專利名稱：人類ctrp4基因、其編碼的蛋白質及它們的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種人類新基因CTRP4及其所編碼的CTRP4蛋白質，本發(fā)明也涉及了該基因和蛋白質的拈抗劑在制備抑制NF-K B和/或IL6-STAT3通路的活性的藥物中的應用，該基因的激動劑及該蛋白質在制備促進造血的藥物中以及在制備上調GP 130分子的藥物中的應用。
背景技術：
現(xiàn)在的研究已知正常細胞維持其生理功能與表型需要平衡自身免疫反應與抗炎應答兩個生理過程，并且要有嚴格的監(jiān)控機制以維持這個平衡。時間過長和強度過大的炎癥反應會直接導致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。另外炎癥反應也是腫瘤細胞遠隔轉移的必經(jīng)過程。 因此，NF-K B與IL6-STAT這兩個關鍵信號通路的活化與腫瘤細胞的最終結局緊密相關。 NF-K B與IL6-STAT通路活化的最常見機制主要是腫瘤細胞周圍的炎癥微環(huán)境提供過量的活化細胞因子，這個微環(huán)境被認為是腫瘤惡性轉化的關鍵因子。由于炎癥反應在腫瘤發(fā)生中的關鍵作用，現(xiàn)在研究表明，干擾或者直接抑制腫瘤相關組織中的炎癥反應是一種新的有效治療方法，其應用前景很大。很多治療項目已進入臨床I期或者臨床II期試驗。鑒于此，我們通過高通量細胞篩選平臺對基因進行了篩選，期望篩選到能夠成為藥物靶點或直接作為治療藥物(基因藥物或蛋白質藥物)的新基因及其蛋白質。人類CTRP4基因(NCBI數(shù)據(jù)庫中匪031909)是我們的候選基因之一，其定位于人類染色體llpll，mRNA序列全長1436bp，由兩個外顯子組成。完整的⑶S編碼3 個氨基酸(NCBI數(shù)據(jù)庫中NP 114115)，其預測的分子量為35. ^KD,理論PI值為8. 38。目前未見對該基因以及其所編碼蛋白質進行研究的報道。CTRP4的空間結構和功能域同其他CTRP成員相比，具有一些明顯的特殊性，可將其歸納為如下幾點第一，CTRP4具有兩個典型的C Iq結構域而CTRPs其他成員卻只具有一個Clq結構域。第二，相對CTRI^s其他成員，CTRP4沒有膠原樣重復序列結構。CTRP4蛋白的這些結構特點提示其可能具有與CTRPs其他成員不一樣的生理功能。除了背景技術中所提及的CTRP4基因和蛋白質為現(xiàn)有技術所公開記載的基因和蛋白質外，本申請文件中其它部分提及的CTRP4基因和蛋白質若無特別說明，均為本發(fā)明尋求保護的CTRP4基因(SEQ ID NO. 1)和蛋白質(SEQ ID NO. :2)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的CTRP4基因，CTRP4蛋白質及它們在制備藥物中的應用。為了達到上述目的，本發(fā)明提供了如下技術方案本發(fā)明提供了一種CTRP4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。該CTRP4基因是編碼CTRP4分泌蛋白質的基因。
本發(fā)明提供了 CTRP4基因的拮抗劑在制備抑制NF-K B和/或IL6-STAT3通路的活性的藥物中的應用。其中所述的拮抗劑是針對CTRP4基因所轉錄的mRNA的siRNA分子或者反義RNA。本發(fā)明也提供了 CTRP4基因的激動劑在制備促進造血的藥物中的應用。本發(fā)明也提供了 CTRP4基因的激動劑在制備上調GP130分子的藥物中的應用。進一步地，本發(fā)明提供了一種CTRP4蛋白質，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本發(fā)明也提供了 CTRP4蛋白質的拮抗劑在制備抑制NF-K B和/或IL6-STAT3通路的活性的藥物中的應用。其中所述的拮抗劑是CTRP4蛋白質的單克隆抗體或多克隆抗體或可溶性受體。