專利名稱：一種酰化支鏈淀粉修飾卡介菌多糖核酸口服獸用脂質(zhì)體及其凍干制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物藥領(lǐng)域，涉及一種酰化支鏈淀粉修飾口服獸用卡介菌多糖核酸 (BCG-PSN)脂質(zhì)體及其凍干制劑，以及制備方法。
背景技術(shù)：
使用高分子材料包裹脂質(zhì)體后可以使得載體更穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)更完整，來(lái)提高在其在 口服或外周給藥后復(fù)雜生理環(huán)境中的穩(wěn)定性。支鏈淀粉從結(jié)構(gòu)上來(lái)講，是一個(gè)具有樹(shù)枝形 分支結(jié)構(gòu)的多糖。相對(duì)分子質(zhì)量較大，一般由1000-300，000個(gè)左右葡萄糖單位組成，分子 量約為100萬(wàn)，有些可達(dá)600萬(wàn)。D-吡喃葡萄糖單位通過(guò)a-1，4-苷鍵連接成一直鏈，此直 鏈上又可通過(guò)a -1，6_苷鍵形成側(cè)鏈，在側(cè)鏈上又會(huì)出現(xiàn)另一個(gè)分支側(cè)鏈。主鏈中每隔6-9 個(gè)葡萄糖殘基就有一個(gè)分支，每一個(gè)支鏈平均含有約15-18個(gè)葡萄糖殘基，平均每24-30個(gè) 葡萄糖殘基中就有一個(gè)非還原尾基。因此支鏈淀粉的結(jié)構(gòu)為高支化聚合物，十分復(fù)雜。但 由于考慮到支鏈淀粉本身有一定的親水性，所以要將其結(jié)合到脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙分子層中， 需要在其結(jié)構(gòu)中加入親脂性基團(tuán)。本專利旨在使支鏈淀粉在催化劑條件下與棕櫚酰氯等反 應(yīng)，合成酰化支鏈淀粉，并用該?；ф湹矸坌揎椇卸嗵呛秃怂岬闹|(zhì)體，由于多糖和核 酸在胃酸和腸液中暴露會(huì)失效，所以考慮將其制備成脂質(zhì)體，使用脂質(zhì)體中的磷脂雙分子 層保護(hù)藥物，但在實(shí)際使用中發(fā)現(xiàn)保護(hù)效果不佳，不能達(dá)到有效給藥，所以使用合成的?；?支鏈淀粉修飾多糖和核酸脂質(zhì)體，使含多糖和核酸的脂質(zhì)體口服成為可能，試驗(yàn)取得了很 好的實(shí)際效果。以棕櫚?；ф湹矸鄣暮铣烧f(shuō)明合成方法和取代度測(cè)定方法，合成過(guò)程如下
當(dāng)于棕櫚酰基的2. 656mg/mL)。取此溶液0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. OmL至試管中，分別補(bǔ)足50% 乙醇溶液至lmL，接著分別加入lmL堿性鹽酸羥胺溶液，混勻，沸水浴中加熱1 2min，取 出立即冷卻。加稀HC1溶液lmL，加FeCl3溶液5mL，另取50%乙醇溶液lmL按上法同樣操 作為試劑空白，在530nm處測(cè)定吸收度值，以棕櫚?；?jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線為A53(1 = 0. 2555C(mg/ mL)+0. 0011，相關(guān)系數(shù)r = 0. 9999，將合成樣品測(cè)得的吸收值帶入曲線即可求得取代度。以 棕櫚酸甲酯為標(biāo)準(zhǔn)，建立了顯色后530nm吸光度值與棕櫚酰基團(tuán)質(zhì)量的對(duì)應(yīng)線性關(guān)系，結(jié) 果線性良好，方法學(xué)研究合格，證明此方法可以用來(lái)測(cè)定樣品中棕櫚酰基的含量。
卡介苗(Bacillus Calmette Guerin，BCG)是一種弱化的牛型分支桿菌，廣泛應(yīng)用于預(yù)防結(jié)核病，也是目前預(yù)防結(jié)核病最為有效的疫苗。BCG的主要成分包括脂類、多糖、蛋白 質(zhì)和核酸，而其中的多糖和核酸組分具有重要的生理功能，如BCG及其相應(yīng)成分對(duì)免疫系 統(tǒng)的非特異刺激功能常有助于治療變態(tài)反應(yīng)性疾病、腫瘤等，因而B(niǎo)CG也顯示出臨床治療 相關(guān)疾病的潛在應(yīng)用價(jià)值。但由于BCG的成分復(fù)雜，其引發(fā)副作用的幾率也比較高。