專利名稱：重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，具體的涉及重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊及其制備方法。
背景技術：
重組人生長激素(rhGH)是臨床上廣泛應用于治療矮小癥、嚴重燒傷、艾滋病患者的脂肪代謝障礙等多種疾病的藥物，體內的半衰期短(0. 5小時)，急需開發(fā)rhGH長效緩釋制劑。傳統(tǒng)rhGH微囊的制備方法主要是機械攪拌或利用均質儀，制得的微囊粒徑非常大， 達到幾十甚至上百微米，且大小不可控。粒徑不均一導致藥物在小粒徑微囊中分布不均，包埋率難以提高，而且勢必造成制備、治療重復性差的問題，難以報批臨床；其次，較大的粒徑在應用時還會受到給藥途徑的限制；另外均質等劇烈的乳液制備方法也會導致rhGH在包埋過程中失活，難以保持藥物的活性。雖然目前對rhGH的微囊進行了大量的研究，但目前還沒有真正商品化的rhGH長效緩釋制劑產品。1999年美國FDA批準第一個載rhGH的聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物(PLGA)微囊，但可能由于放大生產中出現了藥物突釋率高于20%， 釋放達不到一個月等一系列問題，已撤出市場。目前已有Gang Ruan等人在Biomaterials中指出用三嵌段聚合物材料 (PLA-PEG-PLA)包埋紫杉醇能達到持續(xù)釋放一個月的效果。但三嵌段結構的材料，其親水性PEG受到兩端PLA空間位阻的影響，降低了對乳液的穩(wěn)定作用，導致藥物包埋率難以提高 (64 82% )。被包埋藥物的生物活性保持也是限制載藥聚合物微囊進入臨床應用的主要問題， 疏水性的有機溶劑和疏水性的聚合物材料對所包埋的蛋白藥物的生物活性影響很大。中國專利(公開號CNl 187120)中使用的包埋rhGH微球材料是疏水性的聚乳酸-聚羥基乙酸 (PLGA)共聚物，大鼠皮下注射該微球6天以后，體內產生了抗hGH抗體，說明被包埋的hGH 在釋放過程中由于PLGA降解產生的酸性寡聚體導致聚集。hGH聚集后產生免疫原性，這種具有免疫原性的hGH沒有活性，降低了載藥微囊的藥物利用度。中國專利(公開號CN1187120)也公開了一種延續(xù)釋放人生長激素(hGH)組合物的制備及使用方法，該技術解決了一個月內給對象提供延續(xù)釋放治療有效血液水平劑量的 hGH的問題，但需要用金屬離子鋅Si2+穩(wěn)定生長激素達到延續(xù)釋放的要求，制備工藝復雜； 另外，由于制備過程中加入Zn2+，對殘留的測定和去除帶來困難，不利于大規(guī)模的工業(yè)化生產。粒徑大小與微囊的降解及藥物的釋放有緊密聯系，粒徑均一的微囊有利于準確調控藥物釋放和實驗批次間的重復性。在制備載重組人生長激素緩釋微囊方面，Kwak等人在 Journal of Controlled Release中指出分別用PLGA、氧化鋅作為微囊材料和穩(wěn)定劑能制備出包埋率為87%可持續(xù)釋放一個月，并且有活性的rhGH微囊，但該方法制備的微囊粒徑非常不均一，勢必導致藥物控釋難以準確控制、降低療效、放大重復性和批次重復性差。由于生長激素屬于蛋白質藥物，穩(wěn)定性差，容易變性，一般制備人重組生長激素微囊研究條件要求較高，使研究受到限制。用W/0/W(水相/油相/水相)復乳法制備比較簡單，故目前常用此法來制備。但蛋白質溶液在與有機溶劑-水界面接觸后容易發(fā)生變性，所以Kim等人在Journal of Controlled Release中提出聚集體/油相/水相乳化法，即將含PLGA的乙酸乙酯溶液和含rhGH粉末的磷酸緩沖鹽溶液被均質儀以高速混合，得到的初乳加入到聚乙烯醇的檸檬酸緩沖鹽中，揮發(fā)去有機溶劑，經離心水洗干燥即得到負載人重組生長激素的微米緩釋球。它能使固態(tài)蛋白質在有機溶劑中保持活性，避免了溶劑揮發(fā)法中蛋白質在有機溶劑-水界面發(fā)生的變性。但該方法藥物包埋率不高，最高只達到76. 7%, 而且體外釋放研究結果顯示該微囊的藥物突釋率為25%。這種較高的突釋造成血藥濃度過高，超過有效利用濃度，導致體內藥物濃度過高引起或加重副作用；且造成藥物浪費，致使藥物在后期不能達到有效濃度的持續(xù)釋放?？偟膩碚f，在制備載重組人生長激素緩釋微囊時，現有技術制備得到的微囊粒徑不均一、重復性差、生物利用度低；制備和釋放過程中蛋白藥物容易產生聚集體(大于15%為明顯聚集)，從而產生免疫原性，導致失去活性；需要額外添加賦形劑才能得到較高的藥物包埋率和可持續(xù)釋放，造成后期殘留測定困難，并且降低生物安全性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種尺寸均一的高包埋率、高活性、低突釋的載重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊。本發(fā)明的再一目的是提供一種快速制備尺寸均一的載重組人生長激素微囊的方法。根據本發(fā)明的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，是通過包括以下步驟的方法制備1)將兩嵌段兩親性聚合物材料溶于有機溶劑中，形成油相0 ；2)將含重組人生長激素rhGH的水溶液W1或顆粒S加入步驟1)所得到的油相0 中，乳化制備W1A)或s/o初乳，其中W1為內水相；3)再將上述所得初乳加入到含有穩(wěn)定劑的外水相中W2,形成W1AVW2或s/o/w2預復乳；4)將步驟3)所得的W1ZiCVW2或S/0/W2預復乳用壓力通過微孔膜，得到W/0/%或 s/o/ff2復乳液；5)將步驟4)所得到的復乳液中的有機溶劑去除固化、離心洗滌、冷凍干燥，得人生長激素rhGH長效緩釋微囊。本發(fā)明針對rhGH微囊粒徑不均一，藥物包埋率低、突釋率高、不能持續(xù)釋放和活性低等問題，提出采用一種兩嵌段的兩親性聚合物為材料對rhGH進行包埋，采用快速膜乳化方法制備出粒徑均一可控，藥物包埋率高，突釋率低，能持續(xù)釋放，且藥物活性高的rhGH微囊。因為兩嵌段的兩親性聚合物，可以很好的解決rhGH與微囊膜材之間的疏水相互作用問題，親水性mPEG鏈段可以覆蓋在疏水性膜材的表面，阻隔rhGH與材料疏水鏈段(如 PLA)之間的接觸，有效保持被包埋蛋白的活性，且釋放過程中不會因為疏水吸附而釋放不完全；其次，兩親性共聚物避免rhGH與油水界面的接觸，降低rhGH聚集體生成的幾率 ’另外，以兩親型聚合物為微囊材料還可以穩(wěn)定制備過程中的初乳液，親水鏈段和疏水鏈段能夠自由分布于油水兩相，能很好地增強初乳液的穩(wěn)定性，從而可以獲得較高的包埋率。由于兩親性材料本身具有類似于表面活性劑的性質，在制備過程中不需要額外添加輔料和佐劑，降低了生產成本，解決了殘留測定的困難，利于提高生物安全性。采用快速膜乳化法可實現制備出粒徑均一，大小可控的載rhGH微囊，因為粒徑大小與藥物釋放有緊密聯系，從而可以通過調節(jié)微囊粒徑大小達到控制釋放周期的目的。因此，根據本發(fā)明的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，本領域普通技術人員， 基于本發(fā)明的技術方案的原理，結合現有技術和公知常識，可以選擇適合本發(fā)明的兩嵌段的兩親性聚合物，所述的聚合物材料的選擇面很廣。在本發(fā)明的具體實施例中，可以選擇兩親性材料為聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物、聚酸酐、聚原酸酯、聚己內酯分別與聚乙二醇共聚所得的聚合物材料之一，或不同種類不同分子量的聚合物復配混合使用，并且本發(fā)明的發(fā)明人經試驗證明使用上述兩親性材料、根據本發(fā)明的方法制備的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊尺寸均一、包埋率高、 活性高、突釋低、重復性好。根據本發(fā)明的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，其中，在步驟1)中，所述的兩嵌段兩親性聚合物為聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物、聚己內酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈與聚乙二醇共聚所得的兩親性聚合材料中的一種或多種。所述的有機溶劑可選自水中的溶解度低于2%的有機溶劑，如二氯甲烷、甲苯、氯仿等有機溶劑中的任意一種或多種； 也可選自在水中的溶解度高于2%的有機溶劑，如乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、丙酮等中的一種或者幾種；還可選自上述不同有機溶劑之間的任意復配，具體種類或體積需視所用膜材等制備參數而定。 根據本發(fā)明的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，其中在步驟2、中，所述的重組人生長激素水溶液的濃度為1 100mg/mL，也可為固體顆粒，藥物為固體顆粒時，其粒徑必須小于膜孔徑。根據本發(fā)明的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，其中在步驟幻中，所述的外水相穩(wěn)定劑為聚乙烯醇、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯(TweenSO)、聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酸酯(Tween20)、十二烷基磺酸鈉(SDQ重的一種或多種，穩(wěn)定劑使用濃度優(yōu)選為0. IOwt %，其中內水相(W1)和油相(0)的體積比優(yōu)選為1 1 1 10， 所述的油相(0)與外水相(W2)體積比為1 4 1 10。