用本發(fā)明的CTRP4蛋白質及其片段、類似物或衍生物作為免疫原制備相應的抗體。抗體可以是多克隆或單克隆抗體。可以用雜交瘤技術生產(chǎn)人單克隆抗體。所述制備該單克隆及多克隆抗體技術為本領域已知的技術。本發(fā)明也提供了 CTRP4蛋白質在制備促進造血的藥物中的應用。本發(fā)明也提供了 CTRP4蛋白質在制備上調GP130分子的藥物中的應用。本發(fā)明的有益效果是提供了一種新基因及其蛋白質，其能夠作為藥物靶點或直接作為基因藥物或蛋白質藥物，用于相關疾病的治療。為了更好地理解本發(fā)明，現(xiàn)在結合附圖及具體實施方式
對本發(fā)明進行詳細的說明。需要說明的是，所述的實施例僅僅是示例本發(fā)明的目的，而不應該理解為對本發(fā)明的任何限制。另外本發(fā)明中所使用的實驗方法、實驗試劑、實驗材料等如無特別說明均為本領域普通技術人員所熟知的常規(guī)的實驗方法、實驗試劑、實驗材料。


圖1 是使用CTRP4-MYC融合蛋白過表達細胞的培養(yǎng)上清，檢測CTRP4的分泌情況，箭頭所示為使用抗MYC抗體對其進行免疫印記分析。圖2 是在H印G2細胞中，劑量依賴的過表達CTRP4-MYC融合質粒，檢測細胞中IL6 的轉錄強度的變化。同時，使用免疫印記技術，對過表達效率進行了驗證。圖3A、3B 是在HEK293和Hela細胞中劑量依賴的，采用熒光素酶報告基因技術， 檢測細胞中NF-K B的活化情況。圖4是使用EMSA技術，在過表達CTRP4-MYC融合質粒的!fepG2細胞中，檢測NF-K B 轉錄元件P65與相應DNA序列結合的能力。圖5A、5B、5C是分別使用過表達上清，劑量梯度的過表達上清以及不同稀釋度的過表達上清，處理正常的HepG2細胞，相應時間點后，檢測其中的IL6的轉錄水平。圖5D是通過PAGE凝膠電泳的方法，檢測原核誘導表達的CTRP4重組蛋白的純度和濃度。圖5E是通過RT-PCR實驗表明CTRP4原核蛋白對于IL6-STAT3全部信號通路成員 (GP130, JAK2、STAT3、CyclinDl)都具有明顯的上調作用。圖6A、6B、6C是通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，檢測CTRP4重組原核蛋白處理不同時間點(6/12/18h)后，細胞培養(yǎng)上清中，IL6的濃度水平。橫坐標表示不同的CTRP4原核蛋白濃度，縱坐標表示培養(yǎng)上清中IL6的濃度。圖7A、7B是采用不同濃度的CTRP4重組原核蛋白處理H印G2細胞，檢測相應濃度下IL6的表達水平，并對得到的條帶進行灰度值定量分析。圖7B中的χ軸表示不同的重組蛋白處理濃度，y軸表示通過IMAGE j軟件進行測量得到的灰度值。圖8A、8B是使用4ng/ml的CTRP4重組原核蛋白以不同時間處理H印G2細胞，并檢測相應處理時間點下的IL6表達水平，并對相應條帶進行灰度分析。圖8B中的χ軸表示不同的重組蛋白處理濃度，y軸表示通過IMAGEj軟件進行測量得到的灰度值。圖9A 是以不同劑量的IL6處理H印G2細胞，檢測CTRP4內源性的轉錄水平的變化。圖9B 是在k-RAS_V12穩(wěn)定轉染的Η ^9細胞株及陰性對照細胞株中，檢測CTRP4 內源性的轉錄水平的變化。
具體實施例方式本發(fā)明中所用的材料和實驗方法如下I.材料電穿孔儀(美國BTX公司)；GS-15R Beckman離心機(美國Beckman公司)；Robocycler (Stratagene Inc.)、ABI 9700、2400、2700PCR 擴增儀；垂直板蛋白電泳裝置(美國Bio-Rad公司)；蛋白質電轉移裝置(美國Bio-Rad公司)；EL-311SX ELISAReader (美國 Bio-ΤΕΚ 公司)；恒溫搖床 Gyrotory Water Bath Shaker. G76. (NewBrunswick Scientific Co.Inc.) ；C02 培養(yǎng)箱 AUTO FLOW C02ffater-Jacketed Incubator (NUAIRE 公司，U. S. A.) ；Heto Cell House C02 細胞培養(yǎng)箱；Odyssey Imaging System(LI-COR BIOSCIENCE INC.