專利名稱：Ing4和il-24雙基因共表達(dá)載體作為放療增敏劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因組學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因工程以及臨床醫(yī)學(xué)，本發(fā)明 具體涉及人類ING4和IL-24雙基因共表達(dá)載體作為化療藥物增敏劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
放射治療是腫瘤治療的常規(guī)手段之一，70% 80%的惡性腫瘤患者在治療過程中 需接受放療。腫瘤對(duì)輻射不敏感或?qū)椛洚a(chǎn)生抗拒性，是放射治療難以根治惡性腫瘤的主 要原因之一。近年來，隨著對(duì)腫瘤發(fā)病分子機(jī)制及細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)理研究的深入，腫瘤基 因治療已取得一些令人振奮的成果，但針對(duì)單一環(huán)節(jié)的轉(zhuǎn)基因治療常常不能達(dá)到令人滿意 的治療效果。Weichselbaum等于1994年提出腫瘤基因-放射治療的新思路，其原理是將 輻射誘導(dǎo)型基因的調(diào)控序列與腫瘤殺傷基因相耦聯(lián)，轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，對(duì)腫瘤實(shí)施局部照射 同時(shí)誘導(dǎo)基因表達(dá)，通過射線與基因的雙重作用殺傷腫瘤，以達(dá)到降低照射劑量、緩解正常 組織損傷的目的。因此，將放射治療與基因治療相結(jié)合，事半功倍，已成為腫瘤治療研究的 重要方向之一，目前腫瘤基因聯(lián)合放射治療的有關(guān)機(jī)制主要有如下幾種(參見田玥，蘇成 海.國(guó)際放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)雜志.2008 32(1))①免疫基因治療與放射治療的聯(lián)合；②抑癌 基因與放射治療的聯(lián)合；③自殺基因治療與放射治療的聯(lián)合；④抗血管生成基因治療與放 射治療的聯(lián)合；⑤特異性啟動(dòng)子基因治療與放射治療的聯(lián)合；⑥輻射保護(hù)性基因治療與放 射治療的聯(lián)合?，F(xiàn)有技術(shù)中，已知人ING4基因定位于12pl3_31，基因跨距13kb，由8個(gè)外顯子 和7個(gè)內(nèi)含子組成，cDNA全長(zhǎng)1380bp，編碼蛋白含249個(gè)氨基酸，是新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞 內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)抑制因子，可與NF- κ B蛋白的P65亞基結(jié)合抑制NF- κ B蛋白的活性，引起對(duì) NF-κ B敏感的IL-8等基因的表達(dá)量減少；可通過調(diào)節(jié)p53乙?；癄顟B(tài)增強(qiáng)p53的轉(zhuǎn)錄 活性；可抑制缺氧誘導(dǎo)因子HIF-I的活化等，從而抑制腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；白 介素-24(interleukin-24，IL-24)基因原先被命名為黑色素瘤分化相關(guān)基因(melanoma differentiation-associated gene-7，mda_7)，由美國(guó)哥倫比亞大學(xué)的 Jiang 等人于 1995 年將增生活躍的人類黑色素瘤細(xì)胞HO-I產(chǎn)生的cDNA文庫(kù)與經(jīng)人成纖維細(xì)胞β干擾素 (IFN-β )和Hiezerein(MEZ)共同處理過的HO-I細(xì)胞的cDNA文庫(kù)進(jìn)行減數(shù)雜交時(shí)首次發(fā) 現(xiàn)(參見 Jiang H, Lin JJ, Su ZZ 等人，Oncogene，1995，11 (12) :2477_2486·)。這一因子 從其結(jié)構(gòu)、染色體定位、堿基序列同源性及細(xì)胞因子特性等方面綜合考慮，被歸入IL-10家 族，并命名為IL-24。IL-24為分泌型細(xì)胞因子，是一種膜受體介導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)抑制因子。目 前的研究顯示，IL-24基因是第一個(gè)，很可能是唯一既抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和血管形成并誘導(dǎo) 凋亡，同時(shí)又能刺激免疫細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的新型抑癌基因，因而能通過抑制腫瘤血管生 長(zhǎng)，刺激免疫系統(tǒng)應(yīng)答及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡三者聯(lián)合的方式來發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。申請(qǐng)?zhí)枮?00910029793. 9的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)公開說明書公開了人類ING4基因 作為腫瘤放療增敏劑的用途，可以將ING4基因應(yīng)用于腫瘤放療過程，并且明顯促進(jìn)不同腫 瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，有效地抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。
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申請(qǐng)?zhí)枮?00810244301. 3的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)公開說明書公開了雙基因重組轉(zhuǎn) 移載體 pAdTrack-CMV-ING4-polyAA296 298+CMV-IL-24，所述雙基因載體將 ING4 和 IL-24 基 因理想而又成功的組合使兩個(gè)基因在同一個(gè)載體上均能獲得成功表達(dá)，并且通過雙基因表 達(dá)產(chǎn)物的聯(lián)合作用，將作用于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的ING4與分泌至胞外的IL-24聯(lián)合作用，進(jìn)而發(fā) 揮出抑癌增效和化療增敏效果，而且其效果相對(duì)于單獨(dú)的ING4或者IL-24的作用更明顯。但是關(guān)于人類ING4和IL-24雙基因共表達(dá)載體作為腫瘤放療增敏劑的應(yīng)用卻未 見報(bào)道，而且本領(lǐng)域技術(shù)人員公知化療增敏藥物未必可以作為放療增敏藥物使用；放射 增敏作用主要是針對(duì)瘤內(nèi)放射抗拒的那部分乏氧細(xì)胞而提出的，指的是某些化學(xué)物質(zhì)能增 強(qiáng)射線對(duì)腫瘤內(nèi)乏氧細(xì)胞的殺滅作用而對(duì)有氧的正常組織損傷較小，這些化學(xué)物質(zhì)稱為放 療增敏劑，常用的放療增敏劑主要有米索硝唑(MISO)、甘氨雙唑鈉(CMNa)、黃酮乙酸和氧； 有些藥物既可以作為放療增敏劑又可以作為化療增敏劑，比如米索硝唑(MISO)、甘氨雙唑 鈉化11妝)、011妝、環(huán)磷酰胺、氟尿嘧啶、￥ -16、博來霉素、絲裂霉素(、(羥基)喜樹堿、紫杉 醇、阿霉素、順(卡)鉬等；但是有些藥物只能作為化療增敏藥物而不能作為放療增敏藥物， 比如磺氨酸、decitabine等可以克服抗藥性，使癌癥得到更好的治療。