專利名稱：甘草次酸修飾脂質(zhì)、肝靶向脂質(zhì)體、膠束及復(fù)合物和制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及甘草次酸修飾脂質(zhì)、肝靶向脂質(zhì)體、膠束及復(fù)合物和制法。
背景技術(shù)：
目前，肝癌、肝炎等肝臟疾病仍是危害人類健康的重大疾病之一。廣大科研工作這已經(jīng)做了大量的工作，但是仍然防治效果不甚理想，肝臟疾病依然是目前醫(yī)藥領(lǐng)域面對的強力挑戰(zhàn)之一。肝炎治療主要是采用兩種或兩種以上抗病毒藥物聯(lián)合治療，由于難治性肝炎病人多處于免疫耐受狀態(tài)，單用一種藥物療效比較差，聯(lián)合抗病療法就根據(jù)藥物成分不同、作用病位點不同來選擇不同藥物，使藥物在不同位點同時發(fā)揮藥效。又有采集人體自身免疫細(xì)胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)，使其數(shù)量成千倍增多，靶向性殺傷功能增強，然后再回輸?shù)饺梭w來殺滅血液及組織中的病原體、癌細(xì)胞、突變的細(xì)胞，打破免疫耐受，激活和增強機體的免疫能力， 兼顧治療和保健的雙重功效。這種肝炎的治療方法源于依靠重建自身免疫能力徹底消除病的科研思路即以肝炎病的抗原蛋白為主體，加上多種細(xì)胞因子作為佐劑，激發(fā)重建患者體內(nèi)抗病免疫能力，達(dá)到清除病的目的。然而這些方法的治療效果仍然不是很好，主要原因之一就是藥物沒有靶向性，因此構(gòu)建肝靶向的新型給藥系統(tǒng)，有望提高肝炎的治療效果。肝癌治療目前仍以手術(shù)切除為主，但臨床實踐顯示，大多數(shù)患者無手術(shù)適應(yīng)征，全肝癌切除手術(shù)患者比例不到肝癌總例數(shù)的10% ；且大肝癌根治性切除后5年復(fù)發(fā)率高達(dá) 80%以上，小肝癌切除后5年復(fù)發(fā)率也高達(dá)40% 60%。因此，對于無法手術(shù)的患者或者手術(shù)后復(fù)發(fā)患者，局部治療和化療發(fā)揮著重要作用。目前全身化療和化療相關(guān)治療如肝動脈灌注化療(TAI)應(yīng)用較多，但現(xiàn)在臨床上治療肝癌的藥物沒有一個是對肝癌特別有效的。 一線藥物阿霉素是單劑化療療效最高的，反應(yīng)率僅為15% 20%，聯(lián)合化療反應(yīng)率也不超過35% ；而用紫杉醇、氟達(dá)拉賓等藥物進行全身化療時的反應(yīng)率幾乎為零。近年來，抗肝癌新藥研究報道頗多，但進展不大。因此，開發(fā)肝靶向的新型給藥系統(tǒng)，增加藥物的肝臟分布和提高肝靶向性有望提高肝癌的治療效果。脂質(zhì)體和膠束作為藥物載體已經(jīng)顯示了較好的應(yīng)用前景，其組成的脂質(zhì)材料具有生物可降解性，毒性小等特點，還可緩釋藥物，延長藥物作用時間；靜脈給藥后可由肝臟 Kuppfer細(xì)胞攝取而被動靶向于肝，使藥物達(dá)到肝器官的目的。但是普通脂質(zhì)體容易被調(diào)理素識別，被肝臟以外的其他單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬，存在選擇性差，靶向效率低的問題。Negishi等在證實了離體大鼠肝細(xì)胞勻漿的細(xì)胞膜組分中含有多量甘草次酸 (Glycyrrhetinic Acid,GA)特異結(jié)合位點，在所有臟器組織中，肝臟的GA結(jié)合位點活性最高。GA與該位點的結(jié)合呈可飽和性、高度特異性，且該位點具蛋白質(zhì)性質(zhì)。國內(nèi)也有學(xué)者用透射電鏡進行觀察，證實了肝細(xì)胞表面確存在大量GA受體。現(xiàn)有報道中，僅有毛聲俊等在肝細(xì)胞靶向甘草次酸表面修飾脂質(zhì)體的制備[中國中藥雜志，2003年4月第觀卷第4期，3觀-331]以及毛聲俊在2007年ft·印aration，characterizationand uptake by primary cultured rat hepatocytes of liposomes surface-modified with glycyrrhetinicacid. Pharmazie,[ORIGINAL ARTICLES,2007 年， 62卷第8期614-619]中公開了一種甘草次酸表面修飾脂質(zhì)體，它是將GA與硬脂醇、琥珀酸酐偶聯(lián)，合成一新型兩親性導(dǎo)向分子，將其摻入脂質(zhì)體中，介導(dǎo)該修飾脂質(zhì)體與肝細(xì)胞表面的GA受體特異結(jié)合，以期達(dá)到肝細(xì)胞主動靶向作用。該甘草次酸表面修飾脂質(zhì)體簡稱 LP-SM-GA。制得的甘草次酸修飾的脂質(zhì)體平均粒徑在65 79nm之間，甘草次酸修飾脂質(zhì)的摩爾含量最高為10%。由于甘草次酸是一中藥單體成分，將其作為肝靶向配體，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)采用上述兩篇文獻公開的方法制備的甘草次酸修飾的脂質(zhì)體尚存在以下不足之處1、文獻中記載的肝靶向配體甘草次酸是與硬脂醇、琥珀酸酐偶聯(lián)，合成了一新型兩親性導(dǎo)向分子，然后將其摻入脂質(zhì)體中。由于在脂質(zhì)體引入了硬脂醇，其生物相容性難以保證。2、文獻中記載的甘草次酸修飾的脂質(zhì)體容易被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬，難以較多量到達(dá)肝實質(zhì)細(xì)胞，無法作為治療基于肝實質(zhì)細(xì)胞疾病藥物的優(yōu)良載體。3、文獻中記載的甘草次酸修飾的脂質(zhì)體中，導(dǎo)向分子摻入的摩爾含量最高為 10 %，進一步增加摻入比例，所得脂質(zhì)體為白色混濁液，短時間內(nèi)即出現(xiàn)大量絮狀沉淀物， 無法制得穩(wěn)定的具有較高甘草次酸靶向配體含量的脂質(zhì)體。4、甘草次酸表面修飾的脂質(zhì)體平均粒徑在65 79nm之間，粒徑范圍較窄，難于滿足不同肝臟疾病對粒徑的需求。5、文獻中記載的甘草次酸表面修飾的脂質(zhì)體，處方中所用磷脂為大豆磷脂，采用注入法制備，無法滿足不同性質(zhì)藥物如親水性藥物、基因蛋白等大分子藥物的高效包載。