專利名稱：Mg53基因在治療胰島素抵抗和ⅱ型糖尿病及其相關(guān)病癥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及MG53基因在治療胰島素抵抗和II型糖尿病及其相關(guān)病癥中的應(yīng)用， 具體是在制備和/或篩選預(yù)防、緩解和/或治療胰島素抵抗和I I型糖尿病及其相關(guān)病癥 的藥物中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于近年來我國人民生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整和生活方式的改變，糖尿 病患病率不斷上升，中國已經(jīng)成為繼印度之后的第二糖尿病大國(1)。在糖尿病的患病群體 中，II型糖尿病占據(jù)大多數(shù)(95%)，與全身肥胖和/或體脂分布異常(腹型肥胖)關(guān)系密 切。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到胰島素抵抗是II型糖尿病的主要特征和 中心環(huán)節(jié)，胰島素抵抗是指機(jī)體不能利用胰島素有效地激活胰島素受體信號(hào)通路(2，3)。正 常情況下，一旦胰島素與胰島素受體結(jié)合，會(huì)催化受體的兩聚體化和自身磷酸化，使之充分 激活，然后招募并磷酸化胰島素受體底物(IRSs) (4)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)廣泛的下游信號(hào)通路 被激活(5)。其中主要包括PI3K-Akt通路、Ras-MAPK通路和Cbl/CAP-TC10通路(5)。這 些信號(hào)通路以協(xié)同的方式共同調(diào)控著細(xì)胞囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)合成、酶的激活與失活以及基 因表達(dá)等生物過程，從而最終對(duì)糖、脂肪和蛋白質(zhì)這三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝進(jìn)行控制(5)。在II型糖尿病中，由于胰島素作用缺陷，導(dǎo)致糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝異常，隨病程 延長，可致眼、腎、神經(jīng)、心臟和血管等多系統(tǒng)進(jìn)行性損害，引起功能衰竭，使患者的生活質(zhì) 量降低，壽命縮短，病死率增高。在我國，II型糖尿病的發(fā)病日趨低齡化，給社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā) 展帶來沉重的負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重危害人民的生命健康。為此，一定要對(duì)其積極防治，而防治的關(guān)鍵 就在于改善胰島素抵抗。由于對(duì)糖尿病的病因和發(fā)病機(jī)制尚未充分明了，缺乏針對(duì)病因的治療。目前強(qiáng)調(diào) 早期治療、長期治療、綜合治療和治療個(gè)體化的原則。國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)提出了糖尿病 現(xiàn)代治療的五個(gè)要點(diǎn)，分別是飲食控制，運(yùn)動(dòng)療法、血糖監(jiān)測(cè)、藥物治療和糖尿病教育。長 期以來醫(yī)學(xué)界重視控制高血糖，1993年以來，以循證醫(yī)學(xué)為原則的DCCT (糖尿病控制與并 發(fā)癥研究，由美國和加拿大聯(lián)合進(jìn)行)和UKPDS (英國前瞻性糖尿病研究)分別對(duì)大樣本的 I型和II型糖尿病患者進(jìn)行為期平均達(dá)10年的長期隨訪，結(jié)果表明應(yīng)用強(qiáng)化治療使血糖接 近正常可預(yù)防糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生；不僅控制空腹血糖，還應(yīng)注意餐后血糖達(dá)標(biāo)。由于II型糖尿病患者很少自發(fā)性發(fā)生酮癥酸中毒等急性并發(fā)癥，多數(shù)患者不需 要胰島素治療維持生命，(除非在某些階段，可能需要胰島素控制代謝紊亂)，所以口服降 糖藥在II型糖尿病的藥物治療中占有相當(dāng)大的比例。口服藥物治療方面目前應(yīng)用比較多 的降糖藥物主要有四類促胰島素分泌劑(磺脲類和格列奈類)、雙胍類、α _糖苷酶抑制劑 類和胰島素增敏劑類。這些藥物以及胰島素作用于全身各個(gè)代謝器官(α-糖苷酶抑制劑 除外)，所以在糾正血糖的同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生很多的副作用(6)，比如增加體重(雙胍類除外)，其他副作用具體見下1)促進(jìn)胰島素分泌劑的不良反應(yīng)主要是低血糖，吃藥后會(huì)出現(xiàn)心慌、出汗、有饑餓 感癥狀，嚴(yán)重者甚至?xí)霈F(xiàn)意識(shí)障礙，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)皮疹等過敏反應(yīng)以及肝腎功能損害。2)雙胍類主要是胃腸道反應(yīng)(患者服藥后會(huì)有惡心、食欲不振的現(xiàn)象)以及乳酸 酸中毒(服用降糖靈后，患者會(huì)出現(xiàn)乏力、意識(shí)障礙甚至昏迷的癥狀)，還有一部分病人會(huì) 有肝腎功能損害和過敏性反應(yīng)以及大細(xì)胞性貧血反應(yīng)。