專利名稱：聚蘋果酸前藥衍生物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種聚合物藥物，特別是載帶多種活性基團的多功能聚合物藥物，具 體涉及聚蘋果酸類前藥衍生物及應用。
背景技術：
目前臨床應用的藥物主要為低分子化合物，低分子藥物，其具有療效高、使用方便 等優(yōu)點，但同時也存在很大的副作用。如在給藥后的短時間內，血液中藥物的濃度往往高于 治療所需濃度，有時甚至高于最低中毒濃度，從而導致人體發(fā)生中毒、過敏等；有些低分子 藥物在人體內代謝速度快，半衰期短，易排泄，隨著時間的推延，血藥濃度會很快降低到最 低有效濃度以下從而影響療效；重復給藥后，會增加對人的毒副作用，并且許多藥物因為水 溶性差而影響人體吸收，而高分子載體是降低小分子藥物副作用的有效手段之一。高分子化合物由于具有較大的相對分子量和豐富的鏈結構等特點，可把小分子藥 物引入高分子鏈，可降解的聚合物作為藥物載體可以使得藥物釋放具有較好的靶向性、藥 物釋放更加平緩，特別是可以使一些不穩(wěn)定、半衰期短的藥物在人體內達到可控制釋放的 效果。因此將可降解聚合物應用于藥物釋放體系中作為藥物載體得到了較深入的研究。具 有生物相容性和生物可降解性的高分子材料作為小分子藥物的載體可在病灶部位選擇性 地釋放藥物，能極大地提高藥物的生物利用率，有效地降低藥物的毒副作用和用藥劑量，并 且將某些聚合物前藥引入靶向分子，實現(xiàn)主動尋靶的效果。利用生物可降解高分子作為載 體，一般有兩種方法化學結合小分子藥物和物理包埋小分子藥物。將不同種類的藥物封 入高分子小球或微粒中，以聚合體為基礎的抗腫瘤藥物會在較長時間內直接進入病灶部位 釋放藥物，使藥物的毒副作用降低到最小。目前制備聚合物前藥中應用較多的有聚乳酸 (PLA)、聚乙醇酸(PGA)，聚谷氨酸等。聚乳酸、聚乙醇酸不溶于水，交聯(lián)的藥物分子在體內釋 放較慢，影響藥效；聚谷氨酸等吸水性又太強，容易崩解，對于其藥效也有影響。聚蘋果酸是一種特殊的脂肪族聚酯，具有良好的水溶性、可生物降解性、生物相容 性和生物可吸收性；另外聚蘋果酸還具有兩個顯著的優(yōu)點(1)易代謝性。由于L-蘋果酸 是生物體內克雷伯氏三羧酸循環(huán)(Kerbs TCA)的中間體，A -聚蘋果酸容易在生物體內通 過正常的三羧酸循環(huán)代謝途徑除去；(2)易修飾性。聚蘋果酸重復單元具有懸掛羧基，易溶 于水，而且容易與其它官能團反應而制得聚蘋果酸衍生物，或引入靶向分子或小分子藥物， 從而制得許多具有特殊功能的產(chǎn)物。通過共聚或懸掛羧基的修飾來調節(jié)聚蘋果酸及其衍生 物大分子鏈的結構和組成，從而實現(xiàn)可控釋放。迄今為止，以VertCammas和Kajiyaina等 為代表的國外學者已對聚蘋果酸的合成、性能和應用做了較深入的研究；用其做載體制備 的腦靶向聚合物前藥，不但具有良好的生物相容性及降解性，且改善了藥物性質。在國內目 前對聚蘋果酸的研究主要集中在其合成方法的改進和優(yōu)化，復旦大學印春華等(中國專利 申請?zhí)?00710040494. 6)發(fā)明了一種兩親性的0-長鏈烷基-N-聚蘋果酸殼聚糖接枝共聚 物，其它未見用其做藥物、抗體、配體、增敏劑等聚蘋果酸類相關前藥及其衍生物的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一類聚蘋果酸前藥衍生物，該類前藥衍生物不但能調節(jié)原有 藥物的兩親性，增強其生物相容性，而且制備的前藥在人體環(huán)境下，可斷鍵釋放藥物，達到 緩釋的目的。改性后的兩親性衍生物，通過調節(jié)親水部分和疏水部分比例，可制備成納米 給藥體系(如膠束、納米乳)，繼而也可采用物理包封方式將其他難溶性藥物(尤其抗腫瘤藥 物)、增敏劑載入納米藥物體系。本發(fā)明實現(xiàn)過程如下