因此， 如何分離、純化BCG，提取其中的有效成分而去除引發(fā)副作用的組份將有助于減少其副作用 的發(fā)生，真正發(fā)揮其在其他相關(guān)疾病治療中的效用。有資料報(bào)道，卡介菌多糖核酸(Polysaccharidenucleic acid fraction of BacillusCalmette Guerin，BCG-PSN)是一種去除了 BCG中菌體蛋白后而得到的活性成 分，主要成分為脂多糖和核酸，其副作用顯著減小，但依然保留了其發(fā)揮菌苗的作用活性。 BCG-PSN具有促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)增生，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬與消化能力，激活T淋巴 細(xì)胞，誘生白細(xì)胞介素、干擾素，發(fā)揮雙向免疫調(diào)節(jié)NF-kB等作用。在臨床上用于防治感 冒、哮喘、慢支、抗炎和抗過(guò)敏作用等?？ń榫嗵呛怂?BCG-PSN)是由我國(guó)醫(yī)藥工作者首 創(chuàng)的人用新型免疫調(diào)節(jié)劑，它是由卡介菌經(jīng)過(guò)熱酚法除去菌體蛋白后的生物活性物質(zhì)，其 中多糖含量彡70%，核酸含量彡5%，蛋白質(zhì)< 1%。研究顯示，BCG-PSN能夠促進(jìn)細(xì)胞免 疫，刺激單核_巨噬細(xì)胞增生，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬與消化能力，激活T淋巴細(xì)胞，直接調(diào)節(jié) 外周血、外周免疫器官(脾臟)和中樞免疫器官(胸腺)CD4+T、CD8+T細(xì)胞的成熟與分化，進(jìn) 而維持⑶/、⑶8+T細(xì)胞兩亞群間的平衡，誘生白細(xì)胞介素(IL)、干擾素(IFN)，發(fā)揮雙向免疫 調(diào)節(jié)NF-kB等作用。因其具有多重免疫增強(qiáng)功能，目前BCG-PSN早已獲準(zhǔn)在人醫(yī)臨床上進(jìn) 行應(yīng)用，用于慢性支氣管炎、哮喘、腫瘤和抗炎、抗過(guò)敏等的預(yù)防和治療。但作為一種效果獲 得肯定的免疫增強(qiáng)劑而言，BCG-PSN在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中得到深入研究的報(bào)道則極為少見(jiàn)。以 雞為例，雞傳染性性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由雞傳染性法氏囊病 毒(Infectious bursal diseasevirus, IBDV)引起的雞和火雞的急性、高度接觸性傳染病， 是危害養(yǎng)雞業(yè)的主要疫病之一。該病在國(guó)內(nèi)外目前均采用免疫防御為主的防制措施，盡管 受到環(huán)境、機(jī)體、病原等多種因素的影響，但I(xiàn)BD疫苗免疫效果的好壞是降低該病發(fā)生的重 要因素之一，BCG-PSN具有效果良好的增強(qiáng)機(jī)體特異性和非特異性免疫的能力。由于卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)主要成分為脂多糖和核酸，所以其體內(nèi)外穩(wěn)定性 一直是限制其使用的重要因素，將其包封于脂質(zhì)體中后，顯著提高了其體內(nèi)外穩(wěn)定性，但使 用卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體口服給藥時(shí)，動(dòng)物胃中的胃酸和腸液會(huì)破壞脂質(zhì)體，并進(jìn)一步破 壞脂質(zhì)體中的卡介菌多糖核酸。目前市場(chǎng)上尚沒(méi)有采用?；ф湹矸坌揎椀目ń榫嗵呛?酸口服獸用脂質(zhì)體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種適合動(dòng)物使用的酰化支鏈淀粉修飾的 卡介菌多糖核酸口服脂質(zhì)體及其凍干制劑。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述脂質(zhì)體及其凍干制劑的制備方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種?；ф湹矸坌揎椀目ń榫嗵呛怂峥诜F用脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體的配方含有 以下重量份的原料卡介菌多糖核酸 1份
