專利名稱：具有哺乳動物體液穩(wěn)定性的雙鏈rna分子及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及核酸技術領域，具體涉及一種具有哺乳動物體液穩(wěn)定性的雙鏈RNA分子及其制備方法和應用方法。
背景技術：
RNA干擾(RNA interference, RNAi),又稱為轉錄后基因沉默 (post-transcriptional gene silencing, PTGS)，是指雙鏈 RNA (dsRNA)分子在 mRNA/K平關閉同源基因的表達或使該基因表達沉默的現象(Fire A, 1998 ；Elbashir SM，2001)。最早有關RNA干擾的報道出現在1990年，由兩個不同的研究小組同時報道了轉基因植物中的 RNA干擾現象，以后又在線蟲、果蠅、斑馬魚和小鼠等幾乎所有真核生物中觀察到了 RNA干擾現象(Napoli C, 1990 ；Fire A, 1991 ；Guo S，1995)。1999 年，Hamilton 和 Baulcombe 在發(fā)生RNA干擾的植物中檢測到了長度為21-25個核苷酸的RNA片段，這些RNA片斷被證明是RNA干擾所必需的，被稱為小干擾核酸(siRNA) (Hamilton AJ，1999)。雙鏈siRNA與細胞內源性的相關酶和蛋白質形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex, RISC)。在RNA干擾過程中，雙鏈siRNA中的正義鏈被排除出復合體，反義鏈指導RISC結合到靶mRNA的同源位點，然后由復合物中的核糖核酸酶III降解靶mRNA，從而關閉靶基因的表達(Zamore PD, 2000 ；Hammond SM, 2001) 除了基因功能研究外，SiRNA被迅速應用于人類疾病的治療，抑制病毒或腫瘤等重大疾病中致病基因的表達(Tiemann K, 2009 Jackson AL 2010)。但由于siRNA的穩(wěn)定性較差，在體內容易被血液中大量存在的核酸酶降解(Czauderna F, 2003 ；Haupenthal J， 2006 ；Turner JJ, 2007)，因此人們需要對合成的siRNA進行化學修飾，以增加其血液穩(wěn)定性(Braasch DA, 2003 ；Layzer JM, 2004 ；Choung S2006)。雖然這種化學修飾策略能夠很好地提高siRNA分子的血液穩(wěn)定性，但引入的核苷酸類似物增加了修飾siRNA的潛在細胞毒性，并在很多情況下降低了它的生物學活性，制約了其在體內的應用。因此，迫切需要建立在不增加siRNA體內毒性條件下，提高其血液穩(wěn)定性的方法， 解決siRNA制藥中的這個技術瓶頸。Braasch DA, Jensen S, Liu Y, Kaur K, Arar K, White MA and Corey DR(2003) RNA interference in mammalian cells by chemically-modified RNA. Biochemistry 42 :7967Choung S, Kim YJ, Kim S, Park HO and Choi YC (2006) Chemical modification of siRNAs to improve serum stability without loss of efficacy. Biochem Biophys Res Commun. 342 :919Czauderna F, Fechtner M, Dames S, Aygiin H, Klippel A, Pronk GJ, Giese K and Kaufmann J(2003)Structural variations and stabilising modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 31 :2705Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,Yalcin A,Weber K and Tuschl T(2001)Duplexes of 21—nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411 :494Fire A，Albertson D，Harrison SW and