不能高效包載基因蛋白等大分子藥物的主要原因是基因蛋白等大分子等常帶有正電荷，大豆磷脂為中性磷脂，無法通過靜電吸附作用實現(xiàn)高效包載；此外，注入法這個制備方法包載親水性藥物、基因蛋白等大分子藥物的包封率本身就比較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明第一個目的是提供一種全新的甘草次酸修飾脂質(zhì)，它是甘草次酸作為肝靶向介導(dǎo)物質(zhì)，該甘草次酸修飾脂質(zhì)作為脂質(zhì)體或膠束的膜材應(yīng)用，使得由其制備的脂質(zhì)體或膠束具有肝靶向性。本發(fā)明甘草次酸修飾脂質(zhì)是以甘草次酸與磷脂或膽固醇為原料，在含有縮合劑的溶劑中反應(yīng)而得。具體地，本發(fā)明甘草次酸修飾脂質(zhì)是將甘草次酸、磷脂或膽固醇、與縮合劑在溶劑中混合反應(yīng)后，濃縮，柱層析或高效液相色譜純化即得。其中，甘草次酸與磷脂或膽固醇的反應(yīng)關(guān)系摩爾比為1 1;縮合劑與反應(yīng)物料 (即原料總量)的反應(yīng)關(guān)系為摩爾比為1 1-1 5。添加的催化劑為DMAP，其用量與反應(yīng)物料甘草次酸的反應(yīng)關(guān)系為摩爾比是1 1。制備過程中優(yōu)選分別將甘草次酸、磷脂或膽固醇與縮合劑配制成溶液后進行反應(yīng)。進一步地，為了使甘草次酸修飾脂質(zhì)制備得到束和脂質(zhì)體能夠到達(dá)肝實質(zhì)細(xì)胞， 發(fā)明人在本發(fā)明甘草次酸修飾脂質(zhì)中引入了親水基團聚乙二醇，使甘草次酸修飾脂質(zhì)及其制備而得的相應(yīng)膠束和脂質(zhì)體具有隱形的特性，避免單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬，使所載藥物更多的到達(dá)肝實質(zhì)細(xì)胞，達(dá)到治療目的，尤其可作為治療基于肝實質(zhì)細(xì)胞疾病藥物的優(yōu)良載體。引入聚乙二醇制備修飾脂質(zhì)是以甘草次酸、磷脂(或膽固醇)、聚乙二醇為原料，在含有縮合劑的溶劑中反應(yīng)而得。其中，甘草次酸與磷脂(或膽固醇)、聚乙二醇的反應(yīng)關(guān)系摩爾比為1 :1:1; 縮合劑與反應(yīng)物料(即原料總量)的反應(yīng)關(guān)系為摩爾比為1 1-1 5;添加的催化劑為 DMAP，其用量與反應(yīng)物料甘草次酸的反應(yīng)關(guān)系為摩爾比是1 1。本發(fā)明甘草次酸修飾脂質(zhì)可實現(xiàn)高效包載治療藥物，提高藥物肝靶向性和富集濃度，從而起到高效低毒的作用。當(dāng)采用磷脂或膽固醇制備修飾脂質(zhì)時，采用如下方法制備在甘草次酸溶液中，加入磷脂或膽固醇的溶液、縮合劑的溶液，在0_80°C反應(yīng) 2-48小時，冷卻后，濃縮反應(yīng)液，柱層析或高效液相色譜純化，作為甘草次酸修飾脂質(zhì)。采用磷脂(或膽固醇)與聚乙二醇制備修飾脂質(zhì)時，采用如下方法制備甘草次酸溶液中，加入聚乙二醇的溶液、縮合劑的溶液，在0-80°C反應(yīng)2-48小時， 冷卻后，再加入膽固醇與丁二酸酐的溶液、縮合劑的溶液(或再加入磷脂的溶液、縮合劑的溶液)，濃縮反應(yīng)液，柱層析或高效液相色譜純化，作為甘草次酸修飾脂質(zhì)。上述兩種制備方法中，進一步限定的反應(yīng)條件為(1)甘草次酸溶液配制成1-30% (g/100ml)；磷脂、膽固醇、聚乙二醇、縮合劑配制溶液時滿足其溶解于溶劑中即可。甘草次酸溶液、縮合劑的溶液，磷酸或膽固醇的溶液，以及聚乙二醇的溶液均可采用以下溶劑水、乙醚、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正戊烷、正己烷、正庚烷、三氯甲烷、四氫呋喃、二氧六環(huán)、N，N-二甲基甲酰胺，二甲亞砜，N-甲基吡咯烷酮。針對不同的溶質(zhì)，在同一方法中，既可以使用相同的溶劑，也可以使用不同的溶劑系統(tǒng)， 只要不同的溶劑能夠互溶即可。(2)采用的縮合劑為1-乙基-3-(3-二甲氨基異丙基)碳二亞胺(以下簡稱為 EDC)、二環(huán)己基碳二亞胺(以下簡稱為DCC)。(3)柱層析條件為二氯甲烷甲醇=0 100-30 70、石油醚丙酮 =90 10-30 70、石油醚乙酸乙酯=100 0-20 80和正己烷丙酮= 95 5-25 75，采用上述四種溶劑系統(tǒng)中任意一種進行梯度洗脫以獲得修飾脂質(zhì)。如制備甘草次酸修飾膽固醇時，采用石油醚丙酮=90 10-30 70梯度洗脫；或制備甘草次酸修飾磷脂時，采用正己烷丙酮=95 5-25 75梯度洗脫；或制備甘草次酸修飾聚乙二醇化膽固醇時，采用二氯甲烷甲醇=0 100-30 70梯度洗脫；或制備甘草次酸修飾磷脂時，采用正己烷丙酮=95 5-25 75梯度洗脫；或制備甘草次酸修飾聚乙二醇化磷脂時，采用正己烷丙酮=95 5-25 75梯度洗脫。即制備任一種修飾脂質(zhì)時，均可采用上述四種洗脫系統(tǒng)進行梯度洗脫。洗脫時，不同比例洗脫液的流出液都用薄層色譜監(jiān)測，收集薄層色譜上組分Rf值在0. 3 0. 5的流出液，濃縮干燥即得修飾脂質(zhì)。若采用高效液相，其色譜條件為甲醇/乙腈-水系統(tǒng)，檢測器為紫外檢測器， 檢測波長為249nm;具體的流動相條件為甲醇水=50 50-100 0或乙腈水= 50 50-100 0，收集在M9nm處有吸收的流出液，濃縮干燥即得修飾脂質(zhì)。本發(fā)明第二個目的是提供一種由甘草次酸介導(dǎo)的肝靶向脂質(zhì)體載體。