而且目前未見有關(guān)人類ING4和IL-24雙基因共表達(dá)載體及其雙基因編碼蛋白聯(lián) 合放療發(fā)揮放療增敏作用的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供ING4和IL-24基因共表達(dá)載體的新用途，具體涉及人類ING4 和IL-24雙基因共表達(dá)載體作為放療增敏劑的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供應(yīng)用人類ING4和IL-24雙基因共表達(dá)載體增強(qiáng)腫瘤細(xì) 胞對(duì)放療敏感性的方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是人類ING4和IL-24雙基因共表達(dá)載 體作為放療增敏劑的應(yīng)用，所述人類ING4和IL-24雙基因共表達(dá)載體為雙基因重組轉(zhuǎn)移載 體 pAdTrack-CMV-ING4-polyAA296 298+CMV-IL-24(參見公開號(hào)為 CN 101591658A 的中國(guó) 發(fā)明專利申請(qǐng)公開說明書)。本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用人類ING4和IL-24雙基因共表達(dá)載體增強(qiáng) 腫瘤細(xì)胞對(duì)放療敏感性的方法，放療前將人類ING4和IL-24雙基因共表達(dá)載體 pAdTrack-CMV-ING4-polyA^96^ 298+CMV-IL-24 導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，使人類 ING4 和 IL-24 基因在 腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，然后進(jìn)行放療。上述技術(shù)方案中，所述將pAdTrack-CMV-ING4_polyAA296 298+CMV-IL_24 導(dǎo)入腫瘤 細(xì)胞的方法為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染或腺病毒介導(dǎo)法。上述技術(shù)方案中，所述pAdTrack-CMV-ING4_polyAA296 298+CMV-IL_24 具有公開號(hào) 為CN 101591658A中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)公開說明書的序列表中SEQID NO. 2所述的堿基序列。下面以腺病毒介導(dǎo)法為例，說明本發(fā)明采用的技術(shù)方案，包括以下具體步驟(1)按照現(xiàn)有技術(shù)，用 pAdTrack-CMV-ING4-polyAA296 298+CMV-IL-24 雙基 因共表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建Ad-ING4-polyAA296 298+CMV_IL_24重組腺病毒病毒子(簡(jiǎn)稱 Ad-ING4-IL-24)；(2)用Ad-ING4-polyAA296 298+CMV-IL_24感染人腫瘤細(xì)胞或裸鼠移植瘤，使人
4ING4和IL-24基因在人的腫瘤細(xì)胞中得到表達(dá)；(3)對(duì)步驟(2)所述的人的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行放療。上述技術(shù)方案中，所述腫瘤為肺腺癌、乳腺癌。因此，本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)Ad-ING^polyA"296 298+CMV-IL-24重組腺病毒子(簡(jiǎn) 稱Ad-ING4-IL-24)作為放療增敏劑的應(yīng)用。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明所述Ad-ING^polyA"296 298+CMV-IL_24可以使大量增殖期腫瘤細(xì)胞阻滯 于G2/M期，有利于增強(qiáng)照射敏感性，MTT和FCM檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步表明，Ad-ING4-IL_24聯(lián)合 放療具有顯著性抑制SPC-Al肺腺癌細(xì)胞和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 的作用，并優(yōu)于Ad-ING4-IL-24單純組和放療單純組，呈現(xiàn)明顯放療增敏協(xié)同效應(yīng)(Q值=
1.17)；因此，可以應(yīng)用人類ING4和IL-24雙基因共表達(dá)載體增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療敏感性。


圖1為實(shí)施例三中腺病毒介導(dǎo)的ING4和/或IL-24基因在SPC-Al中的轉(zhuǎn)錄鑒定 (RT-PCR)，其中，1. PBS ；2. AdV ；3. Ad-IL-24 ；4. Ad_ING4 ；5. Ad-ING4-IL_24 ；圖2為實(shí)施例四中IL-24和ING4蛋白表達(dá)Western blotting鑒定，其中，1. PBS ；
2.AdV ；3. Ad-IL-24 ；4.Ad-ING4 ；5.Ad-ING4-IL-24；圖3A為實(shí)施例六中Ad-ING4-IL_24+放療對(duì)SPC-Al肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影 響，Ad-ING4-IL-24+放療聯(lián)合組分別與AdV組，PBS組比較，Δ P < 0. 01 ；分別與 Ad-ING4-IL-24，放療組比較，* P < 0. 01 ；圖3B為實(shí)施例六中Ad-ING4-IL-24+放療對(duì)SPC-Al肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率結(jié) 果比較，Ad-ING4-IL-24+放療聯(lián)合組分別與Ad-ING4-IL-24，放療組比較，* P < 0. 01，Q = 1. 17 ；圖4A為實(shí)施例六中流式細(xì)胞儀檢測(cè)Ad-ING4-hIL_24+放療對(duì)SPC-Al肺腺癌細(xì)胞 周期的測(cè)定結(jié)果；圖4B為實(shí)施例六中流式細(xì)胞儀檢測(cè)Ad-ING4-IL_24+放療對(duì)SPC-Al肺腺癌細(xì)胞 周期結(jié)果的比較，Ad-ING4-IL-24+放療聯(lián)合組分別與Ad-ING4-IL_24，單純放療組比較，* P < 0. 01 ；圖5A為實(shí)施例六中流式細(xì)胞儀檢測(cè)Ad-ING4-IL_24+放療聯(lián)合組對(duì)SPC-Al肺腺 癌細(xì)胞凋亡率測(cè)定的結(jié)果；圖5B為實(shí)施例六中Ad-ING4-IL_24+放療對(duì)SPC-Al細(xì)胞凋亡率的放療增敏效應(yīng)， Ad-ING4-IL-24+放療聯(lián)合組分別與Ad-ING4-IL_24，單純放療組比較，* P < 0. 01，Q = 1. 16 ；圖6為實(shí)施例八中各組肺腺癌瘤體體積_時(shí)間變化曲線，Ad-ING4-IL_24+放療聯(lián) 合組分別與PBS組、AdV組比較，* P < 0. 