專利名稱：一種口服免疫阻斷雞肌抑素作用的轉(zhuǎn)化子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種口服免疫阻斷雞肌抑素作用的轉(zhuǎn)化子及 其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
禽產(chǎn)品是人類主要?jiǎng)游镄允称分弧ｋS著人們生活水平的不斷提高，市場(chǎng)對(duì)禽產(chǎn) 品的需求日益增加。我國(guó)是個(gè)多禽種國(guó)家，地方雞種資源十分豐富，我國(guó)的這些品種與國(guó) 外培育出的一些“專用家禽品種”相比，具有對(duì)周圍環(huán)境的高度適應(yīng)性、耐粗放管理、抗病性 強(qiáng)、肉及蛋的品質(zhì)好等特點(diǎn)。然而由于地方雞種生長(zhǎng)慢、飼料利用率低，產(chǎn)蛋量少，再加上外 來高生產(chǎn)性能品種的引進(jìn)，使許多地方雞種由于市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)而逐步減少甚至瀕?；驕缃^。外 來品種雖然生長(zhǎng)快、飼料利用率高，但肉及蛋的品質(zhì)差。隨著生活水平的提高，人們已越來 越注重禽產(chǎn)品的品質(zhì)，目前市場(chǎng)對(duì)高品質(zhì)土雞蛋及肉產(chǎn)品的需求量迅猛增長(zhǎng)，這種轉(zhuǎn)變給 我們提出了培育肉蛋品質(zhì)好的新品種、品系的要求和挑戰(zhàn)。提高動(dòng)物生產(chǎn)性能一直是動(dòng)物生產(chǎn)研究人員所努力的目標(biāo)。但目前通過傳統(tǒng)的遺 傳改良和營(yíng)養(yǎng)調(diào)控手段來提高動(dòng)物產(chǎn)肉率已很難再有大的進(jìn)展。因而研究一種安全、高效、 對(duì)人類無毒副作用的提高動(dòng)物產(chǎn)肉率的制劑或產(chǎn)品是目前養(yǎng)殖業(yè)所面臨的迫切問題。動(dòng)物的生產(chǎn)性狀總是由促進(jìn)和抑制兩類激素或因子聯(lián)合控制的。如果把免疫學(xué)的 方法應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)性能的調(diào)控，選擇對(duì)動(dòng)物產(chǎn)肉率有抑制作用的激素或因子作為抗原來 免疫動(dòng)物，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生對(duì)抗該種激素或因子的抗體，從而抑制或減弱該激素或因子的 生理功能，進(jìn)而提高動(dòng)物的產(chǎn)肉率。該技術(shù)對(duì)那些產(chǎn)肉率低的地方品種意義尤其重大，且十 分安全無任何副作用。由于大腸桿菌、酵母菌等不能在動(dòng)物腸道中定植，所以不能進(jìn)行口服免疫，必須將 所表達(dá)的目的產(chǎn)物純化進(jìn)行注射免疫。蛋白純化步驟大大增加了生產(chǎn)的成本和難度，使大 規(guī)模生產(chǎn)目的蛋白制劑難以實(shí)現(xiàn)。同時(shí)注射免疫程序也較繁瑣，不僅要耗費(fèi)較大人力，對(duì)動(dòng) 物的應(yīng)激和傷害也較大。因此迫切需要研制出一種對(duì)動(dòng)物產(chǎn)肉率起促進(jìn)作用的安全、方便 并能進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的口服制劑。乳酸菌是一類在食品中應(yīng)用最廣泛的重要工業(yè)菌株，它包括乳酸乳球菌、乳酸桿 菌等十幾個(gè)屬，被公認(rèn)為是安全的食品級(jí)微生物。乳酸菌本身就是一種益生菌，能調(diào)節(jié)腸道 微環(huán)境，幫助消化，抑制腸道有害微生物，防治腹瀉，促動(dòng)物生長(zhǎng)增重。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種口服免疫阻斷雞肌抑素作用的轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子可以通過口服 方式攝入并定植在雞腸道內(nèi)，其分泌的融合蛋白能有效誘發(fā)雞體內(nèi)產(chǎn)生抗雞肌抑素的抗 體，從而抑制或減弱內(nèi)源肌抑素對(duì)雞產(chǎn)肉性能的抑制作用。一種轉(zhuǎn)化子，包括受體菌和轉(zhuǎn)化到受體菌內(nèi)部的重組載體，所述的受體菌為乳酸 乳球菌NZ9800，重組載體的原始載體為PNZ8112，重組載體的外源目的基因包括雞肌抑素基因、霍亂毒素B亞基基因以及細(xì)胞壁錨定子M6基因。