Moerman DG(1991)Production of antisense RNA leads to effective and specific inhibition of gene expression in C. elegans muscle. Development 113 :503Fire A,Xu SiMontgomery MKiKostas SAiDriver SE and Mello CC(1998)Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391:806Guo S and Kemphues KJ(1995)par_l，a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell 81:611Hamilton AJ and Baulcombe DC(1999)A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science 286 :950Hammond SM, Boettcher S，Caudy AA, Kobayashi R and Hannon GJ(2001) Argonaute2，a link between genetic and biochemical analyses of RNAi. Science 293 1146Haupenthal J，Baehr C，Kiermayer S，Zeuzem S and Piiper A(2006)Inhibition of RNAse A family enzymes prevents degradation and loss of silencing activity of siRNAs in serum. Biochem Pharmacol. 71 :702Jackson AL and Linsley PS (2010)Recognizing and avoiding siRNA off-target effects for target identification and therapeutic application. Nat Rev Drug Discov. 9 :57Layzer JMiMcCaffrey APiTanner AKiHuang ZiKay MA and Sullenger BA(2004) In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs. RNA 10 :766Napoli C， Lemieux C and Jorgensen R(1990)Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell 2:279Tiemann K and Rossi JJ(2009)RNAi-based therapeutics-current status， challenges and prospects. EMBO Mol Med. 1 :142Turner JJ, Jones SW, Moschos SA, Lindsay MA and Gait MJ(2007)MALDI-T0F mass spectral analysis of siRNA degradation in serum confirms an RNAse A—like activity. Mol Biosyst 3:43Zamore PD， Tuschl T， Sharp PA and Bartel DP(2000)RNAi :double-stranded RNA directs the ATP—dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 101(1) :2