為了探尋制備工藝簡單、工藝穩(wěn)定、質(zhì)量易于控制的肝靶向脂質(zhì)體制備方法，比較考察了多種脂質(zhì)體的制備方法如薄膜法、逆向蒸發(fā)法、注入法、超聲法等多種制備方法，優(yōu)選出薄膜法、逆向蒸發(fā)法和注入法三種方法用于制備肝靶向脂質(zhì)體。然后對每一種方法的工藝參數(shù)進行考察，如有機溶劑種類、用量，藥脂比，甘草次酸修飾脂質(zhì)用量等進行優(yōu)化， 以獲得本發(fā)明中的粒徑、zeta電位穩(wěn)定的肝靶向脂質(zhì)體處方。具體地，它是采用上述方法制備的甘草次酸修飾脂質(zhì)與膽固醇和磷脂制成的脂質(zhì)體，其中，各組分配比關(guān)系如下膽固醇和磷脂的摩爾比為1 1 10，甘草次酸修飾脂質(zhì)的摩爾含量為膽固醇和磷脂的總摩爾數(shù)的0. 5 30%。按照上述組分配比關(guān)系采用薄膜法、逆向蒸發(fā)法和注入法三種方法制備肝靶向脂質(zhì)體，可制備得到粒徑、zeta電位穩(wěn)定的肝靶向脂質(zhì)體，包封率在60% 98%。進一步地，優(yōu)選甘草次酸修飾脂質(zhì)的摩爾含量為膽固醇和磷脂的總摩爾數(shù)的1 25%，制備所得脂質(zhì)體的包封率在70% 98%。磷脂種類很多，可采用制劑領(lǐng)域常用于制備脂質(zhì)體的磷脂類型。具體地，制備肝靶向脂質(zhì)體時采用的磷脂為中性磷脂，負(fù)電荷磷脂或正電荷脂質(zhì)材料。本發(fā)明第三個目的是提供一種由甘草次酸介導(dǎo)的肝靶向膠束載體。具體地，本發(fā)明肝靶向膠束的制備方法是采用混合法、乳化-溶劑揮發(fā)法、自組裝溶劑蒸發(fā)法、薄膜分散法、透析法、熔融法中的任意一種，將磷脂(或膽固醇)與聚乙二醇反應(yīng)制備所得的甘草次酸修飾脂質(zhì)制成肝靶向膠束。該肝靶向膠束因引入了聚乙二醇，優(yōu)點有二 其一，修飾脂質(zhì)中引入親水基團才能形成膠束；其二，可避免單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬，作為肝實質(zhì)細(xì)胞疾病治療藥物的優(yōu)良載體，實現(xiàn)肝病治療藥物在肝實質(zhì)細(xì)胞富集。本發(fā)明第四個目的是提供一種肝靶向脂質(zhì)體復(fù)合物或膠束復(fù)合物，它是以本發(fā)明肝靶向脂質(zhì)體或膠束作為包封層，將基因、蛋白、多肽或小分子藥物中的任意一種包封于肝靶向脂質(zhì)體或膠束中的復(fù)合物。通過甘草次酸實現(xiàn)介導(dǎo)相關(guān)藥物(如小分子肝病治療藥物，大分子肝病防治藥物包括蛋白、多肽和基因)靶向到肝細(xì)胞，降低其對正常組織的毒性，提高藥物的肝病防治效果。


圖1 空白肝靶向脂質(zhì)體或膠束體外抗人肝癌細(xì)胞H印G2活性。圖2 肝靶向空白脂質(zhì)體的粒徑分布圖，size = 96. 29，PDI = 0. 12。圖3 肝靶向載基因脂質(zhì)體復(fù)合物的粒徑分布圖，size = 220. 30，PDI = 0. 11。圖4 肝靶向載槲皮素膠束的粒徑分布圖，size = 127. 20，PDI = 0. 07。圖5 肝靶向空白脂質(zhì)體的zeta電位分布圖zeta電位=50. 41mV。圖6 肝靶向載基因脂質(zhì)體復(fù)合物的zeta電位分布圖zeta電位=30. 27mV。圖7 肝靶向脂質(zhì)體的原子力顯微鏡圖譜。圖8 不同比例甘草次酸修飾的肝靶向脂質(zhì)體的最佳載體/基因質(zhì)量比篩選電泳圖。圖9 不同比例甘草次酸修飾的載基因肝靶向脂質(zhì)體的肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染圖。圖10 肝靶向膠束的透射電鏡圖譜。其中圖9(A)為彩色照相圖，圖9(B)為彩色照相圖應(yīng)用Microsoft Word設(shè)置圖片格式-圖片-圖像控制項，將顏色轉(zhuǎn)換為灰度的轉(zhuǎn)染圖。
具體實施例方式本發(fā)明提供的甘草次酸修飾脂質(zhì)，從功能上與本發(fā)明背景技術(shù)中提及的導(dǎo)向分子作用相同，均是介導(dǎo)由其制成的脂質(zhì)體具有肝靶向性，但是本發(fā)明甘草次酸修飾脂質(zhì)可作為膜材應(yīng)用，而該導(dǎo)向分子中并不是作為膜材使用。本發(fā)明甘草次酸修飾脂質(zhì)是它是以甘草次酸與磷脂或膽固醇為原料，在含有縮合劑的溶劑中反應(yīng)而得。應(yīng)用磷脂和膽固醇在治療效果上差異不大，但是由于磷脂成本較低， 所以優(yōu)選磷脂制備修飾脂質(zhì)。為了使甘草次酸修飾脂質(zhì)制備得到束和脂質(zhì)體能夠到達(dá)肝實質(zhì)細(xì)胞，在修飾脂質(zhì)中引入親水基團聚乙二醇。具體制備方法可參見以下四個制備實施例實施例1甘草次酸修飾膽固醇的制備稱取5g甘草次酸置于500mL圓底燒瓶中，向瓶內(nèi)加入250mL 二氯甲烷，磁力攪拌溶解。再向瓶內(nèi)加入2. 5gEDC，磁力攪拌至溶解后，加入4g膽固醇，繼續(xù)攪拌，室溫反應(yīng)12 小時。有機層分別用lmol/L的HCl溶液，飽和碳酸氫鈉溶液和飽和NaCl溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥后減壓，濃縮除去有機溶劑。所得固體柱層析(石油醚丙酮=90 10-30 70 梯度洗脫)后得到淡黃色固體7. 4g (產(chǎn)率82. 6% )。上述固體也可以采用高效液相純化，其色譜條件為甲醇/乙腈-水系統(tǒng)，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為249nm;具體的流動相條件為甲醇水=50 50-100 0或乙腈水=50 50-100 0，收集在M9nm處有吸收的流出液，濃縮干燥即得修飾脂質(zhì)。實施例2甘草次酸修飾磷脂的制備稱取Ig甘草次酸置于250mL圓底燒瓶中，向瓶內(nèi)加入IOOmL 二氯甲烷，磁力攪拌溶解。再向瓶內(nèi)加入0. 5gEDC，磁力攪拌至溶解后，冰水浴冷卻，加入0. 4g 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(以下簡稱DSPE)，繼續(xù)攪拌至完全溶解，保持冰水浴冷卻，避光反應(yīng)對小時。有機層分別用lmol/L的HCl溶液，飽和碳酸氫鈉溶液和飽和NaCl溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥后， 減壓濃縮除去有機溶劑。所得固體柱層析(正己烷丙酮=95 5-25 75梯度洗脫) 后得到白色固體0. 5g (產(chǎn)率76.8% )。