3) α -糖苷酶抑制劑是通過延緩葡萄糖的吸收從而達(dá)到降低血糖的目的，由于自 身不吸收，對(duì)全身的副作用就相對(duì)小一些，其最主要的副作用是胃腸道反應(yīng)，患者服藥后 會(huì)有腹脹、腹痛、腹瀉和腸排氣過多等現(xiàn)象。4)胰島素增敏劑是通過激活PPAR-而起作用的，其最大的副作用是肝損害以及增 加血容量，從而加重心臟負(fù)擔(dān)。由于糖尿病人需要終身服藥，很多患者對(duì)長期服藥的副作用比較擔(dān)心，而這些副 作用的控制也往往成為降糖治療成敗的關(guān)鍵因素之一。MG53是已知的人體的基因，又稱三結(jié)構(gòu)域蛋白72(TRIM72)，其DNA序列如美國專 利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)枽浴?S. Patent Application Serial No. 12/307, 303)中所述。最近又發(fā)現(xiàn) MG53蛋白在心肌和骨骼肌中特異性表達(dá)，其氨基酸序列如專利申請(qǐng)“MG53蛋白預(yù)防和/或 治療心臟缺血/再灌損傷的用途(申請(qǐng)?zhí)?200910241451. 3)”中MG53蛋白氨基酸序列表中 的SEQ ID NO. 1所示。已有的研究結(jié)果表明，在骨骼肌中MG53能夠作為一種結(jié)構(gòu)蛋白促進(jìn) 細(xì)胞膜損傷的修復(fù)，同時(shí)也能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)小泡的運(yùn)轉(zhuǎn)和骨骼肌細(xì)胞再生。目前，有關(guān)MG53 的研究都是在骨骼肌內(nèi)進(jìn)行的。已知MG53基因表達(dá)的MG53蛋白僅在心臟和骨骼肌(全身 最大的胰島素靶器官)中表達(dá)(7)(圖1)，推測(cè)MG53基因的表達(dá)很可能與胰島素的功能有 關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述現(xiàn)有降糖治療技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是確定MG53基因的表 達(dá)與胰島素抵抗特征之間的相互關(guān)系，提供一個(gè)用于治療胰島素抵抗且骨骼肌特異性的的 靶基因-MG53的新用途，進(jìn)而用MG53作為靶點(diǎn)，把拮抗MG53應(yīng)用于糖尿病及其相關(guān)病癥的 治療。本發(fā)明的目的通過下述的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明首先通過大量的試驗(yàn)，深入研究，確定MG53表達(dá)與胰島素抵抗之間的關(guān) 系1、在出現(xiàn)胰島素抵抗的情況下，其MG53的表達(dá)明顯上調(diào)本發(fā)明選用db/db和SHR(自發(fā)性高血壓大鼠)這兩種不同類型的胰島素抵 抗的動(dòng)物模型(8，9)，動(dòng)物經(jīng)喂養(yǎng)并將其處死以后，對(duì)心臟和骨骼肌利用RIPA (Radio Immunoprecipitation Assay,放射免疫沉淀分析)用裂解液結(jié)合超聲的方法裂解后得到蛋 白，利用免疫印跡的方法(Western blot)結(jié)合特異性識(shí)別MG53蛋白的抗體進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定 其MG53的表達(dá)，結(jié)果表明，這兩種不同類型的胰島素抵抗動(dòng)物模型中，其MG53的表達(dá)明顯 上調(diào)(圖2、圖3)。2、MG53的過表達(dá)可產(chǎn)生胰島素抵抗的基本特征
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本發(fā)明通過用GFP-MG53腺病毒載體(Ad-GFP_MG53)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的成年鼠心肌 細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞，使MG53在細(xì)胞中過表達(dá)，提取蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE-免疫印跡試驗(yàn) (Western blot)檢測(cè)MG53蛋白質(zhì)含量(圖5A)。通過在熒光顯微鏡下觀察到感染腺病毒的 細(xì)胞呈現(xiàn)熒光(圖4)，以及通過MG53蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)所確定的MG53過表達(dá)的效率(圖 5B)，表明在Ad-GFP-MG53感染的大鼠心肌細(xì)胞中，MG53已過表達(dá)(* :p < 0. 001 vs GFP 組)。確定在Ad-GFP-MG53感染的大鼠心肌細(xì)胞中，MG53已過表達(dá)后，用摻入作為示蹤劑的 3H標(biāo)記的2-脫氧葡萄糖的臺(tái)氏液處理細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)2-脫氧葡萄糖的含量通過液閃儀進(jìn)行 計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MG53過表達(dá)的體外細(xì)胞可以模擬下述的胰島素抵抗的基本特征過表達(dá)的 MG53抑制胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取(圖6，* :p < 0. 001 vs GFP組0分鐘)；同時(shí)過表達(dá) MG53還能夠抑制胰島素引起的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的改變。