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酰化支鏈淀粉 1-10份磷脂10-50 份膽固醇1-10份。所述的卡介菌多糖核酸口服獸用脂質(zhì)體，該脂質(zhì)體的配方含有以下重量份的原 料卡介菌多糖核酸 1份?；ф湹矸?3-4份磷脂20-25 份膽固醇2-3份。所述的卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體，其中?；ф湹矸蹫樘兼溨刑荚訑?shù)目從6到20 的?；ф湹矸?；優(yōu)選為正己酸?；ф湹矸?、月桂酸?；ф湹矸刍蜃貦八狨；ф湹?粉；磷脂為天然磷脂和/或合成磷脂，其中天然磷脂為卵磷脂或大豆磷脂，合成磷脂為二棕 櫚酰磷脂酰膽堿。所述的卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體，其中?；ф湹矸蹫槿〈葹?. 1-1的?；ф?淀粉。一種?；ф湹矸坌揎椀目ń榫嗵呛怂峥诜F用脂質(zhì)體凍干制劑，在上述?；?支鏈淀粉修飾的卡介菌多糖核酸口服獸用脂質(zhì)體的原料中再加入賦形劑，卡介菌多糖核酸 與賦形劑的重量比為1 30 100，通過(guò)冷凍干燥制備成凍干制劑。所述的修飾卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體凍干制劑，其中賦形劑選自甘露醇、蔗糖、右旋 糖甘、山梨醇、葡萄糖和海藻糖中的一種或幾種。所述的卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟a.?；ф湹矸坌揎椙暗目ń榫嗵呛怂嶂|(zhì)體的制備采用薄膜分散法、乙醇 注入法、逆相蒸發(fā)法、乙醚注入法或機(jī)械法等常規(guī)方法制備脂質(zhì)體混懸液；其中機(jī)械法可以 使用均質(zhì)機(jī)、超聲儀、超臨界流體儀及擠出儀器等機(jī)器設(shè)備；b.制備得到脂質(zhì)體混懸液后，將脂質(zhì)體混懸液沖入氮?dú)庠谑覝叵戮徛龜嚢?，將?化支鏈淀粉溶液以恒定速度滴入脂質(zhì)體混懸液中，滴加完畢后在室溫下孵化1 3小時(shí)，得 到混懸液備用；c.使用pH7 8的磷酸鹽緩沖液加入到混懸液中混合，調(diào)節(jié)混懸液的pH到7. 4， 得到?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂嶂|(zhì)體；d.為了得到更小粒徑的?；ф湹矸坌揎椀目ń榫嗵呛怂嶂|(zhì)體，可將步驟c 得到的?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂嶂|(zhì)體進(jìn)行二次均質(zhì)和/或擠壓，得到所需脂質(zhì) 體；也可以不進(jìn)行二次均質(zhì)和/或擠壓(均質(zhì)采用Niro Soavi NslOOlL均質(zhì)機(jī)，在一級(jí)閥 1100 1250bar和二級(jí)閥200 250bar的壓力下均質(zhì)3 5次；擠壓可采用200nm的濾 膜通過(guò)擠出儀擠壓出來(lái))。所述的卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟a.?；ф湹矸坌揎椙暗目ń榫嗵呛怂嶂|(zhì)體混懸液的制備稱取處方量的 卡介菌多糖核酸、磷脂和膽固醇溶解于適量的90%乙醇溶液中，通入氮?dú)夂蠡旌暇鶆?，放?溫度30 45°C的水浴中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽干乙醇(毒性小，不必?fù)?dān)心有機(jī)溶劑殘留)，形成 均一的磷脂膜，使用PH7. 4的磷酸鹽緩沖液洗脫磷脂膜；將得到的脂質(zhì)體混懸液進(jìn)行均質(zhì)或擠壓(均質(zhì)采用Niro Soavi NslOOlL均質(zhì)機(jī)，在一級(jí)閥1100 1250bar和二級(jí)閥200 250bar的壓力下均質(zhì)3 5次；擠壓可采用200nm的濾膜通過(guò)擠出儀擠壓出來(lái))，得到脂質(zhì) 體混懸液；b.制備得到脂質(zhì)體混懸液后，將脂質(zhì)體混懸液沖入氮?dú)庠谑覝叵戮徛龜嚢?，將?