上述固體也可以采用高效液相純化，其色譜條件為甲醇/乙腈-水系統(tǒng)，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為249nm;具體的流動相條件為甲醇水=50 50-100 0或乙腈水=50 50-100 0，收集在M9nm處有吸收的流出液，濃縮干燥即得修飾脂質(zhì)。實施例3甘草次酸修飾聚乙二醇化膽固醇的制備稱取5g甘草次酸置于500mL圓底燒瓶中，向瓶內(nèi)加入250mL 二氯甲烷，磁力攪拌溶解。再向瓶內(nèi)加入2.5gEDC和0.9g 4-二甲氨基吡啶(以下簡稱DMAP)，磁力攪拌至溶解后，加入18g聚乙二醇2000，繼續(xù)攪拌，室溫反應(yīng)12小時。有機層分別用lmol/L的HCl 溶液，飽和碳酸氫鈉溶液和飽和NaCl溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮除去有機溶劑。所得固體柱層析(二氯甲烷甲醇=0 100-30 70梯度洗脫)后得到淺黃色固體 7. Sg。將該固體置于500mL圓底燒瓶中，向瓶內(nèi)加入200mL 二氯甲烷，磁力攪拌溶解。再向瓶內(nèi)加入2g 丁二酸單膽固醇酯，磁力攪拌至溶解后，加入Ig EDC和0. 4g DMAP，繼續(xù)攪拌，室溫反應(yīng)M小時。有機層分別用lmol/L的HCl溶液，飽和碳酸氫鈉溶液和飽和NaCl溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥后，減壓濃縮除去有機溶劑。所得固體柱層析(二氯甲烷甲醇= 0 100-30 70梯度洗脫)后得到淡黃色固體14. 6g(產(chǎn)率9% )。上述固體也可以采用高效液相純化，其色譜條件為甲醇/乙腈-水系統(tǒng)，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為249nm;具體的流動相條件為甲醇水=50 50-100 0或乙腈水=50 50-100 0，收集在M9nm處有吸收的流出液，濃縮干燥即得修飾脂質(zhì)。上述固體也可以采用高效液相純化，其色譜條件為甲醇/乙腈-水系統(tǒng)，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為249nm;具體的流動相條件為甲醇水=50 50-100 0或乙腈水=50 50-100 0，收集在M9nm處有吸收的流出液，濃縮干燥即得修飾脂質(zhì)。實施例4甘草次酸修飾聚乙二醇化磷脂的制備稱取5g甘草次酸置于500mL圓底燒瓶中，向瓶內(nèi)加入250mL 二氯甲烷，磁力攪拌溶解。再向瓶內(nèi)加入2. 5gEDC和0.9g DMAP，磁力攪拌至溶解后，加入18g聚乙二醇2000， 繼續(xù)攪拌，室溫反應(yīng)12小時。有機層分別用lmol/L的HCl溶液，飽和碳酸氫鈉溶液和飽和 NaCl溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥后減壓濃縮除去有機溶劑。所得固體柱層析(二氯甲烷 甲醇=0 100-30 70梯度洗脫)后得到淺黃色固體7. Sg。將該固體置于500mL圓底燒瓶中，向瓶內(nèi)加入200mL 二氯甲烷，磁力攪拌溶解。再向瓶內(nèi)加入Ig 丁二酸酐，磁力攪拌至溶解后，加熱回流反應(yīng)2小時。冷卻后分別用飽和碳酸氫鈉，飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥后，再向溶液中加入4g 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，磁力攪拌至溶解后，加入 1. 2g EDC，繼續(xù)攪拌，室溫反應(yīng)M小時。有機層分別用lmol/L的HCl溶液，飽和碳酸氫鈉溶液和飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥后，減壓濃縮除去有機溶劑。所得固體柱層析 (二氯甲烷甲醇=0 100-30 70梯度洗脫)后得到淡黃色固體13. 2g(產(chǎn)率44.3%)。上述固體也可以采用高效液相純化，其色譜條件為甲醇/乙腈-水系統(tǒng)，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為249nm;具體的流動相條件為甲醇水=50 50-100 0或乙腈水=50 50-100 0，收集在M9nm處有吸收的流出液，濃縮干燥即得修飾脂質(zhì)。本發(fā)明甘草次酸修飾脂質(zhì)的制備過程中，當(dāng)采用甘草次酸與磷脂或膽固醇反應(yīng)時甘草次酸與磷脂或膽固醇的反應(yīng)關(guān)系摩爾比為1 1 ；縮合劑與反應(yīng)物料(即原料總量)的反應(yīng)關(guān)系為摩爾比為1 1-1 5;當(dāng)采用甘草次酸與磷脂(或膽固醇)、聚乙二醇反應(yīng)時甘草次酸與磷脂(或膽固醇)、聚乙二醇的反應(yīng)關(guān)系摩爾比為1 1 1;縮合劑與反應(yīng)物料(即原料總量)的反應(yīng)關(guān)系為摩爾比為1 1-1 5。若應(yīng)用催化劑DMAP，其用量與反應(yīng)物料甘草次酸的反應(yīng)關(guān)系為摩爾比是1 1。本發(fā)明甘草次酸修飾脂質(zhì)制成的脂質(zhì)體或膠束可克服“肝細(xì)胞靶向甘草次酸表面修飾月旨質(zhì)體的制備，，禾口 “Pr印aration，characterization and uptake by primary cultured rat hepatocytes ofliposomes surface-modified with glycyrrhetinic acid. Pharmazie"公開的甘草次酸修飾脂質(zhì)體的不足，具體表現(xiàn)如下其一，本發(fā)明制備的肝靶向脂質(zhì)體或膠束具有良好的生物相容性和生物可降解性。所使用的材料為磷脂、膽固醇、聚乙二醇和甘草次酸，其中，磷脂和膽固醇為人體細(xì)胞膜的組成成分，具有較好的生物相容性；聚乙二醇是可以生物降解的；制備的肝靶向脂質(zhì)均采用酯鍵連接，可降解為相應(yīng)的單體成分，因此整個載體系統(tǒng)具有良好的生物相容性和生物可降解性。