01 ；分別與Ad-ING4-IL24組、單純放療組比較， Δ P < 0. 01 ；圖7為實(shí)施例八中各組肺腺癌瘤體重量直方圖，Ad-ING4-IL24+放療聯(lián)合組的抑 瘤作用優(yōu)于單純Ad-ING4-IL24組、單純放療組，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P < 0. 01)；圖8為實(shí)施例八中各組肺腺癌抑瘤率比較直方圖Ad-ING4-IL_24+放療聯(lián)合組分別與Ad-ING4-IL24組、單純放療組比較，* P < 0. 01 ;Q = 1. 20 ；圖9為實(shí)施例八中各組肺腺癌瘤體組織HE染色(X400)；圖10為實(shí)施例七中各組對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用；圖11為實(shí)施例七中FCM檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率；圖12A C為實(shí)施例i^一中Ad-ING4-IL_24聯(lián)合放療對(duì)人乳腺癌裸鼠移植瘤的抑 瘤效應(yīng)結(jié)果的比較。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例中所涉及材料和試劑人肺癌細(xì)胞株SPC-A1，人乳腺癌細(xì)胞 株MDA-MB-231，QBI-293A細(xì)胞及攜帶GFP綠色熒光蛋白的Ad-polyA-promoter 腺病毒 空載體 AdV>Ad-polyA-promoter-IL-24, Ad-ING4-polyA-promoter、 Ad-ING4-polyA-promoter-IL-24由蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系細(xì)胞與分子生物學(xué)教研室提供； 培養(yǎng)基RPMI1640，胎牛血清、DMEM購(gòu)自Gibcol Brl公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美 國(guó) Sigma 公司；Annexin-v-PE/7-AAD 凋亡試劑盒購(gòu)于 southern biothech 公司；PI 單染 凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自CORNING公司， DL2000marker> Taq DNA 胃☆_、 dNTPmix、 Oligo d(T) 18> Ribonuclease Inhibitor TaKaRa公司；逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV購(gòu)自MBI公司；UNIQ-IO柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、瓊脂糖 等生化試劑購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司。各基因其上、下游引物由上海生工(Sangon) 生物技術(shù)有限公司合成(如表1)。Western blotting中，IL-24、ING4—抗購(gòu)自美國(guó)abeam 公司，其二抗均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，硝酸纖維素膜(NC膜)、Western blotting化 學(xué)發(fā)光試劑盒和暗盒購(gòu)自上海普利萊基因技術(shù)有限公司(蘇州金萊生物科技有限公司發(fā) 貨)。3-4周齡、體重約20g/只雄性BALB/c nu/nu裸鼠購(gòu)自中科院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中心(許可證號(hào)SCXK (滬)2007-0005)。免疫組化 Caspase3、bax、bcl_2、cox_2、Fas_L、 Survivin.VEGF 一抗購(gòu)自福州邁新(進(jìn)口分裝)，⑶34 —抗購(gòu)自武漢博士德生物有限公司， 其所有二抗均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司(進(jìn)口分裝)。體外細(xì)胞輻照于蘇州大學(xué)輻照 中心、鈷60(γ射線)、劑量率lGy/min。動(dòng)物體內(nèi)放療蘇大附一院放療科電子輻照(χ射 線)，西門子 PRIMUS Μ, 5MeV, SSD= 100cm, Dt = IOGy。表IPCR擴(kuò)增所用引物及其序列
引物編號(hào)和名稱引物序列SEQ ID No. 1，Pl :ING4 上游5' -tagagatctaccatggctgctgggatgtatttgg-3'SEQ ID No. 2，P2 :ING4 下游5' -accgtcgaccctatttcttcttccgttcttg-3'SEQ ID No. 3，P3 :IL-24 上游5' -gcactcgagaccatgaattttcaacagaggctgca—3'SEQ ID No. 4，P4 :IL-24 下游5' -gcttctagatcagagcttgtagaatttctg-3'
6 實(shí)施例一(1)根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，從保藏號(hào)為CCTCC M 208155的大腸桿菌中獲得 pAdTrack-CMV-ING4-polyAA296 298+CMV-IL-24(簡(jiǎn)稱 pAd-ING4-IL_24)；(所述大 腸桿菌保藏信息為保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；地址中國(guó)武漢大學(xué)； 保藏日期2008年10月12日；保藏編號(hào)CCTCC M 208155 ；分類命名大腸桿菌 DH5 α /pAdTrack-CMV-ING4-polyA^96 298+CMV-IL-24 ；Escherichia coli DH5 α / pAdTrack-CMV-ING4-polyAA296 298+CMV-IL-24。)；根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，采用人ING4和IL-24雙基因共表達(dá)載體質(zhì)粒 pAdTrack-CMV-ING4-polyAA296 298+CMV-IL-24構(gòu)建腺病毒介導(dǎo)的重組病毒子 Ad-ING4-polyAA296 298+CMV-IL-24(簡(jiǎn)稱 Ad-ING4-IL-24)；(2)細(xì)胞培養(yǎng)=SPC-Al細(xì)胞、MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞各自用RPMI1640完全培養(yǎng)基 (10% FCS)，在37°C，5% CO2下培養(yǎng)，2 3天傳代一次；(3) AdV, Ad-ING4-IL-24等腺病毒的擴(kuò)增與效價(jià)的測(cè)定用AdV，Ad-ING4-IL-24，Ad-polyA-promoter-IL-24(簡(jiǎn)稱 Ad-IL-24)， Ad-ING4-polyA-promoter (簡(jiǎn)稱 Ad_ING4)感染 70% 貼壁的 QBI-293A 細(xì)胞，48h 后收集細(xì) 胞，將細(xì)胞懸液于-80°C及37°C反復(fù)凍融4次，取上清，反復(fù)擴(kuò)增，病毒保存于-80°C ；將培養(yǎng)生長(zhǎng)狀況良好的QBI-293A細(xì)胞，用胰酶消化后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋細(xì)胞濃度 為IO5個(gè)/ml后，在96孔板上按每孔100 μ 1接種細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，將收獲的重組病毒子按10_4、10_5、10_6、10_7、10_8稀釋后，每個(gè)稀釋度按每孔100 μ 1接種1排，37°C、5% CO2細(xì)胞培 養(yǎng)箱里培養(yǎng)18h后，熒光顯微鏡下進(jìn)行熒光計(jì)數(shù)。