化支鏈淀粉溶液以恒定速度滴入脂質(zhì)體混懸液中，滴加完畢后在室溫下孵化1 3小時(shí)，得 到混懸液備用；c.使用pH7 8的磷酸鹽緩沖液加入到步驟b所得的混懸液中，調(diào)節(jié)混懸液的pH 到7. 4左右，得到?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂嶂|(zhì)體；d.為了得到更小粒徑的?；ф湹矸坌揎椀目ń榫嗵呛怂嶂|(zhì)體，可進(jìn)一步將 步驟c得到的?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂嶂|(zhì)體進(jìn)行二次均質(zhì)和/或擠壓(均質(zhì)、 擠壓的參數(shù)可與步驟a相同，均質(zhì)、擠壓可以分別采用，也可以共同采用。如均質(zhì)采用Niro Soavi NslOOlL均質(zhì)機(jī)，在一級(jí)閥1100 1250bar和二級(jí)閥200 250bar的壓力下均質(zhì) 3 5次；擠壓可采用200nm的濾膜通過(guò)擠出儀擠壓出來(lái))，得到所需脂質(zhì)體；也可以不進(jìn)行 二次均質(zhì)和/或擠壓。所述的卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體凍干粉的制備方法，包括以下步驟稱取處方量的賦形劑溶解于適量的水中，混合均勻后，將制備得到的?；ф湹?粉修飾卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體緩慢滴入到溶液中，邊滴入邊攪拌，得到穩(wěn)定的混懸液后通 過(guò)0. 2 y m的微孔濾膜過(guò)濾滅菌后在零下70°C下放置一天，然后放入凍干機(jī)中進(jìn)行凍干，凍 干完畢后沖入氮?dú)夥饪?。所述的酰化支鏈淀粉修飾卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體和凍干粉水合后的脂質(zhì)體，其包 封率為80% -99%,粒徑為20nm-5 u m。本發(fā)明所述的卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體，其劑型為口服液或口服凍干制劑，也可以 制成注射劑或凍干粉針。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂岖F用口服脂質(zhì)體穩(wěn)定性高，通過(guò)在模擬 血漿環(huán)境中的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂岖F用口服脂質(zhì)體的釋放速度比 不修飾的卡介菌多糖核酸獸用口服脂質(zhì)體定的速度明顯減慢。通過(guò)在模擬人工胃液和腸液 中的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)普通卡介菌多糖核酸獸用脂質(zhì)體中的藥物在2小時(shí)內(nèi)降解失效，而使用?；?支鏈淀粉修飾卡介菌多糖核酸獸用口服脂質(zhì)體修飾后的藥物在6小時(shí)內(nèi)藥物基本不降解， 所以使用?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂岖F用口服脂質(zhì)能夠在胃液中很好的保護(hù)藥物， 使卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體能夠給動(dòng)物口服使用。1.在模擬生物環(huán)境中的穩(wěn)定性精密量取酰化支鏈淀粉(取代度0. 1棕櫚?；ф湹矸?修飾卡介菌多糖核酸獸 用口服脂質(zhì)體(A，按實(shí)施例2制備，下同)、普通卡介菌多糖核酸獸用脂質(zhì)體(B，按實(shí)施例1 制備，下同)、卡介菌多糖核酸注射液(C)各lmL(約含卡介菌多糖核酸lmg)用pH7.4胎牛 血清(FBS)稀釋1倍，放入透析袋中，外相為150mL pH7. 4PBS，置于磁力攪拌器上，溫度控制 在37士 1°C，測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)外相卡介菌多糖核酸濃度，計(jì)算24小時(shí)累積釋放量，結(jié)果見(jiàn)圖1。 圖中可見(jiàn)卡介菌多糖核酸注射液很快達(dá)到釋放完全，而普通卡介菌多糖核酸獸用脂質(zhì)體釋 放緩慢，?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂岖F用口服脂質(zhì)體釋放更加緩慢。
