專利名稱：重組人白介素15在治療惡性腹水瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組人白介素15(rhIL_15)在制備具有緩解和治療惡性腹水瘤藥物 中的應(yīng)用，屬于生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
惡性腹水是晚期癌癥患者常見(jiàn)的并發(fā)癥，不僅影響患者的生活質(zhì)量，也不利于進(jìn) 一步治療，病人病情重、進(jìn)展快、生存期短，其中消化道惡性腹水平均生存期僅為2-12個(gè) 月，常見(jiàn)的治療方法包括全身或腔內(nèi)局部化療，使用硬化劑，穿刺抽液或置導(dǎo)管引流以及 胸、腹腔分流等，這些方法雖然有一定的療效，但有的易復(fù)發(fā)，有的副反應(yīng)嚴(yán)重，不易為患者 接受，近年來(lái)，臨床上積極開(kāi)展擁古生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑治療惡性胸、腹水，文獻(xiàn)報(bào)道逐年增多， 如孫燕(孫燕，張弘剛，彭民.重組人白細(xì)胞介素_2治療實(shí)體瘤及胸腹水III期臨床研 究.中國(guó)新藥雜志，1998，7 (3) 171-174)等報(bào)道重組人白介素2的III期臨床試驗(yàn)，共治 療90例惡性腹水患者，總有效率可達(dá)76. 7% ；楊曉紅(楊曉紅.重組人白介素_2治療52 例惡性腹水的觀察.重慶醫(yī)學(xué)，2003，32(1) 96用重組人白介素2治療52例惡性腹水時(shí)， 觀察發(fā)現(xiàn)，腹腔內(nèi)注射重組人白介素-2，治療后，腹水及腹水中弘細(xì)胞均明顯減少，部分病 人癌細(xì)胞轉(zhuǎn)陰，但部分病人有較為嚴(yán)重的副反應(yīng)。白細(xì)胞介素15(IL_15)是Grabstein等人于1994年發(fā)現(xiàn)的一種約為12_14kD的 細(xì)胞因子，與大多數(shù)細(xì)胞因子相似，IL-15可在機(jī)體正常的免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，如促進(jìn)T 細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞的發(fā)育等，IL-15還可對(duì)免疫系統(tǒng)外的多種組織和細(xì)胞 發(fā)揮廣泛而多效的作用。體外研究顯示IL-15與IL-2由于共有的受體組分共有幾種生物 學(xué)活性，在T細(xì)胞上存在的IL-15受體包括一種特有的α鏈，IL-15Ra，但是與IL-2R共 有β鏈和Y鏈，結(jié)果，兩種受體都利用相同的Jak/STAT信號(hào)傳遞元件，不過(guò)，基于IL-2 和IL-15及其受體的復(fù)雜調(diào)控和不同表達(dá)，已經(jīng)報(bào)道了體內(nèi)功能的顯著差異(Kirman等， 1998 ；Waldmann and Tagaya, 1999 ；Waldmann 等，2001)。IL-15 和 IL-2 的抗腫瘤效應(yīng)應(yīng)受 到重視，比較IL-15與IL-2對(duì)肺腺癌轉(zhuǎn)移模型的療效時(shí)，它誘導(dǎo)的NK殺傷活性比IL-2誘 導(dǎo)的高3-4倍，此外，6倍劑量的IL-15才能引起肺血管滲漏等毒副作用的出現(xiàn)，在大鼠的結(jié) 腸癌模型中也發(fā)現(xiàn)，IL-15能顯著降低化療英氣的胃腸道毒性，增強(qiáng)藥物的最大耐受劑量。 朱法良等(朱法良，孫訥，田志剛，等· rhIL-15和rhIL-2誘生的LAK細(xì)胞特性比較·中國(guó) 免疫學(xué)雜志[J]. 2002，18 (4) 252-258)在研究重組人白細(xì)胞介素15和重組人白介素2誘 導(dǎo)的粘附性自然殺傷細(xì)胞(LAK)時(shí)發(fā)現(xiàn)，rhIL-15誘生的LAK細(xì)胞殺傷K562細(xì)胞的能力強(qiáng) 于rhIL-2誘生的LAK細(xì)胞，同時(shí)，rhIL-15誘生的LAK細(xì)胞的⑶3XD56+細(xì)胞、⑶94+細(xì)胞百 分率均要高于rhIL-2誘生的LAK細(xì)胞，證明rhIL-15在體內(nèi)對(duì)NK細(xì)胞功能可能具有較強(qiáng) 的調(diào)節(jié)作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明研究人員發(fā)現(xiàn)，rhIL-15在治療惡性腹水瘤方面，如艾氏腹水瘤、卵巢癌腹水、惡性肝癌腹水瘤等，具有一定的治療和緩解作用，可明顯延長(zhǎng)腹水小鼠的生存期。