雞肌抑素(Myostatin，MSTN，GenBank 號(hào)NM 001001461)又稱 GDF-8 (Growth Differentiation Factor 8，生長(zhǎng)分化因子 8)，屬 于TGF-β超家族，其僅在骨骼肌中特異表達(dá)并分泌至血漿中，是影響骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的抑 制因子。該基因的敲除使小鼠的骨骼肌增加了近3倍。該基因天然缺失的比利時(shí)藍(lán)牛被稱 為“雙肌?！?。MSTN基因的缺失或阻斷只影響骨骼肌的發(fā)育，對(duì)心肌、平滑肌等沒有任何影 響，不對(duì)動(dòng)物的其它性能產(chǎn)生危害，牛自然狀態(tài)下的雙肌現(xiàn)象證明了這一點(diǎn)。在本發(fā)明中它 作為免疫原。為了增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答，提高免疫效果，在抗原基因上連接霍亂毒素B亞基基因， 霍亂毒素B亞基(Cholera toxin B subunit，簡(jiǎn)稱CTB，GenBank號(hào)U25679)為免疫增強(qiáng)子， 研究表明它是一種無毒性的非常有效的黏膜免疫佐劑，特別適合作為口服疫苗的免疫增強(qiáng) 佐劑蛋白。細(xì)胞壁錨定子M6 (GenBank號(hào)M11338)可與乳酸乳球菌細(xì)胞膜上的蛋白相結(jié)合， 免疫原和免疫增強(qiáng)子被表達(dá)后分泌到胞外，通過細(xì)胞壁錨定子M6能夠固定在細(xì)胞壁上。原始載體PNZ8112含有強(qiáng)啟動(dòng)子即乳鏈菌肽A(Nisin Α)的啟動(dòng)子NisA(GenBank 號(hào)AY303241)以及高效分泌型信號(hào)肽Usp45 (GenBank號(hào)M60178)，信號(hào)肽Usp45位于啟動(dòng) 子NisA的下游，外源目的基因連接在信號(hào)肽的C端。所述的肌抑素基因、霍亂毒素B亞基基因、細(xì)胞壁錨定子M6基因、啟動(dòng)子NisA和 信號(hào)肽Usp45的堿基序列如SEQ ID N0. 7 11所示。乳酸菌本身就是一種益生菌，能調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境，幫助消化，抑制腸道有害微生 物，防治腹瀉，促動(dòng)物生長(zhǎng)增重。乳酸菌能在體內(nèi)定植或短暫定植是它發(fā)揮生理功能的必要 條件。通過載體把目的基因如免疫原基因?qū)肴樗峋校缓笾瞥苫罹苿╋曃?，引入?dòng)物 體內(nèi)，產(chǎn)生外源目的基因的產(chǎn)物從而引起黏膜和體液免疫。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在腸道中能較長(zhǎng)時(shí) 間定植的乳酸桿菌容易使動(dòng)物對(duì)目的外源基因產(chǎn)物產(chǎn)生免疫耐受，而在腸道中短暫定植的 乳酸乳球菌不產(chǎn)生這種免疫耐受現(xiàn)象。本發(fā)明還提供上述轉(zhuǎn)化子在免疫阻斷雞肌抑素作用中的應(yīng)用，通過將分泌表達(dá)了 外源目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化子喂食給雞，乳酸乳球菌就會(huì)短暫定植在雞腸道內(nèi)，從而引起雞 對(duì)外源目的基因產(chǎn)物產(chǎn)生免疫，即對(duì)乳酸菌表達(dá)的肌抑素產(chǎn)生免疫，產(chǎn)生抗肌抑素的抗體， 該抗體可減弱或抑制雞內(nèi)源肌抑素對(duì)雞產(chǎn)肉性能的抑制作用達(dá)到提高動(dòng)物產(chǎn)肉率的目的。根據(jù)上述應(yīng)用，本發(fā)明又提供了一種利用上述轉(zhuǎn)化子制備的雞口服免疫制劑，它 包括培養(yǎng)基和分泌了外源目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化子。該制劑制備和使用均十分方便。所述的培養(yǎng)基可以為能促進(jìn)乳酸乳球菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，優(yōu)選為GM17培養(yǎng)基。在使 用時(shí)，上述口服免疫制劑中轉(zhuǎn)化子濃度最好為IX IO8CfuAiL IX IOltlCfuAiL,使得腸道內(nèi) 的乳酸乳球菌達(dá)到一定濃度，每次喂食量為1 2ml。