結構通式(I)所示的聚蘋果酸前藥衍生物，
其中，R1、R2、R3、R4、R5和R6獨立地選自帶有或修飾后帶有活性氨基(-NH2)、羥基(-0H)、 巰基(-SH)、-S-S-或腙鍵(-NH-N=CH-),并利用上述活性基團的反應性能夠與聚蘋果酸中 的羧基進行反應的藥物、抗體、配體、增敏劑、穿膜肽、RGD肽、生物大分子藥物或聚乙二醇 (PEG)0聚蘋果酸的分子量為1500 200，000 ；聚蘋果酸和隊、R2、R3、R4, R5, R6取代基的單元 摩爾比為0.廣99。R1^R2, R3, R4, R5 和 R6 獨立地選自帶有或修飾后帶有—d—、_0_、_0_ (CH2) 3-C0_NH-
>-R10-CH=N-NH-, -R11-S-S-基團，其中 R10 為-NH-NH-CO- (CH2)n-C0-、-NH_ (CH2)n_S_S- (CH2)n_ C0-,-Gly-,-Gly-Phe-Lau-Gly-或-Gly-Gly- ；R11 選自-NH- (CH2) n -，上述 η 為 1 12，最好 為1 6。上述帶有活性氨基(-NH2)的藥物為抗腫瘤藥物阿霉素、阿扎胞苷、克拉曲濱，來那 度胺及其衍生物。上述的帶有羥基(-0Η)或巰基(-SH)的藥物為抗腫瘤藥物紫杉醇、多烯紫杉醇、喜 樹堿、羥基喜樹堿、達沙替尼、雌莫司汀、氟脲苷、鹽酸米托蒽醌、奈拉賓、鏈佐星，長春親堿 藥物及其衍生物。在結構通式(I)所示的聚蘋果酸前藥衍生物結構中，聚蘋果酸與藥物、抗體、配體， 增敏劑相互作用的同時還可用PEG修飾，用以延長藥物半衰期及體內循環(huán)時間。本發(fā)明以可生物降解的聚蘋果酸為支載體，利用聚蘋果酸結構中的羧基，在碳化 二亞胺(EDC)或N-羥基琥珀酰亞胺(HOSU)的催化作用下，與帶有活性氨基(-NH2)、羥基 (-0H)、巰基(-SH)、-S-S-或腙鍵(-NH-N=CH-)的藥物、抗體、配體、穿膜肽、增敏劑等鍵合， 制備出聚蘋果酸前藥衍生物。本發(fā)明的聚蘋果酸前藥衍生物，其制備方法包括如下步驟 (1)制備聚蘋果酸載體。(2)藥物分子的引入。其主要過程是將上述聚蘋果酸載體與帶有或修飾后帶有活 性氨基(-NH2)、羥基(-0H)、巰基(-SH)、-S-S-或腙鍵(-NH-N=CH-)的藥物、抗體、配體，增敏 劑等一種或多種相互作用或同時作用，在干燥的二甲基亞砜(DMSO)或N，N-二甲基甲酰胺 (DMF)中，在EDC/ HOSU作用下，冰浴反應3飛h后，在室溫反應l(T48h制得帶有酰胺鍵、酯 鍵的前藥或相關衍生物，這些基團可單一存在也可多種同時存在。
本發(fā)明的優(yōu)點與積極效果
(1) 由本發(fā)明制備的聚蘋果酸類的相關前藥可直接用于藥物轉運體系。(2) 藥物支載體聚蘋果酸是一種可生物降解的材料，其降解產(chǎn)物為人體本身 具有的物質，不會產(chǎn)生蓄積毒性和毒副作用，具有無毒性、無免疫原性和抗原性、生物相容 性良好的特點。(3) 本發(fā)明中聚蘋果酸前藥及其衍生物，通過PEG或其他相似大分子的修 飾，能顯著延長藥物的半衰期，延長在體內的循環(huán)時間。(4) 本發(fā)明中聚蘋果酸前藥及其衍生物，通過調節(jié)親水部分和疏水部分配比， 在一定PH的緩沖溶液中可自組裝成疏水核親水殼的納米粒(膠束)，其表面仍帶有易修飾 的羧基，可進一步與特異性配體結合，從而提供主動靶向給藥系統(tǒng)。(5) 本發(fā)明中聚蘋果酸前藥及其衍生物的降解速度可以通過改變聚蘋果酸分 子量和側鏈羧基脫保護的程度來調節(jié)，從而實現(xiàn)支載或包封藥物、抗體、配體，增敏劑等材 料的緩釋、控釋。說明書附圖