其二，本發(fā)明制備的肝靶向脂質(zhì)體或膠束使用的肝靶向物質(zhì)甘草次酸本身就具有抗肝癌和治療肝炎的活性，因此制備的肝靶向脂質(zhì)體或膠束也具有抗肝癌和治療肝炎的活性，包裝治療藥物以后，具有協(xié)同抗癌作用?？瞻赘伟邢蛑|(zhì)體或膠束體外抗人肝癌細(xì)胞 H印G2活性見圖1。其三，本發(fā)明制備了引入親水基團聚乙二醇的肝靶向脂質(zhì)，制得的相應(yīng)膠束和脂質(zhì)體具有隱形的特性，可避免單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬，可以較多量的到達(dá)肝實質(zhì)細(xì)胞，可作為那些基于肝實質(zhì)細(xì)胞的疾病治療的優(yōu)良載體。其四，本發(fā)明制備的肝靶向脂質(zhì)體的肝靶向物質(zhì)甘草次酸修飾密度范圍為0. 5 30%，甘草次酸修飾脂質(zhì)的用量在0. 5 30%范圍內(nèi)可調(diào)，均可制得粒徑大小適宜，穩(wěn)定性好的脂質(zhì)體，可滿足不同肝臟疾病治療對肝靶向物質(zhì)甘草次酸修飾密度的需求。其五，本發(fā)明制備的載小分子藥物的肝靶向脂質(zhì)體粒徑為82 157nm，載單一大分子藥物或大分子藥物/小分子藥物復(fù)方的肝靶向脂質(zhì)體粒徑為U8-256nm，載小分子藥物的肝靶向膠束粒徑為55 193nm，載單一大分子藥物或大分子藥物/小分子藥物復(fù)方的肝靶向膠束粒徑為97-298nm。粒徑范圍較大，調(diào)節(jié)制備工藝參數(shù)即可獲得不同粒徑的脂質(zhì)體或者膠束，可滿足不同肝臟疾病對粒徑的需求，適用范圍廣。其六，本發(fā)明制備的肝靶向脂質(zhì)體或膠束可包載基因、蛋白、多肽或小分子藥物中的任意一種或多種，適用范圍廣，可解決單一制劑實現(xiàn)肝臟疾病治療的聯(lián)合用藥問題。本發(fā)明提供的由甘草次酸介導(dǎo)的肝靶向脂質(zhì)體載體，它是由本發(fā)明甘草次酸修飾脂質(zhì)與膽固醇和磷脂制成，其中，各組分配比關(guān)系如下膽固醇和磷脂的摩爾比為1 1 10，甘草次酸修飾脂質(zhì)的摩爾含量為膽固醇和磷脂的總摩爾數(shù)的0. 5 30%。進一步優(yōu)選， 甘草次酸修飾脂質(zhì)的摩爾含量為膽固醇和磷脂的總摩爾數(shù)的1 25%。為了探尋制備工藝簡單、工藝穩(wěn)定、質(zhì)量易于控制的肝靶向脂質(zhì)體制備方法，比較考察了多種脂質(zhì)體的制備方法如薄膜法、逆向蒸發(fā)法、注入法、超聲法等多種制備方法，優(yōu)選出薄膜法、逆向蒸發(fā)法和注入法三種方法用于制備肝靶向脂質(zhì)體。然后對每一種方法的工藝參數(shù)進行考察，如有機溶劑種類、用量，藥脂比，甘草次酸修飾脂質(zhì)用量等進行優(yōu)化， 獲得了本發(fā)明中的粒徑、zeta電位穩(wěn)定的肝靶向脂質(zhì)體配方。具體地，采用薄膜法、逆向蒸發(fā)法和注入法制備肝靶向脂質(zhì)體的步驟如下1、薄膜法1)直接制備法a、稱取甘草次酸修飾脂質(zhì)、膽固醇和磷脂適量置于旋蒸瓶中，加入氯仿、乙醚或氯仿-甲醇復(fù)合溶劑使之完全溶解；b、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得脂質(zhì)體膜，干燥；C、在脂質(zhì)體膜中加入葡萄糖溶液、PBS、HEPS或純化水水化得肝靶向空白脂質(zhì)體溶液；d、將基因包括裸基因、載基因的質(zhì)粒載體或病毒載體，正電性蛋白或正電性多肽與肝靶向空白脂質(zhì)體溶液孵育，即得。若制備含有小分子藥物的肝靶向脂質(zhì)體，在a步驟中加入與脂質(zhì)材料共同成膜， 或先溶于c步驟中的水化溶劑中。若制備載非正電性蛋白或多肽的肝靶向脂質(zhì)體，則先將非正電性蛋白或多肽溶于c步驟中的水化溶劑中。2)后插入法a、稱取膽固醇和磷脂適量置于旋蒸瓶中，加入氯仿、乙醚或氯仿-甲醇復(fù)合溶劑使之完全溶解；b、真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得脂質(zhì)體膜，干燥；C、在脂質(zhì)體膜中加入葡萄糖溶液、PBS、HEPS或純化水水化得空白脂質(zhì)體溶液；d、將基因包括裸基因、載基因的質(zhì)粒載體或病毒載體，正電性蛋白或正電性多肽與空白脂質(zhì)體溶液孵育，即得載藥脂質(zhì)體；e、取甘草次酸修飾脂質(zhì)適量與載藥脂質(zhì)體溶液孵育，即得肝靶向載藥脂質(zhì)體。若制備含有小分子藥物的肝靶向脂質(zhì)體，在a步驟中加入與脂質(zhì)材料共同成膜， 或先溶于c步驟中的水化溶劑中。若制備載非正電性蛋白或多肽的肝靶向脂質(zhì)體，則先將非正電性蛋白或多肽溶于 c步驟中的水化溶劑中。2、注入法1)直接制備法a、稱取甘草次酸修飾脂質(zhì)、膽固醇和磷脂適量，乙醚或乙醇使之完全溶解；b、注入葡萄糖溶液、PBS、HEPS或純化水溶液中，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除盡有機溶劑，即得肝靶向空白脂質(zhì)體溶液；C、將基因包括裸基因、載基因的質(zhì)粒載體或病毒載體，正電性蛋白或正電性多肽與肝靶向空白脂質(zhì)體溶液孵育，即得。若制備含有小分子藥物的肝靶向脂質(zhì)體，在a步驟中加入與脂質(zhì)材料共溶解，或先溶于b步驟中的水相溶劑中。若制備載非正電性蛋白或多肽的肝靶向脂質(zhì)體，則先將非正電性蛋白或多肽溶于 b步驟中的水相溶劑中。2)后插入法a、稱取膽固醇和磷脂適量，乙醚或乙醇使之完全溶解；b、注入葡萄糖溶液、PBS、HEPS或純化水溶液中，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除盡有機溶劑，即得空白脂質(zhì)體溶液；C、將基因包括裸基因、載基因的質(zhì)粒載體或病毒載體，正電性蛋白或正電性多肽與空白脂質(zhì)體溶液孵育，即得載藥脂質(zhì)體；d、取甘草次酸修飾脂質(zhì)適量與載藥脂質(zhì)體溶液孵育，即得肝靶向載藥脂質(zhì)體。若制備含有小分子藥物的肝靶向脂質(zhì)體，在a步驟中加入與脂質(zhì)材料共溶解，或先溶于b步驟中的水相溶劑中。若制備載非正電性蛋白或多肽的肝靶向脂質(zhì)體，則先將非正電性蛋白或多肽溶于 b步驟中的水相溶劑中。3、逆向蒸發(fā)法1)直接制備法a、稱取甘草次酸修飾脂質(zhì)、膽固醇和磷脂適量，氯仿或乙醚使之完全溶解；b、加入水溶液，進行短時超聲，直至形成穩(wěn)定的W/0型乳劑；