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2.在胃酸和腸液中的穩(wěn)定性比較精密量取?；ф湹矸?取代度0. 1棕櫚酸?；ф湹矸?修飾卡介菌多糖核酸 獸用口服脂質(zhì)體(A)、普通卡介菌多糖核酸獸用脂質(zhì)體(B，按實(shí)施例1制備)、卡介菌多糖核 酸注射液(C)各10mL(約含卡介菌多糖核酸10mg)，放入90ml人工胃液(取稀鹽酸16. 4mL, 加水約800mL及胃蛋白酶10g，攪勻后加水定容至lOOOmL)和人工腸液(取磷酸二氫鉀6. 8g 加水500mL。用0. 4%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6. 8 ；另取胰酶10g加水適量使溶解，將兩 液混合后，加水定容至lOOOmL)中，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的卡介菌多糖核酸含量，可以發(fā)現(xiàn)在胃 液中(圖2)卡介菌多糖核酸注射液藥物0.5內(nèi)藥物全部降解，普通卡介菌多糖核酸獸用 脂質(zhì)體中藥物在1. 5小時(shí)內(nèi)基本全部降解，而?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂岖F用口服 脂質(zhì)體在3小時(shí)基本不降解，在12小時(shí)內(nèi)降解不超過(guò)80% ；在腸液中(圖3)，胃液中卡介 菌多糖核酸注射液藥物1小時(shí)內(nèi)藥物全部降解，普通卡介菌多糖核酸獸用脂質(zhì)體中藥物在 1. 5小時(shí)內(nèi)全部降解，而?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂岖F用口服脂質(zhì)體在4小時(shí)基本 不降解，在12小時(shí)內(nèi)降解不超過(guò)90%。由此可以發(fā)現(xiàn)?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂岖F 用口服脂質(zhì)體能在胃腸道中很好的保護(hù)藥物，修飾后的卡介菌多糖核酸獸用脂質(zhì)體可以給 動(dòng)物口服使用，而不修飾的卡介菌多糖核酸獸用脂質(zhì)體不適合口服使用。本發(fā)明還解決了卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體和酰化支鏈淀粉修飾脂質(zhì)體及其凍干制 劑的工業(yè)化大生產(chǎn)的問(wèn)題，制備方法適合工業(yè)化大生產(chǎn)。本發(fā)明提供的適合工業(yè)化大生產(chǎn)的酰化支鏈淀粉修飾口服獸用卡介菌多糖核酸 的制備方法，制備的脂質(zhì)體安全性好，穩(wěn)定性顯著提高，包封效果好。由于使用生物可降解的材料，減少了臨床使用中的不安全性因素。使用?；ф?淀粉修飾卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體后可以顯著提高藥物在胃酸中和腸液中的穩(wěn)定性，胃酸和 腸液不會(huì)破壞藥物，從而使介菌多糖核酸脂質(zhì)體可讓動(dòng)物口服使用，提高了對(duì)動(dòng)物使用的 順應(yīng)性和安全性。將?；ф湹矸坌揎椏诜F用卡介菌多糖核酸制備成凍干粉后，使其有 效期顯著延長(zhǎng)，延長(zhǎng)了藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間，從而提高了療效，并且使用時(shí)可按實(shí)際需 要配置所需濃度藥物，使用方便。