按病毒效價(jià)(pfu/ml)=(熒光數(shù)XlO)/ 稀釋度計(jì)算病毒效價(jià)。結(jié)果顯示，將腺病毒感染QBI-293A細(xì)胞后，次日在倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠 色熒光，48h后細(xì)胞變圓，呈葡萄狀聚集，脫落，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病理效應(yīng)(CPE)，收集細(xì)胞， 反復(fù)凍融。重組病毒子經(jīng)多輪感染后，檢測(cè)效價(jià)均達(dá)到108pfu/ml(乳腺癌那個(gè)實(shí)施例是 109pfu/ml，如果合并實(shí)施例，該采用哪個(gè)數(shù)據(jù)？)。實(shí)施例二 Ad-ING4-IL-24重組腺病毒感染SPC-Al細(xì)胞將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SPC-Al細(xì)胞系，經(jīng)0. 25%胰酶消化后，用RPMI1640配成細(xì) 胞懸液，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1 Xio5Ail，每孔100 μ 1接種于96孔培養(yǎng)板，37°C，5% CO2 培養(yǎng)過夜。次日AdV空載體腺病毒體外以1、10、25、50、100、200M0I不同劑量感染SPC-Al 細(xì)胞，以篩選和判定最佳感染劑量并以最佳感染劑量感染SPC-Al細(xì)胞，結(jié)果為在普通光 鏡視野下可見1、10、25、50、100M0I不同劑量AdV空載體腺病毒感染SPC-Al組，細(xì)胞均形 態(tài)正常，生長(zhǎng)良好，與未感染腺病毒SPC-Al細(xì)胞對(duì)照組幾乎無差別，而200M0I劑量感染 SPC-Al組細(xì)胞圓縮、脫落，呈現(xiàn)明顯的由腺病毒本身引起細(xì)胞毒性；在熒光顯微鏡下，50、 100、200M0I不同劑量AdV感染SPC-Al細(xì)胞后可見90%以上細(xì)胞呈現(xiàn)GFP表達(dá)的綠色熒 光，根據(jù)AdV對(duì)細(xì)胞感染效率最高而毒性最低的病毒感染劑量為最佳感染劑量的原則，提 示50M0I可作為腺病毒感染SPC-Al細(xì)胞的最佳感染劑量。實(shí)施例三RT-PCR法鑒定不同基因重組腺病毒感染SPC-Al肺腺癌細(xì)胞后目的基 因轉(zhuǎn)錄將PBS 組及用 50M0I 的 AdV，Ad-ING4-IL_24，Ad-IL-24，Ad_ING4 分別感染 SPC-A1 肺癌細(xì)胞72h后的各組細(xì)胞，1500r/min離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2_3次，按RNA抽提試劑盒 說明書操作提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。將上述cDNA模板和上下游引物在PCR 儀中進(jìn)行擴(kuò)增，IL-24、ING4基因上下游引物見表1_1. PCR的條件為94°C 4min,94°C 30s、 55°C 45s,72°C lmin、30cycle，72°C IOmin0 最后分別取 10 μ 1 產(chǎn)物與 DNA Marker 一起行 瓊脂糖凝膠電泳，其產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后，如圖1顯示，在621bp位置可檢測(cè)到一條IL-24 特異性條帶，750bp位置可檢測(cè)到一條ING4特異性條帶，而PBS，AdV對(duì)照組中均未出現(xiàn)預(yù)期 條帶，提示SPC-Al肺癌細(xì)胞自身可能失去了 IL-24、ING4基因表達(dá)能力；RT-PCR鑒定結(jié)果 表明ING4、IL-24單、雙基因重組腺病毒均能介導(dǎo)外源性ING4和/或IL-24基因在SPC-Al 細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)錄。實(shí)施例四=Western blotting法鑒定不同基因重組腺病毒感染SPC-A1肺腺癌細(xì) 胞后目的基因的蛋白表達(dá)用50M0I 的 AdV，Ad-ING4-IL_24，Ad-IL-24, Ad_ING4 分別感染 SPC-A1 (細(xì)胞數(shù)為 lX105/ml)。感染72h收集細(xì)胞按IO7細(xì)胞/ml細(xì)胞裂解液的比例加細(xì)胞裂解液(含終濃度 為ImM PMSF蛋白酶抑制劑)進(jìn)行裂解，充分裂解后12000r/min離心5min，取總蛋白上清， 并以4 1的比例與5XSDS蛋白上樣緩沖液混勻，100°C煮沸5min，12000r/min離心5min， 再用分離膠為12%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳(100V，2h)，并300mA，2h將蛋白 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，NC膜用5%脫脂奶粉37°C封閉Ih;分別用鼠抗人IL-24、 山羊抗人ING4抗體在37 °C作用Ih，TBST洗滌3次，每次5min ；再分別加HRP標(biāo)記的山羊抗
8鼠IgG 二抗和HRP標(biāo)記的驢抗羊IgG 二抗，37°C作用lh，TBST洗滌3次，每次5min ；最后將 NC膜與發(fā)光工作液(等體積A和B溶液混合)充分接觸，室溫孵育3min，暗室進(jìn)行壓片曝 光、顯影禾口定影。Western blotting 結(jié)果如圖 2 所示，Ad-ING4-IL_24 感染 SPC-A1 可產(chǎn)生 24kD 的與 抗人IL-24抗體和29kD的抗人ING4抗體特異性結(jié)合的條帶；Ad-IL_24組只產(chǎn)生24kD的與 抗人IL-24抗體特異性結(jié)合的條帶，而相應(yīng)位置未產(chǎn)生29kD的抗人ING4抗體特異性結(jié)合 的條帶；Ad-ING4感染組只產(chǎn)生29kD的抗人ING4抗體特異性結(jié)合的條帶，而相應(yīng)位置未產(chǎn) 生與抗人IL-24抗體特異性結(jié)合的條帶；AdV組和PBS組在相應(yīng)位置均未出現(xiàn)上述條帶，說 明SPC-Al肺癌細(xì)胞自身對(duì)IL-24、ING4基因表達(dá)能力低下甚至發(fā)生了缺失，同時(shí)還進(jìn)一步 表明ING4、IL-24單、雙基因重組腺病毒均能介導(dǎo)外源性ING4和/或IL-24基因在SPC-Al 細(xì)胞中成功表達(dá)。實(shí)施例五不同照射劑量對(duì)SPC-Al細(xì)胞凋亡率的影響將呈指數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞密度為70% SPC-Al細(xì)胞分為0、2、4、6、8Gy共5組，室溫下 采用6tlCo γ射線照射，吸收劑量率為lGy/min，由蘇州大學(xué)放射醫(yī)學(xué)輻照中心照射。