專利名稱：共軛聚電解質的醫(yī)藥用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及共軛聚電解質用于如下的用途可選地在選擇性的條件下，特異性地 分離，例如俘獲錯折疊的、病理的或劣種(rogue)形式的蛋白質，即淀粉樣形式、錯折疊形 式或聚集形式的蛋白質，和俘獲類似地引起在其正常形式不聚集的蛋白質的異常形式聚集 的蛋白質。本發(fā)明還涉及同時分離和檢測錯折疊的、病理的或劣種形式的蛋白質的一步方 法。本發(fā)明的進一步的實施方案涉及共軛聚電解質作為新治療劑的用途，其通過在體內干 擾錯折疊的、病理的或劣種形式的蛋白質的形成或俘獲其來起作用。
背景技術：
能夠選擇性俘獲錯折疊的或聚集形式的蛋白質，特別是淀粉樣形式和病理形式的 蛋白質的物質和分子，由于其具有用作臨床化學、診斷中的分析工具以及治療劑的潛能，其 發(fā)展引起了極大的關注。通常，用小分子染料如剛果紅和硫磺素T染色淀粉樣原纖維。這 樣的分子染料的最大缺點是不能分離(separate)，即結合、俘獲或離析(isolate)出所述 錯折疊蛋白質并同時對其檢測。一種用于測定淀粉樣的、錯折疊的或病理形式的蛋白質存在的方法使樣品進行蛋 白水解一段時間，例如用蛋白酶K進行蛋白水解，所述時間足以破壞天然蛋白質，然后，使 用在天然蛋白質的存在下對于淀粉樣的、錯折疊的或病理形式蛋白質沒有選擇性的抗體， 進行免疫測定，以測定所述錯折疊形式蛋白質的存在。如果使用蛋白酶來去除在包含淀粉 樣的、錯折疊的或病理形式蛋白質的樣品中的天然蛋白質，這將阻止在蛋白水解步驟期間 使用抗體作為俘獲劑或檢測劑，因為在蛋白酶的存在下，抗體自然會被破壞。因此，在引入 抗體之前，必須去除或滅活所述蛋白酶。當在天然蛋白質的存在下俘獲和檢測淀粉樣的、錯 折疊的或病理形式蛋白質時，防止這一限制在所述過程中發(fā)生極其有利。天然生物聚合物如蛋白質，通常具有有序的構型，如α-螺旋和β-折疊，其有助 于所述生物聚合物的三維有序結構和特定功能。蛋白質的結構是蛋白質的功能所必需的； 許多科學家已經指出未折疊的蛋白質可能是沒有功能的。更重要的是，近幾年，逐漸意識到 蛋白質錯折疊和錯裝配成例如淀粉樣和其它病理形式的危險性。錯折疊可能會將蛋白質從 一種有用的東西變成非功能性的、有害的甚至有毒的。人體健康依靠正確折疊的蛋白質，淀 粉樣原纖維的體內沉降與許多蛋白質構型的疾病相關，所述疾病包括阿爾茨海默氏病、亨 廷頓氏病、系統(tǒng)淀粉樣變性疾病(systemic amyloidoses)和朊病毒病。朊病毒病，即動物 [例如牛海綿樣腦病(BSE)、羊瘙瘁病和慢性消耗性疾病(CWD)]和人類[克雅病(CJD)、杰 茨曼-斯脫司勒-史茵克(Gerstmarm-Str汪USSler-Scheinker)疾病(GSS)、庫魯癥]中的 傳染性海綿樣腦病(TSE)，與正常細胞朊病毒蛋白質(PrPe)的構型轉化成表示為PrPse的傳染性病原性疾病相關的同工型有關。由于不同的外界刺激，蛋白質經常改變它們的構型，已 經大量報導了導致病原性狀態(tài)的蛋白質的構型變化的重要性。特別地，在使其天然狀態(tài)不 穩(wěn)定的情況下，蛋白質可聚集成特征性纖絲狀裝配，稱為淀粉樣原纖維。這些的富含折 疊的蛋白質裝配具有與其天然狀態(tài)明顯不同的構型。所述錯折疊的朊病毒蛋白質甚至是自 傳播的(有傳染性的)，這是一種在所述錯折疊的構型內完全編碼的性質。蛋白質的錯折 疊和繼發(fā)的淀粉狀蛋白形成的機理還不是很清楚。許多證據(jù)支持在從錯折疊蛋白質到淀粉 狀蛋白的途徑中，存在作為中間體的較小低聚物物種。這些低聚物在形態(tài)學上不同，可能只 有這些低聚物中的一部分引起與淀粉狀蛋白病相關的細胞毒性。而且，單一可溶性蛋白質 可以產生不同“菌株”(strains)的錯折疊產物，如酵母菌朊病毒Sup35所證實的。已經表 明不同的酵母菌朊病毒菌株的傳染性取決于傳染性蛋白質的構型，而且一種蛋白質可以采 取多種自傳播的(有傳染性的)構型。這些構型差異成為朊病毒菌株的可遺傳性差異。另 外，朊病毒菌株也可能在決定朊病毒傳播特異性方面具有重要的作用。慢性人類疾病嚴重地影響衛(wèi)生保健系統(tǒng)。公認快速精確的診斷工具是給予早期介 入和治療所必需的。目前只存在對癥狀的治療如阿爾茨海默氏病，并且這些具有有限的治 療效果。目前，不存在阿爾茨海默氏病或傳染性海綿樣腦病(TSEs)的臨死前分子診斷試 驗，并且進行的這種臨床診斷要求疾病已經很嚴重。而且，也沒有有效的治療手段，免疫治 療如在阿爾茨海默氏病中進行的具有巨大的希望。然而，在治療大多數(shù)蛋白質錯折疊相關 疾病中，缺乏用于俘獲錯折疊蛋白質、監(jiān)測治療和疾病進程兩者的可靠方法是一個嚴重的 缺陷。因此，存在以下需要可以從樣品中分離，例如俘獲促淀粉狀蛋白質 (amyloidogenic proteins)，如錯折疊的朊病毒蛋白質和不同菌株朊病毒蛋白質的簡單、 靈敏和多用途的工具的需要。還存在對通過體內干擾、結合或俘獲錯折疊的或淀粉狀蛋白 的新治療劑的需要。使用共軛聚合物(CPs)來研究生物分子、生物分子的相互作用、生物分子的折疊 事件和生物分子的動力學的可能性要求該聚合物與水相環(huán)境相容。這可通過制備共軛聚 電解質(CPEs)來實現(xiàn)。如在許多科技出版物中描述的，已經通過多種方法使用CPE來檢 測生物分子、生物分子的相互作用和生物分子的折疊事件。其中通過聚電解質鏈的構型 改變，使用CPE來檢測生物特異性相互作用，如受體/分析物相互作用的實例可以在以下 科學文獻中找到[Nilsson，K. P. R. ；Inganas, O. Nature Materials2003, 2,419-424.； Ho, H-A.等人，Angew. Chem. Int. Ed. 2002，41，1548. ；Ho, H-A. ；Leclerc, M. J. Am. Chem. S oc.2004,126,1384. ；Dore, K. ；Dubus,S. ；Ho, H-A. ；Levesque,I. ；Brunette, Μ. ；Corbei1, G. ；Boissinot, M. ；Boivin, G. ；Bergeron, Μ. G. ；Boudreau, D. ；Leclerc, M. J. Am. Chem. Soc.2004，126，4240. ；W002/081735, W003/096016]。

發(fā)明內容
需要用于俘獲錯折疊形式或聚集形式的蛋白質，特別是淀粉樣形式或病理形式的 蛋白質的具有改善親和性(affinity)的簡單方法，特別地，用于從樣品中(回體(ex vivo) 或體內)分離錯折疊蛋白質。因此，在本發(fā)明中描述了基于共軛聚電解質的方法，該共軛 聚電解質可以俘獲用于自裝配/聚集形式的蛋白質，特別是錯折疊形式或聚集形式的蛋白