發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種具有哺乳動物體液穩(wěn)定性的雙鏈RNA分子。為解決上述問題，本發(fā)明一方面，提供了一種分離的雙鏈RNA分子，其序列特征符合以下條件中的至少一種1)其中UA/UA序列的含量不大于10%;2)其中CA/UG和/或UG/ CA序列的含量不大于20% ；3)其中UA/UA和CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20%， 且其中UA/UA序列的含量不大于10%。優(yōu)選條件下，所述雙鏈RNA分子全部由未修飾的核苷酸組成。未修飾的核苷酸優(yōu)選為天然存在于哺乳動物體內的核苷酸。在本發(fā)明中，術語“分離的”在用于RNA時，表示RNA基本上不含其它在天然狀態(tài)下相關的細胞成分，其最好呈均質狀態(tài)，但也可以是干的或水溶液。純度和均一性通常可用分析化學方法如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法來測定。在本文中，所述RNA分子中UA/UA和/或CA/UG和/或UG/CA序列的含量為UA/UA 和/或CA/UG和/或UG/CA序列在該RNA分子所有可能的雙核苷酸組合中所占的數量百分比。所述UA/UA序列是指雙鏈RNA分子的第一條鏈上的一個連續(xù)的UA序列與第二條鏈上的一個與第一條鏈的UA序列互補的連續(xù)的UA序列形成UA/UA序列；所述CA/UG序列是指雙鏈RNA分子的第一條鏈上的一個連續(xù)的CA序列與第二條鏈上的一個與第一條鏈的 CA序列互補的連續(xù)的UG序列形成CA/UG序列；所述UG/CA序列是指雙鏈RNA分子的第一條鏈上的一個連續(xù)的UG序列與第二條鏈上的一個與第一條鏈的UG序列互補的連續(xù)的CA序列形成UG/CA序列。在上述方案中，當雙鏈RNA分子中含有UA/UA序列時，所述UA/UA序列在該RNA分子所有可能的雙核苷酸組合中所占的數量百分比不大于10% ；當雙鏈RNA分子中含有CA/ UG序列時，所述CA/UG序列在該RNA分子所有可能的雙核苷酸組合中所占的數量百分比不大于20%，當雙鏈RNA分子中含有UG/CA序列時，所述UG/CA序列在該RNA分子所有可能的雙核苷酸組合中所占的數量百分比不大于20% ；當雙鏈RNA分子中同時含有UA/UA和CA/ UG、或者同時含有UA/UA和UG/CA、或者同時含有UA/UA和CA/UG和UG/CA時，上述序列的總的含量不大于20%，并且其中UA/UA序列的含量不大于10%。在上述方案中，優(yōu)選的，所述雙鏈RNA分子中不含有UA/UA序列；當雙鏈RNA分子中含有CA/UG序列時，所述CA/UG序列在該RNA分子所有可能的雙核苷酸組合中所占的數量百分比不大于10 %，當雙鏈RNA分子中含有UG/CA序列時，所述UG/CA序列在該RNA分子所有可能的雙核苷酸組合中所占的數量百分比不大于10%。最優(yōu)選的，所述雙鏈RNA分子中不含有任何UA/UA序列和CA/UG或UG/CA序列。具有上述序列特征的雙鏈RNA分子，在37°C條件下在哺乳動物體液中保持穩(wěn)定。 所述哺乳動物選自大鼠、小鼠、兔、狗、羊、豬、牛、猴或者人。所述哺乳動物體液選自血液、 血漿、血清、組織液、腦脊液、唾液或者分泌物。哺乳動物體液濃度至少為lO^JO^jO^、 90%或者100%。所述雙鏈RNA分子與上述哺乳動物體液接觸后，至少70%、80%、90%甚至95%以上的RNA保持完整的雙鏈結構。在哺乳動物體液中，具有上述序列特征的雙鏈RNA 穩(wěn)定存在的時間大于10分鐘，優(yōu)選地大于1小時，再優(yōu)選地大于6小時，更優(yōu)選地大于12 小時。利用聚丙烯酰氨凝膠對SiRNA的血清穩(wěn)定性進行檢測，然后用灰度定量軟件如 ImageJ對RNA條帶進行定量，雙鏈RNA分子的完整性用處理后樣本的灰度值除以未處理樣本的灰度值來表示。在實施例中siRNA的穩(wěn)定性的表述方式如下“ + ”表示經血清孵育后，siRNA主帶完全消失，可見明顯的降解條帶，雙鏈RNA分子的完整性小于70%;“++”表示經血清孵育后，雙鏈RNA分子的完整性在70%以上，同時可見明顯的降解條帶；“+++”表示經血清孵育后，雙鏈RNA分子的完整性在90%以上，未見明顯的降解條帶。在本文中，對所述雙鏈RNA分子的長度沒有特別的限制，例如可以是長雙鏈 RNA,長度在幾十至幾百個核苷酸，甚至幾千個核苷酸；也可是短的雙鏈RNA，如小干擾 RNA(SiRNA)。在一個較佳的實施方式中，所述具有哺乳動物體液穩(wěn)定性的雙鏈RNA分子中每條鏈的長度為8-50個核苷酸，更佳的為10-40個核苷酸，還要佳的為12-30個核苷酸。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方式中，所述具有哺乳動物體液穩(wěn)定性的雙鏈RNA分子中每條鏈的長度為14- 個核苷酸，該RNA分子能夠靶特異性RNA干涉，其中至少一條鏈具有1_5個核苷酸的3’ -突出端。