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C、減壓蒸發(fā)有機溶劑，達(dá)到膠態(tài)后，加入葡萄糖溶液、PBS、HEPS等溶液，旋轉(zhuǎn)使器壁上的凝膠脫落，在減壓下繼續(xù)蒸發(fā)，除盡有機溶劑，即得肝靶向空白脂質(zhì)體溶液；d、將基因包括裸基因、載基因的質(zhì)粒載體或病毒載體，正電性蛋白或正電性多肽與肝靶向空白脂質(zhì)體溶液孵育，即得。若制備含有小分子藥物的肝靶向脂質(zhì)體，在a步驟中加入與脂質(zhì)材料共溶解，或先溶于b步驟中的水溶液中。若制備載基因(包括裸基因、載基因的質(zhì)粒載體或病毒載體)、蛋白或多肽(包括各種電性的蛋白或多肽)的肝靶向脂質(zhì)體，則先將基因、蛋白或多肽溶于b步驟中的水溶液中。2)后插入法a、稱取膽固醇和磷脂適量，氯仿或乙醚使之完全溶解；b、加入水溶液，進行短時超聲，直至形成穩(wěn)定的W/0型乳劑；C、減壓蒸發(fā)有機溶劑，達(dá)到膠態(tài)后，加入葡萄糖溶液、PBS、HEPS等溶液，旋轉(zhuǎn)使器壁上的凝膠脫落，在減壓下繼續(xù)蒸發(fā)，除盡有機溶劑，即得空白脂質(zhì)體溶液；d、將基因包括裸基因、載基因的質(zhì)粒載體或病毒載體，正電性蛋白或正電性多肽與空白脂質(zhì)體溶液孵育，即得載藥脂質(zhì)體；e、取甘草次酸修飾脂質(zhì)適量與載藥脂質(zhì)體溶液孵育，即得肝靶向載藥脂質(zhì)體。若制備含有小分子藥物的肝靶向脂質(zhì)體，在a步驟中加入與脂質(zhì)材料共溶解，或先溶于b步驟中的水溶液中。若制備載基因(包括裸基因、載基因的質(zhì)粒載體或病毒載體)、蛋白或多肽(包括各種電性的蛋白或多肽)的肝靶向脂質(zhì)體，則先將基因、蛋白或多肽溶于b步驟中的水溶液中。肝靶向脂質(zhì)體的詳細(xì)制備工藝可見以下6個具體實施例。實施例5薄膜法直接制備肝靶向脂質(zhì)體稱取膽固醇5. 5mg、甘草次酸修飾膽固醇5mg(實施例1制備)和1，2_ 二油?；?3-三甲基氨基-丙烷(正電荷脂質(zhì))50mg置于茄形瓶中，加入氯仿使之完全溶解；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得脂質(zhì)體膜，干燥；加入5%葡萄糖溶液旋轉(zhuǎn)水化，探頭超聲即得半透明有淡藍(lán)色乳光的肝靶向空白脂質(zhì)體溶液。將綠熒光蛋白質(zhì)粒與肝靶向空白脂質(zhì)體溶液(質(zhì)量比為1 7) 孵育，即得載基因的肝靶向脂質(zhì)體。實施例6薄膜法后插入制備肝靶向脂質(zhì)體膽固醇2. 8mg、l，2- 二油?；鵢3_三甲基氨基-丙烷(正電荷脂質(zhì))IOmg及紫杉醇Img置于茄形瓶中，加入氯仿使之完全溶解；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得脂質(zhì)體膜，干燥；加入5%葡萄糖溶液旋轉(zhuǎn)水化，探頭超聲即得半透明有淡藍(lán)色乳光的載紫杉醇的脂質(zhì)體溶液。將綠熒光蛋白質(zhì)粒與肝靶向空白脂質(zhì)體溶液(質(zhì)量比為1 幻孵育，即得基因/化藥共載的脂質(zhì)體; 然后加入甘草次酸修飾聚乙二醇化膽固醇(實施例3制備)(3. 2mg)，與基因/化藥共載的脂質(zhì)體孵育，即得基因/化藥共載的肝靶向脂質(zhì)體。實施例7注入法直接制備肝靶向脂質(zhì)體稱取甘草次酸修飾磷脂(具體為修飾二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，如實施例2制備)2. 6mg、膽固醇2. 8mg、大豆磷脂IOmg及拉米夫定lmg，乙醇使之完全溶解；注入PBS溶液中，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除盡乙醇，即得載拉米夫定的肝靶向脂質(zhì)體。實施例8注入法后插入制備肝靶向脂質(zhì)體稱取膽固醇4. ang、卵磷脂30mg及阿霉素lmg，乙醇使之完全溶解；注入PBS溶液中，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除盡乙醇，即得載阿霉素的脂質(zhì)體。然后加入甘草次酸修飾聚乙二醇化磷脂(實施例4制備)溶液(31. 5mg)，與載阿霉素的脂質(zhì)體孵育，即得載阿霉素的肝靶向脂質(zhì)體。實施例9逆向蒸發(fā)法直接制備肝靶向脂質(zhì)體甘草次酸修飾膽固醇(實施例1制備)5. 8mg、膽固醇6. 6mg、大豆磷脂20mg及牛血清白蛋白ang，氯仿使之完全溶解；加入水溶液，進行短時超聲，直至形成穩(wěn)定的w/o型乳劑；減壓蒸發(fā)有機溶劑，達(dá)到膠態(tài)后，加入HEPS溶液，旋轉(zhuǎn)使器壁上的凝膠脫落，在減壓下繼續(xù)蒸發(fā)，除盡殘留氯仿，即得肝靶向載蛋白的脂質(zhì)體溶液。實施例10逆向蒸發(fā)法后插入制備肝靶向脂質(zhì)體。膽固醇7. 5mg、大豆磷脂35mg、牛血清白蛋白2mg及硫酸長春新堿lmg，氯仿使之完全溶解；加入水溶液，進行短時超聲，直至形成穩(wěn)定的W/0型乳劑；減壓蒸發(fā)有機溶劑，達(dá)到膠態(tài)后，加入PBS溶液，旋轉(zhuǎn)使器壁上的凝膠脫落，在減壓下繼續(xù)蒸發(fā)，除盡殘留氯仿，即得化藥/蛋白共載的脂質(zhì)體溶液。然后加入甘草次酸修飾聚乙二醇化膽固醇溶液(實施例3 制備)(4. 5mg)，與化藥/蛋白共載的脂質(zhì)體孵育，即得化藥/蛋白共載的肝靶向脂質(zhì)體。本發(fā)明提供的由甘草次酸介導(dǎo)的肝靶向膠束載體，它是由本發(fā)明磷脂(或膽固醇)與聚乙二醇制備的甘草次酸修飾脂質(zhì)制備而成，根據(jù)包載藥物的性質(zhì)不同，可采用混合法、乳化-溶劑揮發(fā)法、自組裝溶劑蒸發(fā)法、薄膜分散法、透析法、熔融法中的任意一種制成肝靶向膠束。