4質，同時起以光信號報告俘獲事件的傳感器作用。而且，本發(fā)明還涉及共軛聚電解質作為新的治療劑的用途，該新治療劑通過干擾、 結合或俘獲錯折疊形式、淀粉樣聚集形式或病理蛋白質形式，如阿爾茨海默中的淀粉狀蛋 白β或TSE中錯折疊的朊病毒蛋白來起作用。共軛聚電解質結合和俘獲這些蛋白質形式， 因此CPEs通過起藥效團作用來影響活生物體中的發(fā)病機理，即所述CPEs是治療劑。能穿 過血腦屏障的共軛聚電解質對影響腦的疾病有作用，這包括，但不限于活生物體中的β淀 粉狀蛋白病理過程，即通過起治療藥效團作用來影響阿爾茨海默氏病的發(fā)病。本發(fā)明涉及固定在固體載體上或者游離在溶液中的共軛聚電解質(CPEs)用于如 下的用途用于特定分離，例如俘獲錯折疊的、病理或劣種形式的蛋白質，即淀粉樣形式、錯 折疊形式或聚集形成，和類似地引起在其正常形式不聚集的蛋白質的異常形式聚集的蛋白 質?？梢栽趯τ阱e折疊蛋白質形式的選擇性條件下，使用一種CPE或幾種CPE可選地進行錯 折疊蛋白質的所述俘獲。本發(fā)明還涉及俘獲和檢測錯折疊的、病理或劣種形式的蛋白質的 一步方法，其可以在錯折疊蛋白質的非選擇性條件下選擇性的進行。本發(fā)明的另一方面是 CPEs作為錯折疊形式或聚集形式的蛋白質，特別是淀粉樣形式和病理形式的蛋白質體內成 像工具。本發(fā)明還涉及使用官能化的共軛聚電解質通過例如MRI對錯折疊蛋白質的體內成 像方法。本發(fā)明通過使用CPE用于分離，例如俘獲、結合或干擾樣品中(回體或體內)錯折 疊蛋白質來解決現(xiàn)有技術的缺點，俘獲和檢測所述蛋白質、用于診斷的新型光學方法和可 能的治療劑，所有都是基于共軛聚電解質?，F(xiàn)有技術證實CPEs能可靠地檢測體外和在回體 組織樣品中的淀粉樣纖顫[W02005109005]。使用CPEs俘獲促淀粉樣結構的物理化學原理 依賴于所述聚電解質的重復結構，其與提供非常高親和性的對稱重復的分子靶點(淀粉樣 變性分子)有關。因此，基于選擇性CPE的方法能夠俘獲與許多疾病相關的病原性和淀粉 狀蛋白。根據(jù)本發(fā)明，用于俘獲錯折疊形式或聚集形式的蛋白質，特別是淀粉樣形式和病理 形式蛋白質的工具和方法，以及與這些蛋白質形式相關的疾病的治療全都基于共軛聚電解 質。包含錯折疊蛋白質的樣品包括，但不限于血液、腦、外周組織、均質化的腦、均質化 的外周組織、體液、活組織檢查、尿、腦脊液(CSF)、淋巴液、血漿、在用于蛋白質藥物的緩沖 液和生物技術生長培養(yǎng)基中的制劑。本發(fā)明的一個方面是共軛聚電解質作為錯裝配/聚集形式的蛋白質，特別是淀粉 樣原纖維和病原性形式的蛋白質的俘獲劑的用途。當用作俘獲錯折疊蛋白質的試劑時，所 述共軛聚電解質可以固定在固體載體上、任何粒徑的珠粒上、管中、透析裝置中、泵中，或者 以在溶液中的游離形式提供。所述CPE也可以具有水凝膠形式。如果所述CPE以在溶液 中的游離形式提供，在被CPE俘獲后，可以采用任何方式分離錯折疊蛋白質的，例如通過沉 淀、離心、吸附、吸收、干燥、煮沸或蒸發(fā)來分離?？蛇x地，可以官能化所述CPE以提供檢測、 固定、促進俘獲、增加選擇性、增加親和性或對測定有意義的其它特征的方式(means)。有趣的是，可以使用共軛聚電解質，如聚(噻吩)、聚(3，4-乙烯基二氧基噻吩)或 聚(吡咯)來檢測錯折疊蛋白質[W02005109005]。由于通過采集系統(tǒng)反應的放大，基于共 軛聚電解質的傳感器對于非常小的干擾非常靈敏，因此，與現(xiàn)有技術的基于分子的傳感器 相比，其提供了重要的優(yōu)點，所述聚電解質也提供了病原性朊病毒蛋白質的直接檢測。根據(jù)
5本發(fā)明，將CPEs的該直接檢測功能與俘獲錯折疊蛋白質的獨特能力相結合，從而提供了比 常規(guī)免疫組織學技術極大的優(yōu)點，因為常規(guī)免疫組織學技術的方法通常需要使用用于俘獲 的一級抗體和用于顯影錯折疊蛋白質的二級抗體。使用共軛聚電解質作為用于錯折疊蛋白 質的俘獲劑的可能性要求聚合物與水相環(huán)境相容，這已經通過制備共軛的發(fā)光聚電解質實 現(xiàn)了。在本發(fā)明中，描述了一種使用CPEs俘獲錯折疊蛋白質的新方法?？梢允褂肅PEs實 現(xiàn)樣品中錯折疊蛋白質的分離，例如從所述樣品中去除它們，這在之前從來沒有描述過。提 供一種使用CPEs來染色和俘獲樣品溶液中錯折疊蛋白質，接著沉淀的方法。使用CPEs的 方法具有不同于其它淀粉樣營養(yǎng)(amyloidotrophic)染料如剛果紅和ThT的其它性質，最 重要地是CPEs提供錯折疊蛋白質的俘獲。因此，在本發(fā)明中預期了使用CPEs俘獲錯折疊 蛋白質的幾種方法。所述CPE可以固定在固體載體上，從而提供一種具有高選擇性和高親 和性的俘獲錯折疊蛋白質到所述固體載體，從而從樣品中分離或去除其的方法。在本發(fā)明的進一步的方面，提供一種俘獲錯折疊蛋白質的方法，包括將如上定義 的共軛聚電解質暴露于樣品，其中所述共軛聚電解質選擇性地俘獲樣品中錯折疊蛋白質。一方面，本發(fā)明涉及用于俘獲固體載體上的樣品中錯折疊蛋白質物種的方法，其 包括以下步驟-將至少一種共軛聚電解質(CPE)固定在固體載體上-使樣品與所述CPE接觸_可選地，加入競爭劑-從樣品中去除所述固體載體或者從樣品中分離所述固體載體，或-洗滌所述固體載體，而不從CPE相中去除俘獲的錯折疊蛋白質-可選地，通過優(yōu)選的方法檢測俘獲的錯折疊蛋白質，然后，由此原始樣品溶液不 包含或包含很少錯折疊蛋白質。另一方面，本發(fā)明涉及用于俘獲溶液中的樣品中錯折疊蛋白質物種的方法，其包 括以下步驟-使樣品與至少一種共軛聚電解質(CPE)結合_可選地，加入競爭劑-從樣品中分離俘獲的錯折疊蛋白質-可選地，通過優(yōu)選的方法檢測俘獲的錯折疊蛋白質，然后，由此原始樣品溶液不 包含或包含很少錯折疊蛋白質。在本發(fā)明進一步的實施方案中，將競爭劑加入到溶液中以增加俘獲錯折疊蛋白質 的CPE與結合例如非特異性結合天然或未折疊的蛋白質的CPE的區(qū)別性。這樣的試劑包括， 但不限于洗滌劑、離子、鹽、螯合劑和溶劑。如果進行對CPE俘獲的錯折疊蛋白質的檢測，在本發(fā)明的方法中使用的輻射具有 的波長為約IOOnm至約2000nm之間。在一個實施方案中，使用在可見范圍中的輻射。使用 多個光子激發(fā)也是可能的，因此，使用2x或3x(分別為雙光子和三光子激發(fā))的輻射代替 χ nm的激發(fā)輻射。另一方面，本發(fā)明涉及實施根據(jù)本發(fā)明的方法的裝置。這樣的裝置設有固定在固 體載體上或溶液中的使CPE與樣品接觸的部件、用于可選地加入競爭劑的部件、可選地從樣品中去除CPE或從樣品中分離CPE的部件、可選地洗滌CPE相而不會從所述CPE相中去 除俘獲的錯折疊蛋白質的部件、可選地通過優(yōu)選的方法檢測俘獲的錯折疊蛋白質的部件以 及可選地收集暴露于所述CPE的樣品溶液的部件。優(yōu)選地，在本發(fā)明中使用的共軛聚電解質包括噻吩、吡咯、苯胺、呋喃、亞苯基、亞 乙烯基、芴、乙烯基二氧噻吩及其取代形式的共聚物或均聚物，所述共軛聚電解質可以具有 一個或多個離子側鏈官能度，如氨基酸、氨基酸衍生物、神經遞質、單糖、核酸或其組合和化 學修飾的衍生物。所述離子官能度可以包括一個或多個陰離子和陽離子側鏈官能度。在本發(fā)明中所用的CPE也可以具有末端官能化的基團，其中所述官能基可以為， 但不限于DNA、RNA、肽、氨基酸、組氨酸(histidin)、組氨酸10 (histidinlO)、蛋白質、肽支 架(ρ印tide scaffolds)、生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素、螯合劑、活性基團、抗體、 酶、配體、受體配體、類固醇、生物分子或其它分子、納米顆粒、微粒、金納米顆粒、金微粒、磁 珠、蛋白質涂布的珠粒、肽涂布的珠粒、超磁(supramagnetic)珠?；蝾w粒、釓納米顆粒、釓 離子、摻雜鑭系元素的納米顆粒、摻雜鑭系元素的氧化釓納米顆粒、鑭系元素顆粒。在本發(fā)明進一步的實施方案中，用DNA、RNA、肽、氨基酸、組氨酸、組氨酸10、蛋白 質、肽支架(ρ印tide scaffolds)、生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素、螯合劑、活性基 團、抗體、酶、配體、受體配體、類固醇、生物分子或其它分子、納米顆粒、微粒、金納米顆粒、 金微粒、磁珠、蛋白質涂布的珠粒、肽涂布的珠粒、超磁珠?