本發(fā)明還提供了一種上述雞口服免疫制劑的制備方法，包括以下步驟將轉(zhuǎn)化子 置于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D_為0. 3 0. 5，加入乳鏈菌肽繼續(xù)培養(yǎng)2 3h。所述的乳鏈菌肽為表達(dá)誘導(dǎo)物，加入后濃度優(yōu)選為10 20ng/mL。本發(fā)明轉(zhuǎn)化子可以通過口服方式進(jìn)入雞腸道，與注射免疫相比，降低直接與循環(huán) 系統(tǒng)接觸引起的毒性，增加疫苗的安全性。選用抗原基因/免疫增強(qiáng)因子(無毒性的霍亂 毒素B亞基)聯(lián)合免疫，增強(qiáng)了機(jī)體免疫應(yīng)答，提高了免疫效果。
具體實(shí)施例方式GMl7液體培養(yǎng)基胰蛋白胨2% ；酵母膏0. 5% ；Vc 0. 05% ；牛肉膏0. 5% ；乙酸鈉 0. 15% ；氯化鈉 0. 4% ;MgS04. 7Η20 0. 25% ；葡萄糖 0. 5%，調(diào)至 pH 6.8。GM17 固體培養(yǎng)基 在上述培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加1. 6%的瓊脂。乳酸乳球菌NZ9800和載體pNZ8112均為商業(yè)化產(chǎn)品，來自荷蘭的NIZO food research。1、目的基因的構(gòu)建及克隆表達(dá)(I)CTB基因成熟區(qū)的獲得上游引物CTB Pl (SEQ ID NO. 1)5，-gg |tctaga| acacctcaaaatattactg-3，引物結(jié)構(gòu)為保護(hù)堿基(GG)-Xba I位點(diǎn)(框中序列)_CTB 5’端部分序列(下劃 線序列)下游引物CTB P2 (SEQ ID NO. 2)5 ’ -tg ]gaattc[ atttgccatactaattg-3 ’引物結(jié)構(gòu)保護(hù)堿基(TG)-EcoR I位點(diǎn)(框中序列)-CTB 3’端部分序列(下劃 線)。用上述引物以霍亂弧菌(V. cholera)基因組DNA (含CTB基因)為模板，進(jìn)行PCR 得到CTB基因成熟區(qū)序列。PCR條件為總反應(yīng)體系為50 μ 1，其中含50ng的DNA模板， IXPCR buffer, 1. 5mM MgCl2,0. 2mMdNTP，0. 2 μ M 上下游引物，2. 5U Taq DNA 聚合酶。PCR 反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為94°C預(yù)變性1分鐘；94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，35 個(gè)循環(huán)；然后72°C后延伸5分鐘。(2)MSTN基因成熟區(qū)的獲得上游引物MSTN Pl (SEQ ID N0. 3)aa |gaattc| Cgcagagattttggccttgac引物結(jié)構(gòu)保護(hù)堿基(AA)-EcoR I位點(diǎn)(框中序列)_MSTN 5’端部分序列(下劃 線)。下游引物MSTN P2 (SEQ ID N0. 4)TT ]ggatcc| TGAGCACCCGCAACGATCTAC引物結(jié)構(gòu)保護(hù)堿基(TT)-BamH I位點(diǎn)(框中序列)_MSTN 3’端部分序列(下劃 線)。用上述引物以雞基因組DNA (含MSTN基因)為模板，進(jìn)行PCR得到MSTN基因成熟 區(qū)序列。PCR條件同上。(3) CTB-MSTN嵌合基因的構(gòu)建將上述PCR所得到的CTB和MSTN成熟區(qū)序列分別與pGEM-T載體(Promega公司) 相連，克隆入大腸桿菌E. coli DH5 α (Takara公司)中。抽提重組目的質(zhì)粒，用內(nèi)切酶將 CTB (Xba I和EcoR I)和MSTN(EcoR I和BamH I)成熟區(qū)分別從重組T載體上酶切下來， T4DNA連接酶16°C連接過夜得到CTB-MSTN的連接產(chǎn)物。以連接產(chǎn)物為模板，以CTB Pl (含Xba I位點(diǎn))和MSTN P2(含BamH I位點(diǎn))為引物，進(jìn)行PCR，得到CTB-MSTN嵌合基因的PCR 產(chǎn)物。將該P(yáng)CR產(chǎn)物用Xba I和BamH I酶切后克隆到pET28載體(Invitrogen公司)中。 