圖1.三種制劑在模擬血漿條件中的釋放((令)，8(_)^(灰).(mean士SD，n = 3)。圖2.三種制劑在人工胃液中的釋放((令)，8(_)4(灰).(11^11士50，11 = 3)。圖3.三種制劑在人工腸液中的釋放((令)，8(_)4(灰).(11^11士50，11 = 3)。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。實(shí)施例采用的卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)可以采用市售的產(chǎn)品，若市售產(chǎn)品中多 糖核酸含量不高，也可以進(jìn)行提純，本發(fā)明采用的BCG-PSN中多糖含量為74 76 %，核酸為 20 22%，多糖核酸含量約為94 98%。實(shí)施例1 制備沒(méi)有使用酰化支鏈淀粉修飾的卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體。稱取10mg卡介菌多糖核酸、200mg卵磷脂和20mg膽固醇溶于15ml的90%氯仿中，置于35-45°C水浴中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀120rpm并減壓的條件下除去氯仿，使混合物在茄形瓶中 形成均一的類脂膜，用25ml純凈水洗脫類脂物質(zhì)，得到乳白色的脂質(zhì)體混懸液，將脂質(zhì)體 混懸液倒入Niro Soavi NslOOlL均質(zhì)機(jī)，在一級(jí)閥llOObar和二級(jí)閥200bar的壓力下均 質(zhì)3次，得到較澄清透明的卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體溶液。制備的脂質(zhì)體包封率為91 %，粒徑 為 211nm(馬爾文 zetasize3000 測(cè)定)。實(shí)施例2 稱取15mg卡介菌多糖核酸、375mg大豆磷脂和45mg膽固醇溶解于20ml的90%乙 醇溶液中，通入氮?dú)夂蠡旌暇鶆蛟跍囟?5°C的水浴中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽干乙醇，形成均一的 磷脂膜后，使用PH7. 4的磷酸鹽緩沖液洗脫磷脂膜。將得到的脂質(zhì)體混懸液倒入Niro Soavi NslOOlL均質(zhì)機(jī)中，在一級(jí)閥1250bar和二級(jí)閥250bar的壓力下均質(zhì)5次，然后用200nm的 濾膜通過(guò)擠出儀擠壓出來(lái)。制備得到脂質(zhì)體混懸液后，脂質(zhì)體混懸液沖入氮?dú)庠谑覝叵戮?慢攪拌，將取代度0. 1棕櫚酸酰化支鏈淀粉100mg溶解后以恒定速度滴入脂質(zhì)體混懸液中， 滴加完畢后在室溫下孵化2小時(shí)，得到混懸液備用。將pH7 8的磷酸鹽緩沖液加入到混 懸液中，調(diào)節(jié)混懸液的PH到7. 4左右，得到?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂嶂|(zhì)體。再 將得到的?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂嶂|(zhì)體使用均質(zhì)機(jī)二次均質(zhì)(采用Mro Soavi NslOOlL均質(zhì)機(jī)，在一級(jí)閥1250bar和二級(jí)閥250bar的壓力下均質(zhì)3次)。制備的?；?鏈淀粉修飾脂質(zhì)體包封率為95%，粒徑為120nm，4°C冰箱內(nèi)觀察其1個(gè)月后的物理穩(wěn)定性 沒(méi)有顯著變化。實(shí)施例3 稱取20mg卡介菌多糖核酸、200mg卵磷脂、200mg 二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)和 15mg膽固醇溶解于50ml的90%乙醇溶液中，通入氮?dú)夂蠡旌暇鶆蛟跍囟?5°C的水浴中用 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽干乙醇，形成均一的磷脂膜后，使用PH7. 4的磷酸鹽緩沖液洗脫磷脂膜。將得 到的脂質(zhì)體混懸液倒入BRANSON B5510E超聲儀中最大功率超聲30分鐘，然后用200nm的 濾膜通過(guò)擠出儀擠壓出來(lái)。制備得到脂質(zhì)體混懸液后，脂質(zhì)體混懸液沖入氮?dú)庠谑覝叵戮?慢攪拌，將取代度0. 5正己酸?；ф湹矸?20mg溶解后以恒定速度滴入脂質(zhì)體混懸液中， 滴加完畢后在室溫下孵化3小時(shí)，得到混懸液備用。將pH7 8的磷酸鹽緩沖液加入到混 懸液中，調(diào)節(jié)混懸液的PH到7. 4左右，得到?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂嶂|(zhì)體。制 備的?