；蝾w粒、釓納米顆粒、釓離子、摻 雜鑭系元素的納米顆粒、摻雜鑭系元素的氧化釓納米顆粒、鑭系元素顆粒官能化的CPE可 以為實質上共價的或非共價的。在本發(fā)明的一方面提供一種方法，其檢測從屏障如管壁、膜、皮膚等的后面的天然 形式蛋白質中錯裝配/聚集形式的蛋白質，特別是淀粉樣原纖維和病原性形式的蛋白質的 形成，該方法包括注入、流入、泵入、吸入、輸入或通過其它方式將樣品暴露于屏障之后，并 通過適當?shù)臋z測部件(means of detection)來檢測所述屏障之后或之內的所述錯折疊的 靶蛋白。用于檢測和給藥CPEs的部件可以變化，這取決于根據(jù)本發(fā)明的側-鏈或末端官能 化，其在說明書的其它部分舉例說明。本發(fā)明的另一方面提供用于涉及錯裝配/聚集形式的蛋白質，特別是淀粉樣原纖 維和病原性形式的蛋白質形成的疾病的基于共軛聚電解質的治療方法和治療劑，所述疾病 如阿爾茨海默氏病、克雅病(CJD)、變異的克雅病(vCJD)、繼發(fā)性淀粉樣變性、2型糖尿病、 傳染性海綿樣腦病(TSE，如CWD、羊瘙瘁病、GSS和庫魯癥、牛海綿樣腦病(BSE))。本發(fā)明的另一方面為生物測定，其依靠在天然蛋白質的存在下，使用CPE俘獲淀 粉樣形式、錯折疊形式或病理性形式的蛋白質的步驟期間的全面區(qū)分，和隨后通過適當?shù)?方法來檢測，如基于比色、吸光度、或熒光的方法。避免假陽性和避免假陰性結果非常重要。 天然蛋白質的選擇性蛋白水解可以是但并不必需，獲得這點的一種方法。本發(fā)明的另一方面涉及CPEs的獨特性，其不僅俘獲錯裝配形式、錯折疊形式、聚 集形式或病原性形式的蛋白質的俘獲，而且能夠起俘獲劑的作用，同時如有必要，其可報道 所述俘獲事件，并將其轉化成光信號和可檢測信號。可能希望鑒定的多種形式的錯折疊蛋白質意味著，在更進一步的方面，本發(fā)明也 可以以微陣列的形式實施，該微陣列要求將檢測系統(tǒng)固定和模式化在表面上。然后，在溶液 中或在固體載體上，使用本發(fā)明的共軛聚電解質作為錯折疊蛋白質的俘獲劑，并且如果期望或需要，使用其作為用于所述俘獲事件的檢測劑。本發(fā)明的全部范圍為附加權利要求書定義的。


圖1 基于聚-噻吩主鏈和混合型聚_噻吩_苯主鏈的不同的CPEs的某些選擇實 例的化學結構。可以構建側鏈變化和定義的主鏈尺寸。這些已經給出了如下單純的命名 POffT, PTAA, POMT, PT2、tPOWT、tPTMl、f-PONT、L-POMT 禾口 D-POMT0圖2 官能化的CPEs。Rl和R2 =末端/端官能化的。Rl和R2可以相同或不同。 Rs =側鏈。圖3 使用末端官能化的CPE或沒有末端官能化的CPE的任意淀粉狀蛋白聚合物 的俘獲示意圖。該圖形并不是按比例描繪的，并且不能代表CPE和淀粉狀蛋白之間的尺寸 關系。在本發(fā)明中，在錯折疊蛋白質中淀粉狀蛋白單體的數(shù)量可以在一個至多個之間。而 且，CPEs可以固定在固體載體上，該實例顯示在后面的圖形中。官能化的或未官能化的CPE 分子的數(shù)量可以是一個至多個中的任何情形。在示意圖中，側鏈(Rs)沒有顯示。圖4:顯示使用固定在固體載體上的CPE俘獲錯折疊蛋白質的示意圖。將樣品暴露 于固定在固體載體上的官能化的或未官能化的CPE中，由此所述CPE俘獲所述樣品中錯折 疊蛋白質。該圖形不是按比例描繪的，并且不能代表CPE和錯折疊蛋白質之間的尺寸關系。 官能化的或未官能化的CPE分子的數(shù)量可以是一個至多個中的任何情形。在示意圖中，側 鏈(Rs)沒有顯示。圖5 顯示使用CPE在合適的固體載體如載玻片、玻璃珠、過濾矩陣、分離矩陣等上 俘獲錯折疊蛋白質的示意圖。將樣品暴露于固定在固體載體上的官能化的或未官能化的 CPE中，由此所述CPE俘獲所述樣品中錯折疊蛋白質。該圖形不是按比例描繪的，并且不能 代表CPE和錯折疊蛋白質之間的尺寸關系。官能化的或未官能化的CPE分子的數(shù)量可以是 一個至多個中的任何情形。在示意圖中，側鏈(Rs)沒有顯示。圖6 使用重量沉降法檢測CPE PTAA染色的PrP-淀粉狀蛋白的原理。也給出PrP 的晶體結構的尺寸作為微小聚集體中PrP含量的粒徑參考。圖7 顯示使用以CPE涂布的磁珠俘獲錯折疊蛋白質的示意圖。用官能化的CPE， 例如用生物素官能化的CPE涂布磁珠，例如用抗生物素蛋白涂布的磁珠。將樣品暴露于含 有CPE的磁珠，由此所述CPE俘獲所述樣品中錯折疊蛋白質。該圖形不是按比例描繪的，并 且不能代表CPE和錯折疊蛋白質之間的尺寸關系?？梢允褂么盆F作為收集/濃縮步驟。CPE 分子的數(shù)量可以是一個至多個中的任何情形。在示意圖中，側鏈(Rs)沒有顯示。在俘獲和 使用磁鐵收集/濃縮步驟之后，可以包括任選的檢測步驟。圖8 顯示使用生物素官能化的CPE和抗生物素蛋白涂布的表面俘獲錯折疊蛋白 質的示意圖。所述官能化的CPE可以是原態(tài)或者在珠粒上。將樣品暴露于CPE，其中所述 CPE俘獲所述樣品中錯折疊蛋白質?？梢允褂每股锼氐鞍淄坎嫉谋砻孀鳛槭占?濃縮步 驟。該圖形不是按比例描繪的，并且不能代表CPE和錯折疊蛋白質之間的尺寸關系。CPE分 子的數(shù)量可以是一個至多個中的任何情形。在示意圖中，側鏈(Rs)沒有顯示。在俘獲和表 面收集/濃縮步驟之后，可以包括任選的檢測步驟。圖9 在通過0. 22 μ m過濾器過濾前后，在20mM pH 8的磷酸鹽緩沖液中的包含胰
8島素的0. 5mg/ml PTAA的熒光光譜。圖10 在通過0.8μπι過濾器過濾后，在20mM pH 8的磷酸鹽緩沖液中包含0、5、50 和100%原纖維的胰島素的0. 5mg/mlPTAA的熒光光譜。圖11 在通過0. 8 μ m過濾器的逆-過濾(back-filtration)后，在20mM pH 8的 磷酸鹽緩沖液中包含0、5、50和100%原纖維的具有胰島素的0. 5mg/ml PTAA的熒光光譜。圖12 使用PTAA-原纖維復合物的離心來俘獲原纖維，接著進行熒光測量。圖13 熒光光譜，其證實一些選擇的CPEs和Gd203納米顆粒之間的相互作用。所 述測量在重蒸餾水中進行。
具體實施例方式一般而言，本發(fā)明涉及一種使用共軛聚電解質俘獲錯裝配形式、錯折疊形式或聚 集形式的蛋白質，特別是淀粉樣原纖維和病原性形式的蛋白質的新方法。將所述錯折疊蛋 白質暴露于共軛聚電解質(CPE)中，由此CPE俘獲、結合或離析所述目標錯折疊蛋白質。與 對于天然折疊的蛋白質相比，對于錯折疊蛋白質，可以進行具有高親和性或高選擇性的俘 獲。在其中共軛聚電解質結合錯折疊的改變的蛋白質，如PrPse或Α-β蛋白質的條件下，進 行所述俘獲，優(yōu)選地，但不是必須的，其中這樣的共軛聚電解質結合這些異常形式而不會結 合它們的非聚集正常的天然形式。期望CPE和目標錯折疊蛋白質之間的非共價結合以足夠 高的親和性和在所選條件下發(fā)生并且具有足夠的選擇性，以在測定中有益于從樣品中俘獲 或離析聚集的、錯折疊的改變的蛋白質。根據(jù)本發(fā)明，術語俘獲(capture)、結合(binding)或離析(isolation)是一般性 術語分離(separation)的子集?？梢允褂肅PEs實現(xiàn)樣品中錯折疊蛋白質的分離，例如從 所述樣品中去除它們，這是以前從來沒有描述過的。例如，可使樣品溶液流過具有固定在固 體載體上的CPE/CPEs的所述固體載體或流入其內部。所述CPE/CPEs的作用是從樣品中俘 獲錯折疊蛋白質，同時也從樣品中分離錯折疊蛋白質。如在本申請中使用的術語“俘獲(capture)”指一種探針(probe)，其可以在 回體或體內結合錯折疊蛋白質，從而在非聚集正常形式的所述蛋白質存在下，將其分離 (separate)、離析(isolate)或固定。