本發(fā)明的目的在于提供重組人白細(xì)胞介素15在制備具有治療和緩解惡性腹水瘤 藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一目的在于提供一種含有重組人白細(xì)胞介素15的藥物組合物在制備 具有治療和緩解惡性腹水瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中，含有重組人白細(xì)胞介素15的藥物組合物，是指，除含有重組人白細(xì)胞 介素15外，還包括一些其它藥物，如白細(xì)胞介素2、IFN-a、抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、索 拉非尼、5-FU、吉西他濱、紫杉烷、鉬類(如順鉬、奧沙利鉬、卡鉬等)等其它抗癌藥物的任意 一種或多種。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，提供了一種制備rhIL-15的方法，本發(fā)明制備方法 通過(guò)一系列基因克隆的構(gòu)建策略，合成目的基因IL-15，并將目的基因IL-15克隆到表達(dá)載 體上，再將含有目的基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，構(gòu)建工程菌發(fā)酵制備rhIL-15。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，提供了 rhIL-15對(duì)Ehrlich腹水瘤小鼠的治療作用， 艾氏腹水小鼠給予有效量的rhIL-15，可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)，而胸腺淋巴細(xì) 胞有絲分裂指數(shù)顯著增長(zhǎng)生長(zhǎng)。本發(fā)明的還一優(yōu)選實(shí)施例中，提供了 rhIL-15對(duì)卵巢癌U15腹水瘤小鼠的治療作 用，小鼠腹水增長(zhǎng)顯著受到抑制，死亡率也明顯降低。在本發(fā)明的又一實(shí)施例中，提供了 rhIL-15對(duì)惡性肝癌H22腹水瘤小鼠的治療作 用，荷肝癌H22小鼠在40天內(nèi)均死亡，但給予重組人白介素15治療后，其生存期得到明顯 延長(zhǎng)。


圖1左為rhIL-15的誘導(dǎo)表達(dá)情況電泳圖，右為rhIL_15的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品 WesternBlot雜交圖，從圖中可以看出在大約13kDa的位置出現(xiàn)明顯的目的蛋白條帶， Western Blot試驗(yàn)表明該目的條帶出現(xiàn)明顯的印跡反應(yīng)，說(shuō)明白介素15獲得了正確高效 表達(dá)。圖2為rhIL-15樣品純化前、后的電泳情況圖，純化后的重組rhIL_15經(jīng) Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果在大約13kDa的位置出現(xiàn)一條帶。圖3為純化后的rhIL-15樣品的高效液相色譜圖，純化后的rhIL_15顯示仍為單一峰。
具體實(shí)施例本發(fā)明通過(guò)下述實(shí)施例進(jìn)一步闡明，但任何實(shí)施例或其組合不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā) 明的范圍或?qū)嵤┓绞降南拗啤１景l(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書(shū)限定，結(jié)合本說(shuō)明書(shū)和本領(lǐng) 域一般常識(shí)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以清楚地明白權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。在不偏離本 發(fā)明的精神和范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行任何修改或改 變，這種修改和改變也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例1制備rhIL-15試驗(yàn)材料DNA限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶均為GIBCO公司產(chǎn)品；大腸桿菌宿主菌DH5a，BL21(DE3)菌株(購(gòu)自Invotrogen公司)；pVB220 載體(購(gòu)自Novagen公司)1引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)報(bào)道的hILl-15的基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物 Pl 5‘ -CctcgagTTCATGAACTGGGTGAATGTAATAAG-3‘,包括起始密碼子 ATG，外設(shè) Xho I 酶切位 點(diǎn)；下游引物P2 :5，-CGGATCCttaTTAAGAAGTGTTGATGAAGATTTG-3，，將終止密碼子變成原核 系統(tǒng)高頻使用的強(qiáng)終止子TAAjhSBamH I酶切位點(diǎn)，引物由北京雷默生物技術(shù)有限公司 合成和純化。