；ф湹矸坌揎椫|(zhì)體包封率為85%，粒徑為500nm，4°C冰箱內(nèi)觀察其1個(gè)月后的 物理穩(wěn)定性沒(méi)有顯著變化。實(shí)施例4 稱取10mg卡介菌多糖核酸、500mg磷脂和40mg膽固醇溶解于15ml的90%乙醇溶 液中，將溶液勻速緩慢的滴入到PH7. 4的磷酸鹽緩沖液中，在室溫下?lián)]干乙醇。將得到的脂 質(zhì)體混懸液倒入Niro Soavi NslOOlL均質(zhì)機(jī)中，在一級(jí)閥1200bar和二級(jí)閥200bar的壓力 下均質(zhì)5次，然后用200nm的濾膜通過(guò)擠出儀擠壓出來(lái)。制備得到脂質(zhì)體混懸液后，在脂質(zhì) 體混懸液沖入氮?dú)庠谑覝叵戮徛龜嚢?，將取代?. 2月桂酸?；ф湹矸?0mg溶解后以恒 定速度滴入脂質(zhì)體混懸液中，滴加完畢后在室溫下孵化2小時(shí)，得到混懸液備用。將pH7 8的磷酸鹽緩沖液加入到混懸液中，調(diào)節(jié)混懸液的pH到7. 4左右，得到穩(wěn)定的?；ф湹矸?修飾卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體。得到的酰化支鏈淀粉修飾卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體使用均質(zhì)機(jī) 二次均質(zhì)(采用Niro Soavi NslOOlL均質(zhì)機(jī)，在一級(jí)閥1200bar和二級(jí)閥200bar的壓力
9下均質(zhì)5次)，得到更小粒徑的?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂嶂|(zhì)體。稱取800mg甘 露醇溶解于水中，將制備得到的更小粒徑的?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂嶂|(zhì)體緩慢 滴入到溶液中，邊滴入邊攪拌，得到穩(wěn)定的混懸液后通過(guò)0. 2 y m的微孔濾膜過(guò)濾滅菌后放 入超低溫冰箱，在零下70°C下放置一天后放入凍干機(jī)中進(jìn)行凍干，凍干完畢后沖入氮?dú)夥?口。制備的?；ф湹矸坌揎椫|(zhì)體凍干粉水合后的脂質(zhì)體包封率為91%，粒徑為186nm， 凍干粉在4°C冰箱內(nèi)觀察其1年后的物理穩(wěn)定性沒(méi)有顯著變化。
權(quán)利要求
一種?；ф湹矸坌揎椀目ń榫嗵呛怂峥诜F用脂質(zhì)體，其特征在于該脂質(zhì)體的配方含有以下重量份的原料卡介菌多糖核酸1份?；ф湹矸? 1 10份磷脂 10 50份膽固醇1 10份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的卡介菌多糖核酸口服獸用脂質(zhì)體，其特征在于該脂質(zhì)體的配 方含有以下重量份的原料卡介菌多糖核酸 1份 酰化支鏈淀粉 3-4份 磷脂20-25份膽固醇2-3份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體，其特征在于?；ф湹矸蹫樘?鏈中碳原子數(shù)目從6 20的?；ф湹矸?；優(yōu)選為正己酸?；ф湹矸邸⒃鹿鹚狨；ф?淀粉或棕櫚酸?；ф湹矸?；磷脂為天然磷脂和/或合成磷脂，其中天然磷脂為卵磷脂或 大豆磷脂，合成磷脂為二棕櫚酰磷脂酰膽堿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體，其特征在于酰化支鏈淀粉為取 代度為0. 1-1的?；ф湹矸?。
5.一種酰化支鏈淀粉修飾的卡介菌多糖核酸口服獸用脂質(zhì)體凍干制劑，其特征在 于在權(quán)利要求1或2所述的原料中再加入賦形劑，卡介菌多糖核酸與賦形劑的重量比為 1 30 100，通過(guò)冷凍干燥制備成凍干制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體凍干制劑，其特征在于賦形劑選自甘 露醇、蔗糖、右旋糖甘、山梨醇、葡萄糖和海藻糖中的一種或幾種，。