然后將含CTB-MSTN的pET28質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，涂LB平板，37°C培 養(yǎng)18-20h，挑取陽性斑擴(kuò)大培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒，PCR和酶切鑒定抽提的質(zhì)粒中含有目的基 因。 (4) CTB-MSTN-M6重組表達(dá)載體的構(gòu)建M6基因的獲得上游引物M6P1(SEQ ID NO. 5)5，-AA |ggatcc| AGAGTGTTTCCTAGGGG-3，引物結(jié)構(gòu)為保護(hù)堿基(aa)-BamH I位點(diǎn)(框中序列)-M65’端部分序列(下劃線 序列)下游引物M6P2(SEQ ID NO. 6)5，-co Iaagcti] cta gttttcttctttgcgtt_3，引物結(jié)構(gòu)為保護(hù)堿基(Cg)-Hind III位點(diǎn)(框中序列)_終止子(粗斜體序 列)-M63’端部分序列(下劃線序列)用化膿性鏈球菌基因組DNA(含M6基因)為模板，以上述引物進(jìn)行PCR(PCR條件 同上)，可得到兩端帶BamH I和Hind III酶切位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物，用該兩種酶酶切PCR產(chǎn) 物，重組入已含CTB-MSTN的pET28載體中的CTB-MSTN基因下游(通過設(shè)計(jì)的BamH I位點(diǎn) 將 CTB-MSTN 與 M6 重組相連(Xba I) CTB- (EcoR I)-MSTN (BamH I)和(BamH I)M6-終止子 (Hind III))。然后將含CTB-MSTN-M6嵌合基因的pET28質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Ε. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞 中，涂LB平板，37°C培養(yǎng)18-20h，挑取陽性斑擴(kuò)大培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒，PCR和酶切鑒定抽提 的質(zhì)粒中含有目的基因。酶切條件為37°C酶切過夜；連接酶及條件=T4DNA連接酶，16°C連接過夜。其他過 程均按常規(guī)方法進(jìn)行。2、CTB-MSTN-M6嵌合基因在中間宿主菌中的克隆和在乳酸乳球菌中的表達(dá)(1) CTB-MSTN-M6嵌合基因在中間宿主菌中的克隆由于表達(dá)載體pNZ8112(NIZ0 food research (荷蘭))在乳酸乳球菌中的克隆拷 貝數(shù)很低，要想得到足夠的重組PNZ8112質(zhì)粒(含CTB-MSTN-M6)，必須通過一個(gè)中間宿主菌 E. coli MC1061 (Invitrogen公司)來使pNZ8112質(zhì)粒達(dá)到足夠的拷貝數(shù)。用氯霉素抗性篩選重組菌(10ug/ml氯霉素)pNZ8112上含氯霉素抗性基因， E. coli MC1061菌株本身不具氯霉素抗性，只有被轉(zhuǎn)化入pNZ8112質(zhì)粒的E. coli MC1061才 能在含氯霉素的平板上生長(zhǎng)。首先將目的基因(CTB-MSTN-M6)從pET28質(zhì)粒中酶切(Xba I和Hind III)下 來，割膠回收，重組入用相同酶切過的PNZ8112中，T4DNA連接酶16°C連接過夜，然后轉(zhuǎn)化 E. coli MC1061感受態(tài)細(xì)胞，涂LB平板，37°C培養(yǎng)18_24h，挑取氯霉素平板上生長(zhǎng)出的菌斑 擴(kuò)大培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒，PCR和酶切鑒定抽提的質(zhì)粒中含有目的基因。(2) CTB-MSTN-M6嵌合基因在乳酸乳球菌中的表達(dá)
得到含目的基因(CTB-MSTN-M6)的重組E. coli MC1061后，將其擴(kuò)大培養(yǎng)，使其 中的重組PNZ8112質(zhì)粒得到足夠的拷貝數(shù)(每個(gè)宿主細(xì)胞約10 60份拷貝)，然后抽提 重組PNZ8112質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入乳酸乳球菌NZ9800(NIZ0 food research (荷蘭))感受態(tài)細(xì)胞 中，涂布含有10ug/ml氯霉素的GM17平板(同樣用氯霉素抗性篩選重組菌)，于30°C培養(yǎng) 48-60h,挑取長(zhǎng)出的菌斑擴(kuò)大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，PCR和酶切鑒定抽提的質(zhì)粒中含有目的基因。