本發(fā)明是基于使用與所述錯折疊蛋白質相互作用的共軛聚電解質來非共價性俘 獲錯折疊的、異常的、錯裝配的、聚集的或病原性的蛋白質。所述相互作用在沒有共價鍵合 下發(fā)生，其基于共軛聚電解質和錯折疊蛋白質之間的偶極-偶極鍵合、氫鍵鍵合、靜電-和 非極性相互作用，本文稱為非共價鍵合，其進一步包括任何類型的天然非共價的鍵合。本發(fā)明的某些方面可以提供共軛聚電解質與某些實體的共價連接，所述實體如蛋 白質、錯折疊蛋白質、肽、生物分子、其它分子或表面。因此，本發(fā)明的一方面是一種方法，其中在天然形式的蛋白質的存在下，使用共軛 聚電解質分離，例如選擇性俘獲、結合或離析錯折疊蛋白質、聚集的異常形式或病理性形式 的蛋白質。將樣品暴露于固定在固體載體上或任何尺寸的珠粒上的共軛聚電解質中，所述 珠粒呈水凝膠或呈溶液提供，由此所述共軛聚電解質俘獲、結合或離析任何錯折疊的、聚集 的、錯裝配的或病原性的蛋白質。所述方法可以在這樣的條件下進行其中所述高親和力 (avidity)共軛聚電解質可以選擇性地俘獲所述錯折疊蛋白質，其對于在包含天然形式和正常形式的蛋白質以及錯折疊的形式的蛋白質的樣品中的所述錯折疊的形式具有高選擇 性。所述共軛聚電解質可以固定在合適類型和可適用形狀的固體載體上，其中所述固 體載體的表面存在樣品的共軛聚電解質。所述固體載體的形狀和尺寸可以是任意類型，例 如圓形、扁平形或珠粒形，表面可以用共軛聚電解質以非共價方式改性，或在所述固體載體 結構內共價鍵合或附著于所述固體載體的表面。根據(jù)本發(fā)明的固體載體也構成管、透析裝 置、泵、胰島素泵、給藥蛋白質的裝置、注射器和針。當固定在固體載體上時，所述共軛聚電 解質可以是任何合適的形式，例如呈水凝膠、聚合物膜、游離的CPEs、支架或層狀的。當用作 俘獲錯折疊蛋白質的試劑時，所述CPEs也可以以在溶液中的游離形式提供。如果所述CPE 以在溶液中的游離形式提供，可以采用任何方法去除CPE俘獲后的錯折疊蛋白質，例如沉 降、離心、吸附、吸收、干燥、煮沸或蒸發(fā)?？蛇x地，所述CPE可以被官能化，以提供用于檢測、 固定、促進俘獲、增加選擇性、增加親和性或對于測定有意義的其它事情的方法。所描述的俘獲、結合或離析條件可以包括存在提供給樣品的競爭劑，其中與共軛 聚電解質相比，競爭劑對于錯折疊的形式的蛋白質具有更小的結合親和力。通常，如果使用 競爭劑，其比共軛聚電解質具有更少的親和性或選擇性。可選地，可以將共軛聚電解質涂布在固體載體表面上或鍵合在其上。在科學文獻中，已經報道了淀粉樣形式的蛋白質，或至少蛋白酶敏感形式的錯折 疊蛋白質可能與聚陰離子相互作用。這些帶負電的聚合物可能與錯折疊蛋白質結構的帶正 電荷的區(qū)域相互作用，并且可能與聚集的蛋白質存在多種相互作用。我們發(fā)現(xiàn)共軛聚電解 質能結合錯折疊蛋白質聚集體，或者錯折疊蛋白質的小的結合物，所述結合物甚至可以小 至淀粉狀蛋白的兩個單體，其結構具有比這些聚陰離子高得多的親和力，因此，其甚至可以 替換所述聚陰離子化合物。CPEs的高親和力的一個可能的機制是CPEs可以與具有帶電荷 的取代基和疏水性共軛主鏈的錯折疊蛋白質同時形成聚離子以及疏水性相互作用。因此， 固定在表面或溶液中的共軛聚電解質可以特別地俘獲異常蛋白質。天然蛋白質是非聚集 的，通常不會具有與聚陰離子的高親和性相互作用?？梢赃x擇所述測定條件，使得較低親和 性的陰離子如洗滌劑薩考西(Sarkosyl)的存在，通過與固定的CPE或在溶液中的CPE競爭 來更進一步改善俘獲特異性?？梢耘悸?lián)使用CPE的分離，例如俘獲、結合或離析樣品中的錯折疊的、聚集異常形 式或病理形式的蛋白質，以改變所述CPE響應俘獲、結合或離析所述錯折疊蛋白質的性質。 可以通過例如光學方法，如熒光或吸收來檢測CPE的性質變化，然后，使用其來確定何時發(fā) 生所述俘獲事件。其它檢測方法根據(jù)本發(fā)明的方面，可以官能化所述共軛聚電解質，以實現(xiàn)有效或期望的用于檢 測分離的方法。通過合適的方法進行檢測鍵合或接觸所述錯折疊蛋白質的共軛聚電解質的 其它方法，所述合適的方法如雙光子或多光子光譜學、磁共振成像(MRI)、PET等。在此描 述了使屏障后的CPE和錯折疊蛋白質的相互作用成像的一個實例，但存在其它顯而易見的 方法，所述屏障如管、膜、管、皮膚等。可以使用例如雙光子或多光子光譜學或磁共振成像 (MRI)在所述屏障后以一些方式檢測共軛聚電解質或官能化的共軛聚電解質，然后使用其 確定何時發(fā)生了所述分離，例如俘獲或結合事件。
作為治療劑的CPE本發(fā)明還涉及共軛聚電解質作為新的治療劑的用途，其中一種作用方式為干擾體 內淀粉狀蛋白的形成。當注射進入生物體時，所述CPE可以改變淀粉狀蛋白的病理過程， 即，通過起治療的藥效團作用影響疾病的發(fā)病。因此，當臨死前診斷和治療對于公共衛(wèi)生具 有巨大的影響和極大的利益時，在本發(fā)明中預期了該治療劑，所述治療劑為用于蛋白質錯 折疊疾病，特別是阿爾茨海默氏病和朊病毒病的基于CPE的治療劑。在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種方法，其中共軛聚電解質直接俘獲所述錯折 疊蛋白質。在這種情況下，所述俘獲在沒有共價鍵合下發(fā)生，其是基于共軛聚電解質和生物 分子之間偶極-偶極鍵合、氫鍵鍵合、靜電_和非極性的相互作用，本文稱為非共價鍵合，其 進一步包括任何類型的天然非共價的鍵合。如在本申請中使用的術語“直接俘獲”指一種探針(probe)，其可以通過直接鍵合 所述錯折疊蛋白質的來直接俘獲錯折疊蛋白質，從而將其從樣品離析或固定在樣品中，而 不需要其它高分子化合物。如本文中使用的術語“親和力(avidity) ”應當采取其通常的含義，指分子與多價 結合劑的許多結合位點的整體結合強度。這應當與“親和性(affinity)”形成對比，其為各 單獨結合位點和分子及粘合劑的結合強度。例如通過將所述共軛聚電解質固定在基質上，有可能適當?shù)貙⒐倌芑蛭垂倌芑?的共軛聚電解質作為俘獲裝置的活性組分實施。所述俘獲裝置包括用于所述基質的合適的 容器，并且共軛聚電解質和錯折疊蛋白質的復合物在該基質上形成。可選地，所述CPE用于 檢測當其出現(xiàn)時的俘獲事件。然而，其它構造方式是可能的，例如所述共軛聚電解質可以以溶液提供，并且穿過 流動池，同時將蛋白質溶液與復合物溶液流體混合。可以通過各種分析技術監(jiān)測俘獲。特別地，本發(fā)明使得用與錯折疊蛋白質相互作用的共軛聚電解質俘獲與疾病相關 的錯折疊蛋白質。在研究用于診斷涉及錯折疊蛋白質的疾病的方法中，錯折疊蛋白質的俘 獲是從樣品中去除錯折疊蛋白質、檢測在屏障后在樣品中錯折疊蛋白質的分離以及基于共 軛聚電解質的各種治療技術所必需的。顯示出上述討論的特征的共軛聚電解質的實例為聚(3-[(S)-5-氨基-5-羧 基-3-噁戊基]_2，5-硫代亞苯基鹽酸鹽)(POWT)、聚噻吩乙酸(PTAA)、聚(3-[⑶-5-氨 基-5-甲氧基羧基-3-噁戊基]-2，5-硫代亞苯基鹽酸鹽)(Ρ0ΜΤ)、聚((3，3 〃 -二 [(S)-5-氨基-5-羰基-3-噁戊基]-[2，2' ；5'，2〃 ])_5，5〃 -叔硫代亞苯基鹽酸鹽) (tPOWT)、聚((1，4_ 二(3-[⑶-5氨基-5-羰基-3-噁戊基]-噻吩-2-基)-苯)鹽酸 鹽)(f-PONT)、聚(3- [ (R) -5-氨基-5-甲氧基羧基-3-噁戊基]-2，5-硫代亞苯基鹽酸鹽) (D-POMT)、聚(3- [ (S) -5-氨基-5-甲氧基羧基-3-噁戊基]-2，5-硫代亞苯基鹽酸鹽) (L-POMT)及其它物質，參見圖1。在本發(fā)明中，可以為包括這些及其它類型的共軛聚電解質 如吡咯、乙烯基二氧噻吩、芴等的變體，包括L和D對映異構體。CPE的長度可以是固定的、 可變的、單分散的或多分散的。加入到側鏈(Rs)或末端(Rl和R2)的官能基顯示在圖2中。這些可以是，但不限 于荷電陰離子的、陽離子的或兩性離子的，具有在不同PH的pKa，這使得這些聚噻吩衍生物 適于與帶負電荷的或帶正電荷的低聚物和聚合物形成聚電解質復合物。另外，所述離子基