2富含IL_15mRNA單個(gè)核細(xì)胞的制備及總RNA提取，采用常規(guī)密度梯度離心方法分 離正常人外周血白細(xì)胞，培養(yǎng)與含10%小牛血清、青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中， 加入細(xì)菌脂多糖5 μ g/ml和干擾素-Y 500u/ml，培養(yǎng)4h，棄去懸浮細(xì)胞，收獲帖壁的單個(gè)核 細(xì)胞，經(jīng)異硫氰酸胍法提取細(xì)胞總RNA，采用甲醛變形瓊脂糖凝膠水平電泳鑒定RNA。3RT-PCR反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取細(xì)胞總RNA 5-10 μ g作為模板，加入DTTlOmmol、 M-MLV200u、4xdNTP (每種)0. 5mmo 1、下游引物 P250pmo 1，總反應(yīng)體積 20 μ 1、37 °C 作用 lh, 95 °C IOmin 滅活 M-MLV ;PCR 反應(yīng)在 RT 反應(yīng)物 20 μ 1 中，加入 MgCl2 2mmol、4xdNTP 0. lmmol、上游引物P150pmol、95°C、5min，加入TaqDNA聚合酶2u。PCR反應(yīng)條件94°C lmin、 58°C lmin、72°C lmin，循環(huán) 35 次，72°C延長(zhǎng) 7min。擴(kuò)增得到 IL_15cDNA 序列。4IL-15重組表達(dá)載體構(gòu)建將RT-PCR擴(kuò)增后的IL_15cDNA用XhoI和BamHI雙酶 切后，經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖電泳純化回收片段，再在T4DNA連接酶的作用下與同樣酶切的pBV220 載體連接，轉(zhuǎn)化入DH5 α大腸桿菌，在含氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上篩選陽(yáng)性克隆。5將rhIL-15表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主菌BL21 (DE3)，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，將陽(yáng)性 的克隆菌株接種于2ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，30°C活化后，1 100接種，擴(kuò)增至 OD600 = 0. 4-0. 6時(shí)，于37°C誘導(dǎo)培養(yǎng)4h，5000r/min離心5min收集菌體，超聲波破碎菌體， 收集包涵體，然后通過(guò)變性_復(fù)性_層析的方法純化rhIL-15，最后獲得95 %以上純度的 rhIL-15。純化的rhIL-15經(jīng)氨基酸分析，其N端的10個(gè)氨基酸序列結(jié)果表明，樣品中除部 分N端多出1個(gè)甲硫氨酸外(轉(zhuǎn)錄時(shí)的起始密碼子)，氨基酸序列與天然的人IL-15相同， 純化后的rhIL-15的比活為2X 107U/mg.實(shí)施例2rhIL_15對(duì)Ehrlich惡性腹水癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的影響Ehrlich腹水癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的小鼠，隨著瘤齡增長(zhǎng)，胸腺組織逐漸萎縮，胸腺淋巴 母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率、有絲分裂指數(shù)級(jí)淋巴轉(zhuǎn)化反應(yīng)均下降，與此同時(shí)，癌細(xì)胞有絲分裂速度加 快，每克體重的癌重(含腹水)及每克癌腫的細(xì)胞數(shù)則不斷增加。試劑rhIL_2(市售，購(gòu)于深圳晶美生物工程有限公司)，rhIL_15(自制)； Ehrlich腹水癌細(xì)胞購(gòu)自北京腫瘤研究所，由本公司保存；Balb/c裸鼠購(gòu)自購(gòu)自中國(guó)醫(yī) 學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心4_5周齡，體重(17-20g)，雌雄各半；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自Invitrogen公司。