將含有陽性重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌轉(zhuǎn)接到5ml含氯霉素(終濃度為lOug/ml)的 GM17液體培養(yǎng)基中，在30°C、180r/min培養(yǎng)過夜后；按1 25的比例稀釋至IOml新鮮培 養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)至0D600約為0. 4，然后加入終濃度為lOng/ml乳鏈菌肽nisin (Sigma公 司)誘導(dǎo)目的基因表達(dá)2-3h。(3)檢驗(yàn)?zāi)康牡鞍资紫葘⒕w用溶菌酶處理，再用超聲波破碎，然后將經(jīng)超聲波破碎處理后的細(xì)胞 溶液用70%飽和硫酸銨沉淀后，IOOOOg離心30min，將沉淀溶解于50mMol/L pH6. 0磷酸 緩沖液中，活性炭脫色后用50mMol/L的磷酸緩沖液透析至透析液中檢測(cè)不到銨根離子，直 接上 DEAE-Cellulose 52 柱(2cmX60cm，Pharmacia，預(yù)先用含 30mMol/L NaCl 的 ρΗ6· 0、 20mMol/L的磷酸緩沖液平衡)，用緩沖體系(含30mMol/L NaCl的20mMol/L pH6. 0磷酸緩 沖液和含300mMol/L NaCl的20mMol/L pH6. 0磷酸緩沖液)進(jìn)行線性梯度洗脫，先用起始 緩沖液(含30mMol/L NaCl的20mMol/L pH6. 0磷酸緩沖液)洗柱后，再進(jìn)行NaCl濃度為 30-300mMol/L的線形梯度洗脫，洗脫流速為12mL/h，用核酸/蛋白檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)收集目的蛋 白，用去離子水透析過夜，再冷凍濃縮后于4°C保存，用常規(guī)Western blotting (Western印 跡法)檢測(cè)驗(yàn)證，檢測(cè)方法如下首先用商品化的MSTN抗原(Sigma產(chǎn)品)免疫兔子，制備用于Westernblotting 檢測(cè)的一抗，用商品化的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(Sigma產(chǎn)品)為二抗。為 了檢測(cè)目的蛋白CTB-MSTN-M6 (基因大小為1965bp)是否被乳酸乳球菌表達(dá)，我們用純化的 表達(dá)產(chǎn)物和另一種已知MSTN融合蛋白(沙門氏菌鞭毛蛋白編碼基因(H-Id)-肌抑素，簡(jiǎn)稱 H-Id-MSTN,基因大小為1833bp)做比較，如果用商品MSTN抗原免疫兔子所制備的一抗既能 與純化產(chǎn)物結(jié)合，又能與H-Id-MSTN蛋白結(jié)合，且蛋白分子量大小相符，則證明純化的表達(dá) 產(chǎn)物中含目的蛋白CTB-MSTN-M6。Western blotting結(jié)果顯示H_ld-MSTN和純化產(chǎn)物均 能與商品MSTN抗原免疫兔子所制備的一抗結(jié)合，顯示出所對(duì)應(yīng)的蛋白條帶(H-Id-MSTN分 子量約為65KD，CTB-MSTN-M6約為75KD)，說明CTB-MSTN-M6融合蛋白被乳酸乳球菌成功表 達(dá)。3、CTB-MSTN乳酸乳球菌口服免疫蕭山雞后的抗體產(chǎn)生情況隨機(jī)選取40只蕭山雞進(jìn)行了重組乳酸菌口服免疫，將濃度為IX 109Cfu/mL的菌 液喂食剛出生的雛雞(1日齡)，每次喂食1 2ml，每周2次，喂食3周。當(dāng)然可以根據(jù)實(shí) 際情況改變菌液濃度，一般選擇1 X IO8 1 X 101(lCfU/mL。在首次免疫后1月、2月、3月和4月抽取雞血，分離得到雞血清，用于檢測(cè)雞MSTN 抗體產(chǎn)生情況。采用ELISA間接法測(cè)定雞血清中的抗體水平，具體步驟如下用0. 5mg/ml的MSTN抗原(Sigma產(chǎn)品)包被96孔免疫板，每孔加抗原溶液100ml， 48°C包被過夜，然后用含1.5% BSA(牛血清白蛋白，Sigma產(chǎn)品)的PBST溶液(含0.05% Tween-20的PBS溶液)封閉免疫板，37°C封閉2h。加入稀釋度為1 50的待測(cè)雞血清，洗滌三次，再加稀釋度為1 1000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗雞IgG抗體(Sigma產(chǎn)品)， 然后將IOmg 3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(Sigma產(chǎn)品，酶的底物，可在辣根過氧化物酶作用 下顯藍(lán)色)溶解在0. 