為了探尋肝靶向膠束制備方法的穩(wěn)定工藝參數(shù)，采用混合法、乳化-溶劑揮發(fā)法、 自組裝溶劑蒸發(fā)法、薄膜分散法、透析法、熔融法等多種膠束制備方法對載不同性質(zhì)藥物的肝靶向膠束進行了大量的試制，擬定了各種制備方法的藥物適用范圍、特點混合法適用于基因、蛋白、多肽或小分子藥物的包載，制備的膠束溶液中聚乙二醇的甘草次酸修飾脂質(zhì)濃度不超過20mg/ml ；乳化-溶劑揮發(fā)法適用于難溶性藥物的包載。制備的膠束載藥量較高， 如槲皮素可高達(dá)25% ；自組裝溶劑蒸發(fā)法適用于基因、蛋白、多肽或小分子藥物的包載，制備的膠束溶液中聚乙二醇的甘草次酸修飾脂質(zhì)濃度可高達(dá)100mg/ml ；薄膜分散法適用于基因、蛋白、多肽或小分子藥物的包載。制備的膠束溶液中聚乙二醇的甘草次酸修飾脂質(zhì)濃度也可高達(dá)100mg/ml，采用自組裝溶劑蒸發(fā)法不能獲得較好包封率和粒徑的藥物可采用此法；透析法適用于難溶性藥物的包載。制備方法較為復(fù)雜，不易規(guī)?；苽洌捎蒙鲜龇椒ňy以獲得較高包封率或適宜粒徑分布時方選用；熔融法適用于對熱穩(wěn)定的藥物。肝靶向膠束的詳細(xì)制備工藝可見以下6個具體實施例。實施例11混合法制備肝靶向膠束由實施例3制備的修飾脂質(zhì)50mg、多烯紫杉醇0. 5mg先混合，然后加入5ml水，水浴超聲，過濾除掉未完全溶解的多烯紫杉醇，即得載多烯紫杉醇的肝靶向膠束溶液。實施例12乳化-溶劑揮發(fā)法制備肝靶向膠束將Img紫杉醇先溶于Iml氯仿中，然后倒入用混合法制得的10mg/ml由實施例3 制備的修飾脂質(zhì)膠束水溶液中，劇烈攪拌或超聲形成0/W型乳狀液，攪拌或旋蒸揮去有機溶劑，即得載紫杉醇的的肝靶向膠束溶液。實施例13自組裝溶劑蒸發(fā)法制備肝靶向膠束將由實施例4制備的修飾脂質(zhì)40mg與Img槲皮素溶于Iml丙酮中，再逐漸加到含干擾素的水溶液中，形成膠束后，攪拌下?lián)]盡丙酮，即得載槲皮素/干擾素的肝靶向膠束溶液。實施例14薄膜分散法制備肝靶向膠束將由實施例4制備的修飾脂質(zhì)IOOmg與青蒿琥酯5mg溶于氯仿中，旋蒸除盡有機溶劑，形成均勻的薄膜，加入到含綠熒光蛋白質(zhì)粒的水溶液，旋轉(zhuǎn)洗膜，即得載青蒿琥酯/ 基因的肝靶向膠束溶液。實施例15透析法制備肝靶向膠束將由實施例3制備的修飾脂質(zhì)30mg與槲皮素溶于anlTHF，然后置于截留分子量為 1000的有機系透析袋(截留分子量選擇依據(jù)為可截留載體材料而有機溶劑及水可以任意通過)中，水透析Mh，除盡有機溶劑，即得載槲皮素的肝靶向膠束溶液。實施例16熔融法制備肝靶向膠束將由實施例4制備的修飾脂質(zhì)60mg與紫杉醇共混，加熱至60°C使熔融，加入水溶液，攪拌，除去未溶解的藥物，即得載紫杉醇的肝靶向膠束溶液。以下通過脂質(zhì)體及膠束粒徑、電位測定，肝靶向脂質(zhì)體復(fù)合物及膠束復(fù)合物載藥量等實驗數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的有益效果。一、發(fā)明人將本發(fā)明甘草次酸修飾脂質(zhì)、膽固醇、磷脂按膽固醇和磷脂的摩爾比為 1 1 10，甘草次酸修飾脂質(zhì)的摩爾含量為膽固醇和磷脂的總摩爾數(shù)的0.5 30%的配比關(guān)系制備的肝靶向脂質(zhì)體用純化水稀釋100倍，于25°C用激光散射粒徑分析儀測定 (Zetsizer Nano ZS90)，并記錄粒徑均值和多分散系數(shù)(polydispersity index,PDI) 結(jié)果顯示載小分子藥物的甘草次酸修飾肝靶向脂質(zhì)體粒徑為82 157nm，載單一大分子藥物或大分子藥物/小分子藥物復(fù)方的甘草次酸修飾肝靶向脂質(zhì)體粒徑為U8-256nm，載小分子藥物的甘草次酸修飾肝靶向膠束粒徑為55 193nm，載單一大分子藥物或大分子藥物/小分子藥物復(fù)方的甘草次酸修飾肝靶向膠束粒徑為97-298nm。粒徑范圍較大，調(diào)節(jié)制備工藝參數(shù)即可獲得不同粒徑的脂質(zhì)體或者膠束，可滿足不同肝臟疾病對粒徑的需求，適用范圍廣，從而具有較好的肝靶向治療前景，彌補了對比文件“肝細(xì)胞靶向甘草次酸表面修飾月旨質(zhì)體的制備，，禾口 "Preparation, characterizationand uptake by primary cultured rat hepatocytes of liposomes surface—modified with glycyrrhetinicacid. Pharmazie”中存在的不足。肝靶向空白脂質(zhì)體、肝靶向載基因脂質(zhì)體復(fù)合物和肝靶向載藥膠束的粒徑分布見圖2 圖4。二、發(fā)明人將本發(fā)明甘草次酸修飾脂質(zhì)、膽固醇、磷脂按膽固醇和磷脂的摩爾比為 1 1 10，甘草次酸修飾脂質(zhì)的摩爾含量為膽固醇和磷脂的總摩爾數(shù)的0.5 30%的配比關(guān)系制備的肝靶向脂質(zhì)體用ImM的NaCl溶液稀釋100倍，于25°C用激光散射粒徑分析儀測定(ZetsizerNano M90)，結(jié)果顯示，肝靶向脂質(zhì)體的zeta電位主要跟磷脂的種類關(guān)系密切，中性磷脂制備的肝靶向脂質(zhì)體的zeta電位幾乎接近中性，負(fù)電荷磷脂制備的肝靶向脂質(zhì)體的zeta電位呈電負(fù)性，而正電荷脂質(zhì)材料制備的肝靶向脂質(zhì)體的zeta電位則呈正電性。肝靶向空白脂質(zhì)體和肝靶向載基因脂質(zhì)體復(fù)合物的zeta電位分布見圖5和圖6， 并記錄zeta電位均值。三、取肝靶向載基因脂質(zhì)體復(fù)合物溶液(實施例幻，將樣品稀釋至0. 01-0. 05mg/ ml，移取5-10 μ 1滴加到新解離的石英片表面，用吸管或移液槍使液滴均勻分散于石英片表面，必要時用Milli-Q水沖洗石英片，置于潔凈的培養(yǎng)皿中并蓋上，空氣中干燥即得樣品。于原子力顯微鏡(SPA400，SII Nanotechnology, Inc.)下觀察，圖像規(guī)格為5 X 5 μ m2或 2Χ2μπι2。圖像經(jīng)專門的原子力處理軟件Spiwin分析處理而得，結(jié)果見圖7。粒徑為150nm 左右，表面圓整光滑。