11團與不同的分子建立了多種氫鍵鍵合模式。對于CPEs俘獲錯折疊蛋白質的獨特的能力，提 出的理由之一是親和力，但本發(fā)明不應當受此提議的束縛。觀察錯折疊蛋白質的一個方法 可以是將其看作是具有沿著分子軸的可替代的或重復的電荷分布的聚離子分子。本發(fā)明的 特制的CPEs可以與錯折疊蛋白質形成非常強的非共價相互作用，從而俘獲它們，參見圖3 中示意圖說明?？梢蕴峁┢渲泄倌芑鶠橄率龅哪┒斯倌芑墓曹椌垭娊赓|用于表面固定、 繼發(fā)俘獲或用于根據(jù)本發(fā)明的屏障后的檢測部件所述官能基可以為，但不限于DNA、RNA、 肽、氨基酸、組氨酸、組氨酸1(1、蛋白質、肽支架、生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素、螯合 齊U、活性基團、抗體、親和性肽支架、scFV、FAB、酶、配體、受體配體、類固醇、生物分子或其它 分子、納米顆粒、微粒、金納米顆粒、金微粒、磁珠、蛋白質涂布的珠粒、肽涂布的珠粒、超磁 珠粒或顆粒、釓納米顆粒、氧化釓顆粒、釓離子、摻雜鑭系元素的納米顆粒、摻雜鑭系元素的 氧化釓納米顆粒、鑭系元素顆粒。可以選擇CPE以使其具有如下能力在非選擇性條件下，具有同時俘獲錯折疊的、 聚集改變的或劣種形式的蛋白質以及非聚集的正常形式的蛋白質的能力，和在選擇性條件 下，選擇性俘獲錯折疊蛋白質的能力。如有必要，可以在非選擇性條件下和改變其光學性質 的選擇性條件下，將CPE固定在固體載體上或溶液中，如此，則有可能區(qū)別所述CPE是俘獲 錯折疊蛋白質或是天然蛋白質。可以通過調節(jié)樣品、根據(jù)PH的反應液或洗滌液、離子強度、 緩沖液的選擇，或者通過加入鹽、離子、金屬離子、洗滌劑、聚電解質、蛋白質、顆?；蝌蟿?來獲得合適的非選擇性條件或選擇性條件分析條件。而且，向樣品、反應液或洗滌液中加入一種或多種試劑是可能的，所述試劑能夠增 加結合錯折疊蛋白質的CPE和與正常蛋白質相互作用的CPE的區(qū)別，按這種方式，增加了 俘獲給定樣品中錯折疊蛋白質的選擇性。在這種情況下，CPE可以以固定在固體載體上或 溶液中提供。這樣的試劑包括洗滌劑如Triton-X、皂苷、SDS、薩考西、正-十二烷基肌氨 酸(laurosylsarcosine)、脂肪酸肌氨酸、CHAPS、Bri j、辛基_b_糖苷、吐溫20、乙基苯基聚 乙二醇(Nonidet)P-40或其它變體，離子和鹽如金屬離子、分子離子和有機離子，螯合劑如 EDTA、EGTA、2，2' -二吡啶基、二巰基丙醇、離子載體(Ionophores)、氨三乙酸、鄰-菲咯啉、 水楊酸和三乙醇胺，溶劑如水、醇、有機溶劑、氯化溶劑、胺化溶劑和磺化溶劑及其它試劑， 如聚合材料、聚電解質(兩性離子的、陰離子的或陽離子的)、糖類(包括多糖)、具有超過 一個配位基團的有機酸、脂質類固醇、氨基酸和相關化合物、肽、磷酸鹽、核苷酸、四吡咯、鐵 草胺、離子載體，如短桿菌肽、莫能菌素和纈氨霉素酚醛塑料。其它試劑包括蛋白質，如胰蛋 白酶、蛋白酶K、抗體、血清白蛋白等?？梢詫⑺龉曹椌垭娊赓|作為裝置的活性部分合適地施用，所述裝置俘獲、分離、 結合或去除樣品中錯折疊蛋白質。這可以通過，例如將所述共軛聚電解質固定在基質上， 然后通過合適方式暴露于樣品來實現(xiàn)(參見用于兩個實施例的圖4和5)。合適地，所述 裝置包括用于所述基質的合適的容器，并且共軛聚電解質和錯折疊蛋白質的相互作用在該 基質上形成，由此其俘獲、分離、結合或去除樣品中錯折疊蛋白質。所述共軛聚電解質可以 是使用那些識別或鑒定錯折疊蛋白質(例如PrPSe、PrFes、淀粉狀蛋白-β、原纖維形式的 A β (1-40), A β (1-42)或Αβ (1_43)、淀粉狀蛋白-β (Α β )肽、在透析-相關淀粉樣變性 (DRA)中的β-2-微球蛋白分子、ΙΑΡΡ、在帕金森氏癥中的α-突觸核蛋白或在亨廷頓氏病 中的亨廷頓蛋白)的抗體的系統(tǒng)的一部分，所述錯折疊蛋白質已經或將要被CPE俘獲?？蛇x地，可以使用共軛聚電解質作為報道錯折疊蛋白質的俘獲的光學探針(參見用于兩個實 施例的圖4和5)。然而，其它方式是可能的，例如所述共軛聚電解質可以在溶液中提供，用 于俘獲、同時在樣品中或體內進行染色錯折疊蛋白質。繼而可以用在溶液中或固體載體上 的抗體來鑒定或識別錯折疊蛋白質。下述的發(fā)明的詳細說明將分別涉及共軛聚電解質、錯折疊的、異常的、聚集的、劣 種的或病原性的蛋白質、涉及所述錯折疊蛋白質的疾病、從樣品溶液中俘獲所述錯折疊蛋 白質的方法、共軛聚電解質在固體載體上的固定和陣列。最后，本發(fā)明采用多個實驗舉例證 實其實用性。I共軛聚電解質本發(fā)明涉及多種共軛聚電解質，其具有最少三個單元，所述單元衍生自下述單體 噻吩、吡咯、苯胺、呋喃、亞苯基、亞乙烯基、芴、乙烯基二氧噻吩或其取代的形式、形成的其 均聚物及共聚物。所述共軛聚電解質可以是單分散的，由具有定義明確的鏈長的聚電解質 鏈組成，或者是多分散的，由具有不同鏈長的聚電解質鏈組成。而且，具有陰離子的、陽離子 的或兩性離子的側鏈官能度的單體包括在本發(fā)明的范圍內。所述側鏈官能度來源于，但不 限于氨基酸、氨基酸衍生物、神經遞質、單糖、核酸，或其組合和其化學改性的L和D對映異 構體，或其衍生物。本發(fā)明的共軛聚電解質可以包含單個側鏈官能基，或者可以包括兩個或 多個不同的側鏈官能基。在不同PH下，帶陰離子或陽離子電荷的共軛聚電解質的官能基使 得這些聚電解質衍生物適于與帶負電荷或帶正電荷的低聚物和聚合物形成強的聚電解質 復合物。另外，所述離子基團與不同的分子建立了多種氫鍵鍵合模式。本發(fā)明的某些方面可以提供共軛聚電解質與某些實體的共價連接，所述實體如蛋 白質、錯折疊蛋白質、肽、生物分子或其它分子。在圖1或圖2中，加入到側鏈(Rs)或末端(Rl和R2)上的官能基可以是，但不限 于具有在不同PH的pKa的帶電荷的陰離子、陽離子、或兩性離子官能基，這使得這些聚噻吩 衍生物適于與帶帶負電荷的或帶正電荷的低聚物和聚合物形成聚電解質復合物。另外，所 述離子基團與不同的分子建立了多種氫鍵鍵合模式。對于CPEs俘獲錯折疊蛋白質的獨特 的能力，提出的原因之一是親和力，但本發(fā)明不應當受此提議的束縛。觀察錯折疊蛋白質的 一個方法可以是將其看作是具有沿著分子軸的可替代的或重復的電荷分布的聚離子分子。 本發(fā)明的特制的CPEs可以與錯折疊蛋白質形成非常強的非共價相互作用，從而俘獲它們， 參見圖3中示意圖說明。可以提供其中官能基為下述的末端官能化的共軛聚電解質用于 表面固定、繼發(fā)俘獲或用于根據(jù)本發(fā)明的屏障后的檢測部件所述官能基可以為，但不限于 DNA、RNA、肽、氨基酸、組氨酸、組氨酸1(1、蛋白質、肽支架、生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物 素、螯合劑、活性基團、抗體、親和性肽支架、scFV、FAB、酶、配體、受體配體、類固醇、生物分 子或其它分子、納米顆粒、微粒、金納米顆粒、金微粒、磁珠、蛋白質涂布的珠粒、肽涂布的珠 粒、超磁珠?；蝾w粒、釓納米顆粒、氧化釓顆粒、釓離子、摻雜鑭系元素的納米顆粒、摻雜鑭 系元素的氧化釓納米顆粒、鑭系元素顆粒。II錯折疊蛋白質本發(fā)明的共軛聚電解質俘獲目標錯折疊蛋白質。在本發(fā)明中，術語錯折疊蛋白質 應當以其廣義理解，包括錯裝配的蛋白質、病理形式或劣種形式的蛋白質，即淀粉樣形式、 錯折疊形式或聚集形式的蛋白質，如噬斑，優(yōu)選地，所述錯折疊蛋白質可以是享有特異性結