在本發(fā)明的第二個方面，提供了獲得所述具有哺乳動物體液穩(wěn)定性的雙鏈RNA分子的方法，該方法包含以下步驟(1)從目標基因轉錄本序列中選擇一個或多個18-30個核苷酸長度的核酸片段作為雙鏈RNA分子的一條鏈，使雙鏈RNA分子的另一條鏈與其互補，所述雙鏈RNA分子的序列符合以下條件中的至少一種；1)其中UA/UA序列的含量不大于10% ；2)其中CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20% ；3)其中UA/UA和CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20 %，且其中UA/UA序列的含量不大于10% ；(2)制備上述雙鏈RNA分子；(3)將制備的雙鏈RNA分子與含有10%以上哺乳動物體液的溶液接觸10分鐘以上，其中RNA的雙鏈結構的完整性在70%以上的雙鏈RNA為哺乳動物體液穩(wěn)定的雙鏈RNA。本發(fā)明第三方面提供了上述雙鏈RNA分子的應用方法。首先，本發(fā)明所述的雙鏈RNA分子可以用于在細胞中抑制基因表達，因此本發(fā)明提供了一種在細胞中抑制目標基因表達的方法，該方法包括以下步驟(1)將上述雙鏈RNA分子中的至少一種導入細胞；(2)培養(yǎng)細胞直至目標基因的表達被抑制。優(yōu)選情況下，所述細胞為哺乳動物細胞。其次，本發(fā)明所述的雙鏈RNA分子還可以用于制備RNA干涉藥物或者作為免疫佐劑。本發(fā)明還提供了一種在哺乳動物中抑制基因表達的藥物組合物，該藥物組合物包含上述雙鏈RNA分子中的至少一種以及至少一種藥學上可接受的載體。本文所用的“藥學上可接受的載體”應當與本發(fā)明藥物組合物中的雙鏈RNA分子相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低藥物組合物在抑制基因表達方面的效果?？勺鳛樗帉W上可接受的載體或其組分的一些物質的具體例子是糖類，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素；西黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween ；潤濕劑，如月桂基硫酸鈉；著色劑；調味劑；壓片劑、穩(wěn)定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磷酸鹽緩沖液等，其中較佳的載體選自生理鹽水、甘油和磷酸鹽緩沖鹽水。本發(fā)明的藥物組合物可以制成各種醫(yī)學上可接受的劑型， 并可由醫(yī)師根據患者種類、年齡、體重和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。本發(fā)明所述制劑是指口服液、注射劑、舌下含服劑等多種液體劑型，或通過加以適當的賦形劑制備成片劑、膠囊劑等多種其他劑型。較佳的是，所述藥物組合物的劑型選自注射劑、膠囊、舌下含服劑、口服液、氣霧劑或貼劑。在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，提供了一種制備上述藥物組合物的方法，該方法包括將上述雙鏈RNA分子中的至少一種與至少一種藥學上可接受的載體相混合，從而獲得所述藥物組合物。雙鏈RNA分子以及藥學上可接受的載體之間的混合次序沒有特別的限制。本發(fā)明通過對核酸序列的選擇，降低其中UA/UA和/或CA/UG和/或UG/CA位點的含量，提高其對哺乳動物體液中核酸酶的抗性，從而達到增加未修飾的雙鏈RNA分子在哺乳動物體液中穩(wěn)定性的目的。與修飾的核酸分子相比，降低了因化學修飾帶來的潛在的細胞毒性以及修飾對核酸分子的生物學活性的影響。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1.穩(wěn)定性siRNA的體內穩(wěn)定性實驗1，未處理的siRNA ；2，siRNA處理的小鼠的尿液；3，生理鹽水處理的小鼠的尿液。
