專利名稱：丹參總酚酸在制備抑制血管內(nèi)皮細胞吞飲小泡形成的藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥應用領(lǐng)域，具體涉及丹參總酚酸在制備抑制血管內(nèi)皮細胞吞飲小泡形成的藥物中的應用。
背景技術(shù)：
缺血再灌注(ischemia/r印erfusion，I/R)損傷可以發(fā)生在外傷、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)、溶栓治療、器官移植、失血性休克及復蘇等多種疾病過程中。I/R通過次黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生的過氧化物一方面直接損傷血管，另一方面又可促進血管內(nèi)皮粘附分子 ICAM-I和白細胞粘附分子CDllb/CD18的表達，引起白細胞與血管內(nèi)皮粘附。粘附于血管內(nèi)皮的白細胞爆發(fā)性地釋放過氧化物和蛋白酶，損傷血管內(nèi)皮細胞和血管基底膜，引起血漿白蛋白的外漏。I/R后血管外肥大細胞脫顆粒釋放促炎性因子和血管活性物質(zhì)從血管外攻擊血管。I/R可誘導包括血管內(nèi)皮細胞損傷、白細胞與血管壁的粘附、血漿白蛋白漏出、肥大細胞脫顆粒、炎性因子釋放等的復雜性的微循環(huán)障礙，其中，過氧化物的產(chǎn)生、白細胞與血管內(nèi)皮粘附和肥大細胞脫顆粒是I/R引起的微循環(huán)早期損傷的重要環(huán)節(jié)。改善I/R引起的微循環(huán)障礙需要對其進行多環(huán)節(jié)干預。丹參總酚酸(Totalsalvianolic acid, TSA)是丹參(Salvia miltiorrhiza, SM)的水溶性有效成分，主要包括丹參素(3，4-Dihydroxy_phenyl lactic acid，DLA)、 SAA(Salvianolic acid A, SAA), SAB (Salvianolic acid B, SAB)和其他丹酚酸成分。丹參和含有丹參的藥物在臨床上已經(jīng)被廣泛用于血管性疾病的預防和治療，且取得了良好的臨床療效。以往的研究證明復方丹參滴丸(含有DLA和SAB等丹參水溶性成分)可以抑制I/R引起的大鼠心臟微循環(huán)障礙和心肌損傷，抑制腸I/R引起的大鼠腸系膜細靜脈白細胞的粘附，抑制血漿中TNF-α表達和內(nèi)毒素的產(chǎn)生，抑制光化學誘導的腸系膜細靜脈血栓的形成。DLA可以抑制腸系膜I/R引起的過氧化物的產(chǎn)生和白細胞釋放的粘附分子⑶lib/⑶18的表達。SAA具有抗氧化和改善膜通透性的作用。SAB可以抑制內(nèi)毒素誘導的大鼠腸系膜微循環(huán)障礙，抑制粘附分子CDllb/CD18的表達，抑制過氧化物和負氧陰離子的產(chǎn)生。然而，DLA和SAB單體的提取和純化過程復雜，獲取成本較高。TSA是丹參的主要的水溶性成分，提取制備過程較簡單，成本較低，成藥性較好。丹參總酚酸(TSA)的制備方法有多種，舉例如下丹參飲片或丹參粗粉先用水或稀堿于30-99°C下初提得丹參中的水溶性成分，然后提取液加酸調(diào)pHl-6，沉淀去除雜質(zhì)后，直接干燥或濃縮后干燥，得浸膏粉末；干燥所得浸膏粉末用50-90%乙醇水溶液回流提取1-4次，合并提取液，靜置，取上清液，即得高純度丹參總酚酸溶液；所得溶液直接干燥或濃縮后干燥，即得所述的丹參總酚酸浸膏粉末。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供丹參總酚酸在制備抑制血管內(nèi)皮細胞吞飲小泡形成的藥物中的應用。本發(fā)明所述丹參總酚酸通過抑制血管內(nèi)皮細胞吞飲小泡形成，從而抑制缺血再灌注引起腸系膜細靜脈血漿白蛋白的漏出，進而改善缺血再灌注引起的腸系膜微循環(huán)障礙。本發(fā)明所述丹參總酚酸，可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)制備，符合藥用標準即可。本發(fā)明所述制備的藥物，是用上述丹參總酚酸作為藥物活性成分制備成的藥物組合物。