13構特征的不溶性纖維狀蛋白聚集的淀粉狀蛋白。所述俘獲在沒有共價鍵合下出現(xiàn)，其基于共軛聚電解質和錯折疊蛋白質之間的偶 極_偶極鍵合、氫鍵鍵合、靜電_和非極性相互作用。所述共軛聚電解質可以與正常天然蛋 白質和錯折疊蛋白質相互作用。所述共軛聚電解質也可以俘獲在體外制備的淀粉狀蛋白或 錯折疊蛋白質。不受理論的束縛，目前假設在合適的測定條件下，共軛聚電解質可以特異性 地和具有高親和性地俘獲錯折疊蛋白質。可以化學修飾所述錯折疊蛋白質，以便其被選擇 的共軛聚電解質俘獲。衍生化不同范圍的蛋白質的方法是熟知的。例如，可以容易地改性 氨基酸側鏈以使其包含極性和非極性基團或具有氫鍵鍵合能力的基團。所述錯折疊蛋白質 可以在溶液中、在固相上、在體內、在體外或在組織樣品中，錯折疊蛋白質的俘獲可以在水 溶液中、有機溶劑中、體液中、固相上或組織樣品中進行。可以包含錯折疊蛋白質的體內或體外的目標樣品包括，但不限于血液、腦、外周組 織、均質化的腦、均質化的外周組織、體液、活組織檢查、尿、腦脊液(CSF)、淋巴液及其它合 適的樣品?；阱e折疊蛋白質俘獲的測定具有極大的商業(yè)利益、巨大的診斷價值，可作為治 療劑以及用于俘獲血液(篩選血液制品)或其它復合物介質中錯折疊蛋白質的選擇性測定 和來自腦、肌肉、脂肪、粘液、神經、血管或其它組織的組織切片的染色。III與錯折疊蛋白質相關的疾病特征為淀粉狀蛋白的疾病是用于說明與錯折疊蛋白質相關的疾病的相應實施例， 其中淀粉樣變被稱為一種可以遺傳的或獲得的疾病。注意默認的淀粉樣變通常指AA淀粉 樣變，但是其中存在淀粉狀蛋白沉降的與淀粉狀蛋白相關的任何疾病都是淀粉樣變。例如 CJD、vCJD、阿爾茨海默和糖尿病幾乎都不被稱為淀粉樣變。在該段中，指出了至今相關的淀粉樣變的一些實例。原發(fā)性淀粉樣變包括溶菌酶、 運甲狀腺素蛋白、載脂蛋白B、纖維蛋白原中的突變和AL淀粉樣變(免疫球蛋白輕鏈，如在 多發(fā)性骨髓瘤中看到的)。繼發(fā)性淀粉樣變性包括AA淀粉樣變(血清淀粉樣A蛋白質，一 種由于慢性炎引起的急性期蛋白質)和凝溶膠蛋白淀粉樣變(血漿凝溶膠蛋白片段)。家 族性淀粉樣變或遺傳性淀粉樣變最常見的是由運甲狀腺素蛋白的突變引起，但是在很少情 況下，也可以由載脂蛋白Al、凝溶膠蛋白、纖維蛋白原和溶菌酶突變引起，其主要是由遺傳 引起，被認為是常染色體顯性的、傳代至后代的高概率的、阿巴拉契亞(Appalachian)類型 的淀粉樣變和在沙皮狗(Shar Peis)中的淀粉樣變的沙皮狗熱病(Shar Pei fever)。器 官特異性淀粉樣變的實例為2型糖尿病(糊精，也稱為IAPP)、神經病學、阿爾茨海默氏病 (Α β 39-42)、帕金森氏癥(α -突觸核蛋白)、亨廷頓氏病(亨廷頓蛋白)、傳染性海綿樣腦 病(朊病毒蛋白質，PrP)，某些實例為克雅病(在大腦中的PrP)、庫魯癥(在腦中沉積的彌 漫性的PrP)、致命性家族性失眠癥(在丘腦中的PrP)和牛海綿樣腦病(在母牛大腦中的 PrP)、嗜剛果紅樣血管病(Congophilic angiopathy)(淀粉狀蛋白β )。心臟淀粉樣變包括 充血性心力衰竭；某些實例(在心臟中的PrP或運甲狀腺素蛋白)。包涵體肌炎。另一種 重要的實例是醫(yī)原性的病癥，如胰島素淀粉樣變，其被認為是由于注射給藥胰島素引起。某些非疾病淀粉狀蛋白為在生物體中的天然淀粉狀蛋白、卷曲大腸桿菌(Curli Ε. coli)蛋白質(curlin)、酵母菌朊病毒[Sup35]、鵝柄孢殼菌(Podospora Anserina)朊 病毒Het-s、瘧疾的外殼蛋白、蜘蛛絲、哺乳動物黑素體(pMel)、組織型纖溶酶原激活物 (tPA)、血液動力學因子、降鈣素和蛋白質及設計制造淀粉狀蛋白的肽。
所述朊病毒疾病[例如牛海綿樣腦病(BSE)和克雅病(CJD)]與正常細胞的朊 病毒蛋白質(PrPe)的構型轉化至表示為PrPseW傳染病-相關的同工型相關。所述錯折 疊的感染形式的蛋白質PrPse是一組罕見的、致命性腦病的原因，所述致命性腦病被稱為 朊病毒疾病，其影響人類和哺乳動物。所述朊病毒疾病也稱為傳染性海綿樣腦病(TSE)， 它們包括牛中的牛海綿樣腦病(BSE，或“瘋母牛”病)；綿羊中的羊瘙瘁??；在鹿和麋 鹿中的慢性消耗性疾??；和人類中的疾病[克雅病(CJD)、杰茨曼-斯脫司勒-史茵克 (Gerstmann- Straussler -Scheinker)疾病(GSS)、庫魯癥]。本發(fā)明的共軛聚電解質意 味著用于俘獲與這些疾病相關的病原性朊病毒的方法。IV檢測方法如已經指出的，本發(fā)明是基于使用共軛聚電解質、官能化的共軛聚電解質或其組 合來從樣品中俘獲、結合、分離或去除錯折疊蛋白質。可以通過非限定性的如下方法觀察所 述俘獲事件熒光、福斯特(Fdrster)共振能量轉移(fret)、淬滅發(fā)射光、吸收、雙光子或 多光子光譜學、磁共振成像(MRi)、動態(tài)光散射(DLS)、電或磁反應、電化學、電流分析法、庫 侖法、重量分析法、偏振或各向異性、熒光相關光譜學(FCS)、石英晶體微量天平、具有耗散 的石英晶體微量天平或其它技術和物理性質。可以通過熒光計記錄發(fā)射強度，增強流入檢 測器中的光子可以增加敏感性。這可以使用燈或激光作為激發(fā)光源來獲得。也可以通過使 用熒光顯微鏡或共焦顯微鏡檢測熒光的變化?？梢允褂眉ぐl(fā)或發(fā)射濾光片的組合，并且可 以通過CXD-照相機、攝像機、普通照相機或偏振照相機記錄圖像。然后，可以通過在計算機 中的圖像處理軟件、圖像相關光譜學(ICS)或其它方式分析圖像。V共軛聚電解質和蛋白質的固定在本發(fā)明中使用的共軛聚電解質、生物分子、錯折疊蛋白質、抗體、蛋白質、肽、錯 折疊蛋白質或其它分子可以固定在多種固體載體上，所述固體載體包括，但不限于硅晶片、 玻璃(例如載玻片、玻璃珠)、玻璃碳、硅橡膠、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、特富龍(聚四氟 乙烯)、硅膠小球、金、氧化銦錫、濾紙(例如尼龍、纖維素和硝基纖維素)、標準復印紙或變 體和隔離介質、其它層析介質、磁珠或顆粒、超磁珠?；蝾w粒、釓、氧化釓顆粒或本發(fā)明中有 用的其它固體載體?？梢酝ㄟ^使用例如，但不限于浸涂、旋涂、接觸印刷、絲網(wǎng)印刷、噴墨技 術、噴霧、分散和通過使用軟的平版印刷術或BIAC0RETM(BiaCOre，Uppsala, Sweden)系統(tǒng)的 微流體印刷(microfluidic printing)來獲得共軛聚電解質至固體載體的轉移。共軛聚電解質的固定可以通過物理粘附或共價結合至固體載體獲得，并且其可以 在高溫下進行，或者通過包埋在水凝膠基質中進行。期望本發(fā)明共軛聚電解質的固定可以 改善它們的使用容易性、裝配進入裝置(例如陣列)、穩(wěn)定性、堅固性、熒光反應以符合使 用微量滴定板的高通量篩選(HTS)的過程及其它期望的方式。在固定至固體載體期間，用 于本發(fā)明的共軛聚電解質和朊病毒蛋白質的溶劑可以是，但不限于水、緩沖的水溶液、甲 醇、乙醇及其組合。在該步驟中，也可以加入其它類型的載體聚合物。生物分子、錯折疊蛋 白質、抗體、蛋白質、肽、錯折疊蛋白質或其它分子也可以固定在固體載體上或微量滴定孔 (microtiter wells)中。具有選擇性能力的識別、鑒定或俘獲抗體或其它生物分子也可以 以其自身、與共軛聚電解質一起(即，與聚電解質溶液混合)固定，或者隨后識別已俘獲錯 折疊蛋白質的CPE。