小鼠模型建立=Ehrlich腹水癌細(xì)胞(EAC)用10 %的FBS、RPMI1640培養(yǎng)基在 37°C、5 %的CO2孵育箱進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用0. 25 %的胰酶消化并收 集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后重懸，每只裸鼠(Balc/c小鼠)于腹腔注射重懸液 0. 2ml (IXlOVmL)0正常和荷瘤小鼠均設(shè)計(jì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組在小鼠右 前肢肌注rhIL-15 (5 X IO4U/次)，隔日一次，共7次，對(duì)照組在相應(yīng)部位肌注等量的無(wú)菌生牀巴正 荷瘤鼠
癌細(xì)正常鼠
^荷瘤鼠 從上表結(jié)果可以看出，正常鼠經(jīng)注射rhIL-15后，其胸腺淋巴細(xì)胞有絲分裂指數(shù) 明顯增加，MI值分別為(1. 15士0. 17) %和8. 27士 1. 26%，差異具有顯著性(P < 0. 01)，小 鼠核瘤后，則胸腺淋巴細(xì)胞有絲分裂指數(shù)顯著下降，而當(dāng)注射rhIL-15后，胸腺淋巴細(xì)胞有 絲分裂指數(shù)顯著升高，MI值分別為(0.21 士0.02)%和6. 92士0.68%，差異具有顯著性(P <0.01)；癌細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)后，細(xì)胞持續(xù)增長(zhǎng)，癌細(xì)胞有絲分裂指數(shù)較高，一場(chǎng)的有 死分裂相增多，注射rhIL-15后，荷瘤小鼠有絲分裂指數(shù)要較對(duì)照組(注射等量生理鹽水) 低，但差異無(wú)顯著性(P>0.05)。15天后，正常組小鼠無(wú)死亡數(shù)量，荷瘤組經(jīng)給予等量生理 鹽水，10只小鼠中有6只死亡，而經(jīng)注射給予rhIL-15，其10只小鼠中死亡數(shù)量為2只，死 亡比例明顯低于未給藥組。實(shí)施例3重組人白介素15對(duì)移植U14腹水瘤小鼠的影響健康的遠(yuǎn)交系Km小鼠，雌性，體重24_29g，購(gòu)自北京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；小鼠 宮頸瘤14號(hào)(U14)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理室提供，經(jīng)615近交系小鼠腹腔 傳代。小鼠腹水瘤模型的建立在無(wú)菌條件下，從腹腔移植U14瘤株第10天的615小鼠腹
理鹽水(0. 2ml)。有絲分裂指數(shù)的測(cè)定在小鼠末次給藥后第一天取材測(cè)定，取材前2小時(shí)腹腔注射秋水仙堿(劑量為 4mg/g.體重)，頸椎脫臼處死小鼠，分別去除EAC細(xì)胞和胸腺細(xì)胞，置于BSS生理鹽水中制 成但細(xì)胞懸浮液，按常規(guī)空氣干燥法制片，每個(gè)樣本重復(fù)15片，用pH6. 8的1 % Giemsa染色 液染色，經(jīng)清水漂洗，干燥后鏡檢。制好的玻片標(biāo)本于光鏡下隨機(jī)觀察計(jì)數(shù)500-1000個(gè)有核細(xì)胞(包括有絲分裂相 細(xì)胞)，按下式求出分裂細(xì)胞占觀察細(xì)胞綜述的百分率，即為各樣本的有絲分裂指數(shù)，結(jié)果 見(jiàn)表1。
MI%=應(yīng)啲細(xì)腿χ1000/ο
觀察的細(xì)胞總數(shù)表lrhIL-15對(duì)Ehrlich惡性腹水癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞有絲分裂指數(shù)的影響
ZZi觀察細(xì)胞有絲分裂Λ/ΓΤ,-_^η、0/ ZZ^
組別總數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)ΜΙ(Η⑵)％ P值
rrrj frr| frrj frrj Trrj ΠΗ^
自資資資紹資資資 照驗(yàn)照驗(yàn)照驗(yàn)照驗(yàn) 對(duì)實(shí)對(duì)實(shí)對(duì)實(shí)對(duì)實(shí)腔中抽出粘稠腹水2ml，以無(wú)菌生理鹽水稀釋，取樣，證實(shí)為活瘤細(xì)胞后，給每只Km小鼠腹 腔注入0.2ml (約3X IO7瘤細(xì)胞)。腹腔移植瘤細(xì)胞24h后，將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(腹腔 注射給予等量生理鹽水)，rhIL-15低劑量組2 X IO4U/次、中劑量組5 X IO4U/次、高劑量組 8 X IO4U/次3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，共4組，每組10只，腹腔給藥，1次/天，每周連續(xù)6天停藥一天， 連續(xù)給藥4周。