本發(fā)明所述的藥物組合物通過抑制血管內(nèi)皮細胞吞飲小泡形成，改善缺血再灌注引起的腸系膜微循環(huán)障礙。本發(fā)明的藥物組合物，以丹參總酚酸作為藥物活性成分，同時含有藥物可接受的載體，其中丹參總酚酸在組合物中所占重量百分比是0. 1-99.9%，其余為藥物可接受的載體。本發(fā)明的藥物組合物，以單位劑量形式存在，所述單位劑量形式是指制劑的單位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶，顆粒劑每袋，注射劑的每支等。本發(fā)明的藥物組合物可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括片劑、糖衣片劑、 薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑。本發(fā)明的藥物組合物，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調(diào)味劑和濕潤劑，必要時可對片劑進行包衣。適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤滑劑包括，例如硬脂酸鎂。適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二烷基硫酸鈉。可通過混合，填充，壓片等常用的方法制備固體口服組合物。進行反復混合可使活性物質(zhì)分布在整個使用大量填充劑的那些組合物中?？诜后w制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑， 或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復配的干燥產(chǎn)品。這種液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常規(guī)的香味劑或著色劑。對于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發(fā)明的活性物質(zhì)和無菌載體。根據(jù)載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過將活性物質(zhì)溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然后密封。輔料例如一種局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩(wěn)定性，可在裝入小瓶以后將這種組合物冰凍，并在真空下將水除去。本發(fā)明的藥物組合物，在制備成藥劑時可選擇性的加入適合的藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA 二鈉、EDTA鈣鈉，一價堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、
4麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發(fā)明的藥物組合物在使用時根據(jù)病人的情況確定用法用量，可每日服三次，每次1-20劑，如1-20袋或?；蚱?，每劑Img-IOOOmgo本發(fā)明還提供了以下試驗，進一步說明丹參總酚酸的應用。1.實驗材料1. 1 試藥TSA(TSA)購于昆明風山漸(中國)，批號09110412 ； DHR 123 購于 Sigma Chemical Co (St Louis,MO,USA) ；FITC標記牛血清白蛋白橙色結(jié)晶，購于Sigma Chemical Co (St Louis,MO, USA)；甲苯胺藍藍色粉末，購于Aldrich公司，試劑名號19804BA-214 ； 肝素鈉注射液(1.25萬單位/2ml):購于江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司，試劑名號 20090219 ；熒光標記單克隆抗體FITC標記的抗大鼠⑶lib的抗體(試劑名號5M982)及其同型對照FITC標記的小鼠IgA κ (試劑名號553478) ；FITC標記的抗大鼠⑶18的抗體 (試劑名號5M979)及其同型對照FITC標記的小鼠IgGlK (試劑名號550616)，以上抗體均購于 BD(Biosciences Pharmingen, USA)公司；溶血素(IOX)購于 BD biosciences Immunocytometer Systems (USA)公司，試劑名號349202。