具體實施例方式自1998年RNA干涉現象被發(fā)現以來，經過幾年的探索，2001年左右小核酸制藥這一新興的生物制藥領域逐漸開始形成。作為該領域一項革命性的突破，第一個siRNAi藥物 Bevasiranib于2004年獲得批準進入臨床試驗(Acuity Pharmaceuticals公司，用于治療濕性老年性黃斑變性)，2008年進入臨床III期試驗。臨床試驗結果表明，小核酸藥物不僅安全、毒性低，而且臨床治療效果十分顯著，極有可能成為一個可用于大規(guī)模藥物開發(fā)的技術平臺。盡管如此，在siRNA制藥技術方面還有許多問題沒有得到解決，例如如何提高 siRNA藥物的血液穩(wěn)定性和容留時間，如何提高siRNA藥物的靶向性等。尤其是對于系統(tǒng)用藥來說，siRNA制劑的血液穩(wěn)定化技術是優(yōu)化容留時間和靶向性的前提條件。以往siRNA穩(wěn)定化技術基本是源于反義核酸和核酶時代的多種核酸修飾，包括2-0-(2， 4-dinitriophenyl) jf trp, 2'-fluoro jf trp, 2'-0-methyl jf trp, 2'-0-methoxyethyl jftrp, VX 及LNA修飾等。這些化學修飾雖然有效地提高了 siRNA的化學穩(wěn)定性，同時也增加了 siRNA 制劑的細胞毒性，為s iRNA藥物的研發(fā)造成了新的障礙。本發(fā)明人針對如何增加siRNA制劑的血液穩(wěn)定性開展了長期而深入的研究，發(fā)現 siRNA在血液降解過程中存在敏感位點。在此基礎上，發(fā)明人研究合成了一種具有哺乳動物體液穩(wěn)定性的雙鏈RNA分子，其在未修飾的狀態(tài)下能夠長時間地在哺乳動物體液尤其是血液中保持穩(wěn)定。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于
1)以往制備具有哺乳動物體液穩(wěn)定性的雙鏈RNA分子是通過對RNA分子中的部分核苷酸進行化學修飾或利用非天然核苷酸替代來實現的，本發(fā)明首次提供一種未修飾的具備哺乳動物體液穩(wěn)定性的雙鏈RNA分子，在不增加RNA分子細胞毒性的條件下，提高了其對核酸酶降解的抵抗能力。2)本發(fā)明提供了一種普遍適用的技術方法，制備針對任何基因序列的具備哺乳動物體液穩(wěn)定性的雙鏈RNA。下面結合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明。下列實施例中未著名具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆實驗手冊(Molecular cloning :A laboratory manual, 3rd ed.，Sambrool 等，Cold Spring Biology-A Laboratory Manual，Clrak等，Springer-Verlag，1997)中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。除非特別說明，本發(fā)明所用到的試劑、培養(yǎng)基均為市售商品。實施例1.雙鏈RNA分子的穩(wěn)定性實驗在含一定量胎牛血清的36 μ L IXPBS溶液中加入4 μ L濃度為20 μ M的雙鏈RNA 溶液，血清終濃度分別為10%,20^,50%或90% ；在37°C條件下將反應體系孵育10分鐘、 30分鐘、1小時、3小時或6小時后取樣；每次取樣10 μ L并立即進行液氮速凍，樣本保存于-80°C條件下備用。配制20%的聚丙烯酰氨凝膠，將3μ L 3Χ的上樣緩沖液(30mM EDTA，36%甘油， 0. 06%溴氛藍)與10 μ L siRNA的降解樣本進行混合，然后上樣，在80mA的恒流條件下電泳。電泳結束后，用IXSybr Gold染料(Invitrogen，Cat. 11494)進行10分鐘的染色后照相。然后用灰度定量軟件如ImageJ對RNA條帶進行定量，雙鏈RNA分子的完整性用處理后樣本的灰度值除以未處理樣本的灰度值來表示。siRNA血清穩(wěn)定性的表述方式如下“ + ”表示經血清孵育后，siRNA主帶完全消失， 可見明顯的降解條帶，雙鏈RNA分子的完整性小于70%;“++”表示經血清孵育后，雙鏈RNA 分子的完整性在70%以上，同時可見明顯的降解條帶；“+++”表示經血清孵育后，雙鏈RNA 分子的完整性在90%以上，未見明顯的降解條帶。實施例2. siRNA基因沉默效率抑制活性檢測將在DMEM培養(yǎng)基(10% FBS，2mM L-谷氨酰胺，100個單位/毫升的青霉素和 100 μ g/ml的鏈霉素)中培養(yǎng)的人胚胎腎細胞(HEK293)接種到M孔板中(IX IO5細胞 /0. 