3、MG53的過表達(dá)抑制胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是實(shí)現(xiàn)胰島素生物學(xué)功能的生物化學(xué)基礎(chǔ)，也是本領(lǐng)域研 究的熱點(diǎn)之一。本發(fā)明中檢測(cè)了 Akt、ERK和IRS-I三個(gè)基本節(jié)點(diǎn)。在成年大鼠心肌細(xì)胞 中過表達(dá)MG53后，用胰島素刺激細(xì)胞，然后提取細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE-免疫印跡試 驗(yàn)(Western blot)，結(jié)果顯示過表達(dá)MG53完全抑制了胰島素介導(dǎo)的下游信號(hào)Akt和ERK 的激活(圖7)。進(jìn)一步，在分化的C2C12肌管細(xì)胞中過表達(dá)MG53，用胰島素刺激后，進(jìn)行 Western blot，結(jié)果顯示過表達(dá)的MG53完全抑制胰島素介導(dǎo)的IR、IRS_l、Akt、GSK3和ERK 的激活，而且會(huì)抑制IR和IRS-I的蛋白表達(dá)水平(圖8)。進(jìn)一步表明，MG53是通過抑制 IR(Insulinreceptor)和IRS-1的激活導(dǎo)致胰島素抵抗的(圖6-8)。4、MG53缺陷顯著抑制了高脂飲食誘導(dǎo)的高胰島素血癥、高血壓癥、高膽固醇血癥； MG53缺陷還可抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖、促進(jìn)葡萄糖代謝并且增強(qiáng)胰島素敏感性。本發(fā)明選用野生型和MG53敲除型的C57小鼠進(jìn)行試驗(yàn)，將C57野生型和MG53敲 除型小鼠各分成正常組和高脂組兩組，每組20只小鼠。C57小鼠野生型和MG53敲除型的正 常組給予正常生長繁殖飼料；高脂組給予脂肪占60%能量百分比的高脂飼料，然后通過對(duì) 正常組和高脂組小鼠進(jìn)行糖耐量試驗(yàn)、清醒狀態(tài)下的血壓測(cè)定、血清膽固醇含量的測(cè)定、小 鼠體重的逐周測(cè)量，繪制小鼠生長曲線圖、空腹血糖和自由進(jìn)食狀態(tài)時(shí)的血糖的檢測(cè)，研究 MG53缺陷對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的高胰島素血癥、高血壓癥、高膽固醇血癥、肥胖、葡萄糖代謝、胰 島素敏感性的影響。結(jié)果表明，敲除MG53基因所致的MG53缺陷可以降低空腹血糖和餐后血 糖；MG53缺陷還可以顯著抑制高脂飲食誘導(dǎo)的高胰島素血癥、高膽固醇血癥和高血壓癥， 對(duì)于所誘導(dǎo)的肥胖有部分抑制作用。(圖9-16)由以上結(jié)果可知MG53基因的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生，而MG53是通過抑 制IR (Insulin receptor)和IRS-I的激活導(dǎo)致胰島素抵抗的；MG53缺陷顯著抑制了高脂飲 食誘導(dǎo)的高胰島素血癥、高血壓癥、高膽固醇血癥；MG53缺陷還可抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥 胖、促進(jìn)葡萄糖代謝并且增強(qiáng)胰島素敏感性。因此，MG53基因可作為藥物靶點(diǎn)，構(gòu)建MG53基 因過表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，用于篩選預(yù)防、緩解和/或治療胰島素抵抗和II型 糖尿病及其相關(guān)病癥的藥物；MG53基因也可作為基因治療中的靶基因，設(shè)計(jì)并制備預(yù)防、 緩解和/或治療胰島素抵抗和II型糖尿病及其相關(guān)病癥的藥物和/或生物學(xué)試劑，通過基 因工程技術(shù)達(dá)到預(yù)防、緩解和/或治療胰島素抵抗和II型糖尿病及其相關(guān)病癥的目的。例 如以MG53為靶基因，設(shè)計(jì)可干擾MG53表達(dá)的雙鏈siRNA，通過化學(xué)方法合成以后，注射入人體通過RNA干擾的方法使MG53基因沉默來治療II型糖尿病及其相關(guān)病癥；還可以設(shè)計(jì)并 構(gòu)建MG53的突變體，注射后進(jìn)入細(xì)胞，競爭MG53原形的作用底物，從而抑制MG53的功能， 起到治療目的；此外，還可以以MG53為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)小分子化合物抑制劑，利用MG53基因過表 達(dá)的體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，通過篩選，發(fā)現(xiàn)其中能夠特異性抑制MG53的分子，從而為 胰島素抵抗和II型糖尿病的治療提供新的治療性分子。本發(fā)明提供了 MG53基因的表達(dá)與胰島素抵抗之間的相互關(guān)系，因此，MG53可作為 藥物靶點(diǎn)或基因治療中的靶基因應(yīng)用于胰島素抵抗和II型糖尿病及其相關(guān)病癥的預(yù)防、 緩解和/或治療，能夠?yàn)橐葝u素抵抗和II型糖尿病的治療提供新的治療方向；同時(shí)，由于 MG53僅在骨骼肌和心臟中表達(dá)，從理論上考慮，控制此基因的表達(dá)并不會(huì)影響身體其他系 統(tǒng)的功能，這將極大地降低其在實(shí)際應(yīng)用中的不良反應(yīng)，提高治療效果，從而提供了一條有 效治療II型糖尿病及其相關(guān)病癥的新途徑。