025M磷酸鹽檸檬酸緩沖液中并加至免疫板各孔中，每孔50ml。底物顯 色后加0. 2M H2S04終止反應(yīng)，然后用酶聯(lián)測(cè)定儀以波長(zhǎng)450nm測(cè)定底物顯色后的光吸收值 (0D值)，將測(cè)得標(biāo)本(即免疫雞血清標(biāo)本)OD值(P)與陰性對(duì)照(未免疫雞血清標(biāo)本)OD 值(N)相比，若P/N值大于或等于2.0，則所測(cè)樣本抗體為陽性，雞MSTN抗體產(chǎn)生情況檢測(cè) 結(jié)果如下表所示 4、CTB-MSTN乳酸菌活菌制劑主動(dòng)免疫對(duì)蕭山雞產(chǎn)肉性能的影響從上述被免疫的40只蕭山雞中選取抗體陽性的20只作為免疫組，另選20只未免 疫雞作為對(duì)照組。蕭山雞經(jīng)上述菌液主動(dòng)免疫后，飼養(yǎng)至120日齡測(cè)定蕭山雞的活體重、 屠體重、半凈膛重、全凈膛重、胸肌重和腿肌重，并統(tǒng)計(jì)其屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌 率、腿肌率。結(jié)果如下表所示本發(fā)明免疫制劑主動(dòng)免疫對(duì)蕭山雞產(chǎn)肉性能的影響(單位g) 同行中不同上標(biāo)字母表示差異顯著，a, b表示ρ < 0. 05，a, c表示ρ < 0. 01.以上數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明所研制的雞CTB-MSTN乳酸菌活菌制劑能刺激雞產(chǎn)生抗肌 抑素(MSTN)的抗體，減弱體內(nèi)肌抑素對(duì)雞產(chǎn)肉性能的抑制作用，提高了雞的產(chǎn)肉率。
權(quán)利要求
一種轉(zhuǎn)化子，包括受體菌和轉(zhuǎn)化到受體菌內(nèi)部的重組載體，其特征在于所述的受體菌為乳酸乳球菌NZ9800，重組載體的原始載體為pNZ8112，重組載體的外源目的基因包括雞肌抑素基因、霍亂毒素B亞基基因以及細(xì)胞壁錨定子M6基因。
2.權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)化子在免疫阻斷雞內(nèi)源肌抑素作用中的應(yīng)用。
3. 一種利用權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)化子制備的雞口服免疫制劑，其特征在于包括培養(yǎng)基 和分泌了所述外源目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雞口服免疫制劑，其特征在于所述的培養(yǎng)基為GM17培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雞口服免疫制劑，其特征在于所述的轉(zhuǎn)化子濃度為 1 X 108cfu/mL 1 X 10lclcfu/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雞口服免疫制劑的制備方法，包括以下步驟將轉(zhuǎn)化子置于 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD6tltl為0. 3 0. 5，加入乳鏈菌肽繼續(xù)培養(yǎng)2 3h。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的制備方法，其特征在于所述的乳鏈菌肽加入后濃度為10 20ng/mLo
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)化子，包括受體菌和轉(zhuǎn)化到受體菌內(nèi)部的重組載體，所述的受體菌為乳酸乳球菌NZ9800，重組載體的原始載體為pNZ8112，重組載體的外源目的基因包括雞肌抑素基因、霍亂毒素B亞基基因以及細(xì)胞壁錨定子M6基因。本發(fā)明轉(zhuǎn)化子可以通過口服方式進(jìn)入雞腸道，與注射免疫相比，降低直接與循環(huán)系統(tǒng)接觸引起的毒性，增加疫苗的安全性。選用抗原基因/免疫增強(qiáng)因子聯(lián)合免疫，增強(qiáng)了機(jī)體免疫應(yīng)答，提高了免疫效果。
文檔編號(hào)A61K35/74GK101906395SQ20101023811
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月27日
發(fā)明者牛冬 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)