5ml培養(yǎng)基/孔)。待細胞生長M小時后，細胞的融合度為50%左右時，將培養(yǎng)基換為 Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司)。然后將帶有siRNA分離靶位點的重組螢火蟲熒光素酶報告質粒和pRL-ΤΚ(編碼海腎螢光素酶)的對照質粒(Promega公司，Madison WI,USA)與化學合成的siRNA通過Lipofectamine 2000 Qnvitrogen公司，美國)進行細胞轉染，每孔含 0. 17g重組質粒和0. 017g pRL-TK對照質粒，siRNA的終濃度為13nM。每種siRNA平行轉染三個復孔，以只轉染同樣量的兩種報告基因質粒，不轉染siRNA的三個復孔作為對照。4 小時后再將轉染介質換成Iml DMEM培養(yǎng)基(10% FBS, 2mM L-谷氨酰胺，100個單位/毫升的青霉素和100 μ g/ml的鏈霉素)。M小時后收獲細胞，以10 μ 1細胞裂解液細胞，利用雙熒光素酶報告基因分析系統(tǒng)(Dual-Luciferase Assay System, Promega公司)和酶標儀 (Novostar，BMG Labtechnologies GmbH,Germany)測定兩種熒光酶的活性，以未轉染siRNA的孔中的報告基因的表達量作為標準對照，通過以下公式計算得到siRNA對靶位點的抑制活性，每種siRNA每次實驗平行做3個復孔，每個實驗重復2次。抑制活性=1-(實驗組Firefly熒光素酶的表達量/實驗組ReniIla熒光素酶表達量)/(對照組Firefly熒光素酶的表達量/對照組Renilla熒光素酶表達量)本發(fā)明利用含有siRNA分離靶位點的報告基因來檢測siRNA的干涉活性，已有研究文獻和實驗數據表明，siRNA對分離靶位點的抑制活性與其對內源靶基因的抑制活性之間存在顯著的相關性(Huang H，Qiao R，Zhao D，Zhang T，Li Y，Yi F，Lai F， Hong J, Ding X, Yang Z, Zhang L, Du Q and Liang Z(2009)Profiling of mismatch discrimination in RNAi enabled rational design of allele-specific siRNAs. Nucleic Acids Res.37(22) :7560-9 ；Du Q,Thonberg H,Wang J,Wahlestedt C and Liang Z(2005)A systematic analysis of the silencing effects of an active siRNA at all single-nucleotide mismatched target sites. Nucleic Acids Res. 33 (5) :1671-7; Du Q, Thonberg H, Zhang HY, Wahlestedt C and Liang Z(2004)Validating siRNA using a reporter made from synthetic DNA oligonucleotides. Biochem Biophys Res Commun. 325(1) :243-9)。實施例3.不同UA/UA和CA/UG和/或UG/CA含量siRNA的穩(wěn)定性及抑制活性比較在前期工作的基礎上，本發(fā)明人制備了具有不同UA/UA和CA/UG和/或UG/CA含量的siRNA，按照實施例1所述的研究方案對其血清穩(wěn)定性進行了研究，具體為將siRNA在 37°C和10%血清濃度的條件下進行孵育，6小時后取樣分析其血清穩(wěn)定性。按照實施例2 的方案檢測siRNA對分離靶位點的抑制活性，其中分離靶位點為與所設計的siRNA互補的 DNA序列。實驗結果如表1。實驗結果可以看出，siRNA的血清穩(wěn)定性與siRNA中UA/UA和 CA/UG和/或UG/CA序列的含量顯著相關，而siRNA的血清穩(wěn)定性與siRNA對融合靶基因的抑制活性無相關性。SEQ ID NO:20 5，-UUAUUGCUUMGMUACGCGUAG-3，22% 6% + 79%SEQ ID NO 21 5，-CGUUMUACUCACUGUAUATT-3， 22% 11% + 84%實施例4.