當生物分子、錯折疊蛋白質、抗體、蛋白質或肽與本發(fā)明的共軛聚電解質 固定在固體載體上時，它們通過非共價相互作用與所述聚電解質形成復合物。該復合物是在沒有共價化學下形成的，并且其是基于共軛聚電解質和朊病毒蛋白之間的氫鍵鍵合、靜 電-和非極性相互作用。VI陣列和線根據(jù)本發(fā)明，在各個點或線中產生的相同或不同共軛聚電解質的大的陣列可以克 服單個傳感器或基于溶液的方法的缺陷。所述陣列或平行線方法開發(fā)了以簡單的方法用一 種或不同的共軛聚電解質對一個或不同的樣品的平行分析，所述樣品可以包含錯折疊蛋白 質，其中該實驗設計的至少一個步驟使用CPE來俘獲錯折疊蛋白質。使用陣列的主要目的 是增加在其他性質和特征中的使用容易性、可攜帶性、定量、選擇性。使用該方法，我們可以 探究測量多組分樣品和使用部分選擇性的傳感器點的能力。這給予了同時分析兩種以上目 標樣品和進行芯片內測定的機會。通過將共軛聚電解質和/或生物分子、錯折疊蛋白質、朊 病毒蛋白質、抗體、蛋白質或肽固定在任意尺寸和任意選擇的模式(如陣列、線、點、柱)的 固體載體上，可以構建小的、可攜帶的、容易閱讀的和可說明的裝置。多種陣列的使用要求可以同時對或多或少的大量樣品進行檢測。這通常以微點陣 的形式進行，其中將許多獨立的檢測元件(或探針)整合在小的表面積上，以用于大規(guī)模并 行檢測。我們已經證實可以通過使用高彈體壓印器的微接觸印刷來印刷共軛聚電解質和共 軛聚電解質/蛋白質復合物。也可以通過點樣共軛聚電解質溶液，或者通過噴墨聚電解質 溶液，或者通過上述的其它方法進行在微點陣表面上的傳輸。這些步驟是制備多像素微點 陣所必需的。實施例^MM 1. #用共$厄聚申J軍JIH孚獲禾Π檢測丨溶液Φ^ΙΡΓΡ-淀I狀g白。禾Il用熒光、昆 微鏡的表面檢測試管中包含PrP和PrP-淀粉狀蛋白樣品，后者為PrPse-或PrPres-樣蛋白。通過 對水透析溶于3M胍鹽鹽酸鹽中的lmg/mlreCHuPrP90-231制備PrP-淀粉狀蛋白。另一個 試驗規(guī)程是通過在高鹽濃度條件下于試管中振搖而制備PrP-淀粉狀蛋白。向包含PrP和 PrP-淀粉狀蛋白的該溶液中加入共軛聚電解質ΡΤΑΑ(10 μ g/ml)，，使PTAA俘獲、結合并染 色PrP-淀粉狀蛋白。然后，靜置該PTAA/PrP-淀粉狀蛋白形成物至沉降至試管的底部，然 后，可以容易地將其從樣品中分離，如有必要時，進行檢測。收集PTAA/PrP-淀粉狀蛋白的 其它方法為，但不限于過濾、離心、在疏水性表面上俘獲、在具有共價結合的PTAA的表面上 俘獲、使用官能化的顆粒、鹽沉淀和免疫沉淀。用于檢測或觀測PTAA/PrP-淀粉狀蛋白的方 法包括，但不限于，熒光顯微鏡、在平板讀數(shù)器或分光熒光計中的熒光檢測、在平板讀數(shù)器 或分光計中的吸收檢測、陣列熒光讀數(shù)器、光電二極管、熒光偏振或各向異性、圓二色性等。 該方法也提供一種在溶液中從給定樣品中俘獲、清除、去除或過濾PrP-淀粉狀蛋白、PrPSe、 PrPres的方法。在該特別的實例中，將PTAA/PrP-淀粉狀蛋白形成物收集在玻璃基板上，并 使用熒光顯微鏡觀測，參見圖6。使用該儀器，其分辨率能夠鑒定小于IymXlymXlymW 獨立的PrP-淀粉狀蛋白顆粒，其相當于少于2pg的PrP。實施例2 過濾，俘獲為了分離天然的和原纖維胰島素，從而純化該原纖維胰島素，進行聚合物-胰島 素樣品的過濾。測定的樣品為天然胰島素和原纖維胰島素，其含有或不含有PTAA。最初， PTAA的濃度為0. 5mg/ml，胰島素的濃度為2mg/ml，樣品在Iml的20mM pH8的磷酸鹽緩沖液
16中包含10μ1 ΡΤΑΑ+25μ1胰島素。對于所有的樣品，在過濾前后均進行熒光測量，和打開 濾光器，觀測檢查。使用的過濾器為0. 22μπι Millex-gu，并將Iml的每種樣品過濾穿過過在過濾穿過0. 22 μ m的過濾器前后，PTAA-天然胰島素(PTAA-ins)和PTAA-原纖 維胰島素(PTAA-fib)的熒光光譜顯示在圖9中。在過濾之前，光譜看上去如預期的。在過 濾后，很明顯含有PTAA和原纖維胰島素的樣品保留在過濾器(看到熒光減少)，而含有天 然胰島素的樣品不會影響聚合物的通過。因此，可以使用過濾去除結合至PTAA的天然胰島 素。在過濾后對過濾器的觀測檢查顯示，在過濾器上存在PTAA-原纖維胰島素的聚集物(看 到紅色聚集物)，而含有PTAA-天然胰島素的過濾器沒有顯示出聚集物或顏色的變化。也進行了檢測所述過濾器中俘獲的PTAA-原纖維胰島素復合物存在的測量。如 上所述制備僅含有PTAA的樣品和含有天然胰島素的樣品，所述天然胰島素包含0、5、50和 100%的原纖維胰島素。隨著原纖維胰島素含量的增加，天然胰島素的含量降低，引起所有 的樣品中的胰島素總量相同。將樣品過濾穿過0.8μπι Millex-aa過濾器，并測量濾液的 熒光。然后，通過擠壓Iml的緩沖液反向穿過過濾器而逆-過濾所述過濾物。之后，測量 逆-過濾的濾液的熒光。第一次濾液的熒光光譜顯示在圖10中。增加原纖維含量會引起更多的PTAA-原 纖維胰島素復合物保留在過濾器中，而PTAA與天然胰島素可以自由地穿過。逆_過濾的樣 品顯示在圖11中。雖然大多數(shù)復合物仍然被捕獲在過濾器中，但是很明顯在逆-過濾后， 增加原纖維的量引起更多的PTAA-原纖維胰島素復合物溶于溶液中。因此，PTAA可用于俘 獲原纖維胰島素。使用過濾來俘獲PTAA-原纖維復合物不限于上述的過濾器和實例?？梢允褂萌魏?其它類型的過濾器、基質、緩沖液、濃縮物和添加劑，并且可以通過熒光測量、吸光度測量、 觀測檢查、顯微鏡法、熒光偏振或各向異性、圓二色性等獲得分析和檢測。實施例3 #用共$厄聚申J軍JIH孚獲禾π檢測丨溶液Φ 仙夷島素-淀I狀g白。禾Il用熒光測W·的溶 液檢測在試管中，將含有天然胰島素的樣品與PTAA (0. 05mg/ml，10 μ 1)和965 μ 1的20mM 磷酸鹽緩沖液PH 7.0混合，所述天然胰島素包含0、1、5、50和100%的原纖維(2mg/ml， 25 μ 1)。通過在65攝氏溫度下，在ρΗ 2溫育天然胰島素8小時產生原纖維胰島素。將樣 品以IOOOOrpm離心5分鐘，除去上清液，加入新的緩沖液，并重復該過程一次。所述PTAA 結合原纖維胰島素，并在離心下沉降到試管的底部。然后，使用熒光微量培養(yǎng)板讀數(shù)器測量 樣品。又測量了沒有離心的PTAA-天然胰島素和PTAA-原纖維胰島素的參照樣品。將結果 顯示在圖12中。所述PTAA-原纖維聚集物沉降到試管的底部，并且其可以通過離心后除去上清 液而容易地被收集以用于檢測。通過溶解所述沉淀物，之后可以通過熒光測量來檢測 PTAA-原纖維復合物。用于檢測或觀測PTAA/PrP-淀粉狀蛋白的方法包括，但不限于熒光 顯微鏡、在平板讀數(shù)器或分光熒光計中的熒光檢測、在平板讀數(shù)器或分光計中的吸收檢測、 陣列熒光讀數(shù)器、光電二極管、熒光偏振或各向異性、圓二色性等。該方法也提供一種在溶 液中從給定樣品中俘獲、清除、去除或過濾淀粉狀蛋白和原纖維的的方式。正如該實施例所示，增加原纖維的量得到更多的PTAA-原纖維復合物。從原纖維至100%原纖維，熒光 強度增加，顯示出PTAA和原纖維之間的結合，因為在離心后，根本不存在PTAA和天然胰島