公司)；HZQ-Z全溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；GENE Snap凝膠成像系統(tǒng)，日本Olympus公司。II.實驗方法1. RT-PCR Hela 細胞系(商購)總 m_RNA 的提取，采用 TRIZOL (Invitrogen，USA) RNA 提取試劑，將已經(jīng)溶解了細胞的Iml樣品溶液，使用0. 2ml的三氯甲烷萃取，4°C離心 15min(12000g)，取上清中的無色透明溶液，并將其轉移至另一個EP管中，向該管中加入 0. 5ml的異丙醇，沉淀RNA，室溫孵育樣品lOmin，并離心收集沉淀(12000g，4°C，15min)棄去上清，將得到的沉淀用75%的DEPC水乙醇溶液清洗一次，以徹底洗脫沉淀中的無機鹽離子。并將洗鹽后的沉淀RNA溶于DEPC-水中，并準確定量得到的RNA沉淀。取等量的RNA 作為模板，用于逆轉錄。逆轉錄反應使用RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit第一鏈合成試劑盒O^ermentas，Canada)，將反轉錄過程中使用的各個組分配如體系中，每個樣品使用3ug樣品作為反轉錄模板，反應轉錄過程45°C 1小時，70°C 5分鐘，即合成出相應細胞系的cDNA文庫。文庫合成完成后，使用相應的引物對文庫進行特異性擴增，進行相應細胞系的表達豐度檢測，在進行檢測時，使用GAPDH作為內參，以保證各實驗組cDNA含量一
致。使用的引物序列列表如下
權利要求
1.一種CTRP4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.如權利要求1所述的CTRP4基因的拮抗劑在制備抑制NF-κ B和/或IL6-STAT3通路的活性的藥物中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其中所述的拮抗劑是針對CTRP4基因所轉錄的mRNA的 siRNA分子或者反義RNA。
4.如權利要求1所述的CTRP4基因的激動劑在制備促進造血的藥物中的應用。
5.如權利要求1所述的CTRP4基因的激動劑在制備上調GP130分子的藥物中的應用。
6.一種CTRP4蛋白質，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
7.如權利要求6所述的CTRP4蛋白質的拮抗劑在制備抑制NF-κ B和/或IL6-STAT3 通路的活性的藥物中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其中所述的拮抗劑是CTRP4蛋白質的單克隆抗體或多克隆抗體或可溶性受體。
9.如權利要求6所述的CTRP4蛋白質在制備促進造血的藥物中的應用。
10.如權利要求6所述的CTRP4蛋白質在制備上調GP130分子的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的人類基因CTRP4及其所編碼的CTRP4蛋白質，本發(fā)明也涉及了該基因和蛋白質的拮抗劑在制備抑制NF-κB和/或IL6-STAT3通路的活性的藥物中的應用，該基因的激動劑及該蛋白質在制備促進造血的藥物中以及在制備上調GP130分子的藥物中的應用。
文檔編號A61P7/06GK102337268SQ20101022876
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月16日 優(yōu)先權日2010年7月16日
發(fā)明者李琦, 王蘭蘭, 王露, 譚偉峰, 馬大龍 申請人:北京大學