根據本發(fā)明的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，在步驟4)中所述的微孔膜優(yōu)選親水的膜，如采用親水性的SPG膜，該SPG膜為商品化產品，在制備過程中，可通過選擇不同膜孔徑的SPG膜來控制產品的粒徑大小，常用的微孔膜孔徑為0. 5 200μπι，優(yōu)選的為 0. 5 50 μ m，更優(yōu)選的為1. 4 18 μ m，通過微孔膜的壓力可在1 2000kPa之間調節(jié)，這主要由制備過程中使用的微孔膜孔徑的大小及目標微囊大小的制備要求所決定。步驟4) 所得的復乳液可作為預復乳用壓力再次通過微孔膜，直至得到的復乳液的粒徑大小與均一性滿足要求，乳液過膜時的流速大小高達IOmL · S"1,因而制備過程大多瞬間完成，因此，步驟4)可多次重復。根據本發(fā)明的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，在步驟4)中在制備預復乳時我們選用普通的乳化方式如均質、超聲、機械攪拌等方法制備，通過這些常規(guī)的方法制得的乳液粒徑大于膜孔徑，在壓力的作用下將這些粒徑大于膜孔徑的預復乳通過微孔膜后，便可以得到粒徑和微孔膜一致的復乳液，可以多次重復的操作直至得到的復乳液的粒徑大小與均一性滿足要求。因此在制備過程中，可通過選擇不同膜孔徑的SPG膜來控制產品的粒徑大小，并且能夠解決以往粒徑難以均一的問題。根據本發(fā)明的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，在步驟幻中所述的將步驟4) 復乳液中的有機溶劑去除固化、離心洗滌、冷凍干燥的過程中，復乳液的體積會的縮小，因此如本發(fā)明的實施例所示，制得的微囊的粒徑會小于微孔膜的孔徑，但是由于體積、粒徑是同等程度的縮小，因此我們最后得到的微囊仍然是粒徑大小均一，可控的。根據本發(fā)明的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊的制備方法，所述方法包括以下步驟1)將兩嵌段兩親性聚合物材料溶于有機溶劑中，形成油相0 ；2)將含重組人生長激素rhGH的水溶液W1或顆粒S加入步驟1)所得到的油相0 中，乳化制備W1A)或s/o初乳，其中W1為內水相；3)再將上述所得初乳加入到含有穩(wěn)定劑的外水相中W2,形成W1ZWW2或S/0/W2預復乳；4)將步驟3)所得的W1ZiCVW2或S/0/W2預復乳用壓力通過微孔膜，得到W/0/%或 s/o/ff2復乳液；5)將步驟4)所得到的復乳液中的有機溶劑去除固化、離心洗滌、冷凍干燥，得人生長激素rhGH長效緩釋微囊。根據本發(fā)明的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊的制備方法，所述的預復乳液的粒徑大小要大于膜孔徑，在制備預復乳液的制備方法，可通過普通的乳化方式如均質、超聲、機械攪拌等方法制備，所述的復乳液中的有機溶劑的去除可采用減壓蒸發(fā)、常溫常壓攪拌揮發(fā)或溶劑萃取等方法中的一種或者幾種。本發(fā)明提供的重組人生長激素微囊，該微囊尺寸均一、可控、直徑分布系數(CV) 值在20 %以內，更優(yōu)選的在15 %以內。藥物包埋率在90 %以上，釋放過程中活性保持率在 90%以上，突釋率低于20%，能持續(xù)釋放4周至12周。該聚合物微囊在制備過程中至少采用了一種兩嵌段兩親性聚合物材料和一種親水性有機溶劑，有利于提高生長激素的包埋率和生物活性，以及降低突釋和保持長效釋放。粒徑分布系數(Coefficient of Variation, CV)采用數球法測定，測定300個粒子的粒徑，按下面的公式計算粒子的粒徑分布系數(CV)。

權利要求
1.一種重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，其特征在于，所述微囊通過包括以下步驟的方法制備1)將兩嵌段兩親性聚合物材料溶于有機溶劑中，形成油相0；2)將含重組人生長激素rhGH的水溶液W1或顆粒S加入步驟1)所得到的油相0中，乳化制備W1A)或S/0初乳，其中W1為內水相；3)再將上述所得初乳加入到含有穩(wěn)定劑的外水相中W2，形成11/0/12或3/0/12預復乳；4)將步驟幻所得的W1ZiCVW2或s/o/w2預復乳用壓力通過微孔膜，得到W1ZiCVW2或S/0/ W2復乳液，；5)將步驟4)所得到的復乳液中的有機溶劑去除固化、離心洗滌、冷凍干燥，得人生長激素rhGH長效緩釋微囊。