此外，由于目前對(duì)糖尿病的病因和發(fā)病機(jī)制尚 未充分明了，缺乏針對(duì)病因的治療，MG53基因的表達(dá)與胰島素抵抗之間的相互關(guān)系的確定， 無疑為進(jìn)一步研究糖尿病的病因和發(fā)病機(jī)制以及治療方法打下了基礎(chǔ)。本說明書中所用的術(shù)語的縮寫定義如下db/db 瘦素受體突變的小鼠，由C57BL/KsJ近親交配株常染色體隱性遺傳衍化而 來，屬胰島素抵抗的動(dòng)物模型；db/+ 瘦素受體正常的小鼠，用作db/db小鼠的對(duì)照；SHR 自發(fā)性高血壓大鼠，屬胰島素抵抗的動(dòng)物模型；Akt、ERK 細(xì)胞內(nèi)兩種激酶，是胰島素受體向細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)其信號(hào)的重要介導(dǎo)分子， 其中Akt為蛋白激酶B(Protain Kinase B)、ERK為胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase)；651(3:糖原合成酶激酶3 0 (Glycogen synthetase kinase)，是 Akt 的重要的下游 分子，受Akt調(diào)節(jié)；IR:胰島素受體(Insulin rec印tor)，能夠和胰島素結(jié)合激活后催化細(xì)胞內(nèi)的胰 島素相關(guān)的反應(yīng)；IRS 胰島素受體底物(Insulin receptor substrate)，能夠被激活的胰島素受體 酪氨酸激酶作用的底物，其上具有十幾個(gè)酪氨酸殘基可被磷酸化，磷酸化的IRS能夠結(jié)合 并激活下游效應(yīng)物；Ad-GFP:含GFP(綠色熒光蛋白)的腺病毒，在本發(fā)明中用作對(duì)照腺病毒； Ad-MG53 (Ad-GFP-MG53)含GFP-MG53 (綠色熒光蛋白-MG53融合蛋白)的腺病毒，在本發(fā)明 中用作MG53過表達(dá)的腺病毒。


圖1是小鼠組織中MG53的Northern blot結(jié)果，說明MG53僅在小鼠心臟和骨骼 肌中表達(dá)。圖2是MG53在db/db型的胰島素抵抗動(dòng)物模型的心臟和骨骼肌中的表達(dá)圖 (Western blot)，顯示MG53在25周齡db/db小鼠中表達(dá)上調(diào)，其中的GAPDH(Glyceraldeh yde-3-phosphate dehydrogenase)為甘油醛_3_磷酸脫氫酶，用作內(nèi)參。圖3是MG53在6月齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)和正常大鼠(WKY，作為SHR的對(duì)照)心臟中的表達(dá)圖(Western blot)，顯示MG53在SHR中的表達(dá)上調(diào)，其中的GAPDH(Glyc eraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)為甘油Sl _3_ 舞酸脫fig|，用作內(nèi)參。圖4是Ad-GFP和Ad_MG53 (Ad-GFP_MG53)感染成年大鼠心肌細(xì)胞48小時(shí)后，在熒 光顯微鏡下的觀察照片。圖5中，A圖是Ad-GFP和Ad_MG53 (Ad-GFP_MG53)感染成年大鼠心肌細(xì)胞48小時(shí) 后，提取蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE-免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)的結(jié)果，用于檢測(cè)MG53蛋 白質(zhì)的含量，其中1、2，3、4和5、6泳道分別代表三組平行試驗(yàn)，1、3、5和2、4、6分別表示用 Ad-GFP和Ad-MG53轉(zhuǎn)染，“ + ”表示有腺病毒感染，“_”表示無腺病毒感染；B圖顯示MG53過 表達(dá)的效率(* :p < 0. OOlvs GFP組)。圖6是Ad-GFP或Ad_MG53 (Ad-GFP_MG53)感染的成年大鼠心肌細(xì)胞的[3H]-葡萄 糖攝取檢測(cè)圖，表明過表達(dá)MG53能夠完全抑制胰島素介導(dǎo)的成年大鼠心肌細(xì)胞葡萄糖攝 取(* :p < 0. 001 vs GFP 組 0 分鐘)。圖7是Ad-GFP或Ad-MG53(Ad-GFP-MG53)感染的成年大鼠心肌細(xì)胞用胰島素誘導(dǎo) 0分鐘、5分鐘和10分鐘后的胰島素受體下游信號(hào)Western blot檢測(cè)圖，顯示過表達(dá)MG53 完全抑制了胰島素介導(dǎo)的下游信號(hào)Akt和ERK的激活；其中“ρ-”代表磷酸化的激酶(Akt 和ERK) ；“t-”代表總的(包括磷酸化和未磷酸化的)激酶(Akt和ERK) ；Akt S473和Akt T308代表不同的Akt的磷酸化位點(diǎn)；“ + ”表示有腺病毒感染，“_”表示無腺病毒感染，Ad-GFP 和Ad-MG53都為“-”的為對(duì)照。圖8是小鼠分化的C2C12肌管細(xì)胞用胰島素誘導(dǎo)10分鐘后的胰島素受體底物 I(IRS-I)信號(hào)Western blot檢測(cè)圖，顯示過表達(dá)MG53完全抑制胰島素介導(dǎo)的IR(Insulin receptor), IRS-U Akt、GSK3和ERK的激活，而且會(huì)抑制IR和IRS-I的蛋白質(zhì)表達(dá)； 其中“P-”代表磷酸化的激酶(Akt，ERK和GSK3)或胰島素受體及其底物(IR和IRS)； P-IRSl (y895)代表在895位酪氨酸上磷酸化的IRSl ( 一種重要的IRS亞型)；“t_”或者沒 有標(biāo)記代表總的(包括磷酸化和未磷酸化的)激酶或受體及其底物；“ + ”表示有腺病毒感 染，“_”表示無腺病毒感染，Ad-GFP和Ad-MG53都為“-”的為對(duì)照；左邊的三條泳道代表在 沒有胰島素刺激的條件下，沒有轉(zhuǎn)染腺病毒、或者轉(zhuǎn)染對(duì)照腺病毒，以及過表達(dá)MG53的腺 病毒對(duì)骨骼肌細(xì)胞中各種激酶，受體以及受體底物的功能狀態(tài)(磷酸化)的影響，作為右邊 的三條有胰島素刺激的條件下，代表同樣含義的泳道的對(duì)照；α-微管蛋白(a-tubulin) 和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)用作內(nèi)參。