圖1為聚蘋果酸-阿霉素前藥的核磁氫譜；
圖2為聚蘋果酸-阿霉素前藥釋藥曲線；
圖3 LHRH-聚蘋果酸-阿霉素納米膠束透射電鏡圖4納米膠束入胞圖A 聚蘋果酸-阿霉素(lh) B =LHRH-聚蘋果酸-阿霉素(Ih)； 圖5為聚蘋果酸-紫杉醇前藥的核磁氫譜； 圖6為聚蘋果酸-喜樹堿前藥的核磁氫譜。
具體實施例方式帶有活性氨基(-NH2)、羥基(-0H)或巰基(-SH)的材料還包括抗體(如抗HER2 抗體等或可根據(jù)需要將抗體進行修飾后帶有上述基團)、配體(如葉酸、促黃體激素釋放激 素 LHRH 等)，增敏劑(如 PDTC，ammonium pyrrolidinedithiocarbamate)，穿膜肽(TAT， transcriptional activator protein)，RGD jj^dLI^·。本發(fā)明經(jīng)過大量的實驗研究，以阿霉素、紫杉醇和喜樹堿為藥物模型，聚蘋果酸自 制，分別以酯鍵和酰胺鍵與聚蘋果酸鍵合制備前藥。本發(fā)明制備的聚蘋果酸前藥及其衍生 物作為一種新型的藥物控釋載體可用于多種藥物的控制釋放，通過鍵合不同的受體和抗 體，可達到主動靶向的效果；通過鍵合不同抗腫瘤藥物的增敏劑可減小藥物產(chǎn)生的多藥耐 藥性；通過鍵合PEG，可延長藥物半衰期及其在體內循環(huán)時間。以下是發(fā)明人給出的實施例，但本發(fā)明不限于這些實施例。實施例1 酰胺鍵鍵合阿霉素_聚蘋果酸前藥的制備
稱取IOOmg聚蘋果酸(MW:5，000)溶到適量N，N-二甲基甲酰胺(DMF)備用。分別稱取 125mg鹽酸阿霉素(ADR · HCl)和39mL三乙胺(TEA)溶解在DMF中，室溫下攪拌過夜后，與 上述聚蘋果酸溶液混合，加入62mg EDC/HC1，0°C時反應2小時，然后室溫下反應10小時， 結束后在去離子水中透析48h，以除去未反應的單體及溶劑，冷凍干燥即得產(chǎn)物。利用紅外分光光度計和核磁共振氫譜表征產(chǎn)物結構(圖1)
IR (KBr) 3424 (0H), 2943 (CH), 1743 (C00)，1647 (CONH), 1617 cm-1 (aromaticC=O)。實施例2 酯鍵鍵合阿霉素_聚蘋果酸前藥的制備
稱取等量的聚蘋果酸(MW :5，000)和DOX溶解到適量的DMF中，磁力攪拌，室溫下反應 10小時，透析48小時，冷凍干燥即得紅色產(chǎn)物。IR (KBr) 3437 (0H), 2943 (C-H), 1736 (COO)，1618 cnT1 (aromatic C=O). 如圖2所示，在pH 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中，酯鍵水解速率相對較酰胺鍵快，但都能起
到緩釋作用。實施例3 =LHRH鍵合阿霉素-聚蘋果酸納米膠束的制備