37°C 5% CO2相同條件下培養(yǎng)72h后收集細(xì)胞，PBS清洗2次，用IXbinding buffer調(diào)節(jié)細(xì)胞至 IX IO6個(gè)/ml，取細(xì)胞100 μ 1于流式管中，加10 μ IAnnexin-V-PE冰上混勻，避光15min。再 加IXbinding buffer 380 μ 1，再加10 μ 17-AAD，上流式檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，旨在篩選出 最佳照射劑量以供Ad-ING4-IL-24聯(lián)合放療的生物學(xué)功能研究時(shí)參考。結(jié)果顯示各照射劑量組的凋亡率分別為(1.83士0.11)%、(12. 51 士0. 95) %、 (24. 13士0.60)%、(38. 46士2. 13) %及(57. 75士0. 83) %。為 了避免高劑量照射的嚴(yán)重副 作用和利于觀察Ad-ING4-IL-24對(duì)中劑量照射的放療增敏和增效作用，故我們選擇常規(guī)照 射劑量的半數(shù)照射劑量(體外實(shí)驗(yàn)為4Gy，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)為IOGy)作為實(shí)施例中體內(nèi)外放療增敏 實(shí)驗(yàn)使用的照射劑量。實(shí)施例六Ad-ING4-IL-24聯(lián)合放療對(duì)SPC-Al肺腺癌細(xì)胞的影響(I)MTT法檢測(cè)Ad-ING4-IL-24+放療對(duì)SPC-A1肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響1. 1實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理PBS 組1 X 105/ml SPC-A1+0. lmol/L PBS ；AdV 組1 X 105/ml SPC-A1+50M0I AdV ；Ad-ING4-IL-24 組(簡(jiǎn)稱雙基因組)1 X 105/ml SPC-Al+50M0IAd-ING4-IL_24 ；放療組:1X 105/ml SPC-Al+48h 后輻照(4Gy)；Ad-ING4-IL-24+放療聯(lián)合組(簡(jiǎn)稱雙基因聯(lián)合放療組)lX105/ml SPC-A1+50M0I Ad-ING4-IL-24+48h 后輻照(4Gy)。1. 2Ad-ING4-IL-24+放療對(duì)SPC-A1肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響取呈指數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞密度為70% SPC-Al細(xì)胞，按上述實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞處理，每 組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37°C，5% CO2孵育，分別于24、48、72、96h每孔加10 μ 1 MTT (5mg/ml)，繼續(xù) 孵育4h后加入10% SDS-HCl終止液100 μ 1/孔，置于37°C，至次日待甲臢結(jié)晶完全溶解 后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)OD57tl值，以O(shè)D57tl值為縱坐標(biāo)，時(shí)間(h)為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線， 并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率=[(對(duì)照組OD57tl值-實(shí)驗(yàn)組OD57tl值)/對(duì)照組OD57tl值]X 100 %
MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示(如圖3A和圖3B)，Ad-ING4-IL_24組+放療聯(lián)合組與 PBS組和AdV組比較均具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用(P < 0. 01)，Ad-ING4-IL-24聯(lián)合放療 組對(duì)SPC-Al肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用明顯優(yōu)于單純Ad-ING4-IL-24組和單純放療組(P
<0. 01)，且對(duì)肺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用較Ad-ING4-IL-24雙基因組和放療單純組呈現(xiàn)明放 療增敏協(xié)同效應(yīng)(Q= 1. 17)。(2) FCM檢測(cè)Ad-ING4-IL_24+放療對(duì)SPC-A1肺腺癌細(xì)胞周期的影響取呈指數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞密度為70% SPC-Al細(xì)胞，按實(shí)施例六分組及細(xì)胞處理，于 37°C,5% C02條件下培養(yǎng)72h后，分別收集各組細(xì)胞，所收集細(xì)胞用PBS1. Oml混勻，2000r/ min離心5min，棄上清，重復(fù)上述步驟一次后，70 %冷乙醇4°C下固定24h以上，進(jìn)行PI染色
流式檢測(cè)細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。PI染色法的FCM檢測(cè)的結(jié)果顯示(如圖4A和圖4B) :Ad-ING4-IL_24聯(lián) 合放療組作用72h的SPC-Al細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯(71. 47 士 1. 54) %高于單 純 Ad-ING4-IL-24(39. 3 士 1. 01) % 和單純放療組(24. 98 士 2. 31) % (P < 0.01)； Ad-ING4-IL-24聯(lián)合放療組的Gl期細(xì)胞比率為(10. 72士2. 24) %，與單純Ad-ING4-IL_24 及單純放療組Gl期細(xì)胞比率(分別為40.70士2.31%、37.81士1.77%)比較均明顯減少 (P < 0. 05)。(3) Annexin-V-P/7-AAD 雙染法流式檢測(cè) Ad-ING4-IL_24+ 放療對(duì) SPC-A1 肺腺癌細(xì) 胞凋亡的影響按實(shí)施例六分組和上述FCM檢測(cè)方法收集細(xì)胞，PBS清洗2次，用IXbinding buffer調(diào)節(jié)細(xì)胞至IX IO6個(gè)/ml，取細(xì)胞100 μ 1于流式管中，加10 μ 1 Annexin-V-PE冰 上混勻，避光15min。再加IXbinding buffer 380 μ 1，再加10 μ 1 7-AAD，應(yīng)用流式細(xì)胞儀
檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果如圖5A、5B所示Ad-ING4-IL_24聯(lián)合放療組(4Gy)誘導(dǎo)SPC-Al肺癌細(xì)胞 凋亡率為(56. 10士 1. 24) %，不僅可達(dá)到如前8Gy照射劑量誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡(凋亡率為 57. 25士0.83% )的放療效果，而且還優(yōu)于單純Ad-ING4-IL-24(31.60士2. 55) %和單純放 療組(24. 27士2.02) %，(P <0.01，)，提示在肺癌細(xì)胞中Ad-ING4-IL_24聯(lián)合放療組對(duì) SPC-Al肺癌細(xì)胞的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用與Ad-ING4-hIL-24單純組和放療單純組比較具有放 療增敏的協(xié)同效應(yīng)(Q = 1. 16)。實(shí)施例七參照實(shí)施例六的方法，觀察Ad-ING4-IL-24聯(lián)合放療對(duì)MDA-MB-231乳 腺癌生長(zhǎng)的影響。(I)MTT法檢測(cè)Ad-ING4-IL-24聯(lián)合放療組對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用， 結(jié)果如圖10所示，單純放療組至第四天γ-射線可輕度抑制細(xì)胞存活率(21.7%)。當(dāng) Ad-ING4-IL-24和6Gy γ -射線共同處理細(xì)胞后的Ad-ING4-IL_24聯(lián)合放療組，細(xì)胞存活 率進(jìn)一步下降，Ad-ING4-IL-24聯(lián)合放療組第四天的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)83. 9%，明顯高于 Ad-ING4-IL-24(62. 1% )和單純放療組(21. 7% )，呈現(xiàn)放療增敏的協(xié)同效應(yīng)(P < 0. 05， Q=L 19)；注Ad-ING4-IL-24聯(lián)合放療組分別與PBS，AdV空載體腺病毒組比較，* P
<0. 05 ；分別與單純放療組、Ad-NG4-IL-24雙基因重組腺病毒組比較，Δ P < 0. 05，Q = 1. 19。(2) Annexin-V-PE/7-AAD 雙染 FCM 檢測(cè) Ad-ING4-IL_24 雙基因重組腺病毒聯(lián)合放療對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果如圖11所示，Ad-ING4-IL_24、單純放療及 Ad-ING4-IL-24聯(lián)合放療組均能誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，其中早期凋亡率分別可達(dá) (39. 18士5. 08) (13. 87士4. 14) %禾口 (56. 63士5. 95) %，與 AdV 組和 PBS 細(xì)胞對(duì)照組比 較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)。尤其Ad-ING4-IL-24聯(lián)合放療組處理細(xì)胞后72h，細(xì) 胞凋亡的發(fā)生率明顯高于Ad-ING4-IL-24組及單純放療組(P < 0. 05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 Ad-ING4-IL-24可以增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)、~射線誘發(fā)凋亡的敏感性，具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的 協(xié)同增效功能(Q = 1. 21)；注:Ad-ING4-IL-24聯(lián)合放療組分別與PBS，AdV組比較，* P < 0. 05 ；分別與單純放療組、Ad-NG4-IL-24雙基因組比較，Δ P < 0. 05，Q = 1. 21。
(3) PI染色的FCM檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，Ad-ING4-IL_24組作用72hMDA_MB_231 細(xì)胞在G2/M期出現(xiàn)明顯阻滯，可達(dá)(32. 36士3.62) %。單純放療處理后，MDA-MB-231細(xì) 胞出現(xiàn)G2/M期阻滯，達(dá)(47. 39士4. 24) %, Ad-ING4-IL_24聯(lián)合放療組出現(xiàn)G2/M期阻滯 達(dá)(59. 26 士 4. 56) %，顯著高于 AdV 組的 G2/M 期(13. 52 士 1. 35) % 和 PBS 組的 G2/M 期 (11. 61 士 1. 26) % (均 P < 0. 05)。實(shí)施例八Ad-ING4-IL-24聯(lián)合放療對(duì)裸鼠SPC-Al肺腺癌移植瘤的影響建立動(dòng)物模型=SPC-Al肺腺癌細(xì)胞用含10%小牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基于 5% CO2、37°C常規(guī)培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SPC-Al肺腺癌細(xì)胞先用PBS洗滌，經(jīng)0. 25% 胰酶消化，并用無血清培養(yǎng)液中止后以lOOOr/min的轉(zhuǎn)速離心5min，收獲細(xì)胞，用PBS調(diào)整 細(xì)胞濃度制備3. OX 107ml的細(xì)胞懸液。取4周齡SPF級(jí)BALB/c雄性裸鼠25只，安爾碘于 裸鼠右前腋下常規(guī)消毒后，每只裸鼠皮下注射細(xì)胞懸液3. O X 106/100 μ 1，并觀察SPC-Al肺 腺癌細(xì)胞在裸鼠皮下的生長(zhǎng)成瘤情況。裸鼠皮下接種SPC-Al肺腺癌細(xì)胞2 3天后，局部 皮丘逐漸縮小、變實(shí)，隨后瘤體體積不斷增殖，IOd后其瘤體直徑約5mm。本實(shí)施例中SPC-Al 肺腺癌細(xì)胞接種裸鼠的成瘤率為100% (25/25)。實(shí)驗(yàn)分組及各組處理待上述皮下接種2周左右腫瘤直徑長(zhǎng)至5mm左右時(shí)，將其隨機(jī)分成5組，每組5 只PBS組50μ1 PBS/只，使用瘤體內(nèi)注射干預(yù)用藥，隔日一次，共注射6次；AdV 組1 X 108pfu AdV/50 μ 1 PBS/ 只，治療方法同 PBS 組；Ad-ING4-IL-24 組1 X 108pfu Ad-ING4-IL_24/50 μ 1 PBS/ 只，治療方法同 PBS 組；Ad-ING4-IL-24+ 放療聯(lián)合組1 X 108pfu Ad-ING4-IL_24/50 μ 1 PBS/ 只，治療方 法同PBS組，治療2次后于腫瘤局部單次照射IOGy/只；放療組抗腫瘤實(shí)驗(yàn)開始后的第5d，荷瘤裸鼠腫瘤處局部單次照射IOGy/只。本實(shí)施例中照射治療方法為先將需要照射的裸鼠麻醉，10%水合氯醛按200mg/ kg體重腹腔注射待裸鼠麻醉后固定在特制裝置上，以鉛板屏蔽除局部腫塊以外的部位，采 用西門子PRIMUS M對(duì)瘤體進(jìn)行電子輻照(χ射線)，5MeV，SSD = 100cm, Dt = lOGy。(1)瘤體體積觀察第一次治療前及開始治療后隔日用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組瘤體的長(zhǎng)徑(a)、短徑(b)， 計(jì)算瘤體體積(V = aXb2/2)，繪制瘤體體積-時(shí)間變化曲線，得圖6，結(jié)果表明，治療15d 后，Ad-ING4-IL-24組、單純放療組、Ad-ING4-IL_24+放療聯(lián)合組對(duì)裸鼠SPC-Al肺腺癌