ο實施例4 在固體載體上CPEs的固定該實施例描述了在涂有APTES的玻璃表面上固定PTAA。所述硅烷APTES是為了具 有用于化學耦合的胺基。EDC (或EDAC)是用于耦合羧基至伯胺的零_長度交聯(lián)劑。該交聯(lián) 劑可以用于多種應用，如在肽合成中形成酰胺鍵，將半抗原結合至載體蛋白以形成免疫原， 用5'磷酸基標記核酸和建立生物分子的胺-反應性NHS-酯。首先，可以活化具有羧基、-COOH的CPEs (如PTAA、POffT, tPTAA或tPOWT)，然后 將其耦合至任何種類，如官能化的磁珠的胺表面。可以將不包含任何羧基但具有胺基的 CPEs (如POMT、tPOMT和PTT)耦合至活化的羧基表面。如果有具有羧基的磁珠，只要將其 放入EDC/NHS溶液中即可。試驗規(guī)稈，PTAA的固定使用TLl洗滌物(5份H2OU份25%的NH3U份28%的H2O2，加熱至85°攝氏度5 分鐘，用水洗滌)和TL2洗滌物(6份H20、1份37%的HC1、1份28%的H2O2，加熱至85°攝 氏度5分鐘，用水洗滌)清潔玻載玻片，以去除有機物和無機物，并使其具有親水性。用隊 干燥。 將載玻片置于汽化室中。將200μ1的APTES置于所述室中，在60°攝氏度蒸發(fā) 10分鐘，在150°攝氏度烘焙60分鐘。在二甲苯中洗滌，并貯存在二甲苯中。對于不同的 汽化室，APTES的量可能不同?！ぶ苽湓贖2O中的2mM的EDC和ImM的NHS的混合物。 將1份EDC/NHS與1份的PTAA混合?！?00 μ 1的PTAA-EDC/NHS施用到載玻片上，在暗處溫育30分鐘。·用20mM的磷酸鹽緩沖液pH 8洗滌表面3次。用N2干燥。將PTAA共價結合至薄層的表面，其可用于結合目標分子?？梢允褂脤υ囼炓?guī)程的 某些改良，如濃度、PH、緩沖液、培養(yǎng)時間和使用的材料。已經選擇EDC/NHS的濃度來活化 PTAA中的一小部分羧基，以增加結合至表面的PTAA的量，并保持PTAA的結合性質。優(yōu)選 地，應當僅僅活化所述聚合物的一個側鏈。沒有評價該報道的濃度是否為最佳?？梢愿淖?PH和用于洗滌的緩沖液組合物。在用于Nunc的Covalink微量滴定板的試驗規(guī)程中，所述 洗滌緩沖液為116. 9g的NaClUOg MgS04*7H20、0. 5ml吐溫20、1升PBS0可以改變培養(yǎng)時 間以改善結果?？梢允褂昧虼?NHS代替NHS，因為其會稍微更穩(wěn)定。試驗規(guī)程，POMT的固定由于POMT不包含羧酸側基，用于固定的方法與PTAA的方法相反。應當使用包含 羧基的表面如PEG基質來代替APTES表面。用BrCH2COOH和NaOH處理所述PEG基質以引入 COOH基團，之后，在加入POMT之前將EDC/NHS應用于所述表面以活化所述羧基。也可以使 用其它表面。沒有評價該方法。參見文獻“Photografted Poly (ethylene glycol)Matrix for AffinityInteraction Studies，，,Biomacromolecules,第 8 卷，第 1 期，第 287-295 頁， 2007中的方法說明。試驗規(guī)程，POffT和PTT的固定
由于POWT和PTT都同時包含羧基和胺基，使用EDC/NHS可以引起聚合物鏈之間的 交聯(lián)，而不是聚合物和表面之間的交聯(lián)，這不是期望的。然而，通過調整EDC/NHS和聚合物 的濃度，有可能產生共價結合至表面上的更厚的交聯(lián)聚合物層，甚至獲得更好的結果?？梢?使用APTES表面或包含羧基的表面。沒有評價該方法。^M在上述實施例中，已經使用載玻片來固定。也可以使用其它表面，如硅晶片、玻璃 珠、微量滴定板(Nunc的Covalink是用APTES表面預涂布的)，或具有合適性質的任何其它 表面。其它的固定技術也可以使用其它的固定技術。對于共價結合，可以使用具有生物素或其它端基的 官能化的聚合物。對于非共價結合，可以使用蛋白質層在表面上的物理吸附。聚合物可以 是例如，涂布在用葡聚糖硫酸鹽涂布的Nunc Maxisorp微量滴定板上的。也可以使用任何 其它能夠將聚合物涂布至表面的技術。將樣品加至表面可以以不同的方式，將待評價或俘獲的樣品加入到聚合物涂布的表面?？珊唵蔚?將一定體積的樣品加入到表面，溫育合適的時間并洗滌?？梢允褂昧鲃訉Ч?Flow canal) 引導合適量的樣品到表面上，其得到更加可重復的系統(tǒng)。如果使用珠粒，可以將其加入到樣 品溶液中，溫育，并使用離心、磁性分離或任何其它分離技術將其從溶液中分離。棚列5 眺■申鍾__係減賊碰該實施例顯示了 CPE和鑭系元素納米顆粒如Eu203、Gd203或Nd2O3之間的特異性相 互作用是可能的。這些顆粒可以是粒徑從幾納米至幾百納米的任何顆粒，其依次可用于體 內成像錯折疊蛋白質和根據(jù)本發(fā)明的與錯折疊蛋白質相關的疾病。鑭系元素顆粒的修飾是 可能的，如摻雜多種金屬，如Fe3+、Eu3+、Tb3+等。在涂布或結合CPEs之前，有可能通過例如 生物分子、二甘醇、烷烴、羧基、檸檬酸、胺基等預涂布所述鑭系元素顆粒，之后進一步加入 其它分子。為了證實一些選擇的CPEs和Gd2O3納米顆粒之間的相互作用，記錄了 CPEs的熒 光，參見圖13。激發(fā)波長設定為400nm，CPE的測量濃度設定為2. 5 μ g/mL，并且將氧化釓顆 粒用購自Sigma-Aldrich的儲備溶液稀釋200倍。在重蒸水中進行本文中出現(xiàn)的測量，但 是其也可以在許多類型的緩沖溶液或復合物介質中進行。
權利要求
一種藥用制劑，其包括任選的官能化的CPE和任選的可藥用載體。
2.根據(jù)權利要求1所述的制劑，其中所述共軛聚電解質具有一個或多個離子側鏈和 /或末端官能度，其中所述離子側鏈和/或末端官能度選自由以下組成的組氨基酸、氨基 酸衍生物、神經遞質、單糖、核酸、DNA、RNA、肽、組氨酸、組氨酸10、蛋白質、肽支架、生物素、 抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素、螯合劑、活性基團、抗體、酶、配體、受體配體、類固醇、生物分 子或其它分子、納米顆粒、微粒、金納米顆粒、金微粒、磁珠、蛋白質涂布的珠粒、肽涂布的珠 粒、超磁珠?；蝾w粒、釓納米顆粒、釓離子、摻雜鑭系元素的納米顆粒、摻雜鑭系元素的氧化 釓納米顆粒、鑭系元素顆粒，或其組合和化學修飾的衍生物。
3.一種共軛聚電解質，其在由錯折疊蛋白質的聚集引起的疾病的治療方法中使用，所 述方法包括將患者的體液進行聚集性錯折疊蛋白質的分離。
4.一種共軛聚電解質，其在由錯折疊蛋白質的聚集引起的疾病的治療方法中使用，所 述方法包括給藥患有所述疾病的患者有效量的CPE以抑制錯折疊蛋白質的進一步聚集或 結合中間體形式的錯折疊蛋白質，并在進一步反應中去除這些物質。
5.根據(jù)權利要求3或4所述的共軛聚電解質，其中所述共軛聚電解質具有一個或多個 離子側鏈和/或末端官能度，其中所述離子側鏈和/或末端官能度選自由以下組成的組 氨基酸、氨基酸衍生物、神經遞質、單糖、核酸、DNA、RNA、肽、組氨酸、組氨酸10、蛋白質、肽 支架、生物素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素、螯合劑、活性基團、抗體、酶、配體、受體配體、 類固醇、生物分子或其它分子、納米顆粒、微粒、金納米顆粒、金微粒、磁珠、蛋白質涂布的珠 粒、肽涂布的珠粒、超磁珠粒或顆粒、釓納米顆粒、釓離子、摻雜鑭系元素的納米顆粒、摻雜 鑭系元素的氧化釓納米顆粒、鑭系元素顆粒，或其組合和化學修飾的衍生物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種共軛聚電解質作為新治療劑的用途，其通過在體內干擾錯折疊的、病理的或劣種形式的蛋白質的形成或俘獲其來起作用。
文檔編號A61P9/04GK101947235SQ201010245519
公開日2011年1月19日 申請日期2007年4月18日 優(yōu)先權日2007年4月18日
發(fā)明者F·安格斯, O·英格納斯, P·奧斯伯格 申請人:比奧克羅密克斯藥業(yè)有限公司