2.根據權利要求1所述的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，其特征在于，所述的兩嵌段兩親性聚合物的分子量為1 6萬，濃度為 20%m/v。
3.根據權利要求1所述的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，其特征在于，在步驟2) 中，所述的重組人生長激素為濃度1 lOOmg/mL的溶液W1或粒徑小于膜孔徑的固體顆粒 S。
4.根據權利要求1所述的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，其特征在于，所述的兩嵌段兩親性聚合物材料為聚乳酸、聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物、聚己內酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈與聚乙二醇共聚所得的兩親性聚合材料中的一種或多種。
5.根據權利要求1所述的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，其特征在于，在步驟4) 中，壓力為1 2000kPao
6.根據權利要求1所述的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，其特征在于，所述的步驟4)中的微孔膜為親水性膜，孔徑為0. 5 200 μ m。
7.根據權利要求6所述的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，其特征在于，所述微孔膜的孔徑為0. 5 50μπι。
8.根據權利要求6所述的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，其特征在于，所述微孔膜的孔徑為或1.4 18 μ m。
9.根據權利要求1所述的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，其特征在于，所述的內水相W1和油相0的體積比為1 1 1 10，所述的油相0與外水相W2體積比為1 4 1 10。
10.根據權利要求1所述的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，其特征在于，所述外水相包含的穩(wěn)定劑為聚乙烯醇、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酸酯、十二烷基磺酸鈉的一種或多種，穩(wěn)定劑的濃度為0. 10wt%。
11.一種重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)將兩嵌段兩親性聚合物材料溶于有機溶劑中，形成油相0；2)將含重組人生長激素rhGH的水溶液W1或顆粒S加入步驟1)所得到的油相0中，乳化制備W1A)或S/0初乳，其中W1為內水相；3)再將上述所得初乳加入到含有穩(wěn)定劑的外水相中W2，形成11/0/12或3/0/12預復乳；4)將步驟幻所得的W1ZiCVW2或s/o/w2預復乳用壓力通過微孔膜，得到W1ZiCVW2或S/0/W2復乳液；5)將步驟4)所得到的復乳液中的有機溶劑去除固化、離心洗滌、冷凍干燥，得人生長激素rhGH長效緩釋微囊。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥領域，具體的涉及重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊及其制備方法。根據本發(fā)明的重組人生長激素rhGH長效緩釋微囊，通過包括以下步驟的方法制備1)將兩嵌段兩親性聚合物材料溶于有機溶劑中，形成油相O；2)將含重組人生長激素rhGH的水溶液W1或顆粒S加入步驟1)所得到的油相O中，乳化制備W1/O或S/O初乳，W1為內水相；3)將初乳加入到含有穩(wěn)定劑的外水相中W2，形成W1/O/W2或S/O/W2預復乳；4)將步驟3)所得的W1/O/W2或S/O/W2預復乳用壓力通過微孔膜，得到W1/O/W2或S/O/W2復乳液；5)將復乳液中有機溶劑去除固化、離心洗滌、冷凍干燥。通過本發(fā)明得到的微囊尺寸均一、包埋率高、活性高、突釋低、重復性好且操作簡單有利于藥物療效的活性和工業(yè)化放大生產。
文檔編號A61K38/27GK102370630SQ20101025152
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月11日 優(yōu)先權日2010年8月11日
發(fā)明者周煒清, 王玉霞, 蘇志國, 韋祎, 馬光輝 申請人:中國科學院過程工程研究所