1. 2實驗動物200 250g的Wister雄性大鼠由北京大學醫(yī)學部動物中心提供，動物合格證號 SCXK (京)2002-0001。動物被置于常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境(溫度對士 1°C，濕度50 士 5 %，交替照明 12h，實驗前禁食給水12h)。動物的處理按照北京大學醫(yī)學部規(guī)定的動物處理和倫理方針進行。1. 3實驗儀器倒置恒溫顯微鏡，LEICA，型號DM_IRB ；DVD錄像機，Malata,型號DVR_R25 ；顯示器，TCL，型號J211BA ；CCD彩色攝像機，TOSHIBA，型號Jk_TU53H ；超敏感熒光攝像機， LEICA，型號DM-IRB ；超高速攝影機，F(xiàn)ASTCAM，型號ultimate APXPH0TR0N ；注射泵，北京思路高高科技發(fā)展有限公司，型號=TCI-II ；離心機，湘儀離心機廠，型號TDZ5-WS ；流式細胞儀，美國BD公司，型號=FACS Calibur02.實驗方法2. 1實驗過程實驗前給大鼠禁食12小時，自由飲水。以20%烏拉坦(1. 25mg/kg)肌肉注射麻醉。經(jīng)左頸靜脈插入3Fr聚乙烯管用于滴注藥物。剪去腹部毛發(fā)沿腹部正中線作2 3cm 的切口，暴露小腸。將大鼠仰位在觀察板上，輕輕提出小腸(回盲部向口側(cè)10 15cm)，并將小腸展開放在有觀察孔的觀察板上，表面連續(xù)滴加37°C生理鹽水保持溫度和濕度，用配有37°C恒溫裝置的倒置生物顯微鏡(DM-IRB，Leica, Germany)進行觀察。選直徑在30 5(^!11之間，20011 m長無分支，無明顯彎曲的腸系膜細靜脈，通過連接在倒置生物顯微鏡上的 CCD (Charge Coupled Device，CCD)彩色攝像機(Jk-TU53HT0SHIBA，Japan)在顯示屏上 (J2118A, TCL, China)觀察，用 DVD (Digital Video Disk)錄像機(DVR-R25,Malata, China) 連續(xù)記錄微循環(huán)的變化。IOmin基礎(chǔ)觀察結(jié)束后，用2-0號絲線結(jié)扎腸系膜上動靜脈，IOmin后解除結(jié)扎進行再灌注。2. 2 給藥I/R組(N = 6)缺血前l(fā)Omin，經(jīng)由左頸靜脈連續(xù)滴注生理鹽水(8ml/kg/hr)至 60分鐘觀察結(jié)束。假手術(shù)組(N = 6)給藥時間和給藥劑量與I/R —致，但不對其進行缺血再灌注。TSA本底對照組(TSA組，N = 6)經(jīng)由左頸靜脈連續(xù)滴注TSA (5mg/kg/hr)直至 60min觀察結(jié)束，不對其進行缺血再灌注。TSA前投入組(TSA+頂組，N = 6)缺血前l(fā)Omin，經(jīng)由左頸靜脈連續(xù)滴注TSA (5mg/ kg/hr)直至60分鐘觀察結(jié)束。TSA后投入組(IR+TSA組，N = 6)再灌注開始IOmin后，經(jīng)由左頸靜脈連續(xù)滴注 TSA(5mg/kg/hr)直至 60min 觀察結(jié)束。2. 3腸系膜微循環(huán)動態(tài)觀察腸系膜細靜脈超微結(jié)構(gòu)的變化60min觀察結(jié)束后，麻醉下，經(jīng)左心室進行全身灌流，先用50ml生理鹽水沖洗血管后，再用40g/L的多聚甲醛和20g/L的戊二醛配成的固定液以3mL/min的速度灌流固定。取出腸系膜組織，于30g/L的戊二醛固定液中后固定lh。