療效指標(biāo)1末次給藥后統(tǒng)計(jì)各組小鼠用藥前后胸圍、體重的變化和生存期，采用 百分率比較，結(jié)果見(jiàn)表2。表2rhIL_15給藥4周后對(duì)U14腹水瘤生存期、體重及腹圍變化的影響( 士 S ) 從上表結(jié)果可知，注射給予不同劑量的rhIL-15均可一定程度地延長(zhǎng)U14腹水瘤小 鼠的存活期，給予生理鹽水的組，其四周后存活比例為0/10，而rhIL-15低、中、高三個(gè)劑量 注射給予4周后的存活比例分別為3/10、5/10、6/10，存活期顯著高于生理鹽水組。從給藥 前后體重和腹圍變化情況可以分析，對(duì)照組和低劑量rhIL-15組體重略微下降，腹圍增長(zhǎng)， 說(shuō)明瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，引起消瘦或惡質(zhì)瘤，而腹圍的增加提示腹水增多，rhIL-15 中、高劑量組體重較給藥前要稍微高，而腹圍增長(zhǎng)率相對(duì)較低，間接反映了腹腔內(nèi)腫瘤組織 增長(zhǎng)受到抑制，腹水體積增長(zhǎng)率小。療效指標(biāo)2實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)將U14細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以Hank，s液洗3次，用PRMI-1640培養(yǎng) 液調(diào)整細(xì)胞濃度為4X 105mL-l無(wú)菌取脾，制備脾細(xì)胞懸液，以Hank，s液洗3次，用PRMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃 度為4X 107mL-l，作為靶細(xì)胞。1000r/min離心lOmin，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X IO7HiL-I，作為效 應(yīng)細(xì)胞。取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各ΙΟΟμ 1(效靶比50 1)，加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板中，靶細(xì) 胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100μ 1，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和體積分?jǐn)?shù)為
的ΝΡ40各100 μ 1 ；上述各項(xiàng)均設(shè)3個(gè)平行孔，于37°C，體積分?jǐn)?shù)5 %的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4h,然后將96孔培養(yǎng)板以1500r/min離心5min，每孔吸取上清液100 μ 1置平底96孔培養(yǎng) 板中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液100μ 1，反應(yīng)3min，每孔加入lmol/1的HC130 μ 1，在酶標(biāo)儀上 490nm處測(cè)定OD值。NK細(xì)胞活性=(反應(yīng)孔OD-自然釋放孔OD)/(最大釋放孔OD-自然釋放孔 0D) X 100%NK細(xì)胞活性見(jiàn)表3表3rhIL_15對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性的影響 與模型對(duì)照組相比，*P < 0. 05，< 0. 01從上表結(jié)果可知，給予不同劑量的rhIL-15后，均可不同程度提高小鼠脾臟NK細(xì) 胞活性，差異具有顯著性(P < 0. 05或P < 0. 01)，并呈劑量增長(zhǎng)關(guān)系，高劑量組脾臟NK細(xì) 胞活性略低于正常對(duì)照組，但差異無(wú)顯著性，而模型對(duì)照組的脾臟NK細(xì)胞活性顯著要低于 正常對(duì)照組，說(shuō)明rhIL-15可以提高荷腹水瘤U14小鼠的NK細(xì)胞活性，增強(qiáng)荷瘤小鼠的免 疫功能。療效指標(biāo)3對(duì)脾臟組織中T淋巴細(xì)胞亞群⑶4+、⑶8+的影響小鼠脾細(xì)胞懸液的制備無(wú)菌取出小鼠脾臟置于盛有IOml Hank’ s液的平皿中并 將脾剪碎，用200目網(wǎng)注射器針芯研磨后1300rpm/min離心6min，在沉淀中加4ml裂解液， 5min裂解，再加Hank，s液至IOml離心，然后用Hank，s液再洗2次后用500 μ IPBS (含 0. l%NaN3)溶解，最后吸少量懸液做20倍稀釋，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞，使細(xì)胞 濃度達(dá)IO6個(gè)/ml左右。