基因特異的血清穩(wěn)定SiRNA的制備及研究為了制備針對任意基因序列片段的具備血清穩(wěn)定性的SiRNA，本發(fā)明人按照實施例3結果的提示，建立了一個相應的技術方案，該方案由以下步驟組成1)從目標基因轉錄本序列中選擇一個或多個18-30個核苷酸長度的核酸片段作為雙鏈RNA分子的一條鏈，使雙鏈RNA分子的另一條鏈與其互補，所述雙鏈RNA分子的序列符合以下條件中的至少一種 其中UA/UA序列的含量不大于10% ；其中CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20% ；其中UA/UA和CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20%，且其中UA/UA序列的含量不大于 10%?；没瘜W合成上述雙鏈RNA分子?；脤⒅苽涞碾p鏈RNA分子與一定濃度的哺乳動物體液進行接觸，獲得在所述哺乳動物體液中能夠穩(wěn)定存在的雙鏈RNA分子。4)按照實施例 2的實驗方案將帶有siRNA分離靶位點的報告質粒與siRNA共轉染到培養(yǎng)細胞中。5)檢測報告基因的表達水平，獲得能夠特異性抑制分離靶位點的雙鏈RNA分子。按照實施例1所述的研究方案對所述SiRNA的血清穩(wěn)定性進行了研究，具體為將 siRNA在37°C和10%血清濃度的條件下進行孵育，6小時后取樣分析其血清穩(wěn)定性。按照實施例2的方案檢測了其對靶位點的抑制活性(表2)。
0090]表2血清穩(wěn)定性siRNA的設計及驗證0091]編號基因siRNA序列UACA穩(wěn)定性抑制括0092]SQΠ)Ν0:22CVU472985'-AGAOJOCUlJOGAUAGGGACtt-3'6%0%+++95%0093]SBQIDNO23CYU472985'^OOOCUCUCUMGGMGUCtt-3 ‘6%0%+++92%0094]SBQIDNO24CYU472985'"GGGA0GMGA0GMCACUUtt-3，0%6%+++87%0095]SBQIDNO25CYU472985，"GAOGMGUAOOGAAAGGUCtt-3，6%0%+++93%0096]SBQIDNO26CYU472985，-MGMGGGOGGMAGAUOGtt-3，0%0%+++75%0097]SBQIDNO27NM_0005465，"GUAAACMUOOGGMGOGAtt-3，6%6%+++97%0098]SBQIDNO28NM_0005465，"GAGAUUCrOGCAUGCQ\GAtt-3，0%17%+++88%0099]SBQIDNO29NM_0005465，"GU0GAUGUACA_0GUCtt-3，6%11%+++90%0100]SBQIDNO30ΝΜ_007294 35"CUGGAGAGCM00GQ\TMtt-3，0%17%+++94%0101]SBQIDNO31ΝΜ_007294 35"GAUUCU0GCAUGCQ\GAGAtt-3，0%17%+++97%0102]SBQIDNO32ΝΜ_007294 35"QVUAAAGGCCMGMGGGCtt-3，6%11%+++72%0103]SBQIDNO33ΝΜ_007294 35"CMGMGGGOGGAAAGAUCtt-3，0%6%+++94%0104]SBQIDNO34ΝΜ_007294 35-AUMAGGCCMGMGGGOGtt-3，6%6%+++99%0105]SBQIDNO35ΝΜ_0001255，-AUCAGGCMGGATATGGGCtt-3，0%11%+++87%0106]SBQIDNO36ΝΜ_0001255，"GMGAGAUAOGCmJGGUUtt-3，6%6%+++89%0107]SBQIDNO37ΝΜ_0001255，^UOGMAUGUOOGUUOGGUtt-3，0%6%+++98%0108]SBQIDNO38ΒΤ007245.15，OJGAGGAGCCUUQ\GGtt-3，0%11%+++94%0109]SBQIDNO39ΒΤ007245.15， UMGGMGU0GGGGMGtt-3，6%0%+++97%0110]實施例5.長雙鏈RNA血清穩(wěn)定性的研究0111]雙鏈RNA除了用作siRNA，對同源靶基因的表達進行調控外，還被廣泛地應用于疫佐劑，調節(jié)機體的免疫力。為了驗證由未修飾的核苷酸組成的具有穩(wěn)定性的雙鏈RNA分子在免疫佐劑方面的用途，本發(fā)明人制備了長雙鏈8-50堿基不同長度的雙鏈RNA分子，按照實施例1所述的研究方案對其血清穩(wěn)定性進行了研究，具體為將siRNA在37°C和10%血清濃度的條件下進行孵育，6小時后取樣分析其血清穩(wěn)定性。實驗結果見表3.表3不同長度雙鏈RNA分子的血清穩(wěn)定性 編號