按電鏡樣品處理方法對樣品進行處理后，通過電子顯微鏡JEM 1230 (JEOL, Japan)觀察腸系膜細靜脈的超微結(jié)構(gòu)變化。3.實驗結(jié)果TSA對大鼠腸系膜細靜脈超微結(jié)構(gòu)的影響圖1為大鼠腸系膜細靜脈超微結(jié)構(gòu)的圖像。Sham組(A)和TSA⑶組內(nèi)皮細胞表面光滑完整，有少量吞飲小泡；I/R IOmin時(C)，大鼠腸系膜細靜脈管腔內(nèi)出現(xiàn)粘附的白細胞和血小板，內(nèi)皮細胞中吞飲小泡數(shù)量有少量增加；I/R 60min時(D)，大鼠腸系膜細靜脈超微結(jié)構(gòu)有顯著變化內(nèi)皮細胞中吞飲小泡數(shù)量顯著增加，體積增大。TSA前投入(E)和后投入(F)顯著抑制了 I/R引起的大鼠腸系膜細靜脈超微結(jié)構(gòu)的變化，主要表現(xiàn)在吞飲小泡數(shù)量顯著減少。4 小結(jié)丹參總酚酸在缺血再灌注前投入和缺血再灌注后投入均可顯著地抑制細靜脈血管內(nèi)皮細胞吞飲小泡的增加。結(jié)果提示，丹參總酚酸(TSA)能夠通過抑制血管內(nèi)皮細胞吞飲小泡的形成，進而改善了缺血再灌注引起的大鼠腸系膜微循環(huán)障礙。綜上所述，丹參總酚酸或其組合物在缺血再灌注前投入和缺血再灌注后投入均能夠抑制血管內(nèi)皮細胞吞飲小泡形成，從而改善I/R引起的大鼠腸系膜微循環(huán)障礙。


圖1、丹參總酚酸(TSA)對I/R后大鼠腸系膜細靜脈超微結(jié)構(gòu)變化的影響其中，A:Sham 組，B :TSA 組，C :I/R IOmin 組，D :I/R 60min 組，E :TSA+IR 組，F(xiàn) IR+TSA^loEn 大鼠腸系膜細靜脈內(nèi)皮細胞，CV 吞飲小泡，L 白細胞。
具體實施方式
通過以下具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不作為對本發(fā)明的限制。實施例1、片劑處方丹參總酚酸105g微晶纖維素55g 微粉硅膠3g硬脂酸鎂1. 5g制法取原、輔料分別過100目篩；丹參總酚酸、微晶纖維素，混勻，用60%乙醇適量作為粘合劑制軟材，過20目篩制顆粒，60°C干燥，取出，過30目篩整粒，加入微粉硅膠及硬脂酸鎂，混勻，壓片，制成1000片，即得。實施例2、片劑處方丹參總酚酸85g硫酸鈣118g 微晶纖維素37g微粉硅膠2. 4g 硬脂酸鎂1. 2g制法取原、輔料分別過100目篩；取丹參總酚酸、硫酸鈣、微晶纖維素，混勻，用 60%乙醇適量作為粘合劑制軟材，過20目篩制顆粒，60°C干燥，取出，過30目篩整粒，加入適量微粉硅膠及硬脂酸鎂，混勻，壓片，制成1000片，即得。實施例3、片劑處方丹參總酚酸133g硫酸鈣208g 微晶纖維素68g微粉硅膠5g 硬脂酸鎂2. 5g制法取原、輔料分別過100目篩；取丹參總酚酸、硫酸鈣、微晶纖維素，混勻，用 60%乙醇適量作為粘合劑制軟材，過20目篩制顆粒，60°C干燥，取出，過30目篩整粒，加入適量微粉硅膠及硬脂酸鎂，混勻，壓片，制成1000片，即得。實施例4、膠囊取丹參總酚酸60g，加入適量淀粉，硬脂酸鎂等輔料，制粒，整粒，裝入1號膠囊，即得。實施例5、口服液取丹參總酚酸7g，加入適量蔗糖，防腐劑，加水到1000ml，分裝成IOml —支，即得
口服液。實施例6、顆粒劑取丹參總酚酸83g，加入適量糊精、甜菊素，干式制粒，整粒，分裝，即得。實施例7、注射劑取丹參總酚酸8. 5g，加水溶解，另氯化鈉、對羥基苯甲酸乙酯加熱水溶解，混勻，調(diào) PH值。注射用水稀釋至1000ml，用中空纖維膜濾過，灌裝，滅菌，即得。實施例8、注射劑丹參總酚酸2g，加水溶解，另氯化鈉、對羥基苯甲酸乙酯加熱水溶解，混勻，調(diào)pH 值。注射用水稀釋至1000ml，用中空纖維膜濾過，灌裝，滅菌，即得。實施例9、丹參總酚酸的提取方法(1)煎煮加水煎煮1-4次，每次1-4小時，每次加水8-14倍量；(2)濃縮合并煎煮藥液，濃縮至每Iml相當于含生藥0. 5_3g ；(3)堿處理將濃縮液加堿調(diào)節(jié)pH至7. 0-14. 0 ；(4)醇沉調(diào)整藥液濃度至每Iml相當于含生藥0. 5_3g，加乙醇沉淀使含醇量達 20-70%，冷藏 24-48 小時；(5)回收醇液將醇沉液過濾，減壓回收至不含乙醇；