稱取等量的聚蘋果酸(MW :5，000)和DOX溶解到適量的DMF中，磁力攪拌條件下緩慢加 入促黃體激素釋放激素(LHRH)，DCC的DMSO溶液，磁力攪拌，室溫下反應16小時，透析48 小時，冷凍干燥即得紅色產(chǎn)物。透析法自組裝成納米膠束取0.025g產(chǎn)物，溶于20ml DMSO 中，將反應液倒入200ml pH8 PBS中，然后倒入透析袋中，在5L相同pH的PBS中透析1天。 將透析袋中液體取出加入5ml分散劑，冷凍干燥，得到200nm左右的納米膠束(圖3)。亦可 在成膠束過程中加入增敏劑(PDTC)，進行物理包封。以乳腺癌細胞A2780為模型，研究其內吞機制。結果表明，通過LHRH介導作用，相 同時間內(1小時)，膠束LHRH-聚蘋果酸-阿霉素(B)熒光強度明顯高于聚蘋果酸-阿霉素 體系(A)，表明前者通過受體-配體介導途徑進入腫瘤細胞的更多(圖4)。實施例4酯鍵鍵合紫杉醇_聚蘋果酸前藥的制備
稱取50mg聚蘋果酸(MW :5，000)溶到適量N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)備用。分別稱取 63mg鹽酸阿霉素(D0X ·Ηα)和2ImL三乙胺(TEA)溶解在DMF中，室溫下攪拌過夜后，與上 述聚蘋果酸溶液混合，加入3Img EDC/HC1，0°C時反應2小時，然后室溫下反應10小時，結束 后在去離子水中透析48h，以除去未反應的單體及溶劑，冷凍干燥即得產(chǎn)物。IR (KBr) 3430 (0H), 2942 (C-H), 1736 (COO)，1620 cnT1 (aromatic C=O). 核磁氫譜表征其結構圖5。實施例5酯鍵鍵合喜樹堿_聚蘋果酸前藥的制備
稱取50mg聚蘋果酸(MW :5，000)溶到適量N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)備用。分別稱取 63mg喜樹堿溶解在DMF中，室溫下攪拌過夜后，與上述聚蘋果酸溶液混合，加入3Img EDC/ HC1,0°C時反應2小時，然后室溫下反應10小時，結束后在去離子水中透析48h，以除去未反 應的單體及溶劑，冷凍干燥即得產(chǎn)物。核磁氫譜表征其結構圖6
實施例6腙鍵鍵合阿霉素-聚蘋果酸前藥的制備
稱取8. 7mgD0X -HCl, 1. 5mg己二酸二酰胼和3mgLiCl溶于5ml 二甲基乙酰胺(DMA)，然 后再加入3uL乙酸，室溫，避光反應18h。以甲醇作為展開劑，柱層析法分離提純并干燥，得 酰胼化阿霉素。稱取6mg酰胼化阿霉素，2mgNHS，50mg聚蘋果酸，溶于適量N，N- 二甲基甲酰胺 (DMF)，加入15mg EDC/HC1，避光，室溫下反應24h。反應后的溶液在去離子水中透析48h，以 除去未反應的單體及溶劑，冷凍干燥即得產(chǎn)物。實施例7 二硫鍵鍵合阿霉素
稱取IOOmg聚蘋果酸，8mg巰基乙胺，IOmgNHS和15mgEDC/HCl溶于適量DMF中，室溫下反應20h，反應后的溶液在去離子水中透析48h，以除去未反應的單體及溶劑，冷凍干燥即 得巰基化PMLA。稱取8mg阿霉素，IOmg 3-(2-二硫代吡啶)丙酰胼(PDPH)和IOmgNHS溶于適量 DMF中，加入20mg EDC/HC1，避光，室溫反應20h。反應后的溶液用柱層析法純化。將純化干 燥后的固體5g，溶于IOmlDMSO,加入20mg巰基化PMLA，室溫下反應48h，反應后的溶液在去 離子水中透析48h，以除去未反應的單體及溶劑，冷凍干燥即得產(chǎn)物。上述實施例詳細給出了本發(fā)明的較佳的實施例，對本發(fā)明做出了詳細的描述，并 非用上述實施例限定本發(fā)明。本領域的技術人員應當意識到在不脫離本發(fā)明技術方案所給 出的技術特征和范圍的情況下，對技術特征所作的增加、或以本領域一些同樣內容的替換， 均應屬于本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