11移植瘤均有不同程度的抑瘤作用，與PBS組、AdV組比較有顯著性差異(P < 0. 01)，且 Ad-ING4-IL-24+放療聯(lián)合組的抑瘤作用優(yōu)于單純Ad-ING4-IL_24組和單純放療組，統(tǒng)計(jì)學(xué) 有顯著性差異(P <0.01)。(2)瘤體重量觀察治療15d后，將裸鼠脫頸處死，腫瘤局部皮膚用安爾碘常規(guī)消毒，切開皮膚摘取 瘤體，電子天平稱腫瘤濕重，根據(jù)電子天平稱瘤體重量(g)，并繪制瘤體重量直方圖(圖 7)，Ad-ING4-IL-24組、單純放療組、Ad-ING4-IL_24+放療聯(lián)合組的平均瘤體重量(〒士s) 分別為 0. 963 士 0. 059，1. 232 士 0. 042，0. 386 士 0. 038，與 PBS 組(1. 907 士 0. 103)、AdV 組 (1. 882士0. 129)比較有顯著性差異(P < 0. 01)，Ad-ING4_IL24+放療聯(lián)合組的抑瘤作用優(yōu) 于單純Ad-ING4-IL24組、單純放療組，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(P < 0. 01)。(3)抑瘤率觀察根據(jù)瘤重計(jì)算抑瘤率(E)，抑制率(％ ) = (1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤 重)X100% ；繪制瘤體抑瘤率直方圖，得圖8，結(jié)果表明，Ad-ING4-IL-24組、單純放療組、 Ad-ING4-IL-24+放療聯(lián)合組對(duì)裸鼠SPC-Al肺腺癌移植瘤均有明顯的抑瘤作用，抑瘤率分 別為 48. 86%,34. 54%,79. 52% ；其中 Ad-ING4-IL_24+放療聯(lián)合組較單純 Ad-ING4-IL_24 組和單純放療組有顯著性差異(P < 0. 01)，并呈現(xiàn)放療增敏的協(xié)同作用(Q = 1. 20)。(4)免疫組化檢測(cè)將各組瘤體組織以10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋并組織切片，進(jìn)行HE染 色和免疫組化染色。上述瘤體組織HE常規(guī)染色，光鏡下(X400)觀察各腫瘤組織細(xì)胞的形態(tài)變化，如 圖9所示單純Ad-ING4-IL-24組和放療組及Ad-ING4-IL_24+放療聯(lián)合組表現(xiàn)為大量細(xì)胞 呈細(xì)胞核固縮、裂解或溶解，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞膜不完整，組織間有大量空泡形成。上述5組瘤體均制成組織切片，用特異抗體的免疫組化常規(guī)染色法檢測(cè)SPC-Al 肺腺癌移植瘤生長(zhǎng)相關(guān)因子的表達(dá)(l)BaX、Caspase3, FasL等促凋亡因子；(2)Bcl_2、 Cox-2、Survivin等凋亡抑制因子；(3) VEGF等腫瘤血管形成相關(guān)因子。將每張切片于400 倍光鏡下觀察，共記數(shù)10個(gè)視野下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和/或細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)散在 或彌漫狀分布的棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表2、表3，結(jié)果表 明，各實(shí)驗(yàn)組Fas-L, Bax、Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于PBS組和AdV組(P < 0. 01)， 且Ad-ING4-IL-24+放療聯(lián)合組較單純Ad-ING4-IL-24組、單純放療組有顯著性差異(P < 0. 01)；各實(shí)驗(yàn)組 Cox-2、Bcl-2、VEGF、Survivin 及 CD34 (MVD)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(除 VEGF 陽(yáng)性 細(xì)胞計(jì)數(shù)中單純放療組與PBS組差異不顯著外)均顯著低于PBS組和AdV組(P<0.01)，且 Ad-ING4-IL-24+放療聯(lián)合組較Ad-ING4-IL_24組、單純放療組有顯著性差異(P < 0. 01)。表2 各治療組腫瘤組織中相關(guān)因子的表達(dá)(個(gè)/HP)
12 *為各治療組分別與PBS，AdV組比較* Ρ<0. 05 ；Δ為分別與Ad-ING4-IL_24，
純放療組比較Δ P < 0. 05。表3 各治療組腫瘤組織中相關(guān)因子的表達(dá)(個(gè)/HP) *為各治療組分別與PBS，AdV組比較* Ρ<0. 05 ；Δ為分別與Ad-ING4-IL_24，單 純放療組比較Δ P < 0. 05。(5)腺病毒介導(dǎo)的ING4和/或IL-24基因表達(dá)對(duì)放療敏感性比較參照以上步驟，比較腺病毒介導(dǎo)的ING4和/或IL-24基因?qū)PC-Al肺癌細(xì)胞及 其裸鼠移植瘤放療敏感性，包括Ad-ING4+放療組、Ad-IL-24+放療組和Ad-ING4-IL_24+放 療組對(duì)SPC-Al細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、對(duì)SPC-Al細(xì)胞G2/M期阻滯率、對(duì)SPC-Al細(xì)胞的細(xì)胞凋亡 率、對(duì)移植瘤的瘤體重量、對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的抑瘤率的影響，結(jié)果見下表
組別96h 對(duì) SPC-A1 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制 率(％)72h 對(duì) SPC-A1 細(xì)胞G2/M期阻 滯率(％)72h 對(duì) SPC-A1 細(xì)胞的細(xì)胞凋 亡率(％)移植瘤的瘤體 重量(g)移植瘤生長(zhǎng) 的抑瘤率 (%)Ad-ING4+放療59.99±1.5457.58±1.7643.39±0.890.58±0.0569.62±2.27Ad-IL-24+放療56.82±1.6858.14±0.6542.10±2.270.68±0.0364.21±1.73Ad-ING4-IL-24+放療74.53±1.8571.47±1.5457.65±1.450.39±0.0479.79±1.97結(jié)果表明在同一放療劑量(4Gy)下，Ad-ING4-IL-24雙基因+放療聯(lián)合組體外對(duì) SPC-Al肺癌細(xì)胞96h的生長(zhǎng)抑制率，72h細(xì)胞生長(zhǎng)的G2/M期阻滯率和誘導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡 率均明顯高于單基因表達(dá)的Ad-ING4+放療組和Ad-IL-24+放療組(P < 0. 05)。在同一放療劑量(IOGy)下，Ad-ING4-IL_24雙基因+放療聯(lián)合組體內(nèi)對(duì)SPC-A1肺 癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的瘤體重量(g)的下降和瘤重抑瘤率的升高均明顯優(yōu)于單基因表達(dá)的 Ad-ING4+ 放療組和 Ad-IL-24+ 放療組(P < 0. 05)。
13