圖9是野生型小鼠和MG53敲除小鼠在正常飲食或高脂飲食喂養(yǎng)7周時(shí)的血糖檢 測(cè)圖，顯示MG53的缺陷可降低高脂飲食誘導(dǎo)的空腹和有餐的血糖升高，甚至也可抑制正常 飲食情況下的有餐血糖升高(* =P < 0. 05vs野生型正常組)。圖10是野生型小鼠和MG53敲除小鼠在正常飲食或高脂飲食喂養(yǎng)條件下的生長曲 線圖，顯示MG53缺陷可部分抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖(ρ < 0. 05野生型高脂組和MG53敲 除型高脂組vs野生型正常組；ρ < 0. 05野生型高脂組vs MG53敲除型高脂組)。圖11是野生型小鼠和MG53敲除小鼠在正常飲食或高脂飲食喂養(yǎng)7周、13周和30 周時(shí)的糖耐量試驗(yàn)檢測(cè)圖，顯示MG53缺陷能增強(qiáng)葡萄糖的代謝(* φ < 0. 05vs野生型正常 組，_ :p < 0. OOlvs野生型正常組)。圖12是野生型小鼠和MG53敲除小鼠在正常飲食或高脂飲食喂養(yǎng)7周、13周和30
7周時(shí)的胰島素耐受試驗(yàn)檢測(cè)圖，顯示MG53缺陷能增強(qiáng)高脂食誘導(dǎo)情況下的胰島素敏感性 (*** .ρ < 0. OOlvs野生型正常組)。圖13是野生型小鼠和MG53敲除小鼠在正常飲食或高脂飲食喂養(yǎng)33周時(shí)的血清 胰島素含量在糖耐量試驗(yàn)過程中的檢測(cè)圖，顯示MG53缺陷明顯抑制了高脂飲食誘導(dǎo)的高 胰島素血癥=P < 0. OOlvs野生型正常組)。圖14是野生型小鼠和MG53敲除小鼠在正常飲食或高脂飲食喂養(yǎng)33周時(shí)的血清 胰島素含量在糖耐量試驗(yàn)過程中的升高百分比換算圖，顯示MG53缺陷抑制了高脂飲食誘 導(dǎo)的胰島素釋放第一時(shí)相的高峰缺失(* =P < 0. 05vs野生型正常組)。圖15是野生型小鼠和MG53敲除小鼠在正常飲食或高脂飲食喂養(yǎng)36周時(shí)的血壓 圖(* :p < 0. 05vs野生型正常組)。圖16是野生型小鼠和MG53敲除小鼠在正常飲食或高脂飲食喂養(yǎng)33周時(shí)的血膽 固醇圖(* =P < 0. OOlvs野生型正常組，1* :p < 0. OOlvs野生型高脂組)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1MG53在胰島素抵抗模型動(dòng)物的心臟和骨骼肌中的表達(dá)(1)試驗(yàn)動(dòng)物選用db/db小鼠和自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)兩種胰島素抵抗的動(dòng)物模型作為試驗(yàn) 組；選用瘦素受體正常的db/+小鼠作為對(duì)照組。其中db/db小鼠購自Jackson Lab公司， 這種小鼠是通過基因改造，使其“瘦素”受體的基因突變，隨著年齡的增長會(huì)自發(fā)出現(xiàn)肥胖、 糖尿病和胰島素抵抗等癥狀，從而成為胰島素抵抗的動(dòng)物模型。對(duì)于自發(fā)性高血壓大鼠，是 從正常大鼠中篩選血壓高者，而后利用血壓高的大鼠進(jìn)行交配，在子代中繼續(xù)篩選血壓高 的大鼠，經(jīng)過數(shù)代篩選后得到隨著年齡增加自發(fā)性出現(xiàn)高血壓和胰島素抵抗癥狀的大鼠。 每組動(dòng)物至少為6-8只。(2)試驗(yàn)方法采用24周齡的db/+小鼠，利用普通小鼠飼料喂養(yǎng)，得到對(duì)照小鼠；采用相同周齡 的db/db小鼠和自發(fā)性高血壓大鼠，用普通的小鼠飼料進(jìn)行喂養(yǎng)，喂養(yǎng)的時(shí)間與對(duì)照小鼠 相同。所有的動(dòng)物都能夠自由采食。(3)檢測(cè)方法及結(jié)果每組的動(dòng)物處死以后，對(duì)心臟和骨骼肌利用RIPA(Radiolmmunoprecipitation Assay，放射免疫沉淀分析)用裂解液結(jié)合超聲的方法裂解后得到蛋白，利用免疫印跡的方 法(Westernblot)結(jié)合特異性識(shí)別MG53蛋白的抗體進(jìn)行檢測(cè)，每組至少檢測(cè)6_8只動(dòng)物。 檢測(cè)結(jié)果如圖2和圖3所示。由圖2可見，與正常小鼠相比，MG53在25周齡的胰島素抵抗 db/db小鼠的心臟和骨骼肌中表達(dá)明顯上調(diào)；如圖3所示，MG53在6月齡的另一種胰島素抵 抗的自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的心臟中表達(dá)也上調(diào)。實(shí)施例2在成年大鼠心肌細(xì)胞中過表達(dá)的MG53抑制胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取(1)在成年大鼠心肌細(xì)胞中過表達(dá)MG53取8周齡的雄性SD大鼠心臟，酶法灌流分離細(xì)胞，細(xì)胞種于培養(yǎng)皿中(10)，以 GFP或GFP-MG53腺病毒(Ad-GFP或Ad-GFP_MG53) 200moi感染48小時(shí)，在熒光顯微鏡下觀 察轉(zhuǎn)染效率，感染腺病毒的細(xì)胞可以在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)熒光(圖4)。