結構通式(I)所示的聚蘋果酸前藥衍生物，其中，R1、R2、R3、R4、R5和R6獨立地選自帶有或修飾后帶有活性氨基、羥基、巰基、-S-S-或腙鍵，并利用上述活性基團的反應性能夠與聚蘋果酸中的羧基進行反應的藥物、抗體、配體、增敏劑、穿膜肽、RGD肽、生物大分子藥物或聚乙二醇。289527dest_path_image001.jpg
2.根據(jù)權利要求1所述的聚蘋果酸前藥衍生物，其特征在于氓、R2、R3、R4、R5和R6獨立地選自帶有或修飾后帶有 —、-O-、-O- (CH2) 3-C0-NH-、-R10-CH=N-NH-，-R11-S-S-基團，其中 R10 為-NH-NH-CO-(CH2)n-C0-、-NH-(CH2)n-S-S-(CH2)n-C0-、-Gly-、-Gly-Phe-Lau-Gly-或-Gly-Gly- ；R11 為-NH-(CH2)n -，上述 η 為 1 12。
3.根據(jù)權利要求1所述的聚蘋果酸前藥衍生物，其特征在于所述帶有活性氨基的藥 物為抗腫瘤藥物阿霉素、阿扎胞苷、克拉曲濱，來那度胺及其衍生物。
4.根據(jù)權利要求1所述的聚蘋果酸前藥衍生物，其特征在于所述的帶有羥基或巰基 的藥物為抗腫瘤藥物紫杉醇、多烯紫杉醇、喜樹堿、羥基喜樹堿、達沙替尼、雌莫司汀、氟脲 苷、鹽酸米托蒽醌、奈拉賓、鏈佐星，長春親堿藥物及其衍生物。
5.根據(jù)權利要求1至4任意之一所述的聚蘋果酸前藥衍生物，其特征在于聚蘋果酸 的分子量為150(Γ200，000。
6.根據(jù)權利要求5所述的聚蘋果酸前藥衍生物，其特征在于聚蘋果酸和IWH R5、R6取代基的單元摩爾比為0.廣99。
7.根據(jù)權利要求1所述的聚蘋果酸前藥衍生物，其特征在于聚蘋果酸與藥物、抗體、 配體，增敏劑相互作用的同時用PEG修飾，可以延長藥物半衰期及體內循環(huán)時間。
8.權利要求1至4任意之一所述聚蘋果酸前藥衍生物的制備方法，包括下述步驟(1)制備聚蘋果酸載體；(2)將上述聚蘋果酸載體與帶有或修飾后帶有活性氨基、羥基、巰基、-S-S-或腙鍵的 藥物、抗體、配體，增敏劑等一種或多種相互作用或同時作用，在干燥的二甲基亞砜或N， N-二甲基甲酰胺中，在EDC/ HOSU作用下，冰浴反應3 6h后，在室溫反應l(T48h制得帶有 酰胺鍵、酯鍵的前藥或相關衍生物，這些基團可單一存在也可多種同時存在。
9.權利要求1所述的聚蘋果酸前藥衍生物在納米藥物轉運中的應用。
10.權利要求1所述的聚蘋果酸前藥衍生物在藥物緩、控釋中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有結構通式(I)所示的聚蘋果酸類前藥衍生物，其中，R1、R2、R3、R4、R5和R6獨立地選自帶有或修飾后帶有活性氨基、羥基、巰基、-S-S-或腙鍵，并利用上述活性基團的反應性能夠與聚蘋果酸中的羧基進行反應的藥物、抗體、配體、增敏劑、穿膜肽、RGD肽、生物大分子藥物或聚乙二醇。本發(fā)明制備的聚蘋果酸類的相關前藥可直接用于藥物轉運體系，其降解產(chǎn)物為人體本身具有的物質，不會產(chǎn)生蓄積毒性和毒副作用，具有無毒性、無免疫原性和抗原性、生物相容性良好的特點。
文檔編號A61K45/00GK101879315SQ20101025385
公開日2010年11月10日 申請日期2010年8月16日 優(yōu)先權日2010年8月16日
發(fā)明者喬有備, 吳紅, 張海濤, 李飛 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學