權利要求
1.分離的雙鏈RNA分子，其序列特征符合以下條件中的至少一種1)其中UA/UA序列的含量不大于10%；2)其中CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20%；3)其中UA/UA和CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20%，且其中UA/UA序列的含量不大于10%。
2.如權利要求1所述的雙鏈RNA分子，其特征在于，所述的序列全部由未修飾的核苷酸組成。
3.如權利要求1-2任一項所述的雙鏈RNA分子，其特征在于，其中雙鏈RNA部分的長度為8-50個核苷酸。
4.如權利要求1-2任一項所述的雙鏈RNA分子，其特征在于，其中雙鏈RNA部分的長度為14-27個核苷酸，其中至少一條鏈具有1-5個核苷酸的3’-突出端，該RNA分子能夠靶特異性RNA干涉。
5.如權利要求1-4任一項所述的雙鏈RNA分子，其特征在于，所述雙鏈RNA分子在哺乳動物體液中穩(wěn)定存在的時間大于10分鐘，優(yōu)選的大于30分鐘，更優(yōu)選的大于1小時，最優(yōu)選的大于6小時。
6.如權利要求1-4任一項所述的雙鏈RNA分子，其特征在于，所述雙鏈RNA分子與哺乳動物體液接觸后，70%以上的RNA保持完整的雙鏈結構，優(yōu)選的90%以上的RNA保持完整的雙鏈結構。
7.如權利要求5、6任一項所述的哺乳動物選自大鼠、小鼠、兔、狗、猴或者人。
8.如權利要求5、6任一項所述的哺乳動物體液選自血液、血漿、血清、組織液、腦脊液、 唾液或者分泌物。
9.一種獲得權利要求1-8任一項所述雙鏈RNA分子的方法，其特征在于，該方法包含以下步驟；(1)從目標基因轉錄本序列中選擇一個或多個18-30個核苷酸長度的核酸片段作為雙鏈RNA分子的一條鏈，使雙鏈RNA分子的另一條鏈與其互補，所述雙鏈RNA分子的序列符合以下條件中的至少一種；1)其中UA/UA序列的含量不大于10%；2)其中CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20%；3)其中UA/UA和CA/UG和/或UG/CA序列的含量不大于20%，且其中UA/UA序列的含量不大于10% ；(2)制備上述雙鏈RNA分子；(3)將制備的雙鏈RNA分子與含有10%以上哺乳動物體液的溶液接觸10分鐘以上，其中RNA的雙鏈結構的完整性在70%以上的雙鏈RNA為哺乳動物體液穩(wěn)定的雙鏈RNA。
10.一種在細胞中抑制目標基因表達的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟；(1)將權利要求1-8任一項所述的雙鏈RNA分子中的至少一種導入細胞；(2)培養(yǎng)細胞直至目標基因的表達被抑制。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，所述的細胞為哺乳動物細胞。
12.—種在哺乳動物中抑制基因表達的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物包含權利要求1-8任一項所述的雙鏈RNA分子中的至少一種，以及藥學上可接受的載體。
13.一種制備權利要求12所述的藥物組合物的方法，其特征在于，將權利要求1-8所述的雙鏈RNA分子中的至少一種與藥學上可接受的載體混合。
14.權利要求1-8任一項所述的雙鏈RNA分子中的至少一種在制備RNA干涉藥物以及免疫佐劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有哺乳動物體液穩(wěn)定性的雙鏈RNA分子及其制備和應用方法，本發(fā)明公開的具有哺乳動物體液穩(wěn)定性的雙鏈RNA分子全部由未修飾的核苷酸組成，本發(fā)明首次公開的具有哺乳動物體液穩(wěn)定性的雙鏈RNA分子在免疫治療和小核酸制藥中具有重要的應用價值。
文檔編號A61K48/00GK102206642SQ201010253909
公開日2011年10月5日 申請日期2010年8月16日 優(yōu)先權日2010年3月29日
發(fā)明者杜權, 梁子才 申請人:北京大學