綜上所述，Ad-ING4-IL_24聯(lián)合放療對(duì)SPC-Al肺腺癌細(xì)胞及其裸鼠移植瘤的放療 增敏協(xié)同作用，其機(jī)制可能與明顯上調(diào)BaX、CaSpaSe-3和FasL等促凋亡因子的表達(dá)和下調(diào) Bcl-2X0X-2,Survivin凋亡抑制因子的表達(dá)以及下調(diào)VEGF腫瘤血管形成相關(guān)因子的表達(dá)有關(guān)。實(shí)施例九參照實(shí)施例八的方法，建立人乳腺癌動(dòng)物模型，研究Ad-ING4-IL_24對(duì) 乳腺癌移植瘤的放療增敏效果。取指數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞經(jīng)胰酶消化分散后，PBS洗滌2次，2000r/ min離5min，重懸于PBS中，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X 107/ml，取100 μ 1 (2 X IO6個(gè)細(xì)胞/只)分 別接種于25只裸鼠右側(cè)腹股溝皮下，SPF環(huán)境下飼養(yǎng)。2周后待移植瘤長(zhǎng)至60-80mm3左右時(shí)，計(jì)為第0d。將其隨機(jī)分成5組，即PBS組、 AdV組、Ad-ING4-IL-24組、單純放療組、Ad-ING4-IL_24聯(lián)合放療組，每組5只，給藥方式及 劑量同第二部分。單純放療組于第0天、Ad-ING4-IL-24+放療的聯(lián)合放療組于病毒治療第 二次后，以200mg/kg的劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，仰臥固定于自制解剖板上， 充分暴露局部腫塊，射野充分包括腫瘤。定位后體表標(biāo)記，精確擺位后開始放療，腫瘤局部 接受單次5MeV電子線6Gy照射，源瘤距100cm，劑量率為2Gy/min。小鼠腹股溝局部照射時(shí) 選用3mm厚的鉛板屏蔽身體其他部位。(I)PBS細(xì)胞對(duì)照組第0天瘤體內(nèi)注射PBS 100 μ 1，隔日1次，連續(xù)治療5次；(2)AdV組第0天瘤體內(nèi)注射AdV(108pfu/次)100 μ 1，隔日1次，連續(xù)治療5次；(3)Ad-ING4-IL-24 組第 0 天瘤體內(nèi)注射 Ad-ING4-IL_24 (108pfu/次)100 μ 1，隔 日1次，連續(xù)治療5次；(4)單純放療組第0天腫瘤局部接受單次5MeV電子線6Gy照射；(5)Ad-ING4-IL-24 聯(lián)合放療組第 0 天瘤體內(nèi)注射 Ad-ING4-IL_24 (108pfu/ 次)100 μ 1，隔日1次，連續(xù)治療5次，注射Ad-ING4-IL-24 二次后結(jié)合放療，腫瘤局部接受 單次5MeV電子線6Gy照射；然后觀察以下結(jié)果(1)腫瘤體積、瘤重、抑瘤率及標(biāo)本免疫組織化學(xué)的檢測(cè)結(jié)果見12，其中，A為不同治療組移植瘤體積的大??；B為重組腺病毒治療裸鼠人乳腺癌移植瘤瘤體體積_時(shí)間變化曲線 Ad-ING4-IL-24聯(lián)合放療組分別與PBS、AdV組比較，* P < 0. 05 ；分別與單純放療組、 Ad-NG4-IL-24雙基因重組腺病毒組比較，ΔΡ < 0. 05 ；C為重組腺病毒治療裸鼠人乳腺癌移植瘤14d后瘤體重量:Ad-ING4-IL-24聯(lián)合放 療組分別與PBS，AdV組比較，* P < 0. 05 ；分別與單純放療組、Ad-NG4-IL-24雙基因重組 腺病毒組比較，ΔΡ < 0. 05，Q = 1. 18。瘤體重量研究結(jié)果(圖12C)顯示與PBS對(duì)照組相比，治療2w后Ad-ING4-IL_24 組和單獨(dú)放療組的瘤體重量抑瘤率分別為67. 7%和29. 1%，而Ad-ING4-IL-24聯(lián)合放療組 的抑瘤率高達(dá)88. 1 %，后者明顯高于前兩者(P < 0. 05)。而PBS對(duì)照組和空載體對(duì)照組相 比，無顯著性差異(P > 0. 05)。在飼養(yǎng)治療期間未發(fā)現(xiàn)裸鼠死亡及其它軀體的毒性反應(yīng)。 結(jié)果顯示，Ad-ING4-IL-24雙基因重組腺病毒治療和放療結(jié)合，可產(chǎn)生放療增敏協(xié)同效果 (Q = 1. 18)。
綜上所述，Ad-ING4-IL_24與放射治療結(jié)合可提高乳腺癌細(xì)胞的放射治療敏感性， 可產(chǎn)生放療增敏協(xié)同療效。注，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用i±s表示，用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行單因素方差 分析，P < 0. 05視為統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異，P <0.01視為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。Ad-ING4-IL_24+放療聯(lián)合組放療增敏作用的判斷用金正均法(計(jì)算Q值)，0值= E (A+B) / (EA+EB-EA · EB)，式中EA、EB分別為A、B單用之效應(yīng)，分子E (A+B)代表實(shí)測(cè)合并 效應(yīng)，分母是期望合并效應(yīng)。當(dāng)Q值=1 士0. 15時(shí)，兩藥間被認(rèn)為有相加作用，0值> 1. 15 時(shí)，兩藥間被認(rèn)為有協(xié)同作用，當(dāng)Q值< 0. 85時(shí)，兩藥間有拮抗作用。
1權(quán)利要求
人類ING4和IL 24基因共表達(dá)載體作為放療增敏劑的應(yīng)用，所述人類ING4和IL 24雙基因共表達(dá)載體為雙基因重組轉(zhuǎn)移載體pAdTrack CMV ING4 polyAΔ296～298+CMV IL 24。
2.腺病毒介導(dǎo)的重組病毒子Ad-ING4-polyAA296 298+CMV-IL-24作為放療增敏劑的應(yīng)
全文摘要
本發(fā)明涉及基因組學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因工程以及臨床醫(yī)學(xué)，本發(fā)明具體涉及人類ING4IL-24雙基因共表達(dá)載體作為放療藥物增敏劑的應(yīng)用，放療前將人類ING4和IL-24雙基因共表達(dá)載體導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，使人類ING4和IL-24基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，然后進(jìn)行放療；本發(fā)明所述Ad-ING4-polyAΔ296～298+CMV-IL-24；可以使大量增殖期腫瘤細(xì)胞阻滯于G2/M期，有利于增強(qiáng)照射敏感性，MTT和FCM檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步表明，Ad-ING4-IL-24聯(lián)合放療具有顯著性抑制SPC-A1肺腺癌細(xì)胞和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞及其移植瘤生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，優(yōu)于Ad-ING4-IL-24單純組和放療單純組，呈現(xiàn)明顯放療增敏協(xié)同效應(yīng)；因此，可以應(yīng)用人類ING4和IL-24雙基因共表達(dá)載體增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療敏感性。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101912619SQ20101025025
公開日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月11日
發(fā)明者凌春華, 李正祎, 楊吉成, 盛偉華, 謝宇鋒, 趙大國(guó), 黃錦宏 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)