吸取100 μ 1脾細(xì)胞放入離心管中，然后加入1 μ 1的⑶4-ΡΕ和⑶8-FITC抗體避光 孵育30min，用PBS洗后離心，加含多聚甲醛的PBS500y 1固定，最后通過(guò)BD FACSlibar 流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)及配套原裝BD test試劑盒，檢測(cè)CD4、CD8陽(yáng)性表達(dá)率，結(jié)果 見(jiàn)表4。表4重組人白介素15(rhIL_15)對(duì)脾T淋巴細(xì)胞亞群⑶4+、⑶8+的影響( 與對(duì)照組相比，*P< 0. 05，**P < 0. 01。從上表結(jié)果可以看出，給予不同劑量的重組人白介素15，可以顯著提高移植U14腹 水瘤小鼠脾臟組織中T淋巴細(xì)胞亞群⑶4及其⑶4/⑶8的值，與對(duì)照組相比，差異具有顯著 性，其中中高劑量組與對(duì)照組相比差異具有及顯著性(P < 0. 01)、但各劑量組對(duì)CD8基本沒(méi) 有影響，說(shuō)明給予U14腹水瘤小鼠不同劑量的rhIL15，可以顯著提高小鼠的細(xì)胞免疫能力。實(shí)施例4重組人白介素15對(duì)肝癌H22腹水瘤小鼠生存期與生命延長(zhǎng)率的影響臨床上癌性腹腔積液是晚期肝癌常見(jiàn)的并發(fā)癥，它的產(chǎn)生直接影響患者的生活質(zhì) 量和生存期，晚期肝癌腹水患者，2-12個(gè)月后，大多死亡。本實(shí)驗(yàn)采用昆明小鼠腹腔接種 H22細(xì)胞，建立肝癌腹水模型，以研究rhIL-15對(duì)肝癌腹水的影響。
昆明小鼠，雌雄各半，體重(19士0.5) g，購(gòu)于北京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；H22細(xì)胞購(gòu) 自北京腫瘤研究所。H22細(xì)胞用10%的FBS、RPMI1640培養(yǎng)基在37°C、5%的CO2孵育箱進(jìn)行培養(yǎng)，待 細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用0. 25%的胰酶消化并收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌 后重懸，用生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)胞密度約為5 X 107個(gè)/ml，錐蟲(chóng)藍(lán)染色鏡檢細(xì)胞存活率> 95 %， 小鼠腹腔注射細(xì)胞懸浮液，0. 2ml/只，接種后，隨機(jī)分成4組，10只/組，即空白對(duì)照組(注 射給予等量的生理鹽水)、rhIL-15低劑量組2 X IO4U/次、中劑量組5 X IO4U/次、高劑量組 SXlO4U/次，腹腔注射，給藥體積0. 2ml/只，1次/天，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組小鼠在第13-18天全部死亡，治療組從第17天開(kāi)始出現(xiàn)死 亡小鼠，40天后最終各治療組小鼠均死亡，在此以各組小鼠平均生存期和生命延長(zhǎng)率作為 治療評(píng)價(jià)指標(biāo)，各組小鼠生存期見(jiàn)表5。表5各組小鼠荷瘤生存期與生命延長(zhǎng)率比較 從上表結(jié)果可以看出，給予不同劑量的rhIL-15，均可不同程度地延長(zhǎng)小鼠生存期 (相對(duì)空白對(duì)照組)，三個(gè)劑量組對(duì)小鼠生命延長(zhǎng)率分別為31. 3%,62. 5%和87. 5%，但40 天后各組小鼠均全部死亡，提示rhIL-15可延長(zhǎng)肝癌H22腹水瘤的生存期。
權(quán)利要求
重組人白細(xì)胞介素15在具有治療和緩解惡性腹水瘤藥物中的應(yīng)用。
2.含有重組人白介素15的藥物組合物在制備具有治療和緩解惡性腹水瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組人白介素15(rhIL-15)以及含有重組人白介素15的藥物組合物在制備具有治療惡性腹水瘤藥物中的應(yīng)用，經(jīng)體內(nèi)藥理實(shí)驗(yàn)證明，惡性腹水模型小鼠注射給予rhIL-15后，可顯著延長(zhǎng)其生存期。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101912599SQ20101024038
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月30日
發(fā)明者侯建華, 周德勝, 張春麗, 熊國(guó)裕 申請(qǐng)人:北京凱因科技股份有限公司;北京凱因生物技術(shù)有限公司