7.權(quán)利要求1或2所述的卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于包括以下步驟a.?；ф湹矸坌揎椙暗目ń榫嗵呛怂嶂|(zhì)體的制備采用薄膜分散法、乙醇注入 法、逆相蒸發(fā)法、乙醚注入法或機(jī)械法等常規(guī)方法制備脂質(zhì)體混懸液；b.制備得到脂質(zhì)體混懸液后，將脂質(zhì)體混懸液沖入氮?dú)庠谑覝叵戮徛龜嚢?，將?；?鏈淀粉溶液以恒定速度滴入脂質(zhì)體混懸液中，滴加完畢后在室溫下孵化1 3小時(shí)，得到混 懸液備用；c.使用pH7 8的磷酸鹽緩沖液加入到混懸液中，調(diào)節(jié)混懸液的pH到7.4，得到?；?支鏈淀粉修飾卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體；d.更進(jìn)一步，可將步驟c得到的?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂嶂|(zhì)體進(jìn)行二次均 質(zhì)和/或擠壓，得到所需脂質(zhì)體；也可以不進(jìn)行二次均質(zhì)和/或擠壓。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于包括以下步驟a.?；ф湹矸坌揎椙暗目ń榫嗵呛怂嶂|(zhì)體混懸液的制備稱取處方量的卡介 菌多糖核酸、磷脂和膽固醇溶解于適量的90%乙醇溶液中，通入氮?dú)夂蠡旌暇鶆?，?溫度 30 45°C的水浴中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀抽干乙醇，形成均一的磷脂膜，使用pH7. 4的磷酸鹽緩沖液洗脫磷脂膜；將得到的脂質(zhì)體混懸液進(jìn)行均質(zhì)和/或擠壓，得到脂質(zhì)體混懸液；b.將得到的脂質(zhì)體混懸液沖入氮?dú)庠谑覝叵戮徛龜嚢瑁瑢Ⅴ；ф湹矸廴芤阂院愣ㄋ?度滴入脂質(zhì)體混懸液中，滴加完畢后在室溫下孵化1 3小時(shí)，得到混懸液備用；c.使用pH7 8的磷酸鹽緩沖液加入到步驟b所得的混懸液中混合，調(diào)節(jié)混懸液的pH 到7. 4左右，得到酰化支鏈淀粉修飾卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體；d.更進(jìn)一步，可將步驟c得到的?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂嶂|(zhì)體進(jìn)行二次均 質(zhì)和/或擠壓，得到所需脂質(zhì)體；也可以不進(jìn)行二次均質(zhì)和/或擠壓。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于均質(zhì)采 用Niro Soavi NslOOlL均質(zhì)機(jī)，在一級(jí)閥1100 1250bar和二級(jí)閥200 250bar的壓力 下均質(zhì)3 5次；擠壓采用200nm的濾膜通過(guò)擠出儀擠壓出來(lái)。
10.權(quán)利要求5或6所述的卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體凍干粉的制備方法，其特征在于包括 以下步驟稱取處方量的賦形劑溶解于適量的水中，混合均勻后，將制備得到的酰化支鏈淀粉 修飾卡介菌多糖核酸脂質(zhì)體緩慢滴入到溶液中，邊滴入邊攪拌，得到穩(wěn)定的混懸液后通過(guò) 0. 2 ym的微孔濾膜過(guò)濾滅菌后在零下70°C下放置一天，然后放入凍干機(jī)中進(jìn)行凍干，凍干 完畢后沖入氮?dú)夥饪凇?br> 全文摘要
本發(fā)明屬于動(dòng)物藥領(lǐng)域，公開(kāi)了一種?；ф湹矸坌揎椏ń榫嗵呛怂峥诜F用脂質(zhì)體及其凍干制劑，該脂質(zhì)體配方含有以下重量份的原料卡介菌多糖核酸1份，?；ф湹矸?-10份，磷脂10-50份，膽固醇1-10份。該脂質(zhì)體及其凍干制劑安全性好，穩(wěn)定性顯著提高，包封效果好，提高了對(duì)動(dòng)物使用的順應(yīng)性和安全性。
文檔編號(hào)A61K35/74GK101926771SQ201010242300
公開(kāi)日2010年12月29日 申請(qǐng)日期2010年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月2日
發(fā)明者呂英軍, 王曉斌, 蘇建東, 鮑恩東 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué);南京瑞農(nóng)新獸藥開(kāi)發(fā)工程技術(shù)有限公司