(6)酸處理用酸調(diào)節(jié)至pH至1. 0-5. 0 ；(7)萃取用等量醋酸乙酯萃取3-6次；(8)回收醋酸乙酯合并酯萃取液，減壓回收醋酸乙酯得浸膏；(9)水處理浸膏加水溶解，過濾，濃縮；(10)干燥將上述濃縮液干燥，得丹參總酚酸。實施例10、丹參總酚酸的提取方法(1)提取丹參粗粉，加4 10倍量的水或醇水溶液提取2 4次，每次1. 0 2. 0 小時，濾過；(2)柱層析純化總酚酸合并濾液離心(4000轉(zhuǎn)/分鐘)10分鐘，取上清液過D1400 型大孔吸附樹脂柱，先用水洗至糖檢測反應為陰性，改用10-35%醇水溶液洗2-10倍柱體積；(3)用40-80%醇水溶液洗脫，收集洗脫液，同時分析測定洗脫液中丹酚酸A和丹酚酸B的含量，當?shù)し铀酇 丹酚酸B = 0.90-1. 10 1時，收集該部分洗脫液，60°C減壓濃縮洗脫液至無醇味；(4)調(diào)pH值，有機溶劑萃取加鹽酸調(diào)節(jié)PH值至3-5，用洗脫液1-2倍量體積的有機溶劑萃取2-4次，合并有機溶劑相；(5)濃縮干燥減壓濃縮萃取液至浸膏狀，60°C真空干燥，得黃色粉末，即丹參總酚酸，其中丹酚酸A和丹酚酸B的總含量在90%以上，丹酚酸A 丹酚酸B = 0. 90-1. 10 1。
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權(quán)利要求
1.丹參總酚酸在制備抑制血管內(nèi)皮細胞吞飲小泡形成的藥物中的應用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，丹參總酚酸通過抑制血管內(nèi)皮細胞吞飲小泡形成，從而抑制缺血再灌注引起腸系膜細靜脈血漿白蛋白的漏出。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，丹參總酚酸通過抑制血管內(nèi)皮細胞吞飲小泡形成，從而抑制缺血再灌注引起腸系膜細靜脈血漿白蛋白的漏出，進而改善缺血再灌注引起的腸系膜微循環(huán)障礙。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，丹參總酚酸通過抑制血管內(nèi)皮細胞吞飲小泡形成，改善缺血再灌注引起的腸系膜微循環(huán)障礙。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，丹參總酚酸在缺血再灌注前投入能夠抑制血管內(nèi)皮細胞吞飲小泡的形成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，丹參總酚酸在缺血再灌注后投入能夠抑制血管內(nèi)皮細胞吞飲小泡的形成。
7.一種含有丹參總酚酸的藥物組合物在制備預防和治療缺血再灌注引起的微循環(huán)障礙的藥物中的應用。
8.權(quán)利要求7所述的應用，其特這在于，藥物組合物通過抑制血管內(nèi)皮細胞吞飲小泡形成，改善缺血再灌注引起的腸系膜微循環(huán)障礙。
9.權(quán)利要求7所述的應用，其特這在于，藥物組合物含有藥物可接受的載體。
10.權(quán)利要求7所述的應用，其特征在于，所述藥物組合物制備成任何可藥用的劑型。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥應用領(lǐng)域，具體涉及丹參總酚酸在制備抑制血管內(nèi)皮細胞吞飲小泡形成的藥物中的應用，丹參總酚酸通過抑制血管內(nèi)皮細胞吞飲小泡形成，從而抑制缺血再灌注引起腸系膜細靜脈血漿白蛋白的漏出。
文檔編號A61K36/537GK102370700SQ20101025062
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月11日
發(fā)明者劉育英, 孫凱, 常昕, 王明暇, 胡白和, 韓晶巖 申請人:天津天士力制藥股份有限公司