提取蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE-免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)MG53蛋白質(zhì)含量(圖5A)，確定MG53過表 達(dá)的效率(圖5B)。圖4和圖5表明在Ad-GFP-MG53感染的大鼠心肌細(xì)胞中，MG53已過表 達(dá)(* :p < 0. 00IvsGFP組，每組至少6-8次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果)。(2)檢測(cè)被過表達(dá)MG53的成年大鼠心肌細(xì)胞攝取的2_脫氧葡萄糖含量以GFP或GFP-MG53腺病毒(Ad-GFP或Ad-GFP_MG53) 200moi感染成年大鼠心肌細(xì) 胞(IO5細(xì)胞/孔)48小時(shí)后，用臺(tái)氏液(IMtCa2+])室溫孵育2小時(shí)，然后換為含0或10_7M 胰島素(Sigma，USA)的臺(tái)氏液室溫處理30分鐘，最后5分鐘時(shí)摻入作為示蹤劑的3H標(biāo)記 的2-脫氧葡萄糖(PerkinElmer公司，USA) 1 μ Ci/ml，30分鐘時(shí)棄除臺(tái)氏液，用0. 5M NaOH 終止反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)2-脫氧葡萄糖的含量通過液閃儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。所得數(shù)據(jù)在減去非特異性的 計(jì)數(shù)[預(yù)先用20M松弛素Wcytochalasin B)在加胰島素之前進(jìn)行處理，得到的計(jì)數(shù)，這個(gè) 數(shù)值也可以作為內(nèi)參]即為細(xì)胞實(shí)際攝取的3H標(biāo)記的2-脫氧葡萄糖。結(jié)果如圖6所示， 因?yàn)榇龠M(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取是胰島素最基本的生物學(xué)特性，圖6中過表達(dá)MG53完全抑制 了胰島素介導(dǎo)的3H標(biāo)記的2-脫氧葡萄糖攝取，表明了細(xì)胞中MG53的過表達(dá)導(dǎo)致了胰島素 抵抗(* =P < 0. 00IvsGFP組0分鐘，每組至少6-8次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果)。實(shí)施例3在成年大鼠心肌細(xì)胞中過表達(dá)的MG53抑制胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(1)在成年大鼠心肌細(xì)胞中過表達(dá)MG53的方法同實(shí)施例2中的(1)所述。(2)檢測(cè)過表達(dá)MG53的成年大鼠心肌細(xì)胞中MG53的過表達(dá)對(duì)胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)的抑制。以 GFP 腺病毒(對(duì)照病毒)或 GFP-MG53 腺病毒(Ad-GFP 或 Ad-GFP_MG53) 200moi 感染成年大鼠心肌細(xì)胞(IO5細(xì)胞/孔)48小時(shí)后，用IO-7M的胰島素刺激0分鐘、5分鐘和 10分鐘，然后提取細(xì)胞蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE-免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)，結(jié)果顯示過 表達(dá)MG53完全抑制了胰島素介導(dǎo)的下游信號(hào)Akt和ERK的激活(圖7)。進(jìn)一步，在分化的 C2C12肌管細(xì)胞[2%馬血清(Hyclone，USA)誘導(dǎo)6天]中過表達(dá)MG53，用10_7M的胰島素 刺激10分鐘后，進(jìn)行Westernblot，結(jié)果顯示完全抑制胰島素介導(dǎo)的IR、IRS-l、Akt、GSK3 β 和ERK的激活，而且會(huì)抑制IR和IRS-I的蛋白表達(dá)水平(圖8)。由圖8可見，在正常情況 下，IR和IRS的磷酸化水平很低，檢測(cè)不到，而在胰島素刺激以后，它們的磷酸化可以增加 很多，但是在MG53過表達(dá)以后胰島素刺激的磷酸化增加遭到削弱；對(duì)于總蛋白IR和IRS， 在圖8中可以看到，無論是正常情況下，還是胰島素刺激的條件下，MG53過表達(dá)后的條帶其 強(qiáng)度都要比對(duì)照和對(duì)照病毒的要低，這都表明了 MG53過表達(dá)引起IR和IRSl的蛋白水平下 降。胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是實(shí)現(xiàn)胰島素生物學(xué)功能的生物化學(xué)基礎(chǔ)。本實(shí)施例中檢測(cè)了 Akt,ERK和IRS-I三個(gè)基本節(jié)點(diǎn)，結(jié)果表明細(xì)胞中過表達(dá)的MG53抑制了胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)，從而導(dǎo)致胰島素抵抗(每組至少6-8次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果)實(shí)施例4MG53缺陷抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖將C57小鼠野生型和MG53敲除型(MG53敲除型小鼠的制備方法見《NatureCell Biology)), Cai et. al. 2009 ；11(1) 56-64)各分成正常飲食組和高脂飲食組兩組，每組20 只小鼠。