神經(jīng)痛模 型組)比較，DRG的Ρ2Χ3受體的表達(dá)量下降(ρ < 0. 05)。見(jiàn)圖9。2. 1. 4蛋白印跡檢測(cè)大鼠三叉神經(jīng)節(jié)(TG)Ρ2Χ3蛋白表達(dá)變化SD大鼠(體重200 士 20g)隨機(jī)分為I組(假手術(shù)組，Sham)、II組(三叉神經(jīng)痛模 型組，Trigeminal Neuralgia, TN)、III組(三叉神經(jīng)痛模型+大黃素處理組，TN+Emodin)、 IV組(三叉神經(jīng)痛模型+奈福泮處理組，TN+Nefopam)和V組(單獨(dú)大黃素處理對(duì)照組， Emodin)。于術(shù)后14d，采用蛋白印跡檢測(cè)大鼠三叉神經(jīng)節(jié)(TG)P2X3蛋白表達(dá)變化。結(jié)果通過(guò)Alpha Imager 2200圖像分析軟件讀取目的條帶在X光膠片上測(cè)得的 光密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標(biāo)化其相應(yīng)組蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯 示，假手術(shù)組(Sham)、三叉神經(jīng)痛模型組(Trigeminal Neuralgia, TN)、三叉神經(jīng)痛模型 +大黃素處理組(TN+Emodin)、三叉神經(jīng)痛模型+奈福泮處理組(TN+Nefopam)和單獨(dú)大 黃素處理對(duì)照組(Emodin)的P2X3的蛋白表達(dá)量(經(jīng)對(duì)應(yīng)的β-actin標(biāo)化后)分別為 0. 79 士 0. 08 (Sham)、0. 97 士 0. 02 (TN)。0. 81 士 0. 06 (TN+Emodin)，0. 89 士 0. 03 (TN+Nefopam)、 0.72 士0.05 (Emodin)。II組(三叉神經(jīng)痛模型組)明顯高于I組(假手術(shù)組)、III組(三叉 神經(jīng)痛模型+大黃素處理組)、V組(單獨(dú)大黃素處理對(duì)照組)(ρ < 0. 01)。I、111、V組之 間Ρ2Χ3受體表達(dá)無(wú)顯著性差異(ρ > 0. 05) ；IV (三叉神經(jīng)痛模型+奈福泮處理組)與I、 III、V組之間Ρ2Χ3受體表達(dá)相比增高(ρ<0.05)，但其與II組(三叉神經(jīng)痛模型組)比較，
11DRG的P2X3受體的表達(dá)量下降(ρ < 0. 05)。見(jiàn)圖10。 2.1. 5RT-PCR檢測(cè)大鼠三叉神經(jīng)節(jié)(TG) P2X3的mRNA表達(dá)變化隨機(jī)將SD大鼠(體重200 士 20g)分為I組(假手術(shù)組，Sham)、II組(三叉神經(jīng)痛 模型組，Trigeminal Neuralgia, TN)、III組(三叉神經(jīng)痛模型+大黃素處理組，TN+Emodin)、 IV組(三叉神經(jīng)痛模型+奈福泮處理組，TN+Nefopam)和V組(單獨(dú)大黃素處理對(duì)照組， Emodin)。引物設(shè)計(jì)選用β -actin作為內(nèi)參，引物序列如下Primer P2X3(產(chǎn)物長(zhǎng)度為 519bp)S 5， -CAACTTCAGGTTTGCCAAA-3‘A 5， -TGAACAGTGAGGGCCTAGAT-3，Primer β-actin (產(chǎn)物長(zhǎng)度為 240bp)S 5’ -TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’A 5’ -CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’于術(shù)后14d，用RT-PCR法檢測(cè)結(jié)扎側(cè)TG P2X3mRNA的表達(dá)，采用凝膠成像分 析系統(tǒng)讀取目的電泳條帶的斑點(diǎn)密度(平均光密度)掃描值，將P2X3條帶與其對(duì)應(yīng) 的β -actin條帶的比值作為P2X3mRNA表達(dá)的相對(duì)量。結(jié)果顯示，假手術(shù)組(Sham)、 三叉神經(jīng)痛模型組(Trigeminal Neuralgia, TN)、三叉神經(jīng)痛模型+大黃素處理組 (TN+Emodin)、三叉神經(jīng)痛模型+奈福泮處理組(TN+Nefopam)和單獨(dú)大黃素處理對(duì)照 組(Emodin)的大鼠TG的P2X3mRNA表達(dá)相對(duì)量(經(jīng)對(duì)應(yīng)的β -actin標(biāo)化后)分別為 0. 89 士0. 08 (Sham) U. 03 士0. 03 (TN)、0· 86 士 0. 02 (TN+Emodin)、0· 95 士0· 01 (TN+Nefopam)、
0.84士0.07(Emodin)(各組η = 5)。II組(三叉神經(jīng)痛模型組)明顯高于I組(假手術(shù) 組)、ΙΙΙ組(三叉神經(jīng)痛模型+大黃素處理組)、V組(單獨(dú)大黃素處理對(duì)照組)(ρ < 0. 01)。
1、111、乂組之間卩2\受體表達(dá)無(wú)顯著性差異(ρ>0.05) ；IV (三叉神經(jīng)痛模型+奈福泮處 理組)與I、111、乂組之間？2&受體表達(dá)相比增高(P <0.01)，但其與II組(三叉神經(jīng)痛模 型組)比較，DRG的Ρ2Χ3受體的表達(dá)量下降(ρ < 0. 05)。見(jiàn)圖11。申請(qǐng)人:實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)用大黃素可減輕神經(jīng)病理痛大鼠的痛行為反應(yīng)。根 據(jù)大黃素減小神經(jīng)病理痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞和三叉神經(jīng)痛大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì) 胞Ρ2Χ3受體mRNA和蛋白的表達(dá)，表明大黃素減輕疼痛的作用機(jī)理是阻斷P2X3受體介導(dǎo)的 疼痛信息傳遞，具有防治疼痛的作用。