四、分別取和5%甘草次酸修飾脂質(zhì)(制備工藝參見實施例幻制備的肝靶向脂質(zhì)體(1%和5%是指甘草次酸修飾脂質(zhì)的摩爾含量為膽固醇和磷脂的總摩爾數(shù)的百分比)100yL于12個0.5mLEP管中，按照甘草次酸修飾的肝靶向脂質(zhì)體/基因質(zhì)量比2 1、 3 1、4 1、5 1、6 1 和 7 1 (w/w)分別加入基因，37°C孵育 30min 后于 130V、1 % 瓊脂糖凝膠電泳分析15min，采用凝膠成像系統(tǒng)Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)照相，見圖8?？梢姡? %甘草次酸修飾的肝靶向脂質(zhì)體與基因質(zhì)量比為 7 1時，可完全將基因包載；5%甘草次酸修飾的肝靶向脂質(zhì)體與基因質(zhì)量比為4 1時， 可完全將基因包載。針對本發(fā)明四大類修飾脂質(zhì)(甘草次酸-磷脂反應(yīng)；甘草次酸-膽固醇反應(yīng)；甘草次酸-聚乙二醇-磷脂反應(yīng)；甘草次酸-聚乙二醇-膽固醇反應(yīng)。)參照上述評價方法，即可確定含不同用量的甘草次酸修飾脂質(zhì)與所載藥物的配比關(guān)系，達(dá)到適宜的包載效果。五、!fepG2細(xì)胞接種至6孔板中，每孔150000個左右，接種后于37°C，5% CO2條件過夜，使細(xì)胞貼壁。棄去有血清的DMEM培養(yǎng)基，加入無血清的培養(yǎng)基至少孵育30min后，加入新制備的脂質(zhì)體綠熒光蛋白質(zhì)粒復(fù)合物(含綠熒光蛋白質(zhì)粒1 μ g)，孵育5- ，更換新鮮雙有DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育42h左右，于倒置熒光顯微鏡1X71 (Olympus Corp.，Shinjuku, Tokyo, Japan)下觀察熒光并照相，結(jié)果見圖9，即圖9 (A)和圖9(B)。六、將載槲皮素的肝靶向膠束(實施例14)溶液稀釋5倍以后，滴在銅網(wǎng)上，2%磷鎢酸鈉染色后，HITACHI H-600透射電子顯微鏡觀察粒子形態(tài)，結(jié)果見圖10，可見膠束圓整， 粒徑分布均勻。
權(quán)利要求
1.甘草次酸修飾脂質(zhì)，其特征在于它是以甘草次酸與磷脂或膽固醇為原料，在含有縮合劑的溶劑中反應(yīng)而得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘草次酸修飾脂質(zhì)，其特征在于將甘草次酸、磷脂或膽固醇、與縮合劑在溶劑中混合反應(yīng)后濃縮，經(jīng)柱層析或高效液相色譜純化即得；優(yōu)選的是分別將甘草次酸、磷脂或膽固醇與縮合劑配制成溶液后進行反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的甘草次酸修飾脂質(zhì)，其特征在于原料中還有聚乙二醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的甘草次酸修飾脂質(zhì)，其特征在于將甘草次酸、聚乙二醇、磷脂或膽固醇、與縮合劑在溶劑中混合反應(yīng)后濃縮，柱層析或高效液相色譜純化即得；優(yōu)選的是分別將甘草次酸、聚乙二醇、磷脂或膽固醇與縮合劑配制成溶液后進行反應(yīng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的甘草次酸修飾脂質(zhì)，其特征在于所述的縮合劑為1-乙基-3-(3-二甲氨基異丙基)碳二亞胺或二環(huán)己基碳二亞胺。
6.肝靶向脂質(zhì)體，其特征在于它是由權(quán)利要求1-5任一項所述的甘草次酸修飾脂質(zhì)與膽固醇和磷脂制成，其中，各組分配比關(guān)系如下膽固醇和磷脂的摩爾比為1 1 10， 甘草次酸修飾脂質(zhì)的摩爾含量為膽固醇和磷脂的總摩爾數(shù)的0. 5 30%。
7.肝靶向膠束，其特征在于它是由權(quán)利要求3或4所述的采用甘草次酸修飾脂質(zhì)制成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的肝靶向膠束，其特征在于采用混合法、乳化-溶劑揮發(fā)法、 自組裝溶劑蒸發(fā)法、薄膜分散法、透析法、熔融法中的任意一種，將原料中還有聚乙二醇的修飾脂質(zhì)制成肝靶向膠束。
9.一種肝靶向復(fù)合物，其特征在于它是以權(quán)利要求6所述的肝靶向脂質(zhì)體為包封層制成的肝靶向脂質(zhì)體復(fù)合物，或是以權(quán)利要求7或8所述的肝靶向膠束為包封層制成的肝靶向膠束復(fù)合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求10所述的肝靶向復(fù)合物，其特征在于在包封層內(nèi)包封有基因、蛋白、多肽或小分子藥物中的任意一種。
11.一種肝靶向藥物組合物，其特征在于它是由權(quán)利要求9或10所述的肝靶向復(fù)合物加入藥學(xué)上可以接受的輔料制備而成。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及甘草次酸修飾脂質(zhì)、肝靶向脂質(zhì)體、膠束及復(fù)合物和制法。本發(fā)明提供了一種全新的甘草次酸修飾脂質(zhì)，它是甘草次酸作為肝靶向介導(dǎo)物質(zhì)，該修飾脂質(zhì)作為脂質(zhì)體或膠束的膜材應(yīng)用，使得由其制備的脂質(zhì)體或膠束具有肝靶向性。具體的，修飾脂質(zhì)是以甘草次酸與磷脂或膽固醇為原料，在含有縮合劑的溶劑中反應(yīng)而得。本發(fā)明還提供了由甘草次酸介導(dǎo)的肝靶向脂質(zhì)體載體和膠束載體，脂質(zhì)體載體是采用該修飾脂質(zhì)與膽固醇和磷脂制成，膠束是由該修飾脂質(zhì)直接制成；以及上述兩種載體作為包封層制備的肝靶向脂質(zhì)體復(fù)合物或膠束復(fù)合物，從而實現(xiàn)甘草次酸介導(dǎo)相關(guān)藥物靶向到肝細(xì)胞，降低其對正常組織的毒性，提高藥物的肝病防治效果。
文檔編號A61K31/352GK102336802SQ201010228799
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者何谷, 吳曉華, 宋相容, 魏于全 申請人:四川大學(xué)