C57小鼠野生型和MG53敲除型的正常組從3周齡起給予正常生長繁殖飼料(飼 料購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)；高脂組從3周齡起給予脂肪占60%能量百分比的高脂飼料(飼 料購自Research Diets, USA)，然后逐周測(cè)量小鼠體重，繪制小鼠生長曲線圖(圖10)。結(jié) 果顯示，對(duì)于野生型小鼠，高脂飲食飼喂后，體重出現(xiàn)明顯增加(從35g左右增加到55g左右)，而MG53缺陷在正常飲食情況下對(duì)于小鼠體重生長沒有明顯影響，但是高脂飲食誘導(dǎo) 的肥胖可以受到明顯抑制(p<0. 05野生型高脂組和MG53敲除型高脂組vs野生型正常組； P < 0. 05野生型高脂組vs MG53敲除型高脂組)。實(shí)施例5MG53缺陷促進(jìn)葡萄糖代謝并且增強(qiáng)胰島素敏感性將C57野生型和MG53敲除型小鼠(制備方法同實(shí)施例4)各分成正常飲食組和高 脂飲食組兩組，每組20只小鼠，喂養(yǎng)方法同實(shí)施例4。在C57小鼠10周齡時(shí)，對(duì)其空腹血糖 和自由進(jìn)食狀態(tài)時(shí)的血糖進(jìn)行檢測(cè)(血糖儀及試紙購自Roche公司，USA)，結(jié)果顯示MG53 的缺陷可降低高脂飲食誘導(dǎo)的空腹和有餐的血糖升高，并可抑制正常飲食情況下的有餐血 糖升高(圖9，* :p < 0. 05vs野生型正常組)。喂養(yǎng)7周、13周、30周后分別進(jìn)行糖耐量試驗(yàn)(禁食18小時(shí)，腹腔注射葡萄糖 2g/kg體重，監(jiān)測(cè)給糖前和給糖后15分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘和120分鐘的血糖值)， 結(jié)果顯示喂養(yǎng)高脂飲食的野生型小鼠，腹腔注射葡萄糖以后，引起血糖一過性上升，其持 續(xù)時(shí)間和幅度分別比同樣進(jìn)行高脂飲食飼養(yǎng)MG53敲除小鼠要長和高得多，顯示MG53缺陷 能增強(qiáng)葡萄糖的代謝(圖11，* :p < 0. 05vs野生型正常組，:p < 0. OOlvs野生型正常 組)。喂養(yǎng)7周、13周、30周后分別進(jìn)行胰島素耐受試驗(yàn)(自由進(jìn)食狀態(tài)時(shí)，腹腔注射胰 島素0. 75U/kg體重，監(jiān)測(cè)給胰島素前和給胰島素后15分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘和120 分鐘的血糖值)，結(jié)果換算成給胰島素前血糖值的百分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示喂養(yǎng)高脂飲食的野生 型小鼠，腹腔注射胰島素以后，引起血糖一過性下降，其持續(xù)時(shí)間和幅度分別比同樣進(jìn)行高 脂飲食飼養(yǎng)MG53敲除小鼠要短和低得多，顯示MG53缺陷能增強(qiáng)高脂食誘導(dǎo)情況下的胰島 素敏感性(圖12，:p < 0. OOlvs野生型正常組)。兩個(gè)結(jié)果都提示，MG53敲除小鼠進(jìn) 行高脂飲食飼養(yǎng)以后對(duì)于胰島素的敏感性要高于同樣處理的野生型小鼠。實(shí)施例6MG53缺陷抑制高脂飲食誘導(dǎo)的高胰島素血癥高胰島素血癥是胰島素抵抗的重要標(biāo)志之一，而血漿胰島素的測(cè)量特別是胰島素 釋放第一時(shí)相的情況對(duì)于評(píng)價(jià)胰島素細(xì)胞功能有重要意義。同實(shí)施例5將C57野生型和MG53敲除型小鼠(制備方法同實(shí)施例4)各分成正常 飲食組和高脂飲食組兩組，每組20只小鼠。對(duì)正常組和高脂組的小鼠分別給予正常生長繁 殖飼料(同實(shí)施例4)和高脂飲食(同實(shí)施例4)的喂養(yǎng)，喂養(yǎng)至33周時(shí)，對(duì)正常組和高脂 組小鼠行糖耐量試驗(yàn)在給糖前和給糖后15分鐘及30分鐘，自鼠尾取血，3，OOOg 15分鐘 分離血清，用酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清胰島素含量(Linco公司，USA)。結(jié)果顯示高脂飲食喂養(yǎng) 的野生型小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的高胰島素血癥，而且葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素釋放第一時(shí)相的高峰也 缺失了 ；而高脂飲食喂養(yǎng)的MG53敲除小鼠其高脂飲食誘導(dǎo)的高胰島素血癥被明顯抑制(圖 13，*** :p < 0. OOlvs野生型正常組)，并且出現(xiàn)了葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素釋放第一時(shí)相的高 峰(圖14，* :p < 0. 05vs野生型正常組)。實(shí)施例7MG53缺陷抑制高脂飲食誘導(dǎo)的高血壓癥高血壓癥是急性心腦血管事件的重要危險(xiǎn)因素，也是形成胰島素抵抗的重要病理 生理基礎(chǔ)之一。同實(shí)施例5將C57小鼠野生型和MG53敲除型(制備方法同實(shí)施例4)各分 成正常飲食組和高脂飲食組兩組，每組10只小鼠。