此外，由于Ρ2Χ3·呤受體涉及神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病的 發(fā)病，大黃素可能通過(guò)影響Ρ2Χ3受體介導(dǎo)的神經(jīng)信號(hào)傳遞對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病產(chǎn)生防治作用。實(shí)施例1 用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于神經(jīng)病理痛治療的口服、注射或局部應(yīng)用 (如局敷)的大黃素制劑。與非留體類抗炎鎮(zhèn)痛藥消炎痛處理組大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比表明 大黃素是作用于Ρ2Χ3受體產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)。相對(duì)于阿片類等鎮(zhèn)痛藥物的副作用大、易產(chǎn)生藥 物耐受與依賴以及戒斷綜合征，消炎痛等抗炎鎮(zhèn)痛藥毒副作用大等不足之處，大黃素作為 中藥有效成份毒副作用小，更利于其作為鎮(zhèn)痛藥物的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。實(shí)施例2 大黃素抑制大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞Ρ2Χ3受體mRNA和蛋白的表達(dá)，影響三叉神 經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞介導(dǎo)的疼痛。用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，可制成適用于三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞介導(dǎo)疼痛治療的口服、注射或局部應(yīng)用(如局敷)的大黃素制劑。實(shí)施例3 用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于涉及P2X3受體介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的口 服、注射或局部應(yīng)用(如局敷)的大黃素制劑。消炎痛及奈福泮可明顯減輕大鼠的痛敏反 應(yīng)，但消炎痛及奈福泮對(duì)CCI神經(jīng)病理痛模型大鼠及三叉神經(jīng)痛大鼠背根初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)細(xì) 胞和三叉神經(jīng)初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞P2X3受體表達(dá)的影響低于大黃素處理組，顯示大黃素的鎮(zhèn) 痛作用機(jī)理與消炎痛及奈福泮不同，大黃素可通過(guò)降低P2X3受體表達(dá)產(chǎn)生作用，進(jìn)而表明 大黃素可能成為P2X3受體介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)疾病防治的藥物。
權(quán)利要求
單獨(dú)用大黃素在制備用于治療涉及P2X3受體介導(dǎo)的慢性痛的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述慢性痛為神經(jīng)病理痛。
3.大黃素在制備用于治療涉及三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞P2X3受體介導(dǎo)疼痛的藥物中的應(yīng)用。
4.大黃素在制備治療涉及P2X3受體介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病防治藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及大黃素在制藥領(lǐng)域中的新用途，即大黃素在制備P2X3介導(dǎo)疼痛/神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)觀察到大黃素可抑制痛覺(jué)行為反應(yīng)，進(jìn)而應(yīng)用免疫組化、原位雜交、RT-PCR及蛋白印跡等技術(shù)觀察到大黃素可抑制神經(jīng)病理痛模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)及三叉神經(jīng)痛模型大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞P2X3受體的mRNA和蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)大黃素對(duì)慢性痛(神經(jīng)病理痛)和三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞傳遞的疼痛具有抑制作用的機(jī)理是阻斷初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞P2X3受體介導(dǎo)的痛覺(jué)信息傳遞。本發(fā)明為神經(jīng)病理性疼痛及/或三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞介導(dǎo)疼痛防治探明新方法，同時(shí)還表明大黃素具有影響神經(jīng)細(xì)胞P2X3受體的作用，這將有助于P2X3受體所涉及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物防治應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P25/00GK101879151SQ20101022801
公開(kāi)日2010年11月10日 申請(qǐng)日期2010年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月15日
發(fā)明者劉雙梅, 劉晗, 徐昌水, 李桂林, 梁尚棟, 高云 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)