對(duì)正常組和高脂組的小鼠分別給予正常 生長繁殖飼料(同實(shí)施例4)和高脂飲食(同實(shí)施例4)的喂養(yǎng)，喂養(yǎng)至36周時(shí)，對(duì)正常組和高脂組小鼠進(jìn)行了清醒狀態(tài)下的血壓測(cè)定(BP-2000，ViSitech)，結(jié)果顯示高脂飲食喂養(yǎng) 的野生型小鼠比普通飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠的血壓明顯升高，而高脂飲食喂養(yǎng)的MG53敲 除小鼠的血壓保持正常(圖15，* :p < 0. 05vs野生型正常組)。實(shí)施例8MG53缺陷抑制高脂飲食誘導(dǎo)的高膽固醇血癥高膽固醇血癥是動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要病理生理基礎(chǔ)，后者是II型糖尿病慢 性并發(fā)癥的中心環(huán)節(jié)。同實(shí)施例5將C57小鼠野生型和MG53敲除型(制備方法同實(shí)施例 4)各分成正常飲食組和高脂飲食組兩組，每組20只小鼠。對(duì)正常組和高脂組的小鼠分別給 予正常生長繁殖飼料(同實(shí)施例4)和高脂飲食(同實(shí)施例4)的喂養(yǎng)，喂養(yǎng)至33周時(shí)，對(duì) 正常組和高脂組小鼠禁食18小時(shí)，自鼠尾取血，3，OOOg 15分鐘分離血清，酶法測(cè)定血清膽 固醇含量(Wako公司，Japan)。結(jié)果顯示高脂飲食喂養(yǎng)的野生型小鼠的血膽固醇濃度明顯 升高，而高脂飲食喂養(yǎng)的MG53敲除小鼠的血膽固醇濃度保持正常(圖16，* :p < 0. OOlvs 野生型正常組，t :P <0. OOlvs野生型高脂組)。參考文獻(xiàn)1. S. Wild, G. Roglic, A. Green, R. Sicree, H. King, Diabetes Care 27,1047 (May, 2004).2. S. Matthaei, M. Stumvol 1, M. Kellerer, H. U. Haring, Endocr Rev 21, 585 (Dec, 2000).3. C. M. Taniguchi, B. Emanuelli, C. R. Kahn, Nat Rev Mol Cell Biol 7,85 (Feb, 2006).4. X. J. Sun et al. , Nature 352，73 (Jul 4,1991).5. A. R. Saltiel, C. R. Kahn, Nature 414, 799 (Dec 13,2001).6. D. M. Nathan, N. Engl. J. Med. 347，1342 (Oct, 2002) ·7. C. X. Cai et al. , Nature Cell Biology 11，56(Jan,2009).8. J. Shao, H. Yamashita, L. Qiao, J. E. Friedman, Journal of Endocrinology 167，107(2000).9. T. J. Aitman et al. , Nature Genetics 16,197(1997).10. G.Wang et al. , Circ Res, CIRCRESAHA. 109. 208272 (November 19,2009， 2009).11. J. S. Moyers, P. J. Bi lan, C. Reynet, C. R. Kahn, Journal of Biological Chemistry 271，23111 (S印 20,1996).
1權(quán)利要求
MG53基因在制備預(yù)防、緩解和/或治療胰島素抵抗和II型糖尿病及其相關(guān)病癥的藥物中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的II型糖尿病的相關(guān)病癥為高脂飲食誘 導(dǎo)的胰島素抵抗、高胰島素血癥、高膽固醇血癥、高血壓癥以及肥胖癥。
3.MG53基因在篩選預(yù)防、緩解和/或治療胰島素抵抗和II型糖尿病及其相關(guān)病癥的藥 物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的II型糖尿病的相關(guān)病癥為高脂飲食誘 導(dǎo)的胰島素抵抗、高胰島素血癥、高膽固醇血癥、高血壓癥以及肥胖癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及MG53基因在治療胰島素抵抗和II型糖尿病及其相關(guān)病癥中的應(yīng)用。本發(fā)明確定了MG53基因的表達(dá)與胰島素抵抗特征之間的相互關(guān)系在胰島素抵抗的情況下，其MG53的表達(dá)明顯上調(diào)；MG53的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生；MG53缺陷顯著抑制了高脂飲食誘導(dǎo)的各種病癥、促進(jìn)葡萄糖代謝并且增強(qiáng)胰島素敏感性。因此，MG53基因可作為藥物靶點(diǎn)，用于篩選預(yù)防、緩解和/或治療胰島素抵抗和II型糖尿病及其相關(guān)病癥的藥物；MG53基因也可作為基因治療中的靶基因，用于設(shè)計(jì)和制備預(yù)防、緩解和/或治療胰島素抵抗和II型糖尿病及其相關(guān)病癥中的藥物和/或生物學(xué)試劑，為胰島素抵抗和II型糖尿病及其相關(guān)病癥的治療提供了一條有效的新途徑。
文檔編號(hào)A61P5/50GK101912617SQ20101024098
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月29日
發(fā)明者宋瑞生, 張巖, 曹春梅, 肖瑞平 申請(qǐng)人:北京大學(xué)